1

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK

Három fő csoport

1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése

I típus 

Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en

(~1000-5000 bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja,

nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén.

Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához

Pl. EcoK.

Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

2

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOKII típus 

Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon

a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében

pl. EcoRI

Mg2+ kell

Ez a típus az elterjedt

III. típus 

I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja

egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától

plHgaI

Mg2+-t ésATP-t igényel

3

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK

Enzim Felismerőhely hossza

Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus

AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus

HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus

EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli

BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens

Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)

5' túlnyúló

SalI 6 Streptomyces albis

3' túlnyúló

KpnI 6 Klebsiela pneumonia

Tompa végű hasítások (blunt end)

HaeIII 4 Haemophilus aegyptus

5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3'

5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5'

5' GG CC 3' 3' CC GG 5'

4

Palindrom példák

KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA

RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT

NEM KERESIK

5

Isoschisomers

AtcI 6 5' GGTAC/C 3'KpnI 5' GGTAC/C 3' XmaI 6 5' C/CCGGG 3'SmaI 5' CCC/GGG 3'

Kompatibilis véget adó enzimek

SalI 6 5' G/TCGAC 3'XhoI 5' C/TCGAG 3'

FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK

AflIII 6 5' A/CPuPyGT 3' BspHI 6 5' T/CATGA 3' NcoI 6 5' C/CATGG 3' NdeI 6 5' CA/TATG 3' 

6

DNS METILÁZOK

- dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez

N N

NN

N

adenin

sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI,egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén- dam- törzs használata- nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

7

-dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz) 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez

N

N

O

N

citozin

- hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek- megoldás ugyanaz, mint a dam esetén

Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek

pl. M. EcoRI metiláz

8

Polimerázok

- DNS függő DNS polimerázok

- RNS függő DNS polimerázok

- Templátfüggetlen DNS polimeráz

- DNS függő RNS polimeráz

5’ 3’ polimeráz aktivitás

9

DNS függő DNS polimerázok

10

11

DNS jelölés, nick transzláció

12

13

Templát független DNS polimeráz

14

RNS függő DNS polimeráz

15

A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tudösszekapcsolni,ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

16

DNS ELVÁLASZTÁSAELEKTROFORÉZIS

denaturáló nem-denaturáló

lúgos, (DNS, agaróz)

formaldehid, glioxál, DMSO(RNS, agaróz)

urea (DNS, akrilamid)

méret

> 50 kb

100bp-50 kb

< 1000 bp

Mátrix

agaróz

agaróz 0.5- 2%

poliakrilamid

technika

pulzáló gélelektroforézis

hagyományos gélelektroforézis

(5-20%) hagyományos

LÁTHATÓVÁ TÉTEL:etídium bromid, interkaláló festék nem-denturáló körülmények,

elsőősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.A DNS 254 nm-en elnyel energia a festékre 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel elLehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.Érzékenység kb 10 ng

.Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülményközöttradioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók

Nincs roncsoló ágens

17

Horizontális gélelektroforézis

18

DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL

- közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t

- a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével

AGARÓZ

- dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízisa kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholoskicsapással, univerzális, széles mérettartomány

- - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális

- kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik,a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány

DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálhatónagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb eseténjó a kitermelés

POLIAKRILAMID (PAGE)

a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljukmajd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

19

Klónozás fogalma

Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségévelgazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunkSzubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása

vektor

Hasítás, A,B enzimekkel

A

A

B

B

inszert

ligálás

Transzformálás, felszaporítás,tisztítás

Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni,Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

Hasítás, A,B enzimekkel

20

Figure 20.2

Bacterium

Bacterialchromosome

Plasmid

Cell containing geneof interest

RecombinantDNA (plasmid)

Gene of interest

DNA ofchromosome

Recombinatebacterium

Protein harvested

Basic research on protein

Gene of interest

Copies of gene

Basic research on gene

Gene for pestresistance inserted into plants

Gene used to alterbacteria for cleaningup toxic waste

Protein dissolvesblood clots in heartattack therapy

Human growth hormone treatsstunted growth

Protein expressedby gene of interest

3

21

KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLTVEKTORTÍPUSOK

példa inszert méret

plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kbfonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kbfagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb

fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kbkozmidok pHC79 néhányszor 10 kb

PLAZMIDOK

replikációs origoORI

rezisztencia marker

Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

BAC, YAC néhány 100 kbpBAC108L, pYAC3

BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome

22

NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM

antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció

(µg/ml)

ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor

a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét

50 -100

klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S

riboszoma alegységgel

klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt

20

kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor

aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz

foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint

30 - 500

tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához

a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud

bejutni a sejtbe

15

23

Egy ősi plazmid: pBR322

24

Magas kópiaszámú változat: pUC19

25

Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása

-antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges

- kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható

- plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos

- polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció

- kék fehér színszelekció,

- pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás

- auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

26

Kolónia hibridizáció

27

LacZ komplementáció

F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosavközötti régió

bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiótés az 1-146 aminosavat

a kettő együtt: aktív – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep

a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad)ebbe lehet klónozni fragmentumot,

ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep

28

PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI

1. Kémiai transzformálás

Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejtA sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük,sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá

transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNSelvi szám a transzformációt 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre

:

normál érték: 106 – 108

nagyon jó: 109

a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők:-oldatok edények tisztasága,- sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete- hősokk hőmérséklete hossza- permeabilizáló faktor

a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé

egyéb fogások:-spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk- a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

29

Elektroporáció

A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-igtranszformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása- az impulzus nagysága, hossza- permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása 

30

A fágok általános felépítése

genetikai anyag: 40-50 kb duplaszálú lineáris DNS fertőzéssel jut a sejtbe, nagy hatékonyság két életciklus:

- lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél- lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak

a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek

bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb

cos

a középső, centrális régió eltávolítható

Eco

RI

Bam

HI

Sal

I

Eco

RI

Bam

HI

Sal

I

cos

31

32

Speciális λ fág fajták

33

Mesterséges kromoszómák:BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

34

Mesterséges kromoszómák:YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

35

KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI

- genomiális 

a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz(pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok)mind prokariótákból, mind eukariótákból

- cDNS 

az aktívan termelődő mRNS-ekből készül 

csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza(nincs intron szabályozó régió stb)

 csak eukariótákból

 expressziós

a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet  Követelmények a könyvtárakkal szemben 

- fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt- ne legyen redundáns

 

36

konkatamer

in vitro pakolás: összekeverés fágfehérje extraktummal

GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA

bal kar jobb kar

bal kar jobb kar

centrális régió

hasító helyek

emésztés

részleges vagy 20-24 kb méretű teljes emésztés fragmentek

ligálás

A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

37

cDNS könyvtárA mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények

Integritás

A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb)

  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal

elektroforézis 

Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal

A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

 

38

cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

39

EGYÉB 

pl. ha a fehérje szabályozása ismert szubsztraktív hibridizáció 

- számítógép, adatbankokgenom szekvenálások

- ismeretek a fehérje funkciójáról

RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL

- nem tudunk semmit

csak fenotípus alapján jellemezhető

mutagenezis (transzpozon)kromoszomális séta

van tisztított fehérje

fehérje funkció tesztelhetőexpressziós könyvtárak

fehérje szekvenálásDNS próba tervezés

ellenanyag termeltetésexpressziós könyvtárak

már van ilyen fehérje illetve gén más típusú sejtekből

heterológ próba használata könyvtárak átvizsgálásához

40

A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek:

 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE 2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA  

3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA  

4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA  

5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁSA SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK

AZONOSÍTÁSA

A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA

41

RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS

42

vektor

Hasítás, A,B enzimekkel

A

B

A B

inszert

ligálás

Transzformálás, felszaporítás,tisztítás

Hasítás, A,B enzimekkel

A BA C

Klónozás, szubklónozás

43

AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA

44

FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK

PROKARIÓTÁK

E. coli ismert,Bármilyen fehérje, feltéve, ha- nem túl nagy- nem túl kicsi- nem túl hidrofób- nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális

Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. colivan szekréciós rendszere

EUKARIÓTÁK

élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal,sok ismeretanyagviszonylag könnyű kezelhetőségposzttranszlációs modifikációk lehetősége

emlős sejtvonalak  minden fajta fehérje termeltethető

bennük tranziens expressziós rendszerek

viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek,

stabil expressziós rendszerek hosszú, fáradságos optimalizálást

igényel

45

PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI

TT

-35 -10

SZF

-35 -10 SD kódoló szekvencia

Pr

TSZE

TTGACAN17TATAAT

5’ UAAGGAGGN(3-11)

START kodonAUGGUGUUG

STOP kodonUAAUUGAUAG

AR ORI

GS

Pr: promóterTT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia,

AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origoGS: gazdasejt

46

- Immunológiai detektálás poli- vagy monoklonális ellenanyaggal

  - Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben)

  - Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének)

cDNS-ből készült expressziós könyvtárból

47

Polimeráz láncreakció I.

Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb.Soknak nincs 3’ 5’ exonukleáz aktivitása “A” túlnyúló

48

Polimeráz láncreakció II.

49

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.

- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSAminden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket speciálisan tervezett primerek segítségével PCRa termék megjelenése fertőzésre utal

50

Figure 20.9a, b

Normal -globin allele

Sickle-cell mutant -globin allele

175 bp 201 bp Large fragment

DdeI DdeI DdeI DdeI

DdeI DdeI DdeI

376 bp Large fragment

DdeI restriction sites in normal and sickle-cell alleles of -globin gene.

Electrophoresis of restriction fragments from normal and sickle-cell alleles.

Normalallele

Sickle-cellallele

Largefragment

201 bp175 bp

376 bp

(a)

(b)

Pontmutációk kimutatása RFLP-vel.Rerstrikciós fragment length polimorfizmus

51

A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA

Anormális

C

gén

mutáns5' 3'

A

C5' 3'

A5' 3'

PCR

egészséges

nincs termék

beteg

A

C5' 3'

C5' 3'

PCR

egészséges

nincs termék

beteg

52

transzkriptomika

proteomika

biokémiai aktivitás

metabolikus útvonalak

Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában

degradáció

DNSGén

transzkripció, RNS szerkesztés

RNS

degradáció

fehérje

transzláció, poszttranszlációs módosítás

metabolomika

53

Genom szekvenálási stratégiák

Shotgun

Primerséta

54

Alternatív shotgun stratégiák

térképezés:-genetikai:gének,tulajdonságok pozícionálása-fizikai:szekvenciák,gének rendeződése

55

Cytogenetic mapChromosome bandingpattern and location ofspecific genes byfluorescence in situhybridization (FISH)

Genetic (linkage)mapping Ordering of genetic markers such as RFLPs, simple sequence DNA, and other polymorphisms (about 200 per chromosome)

Physical mappingOrdering of large over-lapping fragmentscloned in YAC and BACvectors, followed byordering of smallerfragments cloned inphage and plasmidvectors

DNA sequencingDetermination ofnucleotide sequence ofeach small fragment andassembly of the partialsequences into the com-plete genome sequence

Chromosomebands

Genes locatedby FISH

Geneticmarkers

Overlappingfragments

…GACTTCATCGGTATCGAACT…

1

2

3

Figure 20.11

3

Genom térképezés fajtái

56

Staining techniques used to produce chromosome banding patterns

Technique Procedure Banding pattern G-banding Mild proteolysis followed by staining with Giemsa Dark bands are AT-

rich Pale bands are GC-rich

 R-banding Heat denaturation followed by staining with Giemsa Dark bands are GC-

richPale bands are AT-rich

 Q-banding Stain with quinacrine Dark bands are AT-rich

Pale bands are GC-rich C-banding Denature with barium hydroxide and Dark bands contain

constitutive then stain with Giemsa heterochromatin

A gének eloszlása nem egyenletes

57

Southern blot és hibridizáció

58

Restrikciósfingerprint RepetívDNSfingerprint

KlónozottDNSfragmentumok

STS: sequence tagged siteegyedi 100-500 bp fragment

EST: expressed sequence tag

59

Bakteriális shot-gun könyvtár készítése

kromoszómális DNS

nebulizátor

összetört DNS

végek tompítása

Preparatív gél elektroforézis

2-3,5 kb fragmentek

defoszforilálás

transzformálás elektroporálás

E. coli

60

szekvenciaanalízis

ellenőrzés,validáció

Vektor és egyéb szennyező szekvenciák

eltávolítása

Gyenge minőségű szekvenciák eltávolítása

Átfedő fragmentumokból kontigok összerakása

A szekvenciák feldolgozása

Phrap

Phrap

Vector_clipping

Phred

SeqMan/DNASTAR

STADENprogramcsomag

61

De ha sikerül, és van szekvenciánk

Mi van rajta,van-e gén? Honnan tudjuk, hogy

Valamit találtunk, találtunk-e gént?

CTCGAGACGCTGTTTCTGGGGTCATTCATTCTTGGCGGGCTGCAACTGCTGGTGTGACCGACGCGACCTGGCAGGCCGCGGTGCGCAACTGGCCGGGCGGACTAATGGTGGAGCAAAAGA

TCGGCATGTCCAGCGCACCTGAAGCTTGGGTGGTTGCTGCAATAGCAGCCTTCCTTATTGGCATGGCGAAGGGCGGTTTGGCCAATGTGGGGGTTATCGCCGTTCCCTTGATGTCCCTGG

TCAAGCCGCCGCTTACCGCTGCCGGATTGCTGCTCCCGATCTATGTCGTTTCTGATGCATTCGGCGTCTGGCTTTATCGGCACCGGTATTCTGCCTCCAATCTGCGCATCCTGATTCCTT

CGGGATTTTTTGGGGTCCTGATTGGCTGGTTATTGGCCGGGCAGATCTCCGACGCGATTGCCAGTGTCATTGTTGGTTTCACCGGCTGCGGCTTCGTGGCTGTGCTGCTGGCACGACGAG

GGGTGCCATCGGTGCCGCGTCAAGCCAACGTGCCCAAAGGATGGTTTCTGGGGGTGGCCACCGGCTTTACCAGCTTTTTGACTCATTCCGGTGCGGCGACCTTCCAGATGTTCGTGCTGC

CGCAACGGCTGGACAAGACCATGTTCGCGGGCACATCAACGCTTACCTTTGCTGCCATAAACCTATTCAAGATTCCGTCCTACTGGGCATTGGGACAGCTTTCGACTTCCTCGGTCATGT

CCGCGCTAGTGTTGATTCCGGTGGCCGTGGCCGGGACGTTCGCAGGTGTTTTTGCGACGCGCAGGCTATCGACATCCTGGTTCTTCATTCTGGTCCAGGCGATGTTGCTGGTGGTCTCCA

TTCAGCTTCTGTGGAGGGGAATGTCGGATATCCTGAACTAGCTGGAGATCGCAATGTCAGAACGCTCAATCAATCAGAATGTAATCTTGACATAGAATACCGTTCCGATTTATTGCTTCG

AGTGAAGCTGCCCGTCCGCTGAGATGTCATGACATTTTCCCCGCTTGATTCCGCCCTGCTTGGACCGTTGTTCGCGACCGATGAAATGCGCACGGTCTTCTCCGAACGGCGTTTTTTGGC

GGGAATGCTTCGTGTTGAAGTGGCCCTGGCGCGCGCGCAGGCGGCAGAGGGCCTTGTCAGTTCGGAATTGGCCGACGCGATCGAGGTTGTTGGTACTGCCGGGTTGGACCCCGAGGCGAT

GGCGGCGACTACTCGCATGACAGGAGTGCCCGCAATATCGTTCGTCCGTGCGGTGCAATCGGCCCTGCCGCCCTCACTGGCGGGTGGATTTCATTTCGGCGCCACCAGTCAAGACATCGT

GGATACGGCCCACGCGCTCCAGCTGGCCGAGGCACTCGATATTATAGAAGTCGATTTACACGCCACTGTCAGCGCAATGATGAATCTGGCCGCTGCTCACTGCAATACACCCTGTATCGG

GCGCACGGCCTTGCAGCACGCAGCGCCAGTTACGTTCGGCTACAAGGCGTCCGGCTGGTGCGTTGCCCTGGCGGAGCATCTGGTGCAGCTTCCCGCGCTGCGAAAGCGGGTTCTGGTGGC

GTCGCTAGGGGGGCCGGTTGGTACCCTTGCCGCGATGGAGGAGCGGGCCGACGCTGTACTGGAGGGTTTCGCTGCGGACCTGGGGTTGGCCATTCCCGCCCTGGCCTGGCACACGCAGCG

GGCCCGGATCGTCGAGGTGGCCAGTTGGCTGGCCATATTGCTGGGAATTCTGGCAAAAATGGCCACCGATGTCGTTCACTTGTCCTCCACGGAAGTGCGCGAGCTTTCCGAACCTGTAGC

GCCGGGCAGGGGGGGCTCCTCGGCGATGCCTCACAAGCGGAACCCGATTTCCTCGATTACCATCCTGTCCCAGCATGCTGCGGCAGGGGCCCAGCTCTCCATTCTCGTGAACGGCATGGC

CAGTCTGCACGAACGTCCGGTGGGGGCGTGGCATTCGGAATGGTTGGCTCTGCCGACGCTGTTCGGCCTTGCCGGCGGTGCCGTGCGCGAGGGCAGGTTTCTGGCCGAGGGGCTGCTGGT

CGATGCCGACCAGATGGGTCGCAATCTACAATTGACCAATGGCCTGATTTTCAGCGACGCGGTAGCCGGCCAGTTGGCAAAGCACTTGGGTCGGGCCGAGGCTTATGCCGCTGTCGAGGA

TGCCGCCGCCGAGGTGTTGCGTTCAGGCGGCAGCTTTCAGGGTCAGCTGAACCAGCGCCTGCCCGATCACCGCGACGCTATCGCTATTGCTTTTGATACGACGCCGGCGATCCAGGCCGG

GGCCGCCCGCTGCCGTAGTGCGCTGGATCATGTGGCTCGTATTCTTGGACCCGCCTCTACCATCGGATTTCAAGGAGGCTAATGACGTGACGACACTGTTTGAGGCGACGACCATCCCGA

TTTGCGAGGGCCCGCGCGACCAGACCGCCGAGATCCTTTTCGAGATGCCGCCGGGTGCGTGGGATACCCATTTTCATGTTTTTGGCCCAGTTTCATCGTTTCCATACGCAGAACACAGGC

TCTATTCCCCACCGGAGTCGCCACTTGAGGATTATCTGGTGTTGATGGAGGCTTTGGGGATCGAGCGCGGCGTTTGTGTCCATCCGAATGTTCATGGTGCCGACAATTCGGTGACGCTCG

ACGCAGTTGCGCGGTCCGATGGTCGTCTGCTGGCGGTGATCAAGCCACATCACGAGATGACTTTTGTTCAGCTGCGGGACATGAAGGCGCAGGGGGTCTGCGGGGTACGTTTTGCCTTCA

ATCCGCAGCATGGCTCGGGCGAGTTGGATACTCGTTTGTTCGAGCGTATGTTGGACTGGTGCCGCGACCTAGGCTGGTGCGTAAAATTGCATTTCGCGCCCGCTGCGCTGGACGGTCTGG

CTGAACGTTTGGCGCGCGTCGATATTCCGATCATCATCGATCATTTCGGGCGGGTGGACACCGCGCAAGGTGTGGATCAGCCGCACTTCCTGCGTTTGCTCGATCTGGCCAAACTGGACC

ATGTCTGGATCAAGCTTACGGGGGCAGATCGTATTAGCGGTTCCGGCGCGCCATATGACGATGTCGTGCCCTTCGCGCACGCTTTGGCAGATGTGGCGCCCGACCGCCTCCTCTGGGGTT

CGGATTGGCCGCATTCAGGCTATTTCGATCCGAAGCACATACCCAATGACGGCGACTTGTTGAACCTTTTGGCGCGTTTTGCCCCCGATGCTGAACTGCGTCGTAAGATCCTTGTGGACA

ACCCGCAGCGCCTGTTCGGGGCTGCTTGAGGAGCCGAGCCGATGCAACCTTTCGTCTACGAAACAGCCCCAGCGCGCGTCGTTTTCGGGCGCGGCACTTCGCAGAATCTGCGGCGGGAAC

TTGAGGCCCTGAATTTTGGCAGGGCGCTGGTTCTTTCCACGCCCGACCAAAAAGAACAATCGCTGCGAATTGCCCAGGGCCTGGGTTCTCAGCTGGCGGGGTCGTTCCACGCCGCTGCCA

TGCATACGCCTGTCGAGGTCACCTTGCAGGCGCTTGAGGTGCTGAAGGATGTGCAGGCCGATTGCATCGTGGCGATTGGCGGCGGCTCAACCATTGGGTTGGGCAAGGCACTGGCCCTGC

GCACCGATCTGCCGCAGATCGTCGTCCCGACGACTTATGCCGGCTCGGAAATGACGCCGATCCTGGGAGAGACGGAAAACGGGCTGAAGACCACACAGCGTAATCCCAAAGTGCAGCCGA

GGGTGGTTCTCTACGATGTGGACCTGACTGTGACGCTTCCGGTGCAGGCCTCGGTTACATCAGGCATGAATGCGATCGCCCATGCGGCCGAGGCATTATATGCGCGGGACGGCAATCCGG

TGATCTCGCTGATGGCCGAAGAGGCGATCCGCGCGCTGGCCCATGCCCTGCCGCGTATCGTTGCCACTCCCGACGATATCGAAGCGCGCAGCGATGCCCTCTATGGCGCGTGGCTGTGCG

GAACGTGCCTGGGTTCGGCCGGAATGGCGTTGCACCATAAGCTCTGCCACACCCTCGGCGGAAGTTTCGATTTGCCACATGCCCCGACCCACACGGTCATCCTCCCCTATGCGCTCGCCT

ATAATAGTGATGCGGCCAGGCCCGCAATGGCAGCCATCGCGCGCGCGCTGGGCATGGCGGATGCAGCGATGGGCATGAGAGCGTTGTCCATGCGGTTGGGCGCCCCGACATCGCTGCGTG

AGTTGGGCATGGCAGAAGCCGATCTTGACCGCGCCGCCGACCTGGCCACGCAAAATGCCTATTGGAACCCGCGACCCATCGAGCATGGGCCGATTCGTAACCTTCTGGGACGGGCCTGGG

CTGGAACTCCGGTCTGAAGGACCTAGAGGACAGTCAATTCATTGATCTGAAGTCACCAACGAGGAGATATGGGATGAACGAGAACATTGCGATCCGCAAATTGGGCCGCCGACTCCGATT

GGGCATTGCCGGTGGCGCGGGTCATTCGCTGATTGGTCCGGTTCACCGGGAGGCGGCTCGGCTTGACGATTTGTTCTCTCTCGATGCTGCGGTGCTGTCCAGTAACGCGGAACGCGGGGA

TGCTGAGGCCGCGGCTCTCGGAATTCCGCGCTCCTATTCGTCCACCGCCGAGATGTTCGCAATGGAGAAGGCTAGGCCCGACGGTATTGAGGCCGTTGCCATAGCCACGCCGAATGACAG

CCATTACCGGATTCTGTGCGAGGCGCTGGACGCCGGGTTGCATGTAATCTGCGACAAGCCTTTAACCTCCACGAAGGCCGAGGCCGACGACGTGCTGGTGCGGGCGAAGGCCGCGGGCAA

GGTTGTGGTCCTGACCCACAATTATTCTGGCTACGCCATGGTACGCCAAGCCCGCGCCATGGTCGCCGCCGGTGAACTTGGGAAAATCCACCAGATTCACGGGGTCTACGCTCTGGGCCA

GATGGGCCGTTTGTTCGAGGCCGACGAAGGGGGCGTGCCTCCGGGGATGCGTTGGCGGATTGATCCTGCGCGCGGTGGCGACAGTCACGCCCTGGTGGATATCGGCACCCATGTGCACCA

TCTGGCTACCTTCATCACGCAGTTACAGGTCGTTGAGGTAATGGCCGATCTTGGGCCGGCGGTTCAAGGCCGCGCGGCCCATGACAGTGCCAACGTCATGTTCCGTATGGAAAACGGAGC

TTTCGGATCGTTCTGGGCCACCAAGGCGGCATCGGGGGCCAGCAAGCTGGCGATCGAAGTCTACGGTGACAAGGGCGGCGTCCTGTGGGAGCAGGCCGACGCCAATAACTTGCTACATAT

GCGGCAGGGCCAACCCCCAGCCCTGATTGGTCGACAAGTTGCCGGGCTGCATCCTGCGGCAATCCGCGCGATGCGGGGGCCGGGTTATCATTTCGTGGAAGGCTATCGCGAGGCCTTTGC

GAATATGTACGTGGATTTCGCCGAACAGATCTTGGCCATGATGGGCAAGGGGGCCGCAGATCACCTGGCATTGGAAGCGCCGTCGGTCGTGGACGGCCTGCGCTCCATGGCGTTCATCGA

AGCCTGTGTGGCGTCGTCGCAGGACCGCCAATGGCGGCAGGTGGAGCAAGTCAGTTGATCTCTCAGCGGCTTCGGCATTTTTCCCGGGCTGGCGGCTCCCCGCAGCTCCCTCCGGTGGAA

AGAACGGGTAATCAAAATAATATTCTGATTTTAAAGGATGTTCCAGACAGCTGATTATTCCTGAAATTTAGGGCTCTTTCGGCTGTAGCAATTGACTAAAAGCCGAATTTAAGGGTAATTAAACAAACGCTGTTCGTATTATTTAAACAGGTGAGTGATGGCGATATTCCTGGAAGGCTGGCCGATGGTTTCATCTGAATACCCGGCCAGAAGCGTTGAGGCGCACCCGGCCTATCTGAC

GCCAGACTATGTTTTCACGCGAAAGCGTGCGCCGACTCGACCGCTGCGGTTAATTCCTCAGTCTGCGACGGAGCTGTATGGCCCGGTTTATGGACAAGAGAGCGTCCGTCCGGGGGATAA

CGACCTGACCCGTCAGCACGAAGCTGAGCCGGTGGGGGAGCGGATTCTGGTGACGGGGCGCGTGACCGACGAAGACGGGCGGGGTGTCCCTAATACGCTGCTAGAGATCTGGCAGGCCAA

TGCCGCCGGTCGCTATATCCACAAGCTTGACCAGCATCTTGCCCCGCTTGATCCAAATTTCTCGGGGGCAGGGCGTACGGTTACGGGGGCTGATGGCTCTTATTCCTTCATCACGATCGT

GCCGGGCGCCTATCCGGTCGTGGGGCTGCACAATGTCTGGCGCCCGCGCCACATCCATGTGTCGTTGTTCGGTCCGTCCTTCGTGACCCGCTTGGTTACCCAGATATATTTCGAGGGCGA

TCCGCTGCTGAAATATGACACGATCTACAACACGGCGCCCGACATCTCGAAGCGCAGCATGGTGGCGCAGTTGGACATGGGCGCCACGCAATCCGAATGGGGCCTGACCTATCGCTTCGA

CATCGTTCTGCGTGGGCGCAACGGCAGCTATTTCGAGGAACCCCATGACCACTAAGACCCCACTGACCATCACCCCCTCGCAGACTGTCGGGCCTTTCTATGCCTATTGCCTGACCCCGG

AGGACTACGGGACGCTTCCACCGCTGTTCGGCGCGCAGCTTGCGACCGAGGACGCCGAAGGGGAACGGATTACGATCCAGGGAACGATCACGGACGGAGAGGGGGCCATGGTTCCCGATG

CCTTGATCGAGATCTGGCAGCCGGACGGGCAGGGGCGTTTTGCTGGAGCCCATCCAGAGCTGCGGAATTCGGCCTTCAAGGGCTTCGGGCGCCGCCACTGTGACAAAAGCGGAAACTTCA

GTTTCCAAACCGTGAAGCCTGGCCGGGTGCCCACTGCCGACGGCGTGATGCAGGCACCCCATATCGCTTTGTCGATCTTCGGCAAGGGATTGAACCGCCGGCTCTATACGCGGATCTACT

TCGCAGACGAGGCATCGAATGCCGAGGACCCCGTTCTGTCGATGCTGTCCGAGGATGAGCGCGTGACCCTGATCGCCACCTCTGAATCGCCCGCCGCATATCGCCTCGACATCCGCCTGC

AAGGCGACGGCGAAACGGTGTTTTTCGAGGCCTGAGTCGGCCGGCAAGTTTGCGGGGATCCGTCCGCCGCAATTGTGTTTCGCTATAGACGCCACGGCTGCCGCATGCCGCCGGGTGGAA

GGGCCTTGCAAGGCCTGTCAACGGCGGAGTAAAATCCGGCCAGGCGGCGGAGTAAAACCAGGCCACTTGTGGCCCACGCATGAGACACCCGGGAGGGCGTAGCCCAAGCGGGGGTCTCAT

GCGTGTGCGGCGGTTTTCTGGGGGTTCAGCCAGCCTTGCGGGCGCGGCTTTGAGCGAGACGATAGCTGTCGCCGTTCATCTCGAG

62

Fehérjeszekvenciák összehasonlítása

63

Ar1Ar2 oriV

Ar2

Ar1

Ar2

oriV

Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis

poláris hatásvad típus mutáns

oriT

oriT

oriV: szűk gazdaspecificitás

Ar: antibiotikum rezisztencia

64

Table 20.1

Génsűrűség különböző élőlényekben

65

Dot-blot technikaRadioaktív génspecifikus próba

Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra

kötve

Hibridizáció A pozitív RNS minták

jelölődnek

Reverz dot-blot technika

Génspecifikus mintákrögzítése szilárd hordozóhoz

Teljes RNS jelölése

Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek

DNS-chip technika100-20,000

Génspecifikusminta

Hibridizálás

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

66Figure 20.16

Bonemarrowcell frompatient

Retroviruscapsid

Viral RNA

Cloned gene (normal allele, absent from patient’s cells)

2

Alkalmazások, humán génterápia

67

Alkalmazások, transzgenikus állatok

Figure 20.18

68

APPLICATION Genes conferring useful traits, such as pest resistance, herbicide resistance, delayed ripening, and increased nutritional value, can be transferred from one plant variety or species to another using the Ti plasmid as a vector.

TECHNIQUE

Transformed cells carrying the transgene of interest can regenerate complete plants that exhibit the new trait conferred by the transgene.

RESULTS

1 The Ti plasmid is isolated from the bacterium Agrobacteriumtumefaciens. The segment of the plasmid that integrates intothe genome of host cells is called T DNA.

2 Isolated plasmids and foreign DNA containing a gene ofinterest are incubated with a restriction enzyme that cuts inthe middle of T DNA. After base pairing occurs betweenthe sticky ends of the plasmids and foreign DNAfragments, DNA ligase is added. Some of the resultingstable recombinant plasmids contain the gene of interest.

3 Recombinant plasmids can be introduced into cultured plantcells by electroporation. Or plasmids can be returned toAgrobacterium, which is then applied as a liquid suspensionto the leaves of susceptible plants, infecting them. Once aplasmid is taken into a plant cell, its T DNA integrates intothe cell‘s chromosomal DNA.

Agrobacterium tumefaciens

Tiplasmid

Site whererestrictionenzyme cuts

T DNADNA withthe geneof interest

RecombinantTi plasmid

Plant withnew traitFigure 20.19

Alkalmazások, transzgenikus növények

69

Defendant’sblood (D)

Blood fromdefendant’sclothes

Victim’sblood (V)

D Jeans shirt V

4 g 8 g

Alkalmazások, kriminológia, apaság, anyaságvizsgálat

70

Alkalmazások, környezetvédelem

Olaj,Klórozott szénhidrogének,Bármilyen ártalmas anyag

16 h

84 h

71

Szulfonált aromás vegyületek lebontása

Nitrokémia Rt. elfolyó szennyvízben nagy mennyiségű szulfanilsav

azofestékek, növényvédőszerek, antibiotikumok alapanyaga

szulfanilsav p-aminobenzoesav

OH O

NH2

folsav

N

NN

N

OH

NH2

NH

O

N

O

OH

O

OH

NH2

SOHO

O

Igény biológiai eltávolításra

• Izoláltunk egy baktériumot, mely képes a szulfanilsavat, mint egyedüli szén-, nitrogén- és kénforrást hasznosítani

• ezzel a tulajdonságával egyedülálló a világon

72

orf1 pcaB orf2 macA orf3 pcaH pcaG istB

pSC1/48 (7404 bp)

gene

length (aa)

function homology (%)

orf1 259 hypothetical conserved protein  

pcaB

~ 450 3-carboxy-cis-cis muconate cycloisomerase

40-45

orf2 319 putative hydrolase 40

macA

359 maleil acetate reductase 45-55

orf3 395 putative oxidase  

pcaH

245 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase beta subunit

80, 67, < 60

pcaG

195 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase alfa subunit

64, 61,

istB 19 IS21 transposase, C-terminal end 100

NH2

SO3

OHOH

SO3

COOCOO

SO3

O OCOO

SO3

COOCOO

O

szulfanilát 4-szulfokatekolát

szulfomukonát

szulfolakton

maleilacetát

-

-

-

-

- -

- -

trikarbonsav ciklus

P340 II 3,4 dioxigenáz

3

NADH+HNAD

HSO3-

O2

+ +

3-karboximukonat cikloizomeráz

szulfolakton hidroláz

maleilacetát reduktáz

?

A SZULFOKATEKOL DIOXIGENÁZT KÓDOLÓ GÉNEK KROMOSZÓMÁLIS RÉGIÓJA