a técnica da eletroforese para a análise de dna e proteínas
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A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas. Prof. Dr. Francisco Prosdocimi. Histórico. 1952, Markham and Smith - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Histórico• 1952, Markham and Smith
– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Vou ali correr um gelzinho e
já volto
Tenho que ir senão vou perder meu gel
Eletroforese• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose
• Prata– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
Eletroforese em campo pulsado
Grandes fragmentos de DNA
PCR a reação em cadeia da polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/538a719f-927b-4192-8e95-18a92a9e95a5
Reação em cadeia
Amplificação do DNA
Síntese de DNA in vitro
• Polimerase Chain Reaction– Reação em cadeia da Polimerase
• Amplificação in vitro demoléculas de DNA– In vivo X In vitro X In silico
• Procedimento análogo à replicação do DNA– Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP
Etapas da PCR
• Ciclos da PCR– Separação das fitas → 96°C– Anelamento dos primers → 60°C– Síntese do DNA → 37°C
• Problema inicial da técnica– Durante a etapa de quebra das
pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo...
– Não permitia automação
História da PCR• Químico, 1966
– Doutor em bioquímica, 1972– 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica
• Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de padaria por dois anos; voltou à indústria
• 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite ao lado da namorada
• Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a técnica
• Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)
• 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus– Permitiu finalmente a automação da técnica
• Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos queacredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!
Kary Mullis, 1944
Taq polimerase
PCR
Sistema de reação:DNA molde (100 ng)Iniciadores (5 M)dNTPsTampão com MgCL2
Taq polimerase
Protocolo de amplificação:Desnaturação: 95º CAnelamento: 45-60º CExtensão: 72º C
Filmes como técnica didática
• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm• http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ
Interlúdio explicativo
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Bioquímica + Biomol
• Enzimas são proteínas, portanto:
1. São formadas por sequências de aminoácidos
2. Derivam de informações dispostas por genes no DNA, que deve ser transcrito e, posteriormente, traduzido
3. Podemos saber a sequência delas, tanto de aminoácidos quanto de nucleotídeos
>gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens] MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR LRTEASS
917 aminoácidos
3617 bp3,6 kb
917 x 3 = 2751
3617-2751 = 866
Sequenciamento de proteínas• Degradação de Edman
– Quebra-se o aminoácido N-terminal– Identifica-se o aminoácido quebrado– Sequenciamento de 50 a 70 aa’s
• Espectometria de massa– Quebra-se a proteína em diversos
pontos e verifica-se a massa dos fragmentos
– Comparações com massas conhecidas dos aa’s identifica a sequência dos mesmos
• Técnicas com limite de automação– Não permitem produzir dados em larga-
escala– Para saber-se a sequência de um
proteína, muitas vezes sequencia-se o DNA do organismo de interesse
O Sequenciamento de moléculas de DNAProf. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Frederick Sanger• Único vivo dentre os 4 indivíduos que já
venceram dois prêmios Nobel
• ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina– Ganhou o Nobel de química em 1958
• 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina
• 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S• 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA• 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro
de um organismo, o bacteriófago phi X 174– 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“– Ganha o segundo Nobel de química em 1980
O método de Sanger, 1975
Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde)na presença de:
DNA polimeraseprimer
tampãodNTPs (desóxinucleotídeo)ddNTPs (didesóxinucleotídeo)
O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tem uma extremidade 3’H?
Como acontece a síntese de moléculas de DNA?
http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related (dideóxi)
Amplificação interrompida com didesoxinucleotídeos
O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre
(...)
e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado,
(...)
interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente
Desoxinucleotídeos
dNTP
ddNTP
Didesoxinucleotídeos
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA|||||||
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CC
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CC
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5’3’
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AA
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TTTTTT
TTTT
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GG
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CCCC
CC
CC
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CC
CC
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5’3’
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População de moléculas
Incorporação aleatória do didesóxi
Quantidade precisa entre didesóxi e desóxi
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
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G A T C
• moldemolde• polimerasepolimerase• ddNNTPsTPs
•ddddGGTPsTPs •ddddAATPsTPs •ddddTTTPsTPs •ddddCCTPsTPs
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G A T C
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ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAA
Modelo originalMarcação do primer
4 reações necessárias, uma para cada base
Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos
Leitura manual da sequência de baixo pra cima
Etapa 1
AmplificaçãoTipo-PCr
Etapa 2
Eletroforese
Sanger e o fago Phi 174
De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas...
Modelo modernoApplied Byosystems, 1986
Marcação fluorescente do ddNTP
1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo
Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos
Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser
http://www.youtube.com/watch?v=ezAefHhvecM
Leroy Hood, 1938-
Cromatograma
As máquinas necessárias para o sequenciamento
• Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reaçãode amplificação interrompida
• Diferenças com relação ao PCR– Utilização de um só primer– Utilização dos ddNTPs
• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo
O que faz um sequenciador de DNA?
• Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento
de onda emitido pelo didesóxi
Exercício
Dê a sequência de DNA da canaleta apontada
azul = Guaninaamarelo = Timinavermelha = Adenina verde = Citosina
http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&feature=related