a vaszkulÁris endoteliÁlis nÖvekedÉsi faktor...

A VASZKULÁRIS ENDOTELIÁLIS NÖVEKEDÉSI

FAKTOR SZINTÉZISÉNEK ÉS SZEREPÉNEK

VIZSGÁLATA HIPOXÁS ÁLLAPOTOKBAN

Dr. Vannay Ádám

Doktori értekezés

Budapest, 2004

Témavezeto: Dr. Szabó András, egyetemi docens

Készült a Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

„Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója“ címu Ph.D. programjának

keretében.

Programvezeto: Prof. Tulassay Tivadar

Opponensek: Dr. Kovács Tibor

Dr. Tóth Mikós

Szigorlati bizottság: Prof. Rácz Károly

Dr. Szalay Csaba

Dr. Prohászka Zoltán

2

TARTALOMJEGYZÉK

1. RÖVIDÍTÉSEK 6

2. ÖSSZEFOGLALÓ 9

3. SUMMARY 10

4. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 11

4.1. A VEGF génszerkezete 11

4.2. A VEGF szintézisének szabályozása 19

4.3. A VEGF izoformái 20

4.4. A VEGF receptorai 21

4.5. A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja 25

4.6. A VEGF biológiai hatásai 27

4.7. A VEGF szintézisének és a vese iszkémia/reperfúziós károsodásának

kapcsolata

32

4.8. A hisztamin és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkémia/reperfúziós

károsodása során

33

4.9. A dehidro-epiandrosztendion és a VEGF szintézis kapcsolata a vese

iszkémia/reperfúziós károsodása során

34

4.10. A patkány VEGF izoformáinak mRNS szintu kimutatása 34

4.11. A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek

retinopátiájának kapcsolata

35

5. CÉLKITUZÉSEK 37

6. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 39

6.1. In vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek 39

6.1.1. A kísérletek során felhasznált állatok 39

6.1.2. Mutéti beavatkozás 39

6.1.3. Kezelési protokollok 40

6.1.4. Szérum kreatinin és karbamid meghatározás 40

6.1.5. A veseszövet hisztológiai vizsgálata 41

3

6.1.6. Hisztamin ELISA 41

6.1.7. DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát radioimmunoassay 41

6.1.8. Szemikvantitatív és kompetitív RT-PCR mérések 42

6.1.9. A patkány vesék szöveti VEGF szintjének meghatározása Western blottal 47

6.1.10. Immunhisztológia 49

6.1.11. Az in vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek statisztikai analízise 50

6.2. A patkány VEGF izoformáinak mRNS szi ntu kimutatása real time

RT-PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével

51

6.2.1. A VEGF különbözo izoformáinak detektálásához használt real time RT-PCR

rendszer tervezése során felmerülo megfontolások

51

6.2.2. Rekombináns DNS molekulák eloállítása 54

6.2.3. A rekombináns DNS molekulák klónozása 55

6.2.4. A VEGF izoformáinak detektálása real time RT-PCR-fluoreszcens

rezonancia energia transzfer segítségével

56

6.3. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú

koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata

56

6.3.1. A vizsgálatba bevont kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai 56

6.3.2. DNS izolálás 57

6.3.3. A VEGF T-460C polimorfizmusának detektálása real time PCR-fluoreszcens


58

6.3.4. A VEGF G+405C polimorfizmusának detektálása PCR- restrikciós fragment

hossz polimorfizmus segítségével

58

6.3.5. A populációs adatok statisztikai feldolgozása 59

7. EREDMÉNYEK 60

7.1. A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkémia/reperfúziós

patkánymodellben

60

7.1.1. A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 60

7.1.2. A vesék szövettani elváltozásai 61

7.1.3. VEGF, IL-6 és az IL-1? mRNS expresszió változásai a patkány vesékben 62

7.1.4. A VEGF fehérje szint változásai a patkány vesékben 64

7.1.5. A VEGF szöveti eloszlása a vesében 65

4

7.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista, ranitidin kezelés

hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós

patkánymodellben

67

7.2.1. A patkányok vese iszkémiát követo túlélése 67

7.2.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 68

7.2.3. A patkányok vese tubuláris károsodásának változásai 69

7.2.4. A patkányok szérum hisztamin koncentrációjának változásai 70

7.2.5. A patkányok VEGF mRNS expres sziójának változásai a vesében 71

7.2.6. A patkányok L-6 mRNS expressziójának változásai a vesében 72

7.2.7. A patkányok VEGF fehérje szintjeinek változásai a vesében 73

7.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgál ata a VEGF

szintézisére patkány vese iszkémia/reperfúziós modellben

74

7.3.1. A patkányok vese iszkémiáját követo túlélés 74

7.3.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai 75

7.3.3. A vesék szövettani elváltozásai 76

7.3.4. A DHEA kezelés hatása a szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-

szulfát koncentrációjára

77

7.3.5. A patkányok VEGF mRNS expressziójának változásai a vesében 78

7.3.6. A patkányok IL-1? mRNS expressziójának változásai a vesében 79

7.3.7. A patkányok IL-6 mRNS expressziójának változásai a vesében 79

7.3.8. A patkányok VEGF fehérjeszint változásai a vesében 80

7.4. A patkány VEGF izoformák mRNS expressziójának real time

RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferrel történo kimutatása

81

7.4.1. A VEGF120 mRNS expressziójának kimutatása 82







87

7.5.1. A VEGF promoter régió -460-as lokusz vizsgálatának reprezentatív real time

PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer eredményei

87

5

7.5.2. A VEGF +405-ös lokusz vizsgálatának reprezentatív PCR-RFLP eredményei 88

7.5.3. A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus

frekvenciái

88

7.5.4. A kis születési súlyú koraszülöttek haplotípus megoszlása 89

8. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK 91

8.1. A patkányvesék iszkémia/re perfúziós károsodása során a VEGF

szintézisében bekövetkezo változások megbeszélése

91

8.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin

kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt

hatásának megbeszélése

93

8.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés nek a posztiszk émiás patkányvese

VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése

96

8.4. A patkány VEGF izoformák detektálására kialakított real time RT-PCR-

fluoreszcens rezonancia energia transzfer rendszer eredményeink

megbeszélése

99

8.5. A VEGF promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú

koraszülöttek retinopátia kockázatának megbeszélése

100

9. EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE 101

10. IRODALOMJEGYZÉK 104

11. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 122

12. PUBLIKÁCIÓS LISTA 125

13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 126

6

1. RÖVIDÍTÉSEK

Akt anti-apoptikus kináz

BAD Bcl 2 antagonista

bFGF bázikus fibroblaszt növekedési faktor

cAMP adenozin 3’, 5’-monofoszfát

Crk avian szarkóma vírus CT10 homológ

DAG diacilglicerol

DHEA dehidro-epiandrosztendion

DHEA-S dehidro-epiandrosztendion-szulfát

dNTP dezoxi nukleotid trifoszfát

ECM extracelluláris mátrix

EGF epidermális növekedési faktor

eNOS endoteliális nitrogén-monoxid szintáz

FAK fokális adhéziós kináz

FR transzkripcióra nem kerülo génszakasz

FRET fluoreszcens rezonancia energia transzfer

Fyn, fyn tirozinkináz protoonkogén

GAP GTPáz aktíváló fehérje

GAPDH glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz

Grb2, növekedési faktor receptor köto fehérje 2

HIF-1 hipoxia indukálta faktor 1

HR2 hisztamin receptor 2

HRE hipoxia válasz elem

HSPG heparin szulfát proteoglikán

HuR Hu-antigen R

HUVEC human köldökzsinór endotélsejt

I/R iszkémia/reperfúzió

IAP apoptózis gátló

IGF-I inzulinszeru növekedési faktor I

IL-1? interleukin-1?

IL-6 interleukin-6

7

IP3 inozitol 1,4,5,-trifoszfát

IRES riboszóma köto hely

JNK c-Jun N -terminális protein kináz

L-NAME N(G)-nitro-l-arginin metil észter

MAM meprin-A5 antigen-protein-tirozin foszfatáz ?

MAPK mitogen-aktivált protein kináz

MEK mitogén-aktivált protein kináz kináz

MMP mátrix metalloproteáz

NCBI nemzeti biotechnikai információs központ

Nck, Nck mediátor fehérje

NF IL-6 nukleáris faktor IL-6

NF?? nukleáris faktor-?? ?

NO nitrogén-monoxid

NP-1 neutropilin-1

PBS foszfátpuffer

PCR polimeráz láncreakció

PDGF trombocita növekedési faktor

PG propilén-glikol

PGI2 prosztaciklin

PI3K foszfatidilinozitol 3’-kináz

PIGF placenta növekedési faktor

PIP2 foszfatidilinozitol-biszfoszfát

PKC fehérje kináz C

PLA2 foszfolipáz A2

PLC foszfolipáz C

Pyk2 FAK tirozinkináz 2

Raf-1 v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ

Ras Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1

RFLP restrikciós fragment hossz polimorfizmus

RIA radioimmunoassay

ROP koraszülött ek retinopátiája

RT reverz transzkripció

8

Sch schwannomin

sFLT-1 szolúbilis VEGF receptor 1

SHP fehérje-tirozin foszfatáz

SNP egy nukleotidot érinto polimorfizmus

Sos guanin nukleotid kicserélo faktor

Src avian szarkóma vírus onkogén

TGF transzformáló növekedési faktor

UTR fehérjére át nem íródó génszakasz

VEGF vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

VEGFR1 VEGF receptor 1

VEGFR2 VEGF receptor 2

VLBW kis születési súlyú koraszülött

VVO veziko-vakuoláris sejtorganellumok

Yes Yamaguchi szarkóma vírus onkogén homológ

9

2. ÖSSZEFOGLALÓ

A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) egy számos izoformával

(VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206) rendelkezo homodimer polipeptid.

A VEGF fontos szabályzó eleme az endotélsejtek differenciálódásának,

proliferációjának, vándorlásának és így az angiogenezisnek. A VEGF ezeken a

folyamatokon kívül számos sejtfunkciót, így a nitrogén-monoxid (NO) és prosztaciklin

(PGI2) termelést, a simaizomsejt proliferációt és az apoptózist is befolyásolja.

Vizsgálataink során a VEGF szintézisét, illetve annak szerepét vizsgáltuk

különbözo hipoxiás kórképekben. Állatkísérleteink kapcsán vizsgáltuk a VEGF

szintézisét a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása során és kifejlesztettünk egy, a

különbözo patkány VEGF izoformák mRNS expresszióját detektáló real time RT-PCR

rendszert. Humán vizsgálatainkban VEGF gén polimorfizmusok (SNP) allél és

haplotípus frekvenciáit vetettük össze a kis születési súlyú koraszülöttek retinopáta

(ROP) kockázatával.

Állatkísérleteink során azt találtuk, hogy más posztiszkémiás szervektol

eltéroen, a posztiszkémiás vesében változatlan VEGF mRNS expresszió mellett

emelkedik a VEGF fehérje szintje. Kísérleti állataink hisztamin, ranitidin, illetve

dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelése után a VEGF mRNS expresszió, illetve

fehérje szint, egymástól eltéro irányú változását tapasztaltuk a posztiszkémiás vesékben.

Adataink a VEGF szintézisének egyedülálló, poszt -transzkripcionális szabályozására

utalnak a posztiszkémniás vesében. A kifejlesztett real time RT-PCR rendszer

egyedülálló módon alkalmas a különbözo patkány szövetekben a VEGF 120-as, 144-es,

164-es, 188-as és 205-ös izoformáinak egymástól független detektálására.

A VEGF -460C alléljának, valamint a -460TT/+405CC haplotípus ának elofordulása

gyakoribb volt a retinopátia fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy

fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben, mint a nem kezeltekben.

Összefoglalva, adataink a vese VEGF szintézisének egyedülállóan, a korábbi in

vitro, illetve in vivo modellekben tapasztaltaktól különbözo, poszt-transzkripcionális

jellegére utalnak. Humán genetikai vizsgálataink eredménye arra utal, hogy a VEGF

T-460C és G+405C SNP-k vizsgálata hasznos információt ad a kis születési súlyú

koraszülöttek, ROP rizikójának becslésére.

10

3. SUMMARY

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric polipeptid which

posses different isoforms (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206). VEGF

plays a crucial role in the differentiation, proliferation and migration of the endothel

cells and therefore in angiogenesis. VEGF also regulates multiple endothelial cell

functions, such as synthesis of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2), proliferation

of vascular smooth muscle cell and apoptosis.

We investigated the regulation of VEGF synthesis and its role in different

ischemic diseases. In our animal experiments we analysed the changes in VEGF

synthesis in a rat model of ischemia/reperfusion (I/R) induced acute renal failure.

Moreover, we developed a new real time RT-PCR method to measure the mRNA

expression of different VEGF izoforms. In our human study we investigated the

association of functional promoter polimorphisms of VEGF with the risk of proliferativ

retinopathy (ROP) of very low birht weight infants (VLBW).

In rats with I/R induced acute renal failure the increased VEGF protein levels

but not mRNA expression suggesting that during renal I/R injury VEGF synthesis -

distinct from other organs - is primarily regulated at a post-transcriptional level.

Histamine, ranitidine and DHEA pretreatment of the rats resulted in distinct

changes in VEGF mRNA expression and protein levels in the postischemic kidneys

further supporting the importance of posttranscriptional mechanisms in the regulation of

VEGF synthesis. Our real time RT-PCR system, irrespectively of each other, is able to

detect the different VEGF izoforms.

We observed increased prevalence of VEGF +405C allele and VEGF -

460TT/+405CC haplotype in VLBW infants between treated with or without

cryotherapy/photocoagulation due to risk of proliferative ROP.

In conclusion our data suggest that ischemic kidney has a unique regulation of

VEGF synthesis. Our data emphasize the importance of the posttranscriptional

regulation of VEGF synthesis in the postischemic rat kidney. Our findings also suggest

that testing of VEGF SNPs would provide valuable information for the risk assessment

of ROP in VLBW infants.

11

4. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS

A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) befolyásolja az

endotélsejtek differenciálódását [1], proliferációját [2] és migrációját [3]. Ezeken a

folyamatokon keresztül szabályozza az angiogenezist mind, az embrionális fejlodés

során [4] mind, pedig a születést követoen [5].

A VEGF számos betegség patomechanizmusában (kardiovaszkuláris

megbetegedések, daganatok, reumatoid artritisz) játszik szerepet. Azon betegségek

esetén, ahol az angiogenezis a patomechanizmus központi eleme (daganatok,

gyulladásos kórképek), a túl nagy mennyiségben termelodo VEGF a betegség

progressziójához vezethet. Ugyanakkor más betegségekben, ahol az érellátási, illetve a

keringési zavar dominál (pl.: iszkémiás szívbetegség), a VEGF mint terápiás eszköz

jöhet szóba.

Egyre világosabban látszik az is, hogy a VEGF egy multifunkcionális citokin,

amely nem csak az angiogenezist befolyásolja. A VEGF az endotélsejtek (és más egyéb

sejtek pl.: vese tubuláris epitélsejt) számos egyéb biológiai funkcióját is szabályozza.

A VEGF fokozza a nitrogén-monoxid (NO) és a prosztaciklin (PGI2) [6]

szintézist, valamint gátolja a trombusképzodést [7] és a simaizom sejtek proliferációját

[8]. A VEGF hatással van a gyulladásos folyamatokra [9] és befolyásolja a sejtek

apoptozisát [10, 11].

Mivel VEGF számos biológiai folyamat (angiogenezis, szöveti átépülés,

gyulladás, apoptózis, daganatáttét-képzés) szabályozásában vesz részt, fontos megérteni

a különbözo betegségek patomechanizmusában betöltött szerepét.

4.1. A VEGF génszerkezete

A humán VEGF gén a hatos kromoszóma rövid karján (6p21.3) helyezkedik el.

A VEGF génjének 5’, illetve 3’ végi transzkripcióra nem kerülo (flanking region - FR),

illetve fehérjére át nem íródó régiója (untranslated region = UTR) igen összetett

szerkezetu (1. ábra). Ezeknek a területeken lokalizált , speciális nukleotid

12

szekvenciáknak fontos szerepe van a gén trans zkripciós, illetve transzlációs szintu

szabályozásában.

A VEGF gén transzkripciója a -1038. bázistól indul (vastag, nagy betu ) [12]. A

VEGF transzkripciós start pontja körüli régióban, ellentétben számos más génnel, nem

található TATA szekvencia (TATA box). Mindössze a gén távoli 5’ FR szakaszán

található TATA box ( -2465 és -2461-es bázisai között), ez azonban túl távol

helyezkedik el a gén transzkripciós start pontjától ahhoz, hogy szignifikáns hatása

lehessen a transzkripcióra [12].

A -2013-es és -2006-os bázisok között található a gén azon szakasza (5’

TACGTTTT 3’), amely a transzkripció hipoxia általi szabályozásáért felelos (hipoxia

válasz elem - HRE) a hipoxia indukálható faktor-1 (HIF 1) megkötésén keresztül. Ehhez

a régióhoz közel (-2000 és -1994 és bázisai között) fekszik még egy úgynevezett,

járulékos HIF-1 transzkripciós faktor köto szekvencia (5’ACAGGTC 3’), amelynek

szintén szerepe van a hipoxia hatásának közvetítésében. Ugyanezek a régiók felelosek a

NO VEGF transzkripciójára kifejtett hatásaiért is [13].

Két 5’ CCGCCC 3’, illetve 5’ GGGCGG 3’ bázis szekvenciájú szakasz,

úgynevezett GC box található a gén 5’ FR régiójában (-2138 és -2133, valamint -1277

és -1272 bázisok között) [12]. A transzkripciós start pontot közvetlenül megelozo

régióban négy GC box is található (-1133 és -1128, -1123 és -1118, -1112 és -1107,

valamint -1096 és -1091 bázisok között). További két GC box van az 5’ UTR régióban

a -518 és -513, valamint a -66 és -61 bázisok között [12]. Korábban hasonló GC box-

okat találtak más gének transzkripciós start pontja körüli régiókban is. Ezeknél a

géneknél a GC box-ok feladata az Sp1-es transzkripciós faktor megkötése.

Feltételezheto, hogy a VEGF estében is hasonló szerepe van ezeknek a GC gazdag

szekvenciáknak [12].

Öt kötohely található az AP-1-es (-2930 és -2924, -2265 és -2258, -1975 és

-1969, -1528 és -1522, valamint -620 és -614 bázisok között) és ketto az AP-2-es (-1875

és -1868, valamint -135 és -128) transzkripciós faktor számára a VEGF 5’FR, illetve

5’UTR régiójában. Az AP-1-es és az AP-2-es transzkripciós faktorok kötohelyeivel

komplementer szakaszok jelenléte a VEGF transzkripciójának 12-O-tetradekanoil-

forbol-13-acetáton, illetve cAMP-n keresztüli aktiválhatóságára utalnak [12].

13

A VEGF 5’ UTR-jának -187. és -185. bázisa közötti szakaszán egy „extra” start

kodon (AUG) található. Bár a pontos jelentosége ennek a struktúrának nem ismert,

részét képezi a VEGF 5’ UTR-n található transzláció folyamatának szabályozásáért

felelos génszakasznak (internal ribosomal entry site – IRES). Ezért valószínusítik az

„extra” start kodonnak transzláció szabályozásában való szerepét.

A VEGF 5’ UTR-jén két IRES szekvenciát is azonosítottak (IRES A és B), ezek

a szakaszok a gén –947 és –555 (IRES B), illetve a –293 és a –1 (IRES A) bázisai

között helyezkednek el [14]. Ezeken a gén szakaszokon (IRES A és B) belül is

kitüntetett szerepe van a -947 és a -904, -659 és a -555, illetve a - 293 és a -192, a -187

és a -131, valamint a -121 és a -41 bázisok közti szakaszoknak. Ezen szakaszok

deléciója jelentos mértekben csökkenti a VEGF transzlációját.

Az eddig felsorolt, a VEGF szintézisének szabályozásában fontos

génszakaszokon kívül ösztrogén receptor köto régió található a gén 5’ UTR

(5’ GGGCAAAGTGACT 3’) régiójában a gén -637 és -625 bázisai között. Ez a régió

mind az ösztrogén ? mind, pedig ? receptorát megkötik. Ez a szekvencia felelos a

VEGF transzkripciójának ösztrogén általi szabályzásáért [15].

A gén 5’ UTR régiójának közvetlenül a transzlációs start kodont megelozo

régiója igen gazdag G, illetve C bázisokban. Bár a pontos szerepe ezeknek a GC gazdag

régióknak nem ismert, minden bizonnyal a transzláció finom szabályozásában van

szerepük. Hasonló szerkezete van más növekedési faktorok a (bázikus fibroblaszt

növekedési faktor = bFGF, illetve a transzformáló növekedési faktor béta = TGF?) 5’

UTR régiójának is [16, 17].

A VEGF gén fehérjét kódoló régiója, mintegy 14 kb hosszúságú, 8 exont

tartalmazó szakasz. A génrol átírt mRNS alternatív splicingja során több különbözo

VEGF izoforma keletkezik [18, 19].

A VEGF 3’ UTR-ja AU gazdag. A gén 3’ UTR-jén sikerült azonosítani egy 13

bázisnyi szakaszt (5’ TTTTTTAATTTTA 3’), mely képes egy RNS köto fehérje, a HuR

megkötésére. A HuR megkötése a VEGF mRNS-ének stabilizálásához vezet [20].

14

1. ábra: A humán VEGF gén promoterének, kódoló szakaszának és részleges

3’ UTR-jának, illetve FR-jának szerkezete (nemzeti biotechnikai információs központ

(NCBI) AF095785, AF437895).

. . . . . . . -3100 aatgagcccttagggctcagagcctccatcctgccccaagatgtctacagcttgtgctcc . . . . . . . -3040 tggggtgctagaggcgcacaaggaggaaagttagtggcttcccttccatatcccgttcat . . . . . . . -2980 cagcctagagcatggagcccaggtgaggaggcctgcctgggagggggccctgagccagga . . . . . . . -2920 aataaacatttactaactgtacaaagaccttgtccctgctgctggggagcctgccaagtg . . . . . . . -2860 gtggagacaggactagtgcacgaatgatggaaagggagggttggggtgggtgggagccag . . . . . . . -2800 cccttttcctcataagggccttaggacaccataccgatggaactgggggtactggggagg . . . . . . . -2740 taacctagcacctccaccaaaccacagcaacatgtgctgaggatggggctgactaggtaa . . . . . . . -2680 gctccctggagcgttttggttaaattgagggaaattgctgcattcccattctcagtccat . . . . . c/a . . -2620 gcctccacagaggctatgccagctgtaggccagaccctggcaagatctgggtggataatc . . . . . . . -2560 agactgactggcctcagagccccaactttgttccctggggcagcctggaaatagccaggt . .t/c . . . . . -2500 cagaaaccagccaggaatttttccaagctgcttcctatatgcaagaatgggatgggggcc . . . . . . . -2440 tttgggagcacttagggaagatgtggagagttggaggaaaagggggcttggaggtaaggg . . . . . . . -2380 aggggactgggggaaggataggggagaagctgtgagcctggagaagtagccaagggatcc . . . . . . . -2320 tgagggaatgggggagctgagacgaaacccccatttctattcagaagatgagctatgagt . . . . . . . -2260 ctgggcttgggctgatagaagccttggcccctggcctggtgggagctctgggcagctggc . . . . . . . -2200 ctacagacgttccttagtgctggcgggtaggtttgaatcatcacgcaggccctggcctcc . . . . . . . -2140 acccgcccccaccagccccctggcctcagttccctggcaacatctggggttgggggggca . . . . . . . -2080 gcaggaacaagggcctctgtctgcccagctgcctccccctttgggttttgccagactcca . . . . . . . -2020 cagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccctcccagtcactgactaaccccggaa . . . . . . . -1960 ccacacagcttcccgttctcagctccacaaacttggtgccaaattcttctcccctgggaa . . . . . . . -1900 gcatccctggacacttcccaaaggaccccagtcactccagcctgttggctgccgctcact . . . . . . . -1840 ttgatgtctgcaggccagatgagggctccagatggcacattgtcagagggacacactgtg . . . . . . . -1780 gcccctgtgcccagccctgggctctctgtacatgaagcaactccagtcccaaatatgtag . . . . . . . -1720 ctgtttgggaggtcagaaatagggggtccaggagcaaactccccccaccccctttccaaa

15

. . . . . . . -1660 gcccattccctctttagccagagccggggtgtgcagacggcagtcactagggggcgctcg . . . . . . . -1600 gccaccacagggaagctgggtgaatggagcgagcagcgtcttcgagagtgaggacgtgtg . . . . . c/t . . -1540 tgtctgtgtgggtgagtgagtgtgtgcgtgtggggttgagggtgttggagcggggagaag . . . t/c . . . . -1480 gccaggggtcactccaggattccaacagatctgtgtgtccctctccccacccgtccctgt . . . . . . . -1420 ccggctctccgccttcccctgcccccttcaatattcctagcaaagagggaacggctctca . . . . . . . -1360 ggccctgtccgcacgtaacctcactttcctgctccctcctcgccaatgccccgcgggcgc . . . . . . . -1300 gtgtctctggacagagtttccgggggcggatgggtaattttcaggctgtgaaccttggtg . . . . . . . -1240 ggggtcgagcttccccttcattgcggcgggctgcgggccaggcttcactgggcgtccgca . . . g/a . . . . -1180 gagcccgggcccgagccgcgtgtggaggggctgaggctcgcctgtccccgccccccgggg . . . . . . . -1120 cgggccgggggcggggtcccggcggggcggagccatgcgccccccccttttttttttaaa . . . . . . . -1060 agtcggctggtagcggggaggaTCGCGGAGGCTTGGGGCAGCCGGGTAGCTCGGAGGTCG . . . . . . . -1000 TGGCGCTGGGGGCTAGCACCAGCGCTCTGTCGGGAGGCGCAGCGGTTAGGTGGACCGGTC . . . . . . . -940 AGCGGACTCACCGGCCAGGGCGCTCGGTGCTGGAATTTGATATTCATTGATCCGGGTTTT . . . . . . . -880 ATCCCTCTTCTTTTTTCTTAAACATTTTTTTTTAAAACTGTATTGTTTCTCGTTTTAATT . . . . . . . -820 TATTTTTGCTTGCCATTCCCCACTTGAATCGGGCCGACGGCTTGGGGAGATTGCTCTACT . . . . . . . -760 TCCCCAAATCACTGTGGATTTTGGAAACCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAGCAAGAGCTC . . . . . . . -700 CAGAGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGGGGTCAGAGAGAGCGCGCGGGCGTGCGAGCAG . g/c . . . . . . -640 CGAAAGCGACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGCTTTTGGGGGTGACCGCCGGAGCGCGGCG . . . . . . . -580 TGAGCCCTCCCCCTTGGGATCCCGCAGCTGACCAGTCGCGCTGACGGACAGACAGACAGA . . . . . . . -520 CACCGCCCCCAGCCCCAGCTACCACCTCCTCCCCGGCCGGCGGCGGACAGTGGACGCGGC . . . . . . . -460 GGCGAGCCGCGGGCAGGGGCCGGAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCGGGGC . . . . . . . -400 TCGCGGCGTCGCACTGAAACTTTTCGTCCAACTTCTGGGCTGTTCTCGCTTCGGAGGAGC . . . . . . . -340 CGTGGTCCGCGCGGGGGAAGCCGAGCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGTGCTAGCTCGGGCCG . . . . . . . -280 GGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCC . . . . . . . -220 GCAGTGGCGACTCGGCGCTCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGC . . . . . . . -160 AGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGG . . . . . . . -100 AAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCACAGCCCGAGCCGGCAGAGG . . . . t/c . Met Asn Phe Leu Leu -40 GAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCGAAACC ATG AAC TTT CTG CTG

16

Exon 1 Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG Trp Ser Gln gtaagcggtcgtgccct......................tctctttctgtcctcag TGG TCC CAG

Exon 2 Ala Ala Pro Met ALa Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu V GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA Ggtgagtcccc al Val Lys Phe Met Asp ctggctg.....................catcgcctctcatgcag TG GTG AAG TTC ATG GAT Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC

Exon 3 Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC

Leu Met Arg Cys GlY Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC Glu Thr Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG gtgggcatctttgggaa.............. Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln GLy Gln ............gcttccttcctttccag ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG

Exon 4 His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Ar CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AG gtgagg Exon 5 g Pro Lys Lys Asp atgtagtcacg......................ctccctacccattgcag A CCA AAG AAA GAT Arg Ala Arg Gln Gln Ly/AS AGA GCA AGA CAA GAA AA gtaagtggccctgactt........................gtttt

Exon 6 S Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg tttattttccag A AAA TCA GTT CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA CGA AAG CGC Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Va AAG AAA TCC CGG TAT AAG TCC TGG AGC GT gtacgttggtgcccgct............ l Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg ...............cttttgcctttttgcag T CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA

Exon 7 Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Ar ACA CAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AG g Cys Asp gttggttcccagaggca........................ ttttccatttccctcag A TGT GAC Exon 8 Lys Pro Arg Arg *** AAG CCG AGG CGG TGA GCCGGGCAGGAGGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCGGGAACCAGATCTC TCACCAGGAAAGACTGATACAGAACGATCGATACAGAAACCACGCTGCCGCCACCACACCATCACCATC

17

GACAGAACAGTCCTTAATCCAGAAACCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGCACTTTGGGT t/c CCGGAGGGCGAGACTCCGGCGGAAGCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCACGGTCCCTCTTGGAATTGGA TTCGCCATTTTATTTTTCTTGCTGCTAAATCACCGAGCCCGGAAGATTAGAGAGTTTTATTTCTGGGAT TCCTGTAGACACACCCACCCACATACATACATTTATATATATATATATTATATATATATAAAAATAAAT ATCTCTATTTTATATATATAAAATATATATATTCTTTTTTTAAATTAACAGTGCTAATGTTATTGGTGT CTTCACTGGATGTATTTGACTGCTGTGGACTTGAGTTGGGAGGGGAATGTTCCCACTCAGACCTGACAG GGAAGAGGAGGAGATGAGAGACTCTGGCATGATCTTTTTTTTGTCCCACTTGGTGGGGCCAGGGTCCTC TCCCCTGCCCAGGAATGTGCAAGCCAGGGCATGGGGGCAAATATGACCCAGTTTTGGGAACACCGACAA AC CCAGCCCTGGCGCTGAGCCTCTCTACCCCAGGTCAGACGGACAGAAAGACAGATCACAGGTACAGG t/c GATGAGGACACCGGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCTGTGCTTTGGGGATTCCCT CCACATGCTGCACGCGCATCTCGCCCCCAGGGGCACTGCCTGGAAGATTCAGGAGCCTGGGCGGCCTTC g/a GCTTACTCTCACCTGCTTCTGAGTTGCCCAGGAGGCCACTGGCAGATGTCCCGGCGAAGAGAAGAGACA t/c CATTGTTGGAAGAAGCAGCCCATGACAGCTCCCCTTCCTGGGACTCGCCCTCATCCTCTTCCTGCTCCC g/a CTTCCTGGGGTGCAGCCTAAAAGGACCTATGTCCTCACACCATTGAAACCACTAGTTCTGTCCCCCCAG t/c GAGACCTGGTTGTGTGTGTGTGAGTGGTTGACCTTCCTCCATCCCCTGGTCCTTCCCTTCCCTTCCCGA GGCACAGAGAGACAGGGCAGGATCCACGTGCCCATTGTGGAGGCAGAGAAAAGAGAAAGTGTTTTATAT ACGGTACTTATTTAATATCCCTTTTTAATTAGAAATTAAAACAGTTAATTTAATTAAAGAGTAGGGTTT TTTTTCAGTATTCTTGGTTAATATTTAATTTCAACTATTTATGAGATGTATCTTTTGCTCTCTCTTGCT CTCTTATTTGTACCGGTTTTTGTATATAAAATTCATGTTTCCAATCTCTCTCTCCCTGATCGGTGACAG g/a TCACTAGCTTATCTTGAACAGATATTTAATTTTGCTAACACTCAGCTCTGCCCTCCCCGATCCCCTGGCT CCCCAGCACACATTCCTTTGAAATAAGGTTTCAATATACATCTACATACTATATATATATTTGGCAACTT t/c GTATTTGTGTGTATATATATATATATATGTTTATGTATATATGTGATTCTGATAAAATAGACATTGCTAT TCTGTTTTTTATATGTAAAAACAAAACAAGAAAAAATAGAGAATTCTACATACTAAATCTCTCTCCTTTT TTAATTTTAATATTTGTTATCATTTATTTATTGGTGCTACTGTTTATCCGTAATAATTGTGGGGAAAAGA TATTAACATCACGTCTTTGTCTCTAGTGCAGTTTTTCGAGATATTCCGTAGTACATATTTATTTTTAAAC AACGACAAAGAAATACAGATATATCTTaaaaaaaaaaaagcattttgtattaaagaatttaattctgatc tcaaagctcctcttggtttctccttctccattgaatccttgctctagacttcctcccgccccctttccct cttcctctggggaacatggcatttgtcttgggtctgggaaaggtacgtctaatgtgtaggatatggggtg acccaccttgttgtgctgggggcaaagtccttccattttggctgagctggtcctgggggaacccatccat cctgtcttgatatagaaggtgggaagctctgggaatgggtggagggggagaaacagcttaggagccaagg

18

gcccttgcaattggtagtgctgccttcaggaattagatgatccaggcccctgtcccttagccagggaaag aactggccatgtctccaagcttgctgcccaggagacaggagagagctgtttttgtctgtgggggtcttgt tggctgcaacaggctgggagtgggagggggatgctgctggagggctgtgactccagggtgtaacttaatt ttacatagttttacaccctggagttccttgagcctctggaagatggacccataggtttggtcaccactga tgggactccctgccccagcttgccataagctcttctctcacgtcctgctcctgggtaaggtggcacctat ccaggtctttgacactgaagggcagtgcttccaaattcacttcctctagcctctcatttattcttgcaaa ccatagatatggcttgaataaatattgagccagtcattgtgctgctatgaataagacacaattccacccc tcaaggatctggtgaggatgggtgggtggggagacccaaaactataaatccatgagcagaaaaatacata aaatgtgctgggggcatctgatctagcttgggagtgggagttgtattgggggtggtggctggggggtggt g/a gtcttatgacattatctctaggctgccacttaaagtatggtttgaagacagggagaacggggcggcggag tgaaagggttgaggacatcccaggcagaagggatagtgtgagcaaggcatgaaggtggcacttgggcagg

A gén teljes szakaszán számos polimorf hely található (aláhúzott betu felette jelölve a báziscsere). A gén

transzkripciója a -1038. bázisnál (vastag nagybetu) indul. TATA box található a gén -2465 és -2461-es

bázisai között (vastag kisbetu). A gén -2013-es és -2006-os, illetve a -2000 és -1994 és bázisai között

találhatóak a hipoxia indukálható faktor-1 megkötéséért felelos génszakaszok (aláhúzott, vastag

kisbetuk). GC boxok találhatók a gén -2138 és -2133, -1277 és -1272, -1133 és -1128, -1123 és -1118, -

1112 és -1107, -1096 és -1091, -518 és -513, valamint -66 és -61 bázisok között (bekeretezett szakaszok).

AP-1 transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén -2930 és -2924, -2265 és -2258, -1975 és -1969, -

1528 és -1522, valamint -620 és -614 bázisai közti területén (bekeretezett, vastag kisbetu) . AP-2

transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén -1875 és -1868, valamint -135 és -128 bázisai között

(bekeretezett aláhúzott, vastag betu). A VEGF 5’ UTR-jén található IRES A –293 és a –1, az IRES B

pedig a –947 és –555 bázisai között helyezkednek el (csíkos vonal). Ösztrogén receptor kötohely van a

gén -637 és -625 bázisai között (aláhúzott, vastag betu). A VEGF start kodonja elott egy extra start kodon

található a -185 és -187 bázisok közti területen. (vastag dolt nagybetu). A hármas és négyes exonok által

kódolt aminosavak (vastag betu) felelosek a VEGF receptoraihoz való kötodésért. A stop kodon a 8-as

exon 3’ végén található (csillagok). A 3’UTR, illetve a 3’FR génszakaszon számos „AU” gazdag terület

helyezkedik el (bekeretezett dolt betu) . Ezek közül egy 13 bázisnyi szakaszról (duplán aláhúzott)

mutattak ki HuR köto képességet.

19

4.2. A VEGF szintézisének szabályozása

4.2.1. A hipoxia hatása a VEGF szintézisére

A VEGF szintézisének legfontosabb szabályzó faktora a hipoxia. Az

oxigéntenzió csökkenése a VEGF szintézisének gyors, reverzibilis fokozódásához vezet

mind in vitro mind in vivo [5, 21].

A hipoxia számos ponton befolyásolja a VEGF transzkripcióját, illetve

transzlációját.

A hipoxia hatására fokozódik a HIF-1 szintézise [22]. A HIF-1 heterodimer

molekula, amely HIF1? és HIF1? alegységekbol épül fel [23]. Hipoxia hatására a

HIF-1 a sejtmagba transzlokálódik, kötodik a VEGF gén promoterén elhelyezkedo

HRE-hez [24], ez a VEGF génjének fokozott transzkripciójához vezet [25].

A hipoxia számos kevésbé tisztázott mechanizmuson keresztül is képes fokozni

a VEGF szintézisét. A hipoxia hatására aktiválódó transzkripciós faktorok, mint a

nukleáris faktor-?? ? (NF?? ) [26], SP1 [27], AP1 [28], AP2 [29], valamint a

felhalmozódó adenozin [30] is képes a VEGF szintézisét fokozni. Más vizsgálatok

szerint a hipoxia során foszforilálódó avian szarkóma vírus onkogén (Src) szintén

fokozza a VEGF expresszióját [31].

A transzkripció fokozásán túl, a hipoxia hatással van a VEGF mRNS-ének

stabilitására is [32]. A hipoxia a 3’UTR régió adenozin-uracil gazdag régióihoz kötodo

fehérjéken (HuR) keresztül stabilizálja a VEGF mRNS-ét [33]. Így a VEGF mRNS-

ének a normoxiás körülmények közötti, 40 perces féléletideje akár 180 percre is

megnohet [34].

A VEGF 5’UTR-jén található két IRES szekvencia is, amely elosegíti a VEGF

mRNS-ének riboszómához való kötodését és transzlációját [17]. A VEGF mRNS-ének

IRES dependens transzlációs mechanizmusa lehetové teszi a transzlációt még

fokozottan hipoxiás körülmények között is, amikor más transzlációs mechanizmusok

már gátoltak [14, 35].

20

4.2.2. A VEGF bioszintézise és a citokinek kapcsolata

Számos pro- és anti-inflammatorikus citokinrol, valamint növekedési faktorról

bizonyították be, hogy fokozza a VEGF szintézisét. In vitro az interleukin-1?

(IL-1???[36], az interleukin-6 (IL-6) [37, 38], az epidermális növekedési faktor (EGF)

[39], bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) [40], a transzformáló növekedési

faktor ? és ? (TGF? , TGF???[41, 42]??az inzulinszeru növekedési faktor I (IGF-I) [43],

valamint a trombocita növekedési faktor (PDGF) [44] fokozza a VEGF mRNS

expresszióját, illetve fehérje szintjét.

4.3. A VEGF izoformái

A VEGF szoros rokonságot mutató növekedési faktorokat (VEGF-B, VEGF-C,

VEGF-D és placenta növekedési faktor (PIGF)) magába foglaló fehérjecsalád tagja.

A VEGF génje 8 exont tartalmaz. A VEGF mRNS-ének alternatív splicingja során 5

különbözo izoforma (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206) keletkezik. Az

különbözo izoformák a 6a a 6b, illetve a 7-es exon meglétében, illetve hiányában

különböznek egymástól (2. ábra) [12].

A különféle sejtek, illetve szövetek eltéro mértékben expresszálják a különbözo

VEGF izoformákat. A VEGF 121-es izoformája a lépben, a vesében és a tüdoben, a

145-ös izoformája a méhlepényben, a 165-ös az agyban és a vesében, a 189-as a szívben

és a tüdoben, míg a 206-os izoforma elsosorban a méhlepényben fordul elo [45, 46, 47].

A VEGF 121-es izoformája enyhén savas karakteru, a sejtekbol szabadon

szecernálódik [48]. A VEGF 145-ös izoformája 6-os exon által kódolt 24 aminosav

jelenléte miatt enyhén bázikus karakteru [18]. VEGF 165-ös izoforma a VEGF145-höz

hasonlóan enyhén bázikus karakteru a 7-es exon által kódolt bázikus aminosavak

jelenléte miatt [49]. Szekrécióját követoen 30-40%-ban sejt, illetve extracelluláris

mátrix (ECM) kötött marad. Ezért a VEGF 165-ös izoforma heparin szulfát

proteoglikánokkal (HSPG) való interakciója teheto felelossé [48]. A VEGF 189-es,

illetve a 206-os izoformái mind a 6-os mind a 7-es exon által kódolt bázikus

aminosavakat tartalmazzák, ezek a legbázikusabb karakteruek. Ezek az izoformák szinte

21

teljes mértékben ECM asszociáltan fordulnak elo [48, 50]. Az ECM-hez kötött VEGF

izoformák raktárt képeznek, melybol heparin, heparán szulfát, heparináz, plazmin vagy

plazminogén aktivátor hatására felszabadulhatnak [48].

A különbözo VEGF izoformák diszulfidhidakkal stabilizált homodimerek

formájában aktívak. A VEGF heterodimerek biológiailag inaktívak [51].

2. ábra: A humán VEGF izoformáinak szerkezete.

A humán VEGF különbözo izoformái a VEGF gén nyolc különbözo exonjának (E1-8) alternatív

splicingja során jönnek létre.

4.4. A VEGF receptorai

A VEGF-nek két tirozinkináz receptora, a VEGF receptor 1 (VEGFR1, Flt-1)

[52] és a VEGF receptor 2 (VEGFR2, KDR/Flk-1) ismert (3. ábra) [53]. Mindkét

tirozinkináz receptor elsosorban az endotélsejtek felszínén expresszálódik, de számos

más sejten (VEGFR1: trofoblaszt [54], mezangiális sejtek [55], monociták [56];

VEGFR2: hematopoetikus [57] és a retina progenitor sejtek [58] is kimutattak már

muködo VEGF receptorokat. A VEGFR1 (180 kD) és a VEGFR2 (230 kD) tirozinkináz

receptorok aminosav homológiája eléri a 44%-ot [59].

E1-E5 E8 VEGF121

E1-E5 E6a E8 VEGF145

E1-E5 E7 E8 VEGF165

E1-E5 E6a E8 E7 VEGF189

E6a E6b E8 E1-E5 E7 VEGF206

24 17 6 115 44 Aminosav (db)

22

3. ábra: A VEGF receptorainak sematikus ábrája.

Hét extracelluláris immunglobulinszeru domén (1-7) felelos a VEGF megkötéséért és a receptorok

dimera lizációjáért. Mindkét receptor rendelkezik egy transzmembrán (TM) és két intracelluláris

tirozinkináz (TK) doménnel. Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4:D141-D520, 1999.

A VEGF tirozinkináz receptorai 7 extracelluláris immunglobulinszeru

doménbol, egy transzmembrán régióból és egy intracelluláris a katalitikus egységet

tartalmazó tirozinkináz doménbol állnak [60]. A VEGFR1 VEGF iránti affinitása

16-114 pM, míg a VEGFR2-jé 400-1000 pM [60]. A VEGFR1, illetve a VEGFR2 elso

három extracelluláris, immunglobulinszeru doménje felelos a VEGF megkötéséért [61,

62].

A VEGF molekulák biológiai hatásukat homodimerek formájában fejtik ki. A

dimeralizáció során a VEGF monomerek egymással ellentétes orientációjú egységeit

diszulfidhidak kötik össze. A VEGF VEGF 1-es receptorához való kötodéséhez a 63.

aszparaginsav, a 64. és a 67. glutaminsav, míg a VEGFR 2-es receprothoz való

kötodéséhez a 82. arginin a 84. lizin és a 86. hisztidin jelenléte nélkülözhetetlen [63]. A

receptorokhoz való kötodéséhez elengedhetetlen aminosavak, a VEGF monomerek

ellentétes oldalán helyezkednek el [63] (4. ábra).

23

4. ábra: A VEGF homodimerek háromdimenziós modellje.

A VEGF monomerek (zöld) egymással ellentétes orientációjú egységeit diszulfidhidak (sárga) kötik össze

egymással. A VEGF VEGFR1-hez (piros), illetve VEGFR2 -höz (kék) való kötodésért felelos aminósavak

a monomerek ellentétes végén helyezkednek el. Keyt BA. és mtsai. : J Biol Chem. 271: 5638-5646, 1996.

Így a VEGF monomerek dimeralizációja lehetové teszi, hogy egyszerre két

receptorhoz is kötodve receptor homo [61], illetve heterodimerek [62] jöjjenek létre. A

VEGF receptorok dimeralizációját segítik elo a negyedik, az ötödik, a hatodik és a

hetedik extracelluláris, immunglobulinszeru domének is [64, 65]. A receptor dimerek

100-szor nagyobb affinitással kötik meg a VEGF-et, mint a monomerek [66].

A VEGFR1 génjérol a teljes receptor mRNS-énél rövidebb mRNS is

expresszálódhat [67]. Ez az mRNS egy, a komplett VEGFR1-nél rövidebb, szolubilis

receptort (sFlt-1) kódol. Az sFlt-1 tartalmazza VEGFR1 elso hat immunglobulinszeru

doménjét, hiányzik viszont a VEGFR1 hetedik immunglobulinszeru, a transzmembrán

és az intracelluláris tirozinkináz doménje is. Az sFlt-1 tartalmaz egy további 31

aminosav hosszú karboxi terminális véget, amit érdekes módon a VEGFR1 génjének

egy intronikus szakasza kódol [67]. Az sFlt-1 nagy affinintással (Kd ? 10-20 pM) köti a

VEGF-et, de a hiányzó tirozinkináz doménje miatt a VEGF biológiai hatásait nem

közvetíti [68]. Emiatt ezt a receptorformát a VEGF természetes antagonistájának tartják

[67].

24

A VEGF rendelkezik egy nem tirozinkináz transzmembrán receptorral, a

neutropilin-1-el (NP-1) is (5. ábra). Az NP-1 egy 140 kD nagyságú rövid

intracitoplazmatikus résszel rendelkezo receptor. Az endotélsejteken kívül számos

egyéb sejten is kimutatták a jelenlétét [69]. Az NP-1 képes specifikusan megkötni a

VEGF 165-ös izoformáját. Ezt a kötést VEGF génjének 7-es exonja által kódolt

fehérjék teszik lehetové [70]. Jelenleg az NP-1-et a VEGFR2 ko-receptorának tartják.

Az NP-1 a VEGFR2 VEGF iránti affinitását, mintegy négyszeresére növeli [71].

5. ábra: A neutropilin-1 sematikus szerkezete.

A neutopilin 5 extacelluláris (komplement C1r homológ-a1; komplement C1s homológ-a2; VIII-as

véralvadási faktor homológ-b1; V-ös véralvadási faktor homológ-b2; MAM (meprin-A5 antigen-protein-

tirozin foszfatáz ?) homológ-c), egy transzmembrán és egy intracelluláris doménnel rendelkezik. Ortega

N. és mtsai. : Front Biosci. 4: D141-D520, 1999.

Az elozoekben felsorolt receptorokon kívül a HSPG-ok egy további kis

affinitású kötohelyet jelentenek a VEGF számára. A VEGF extracelluláris

mátrix-asszociált HSPG -okhoz való bekötodése más növekedési faktorok (bFGF)

HSPG kötésboli felszabadulásához vezethet [72]. Feltételezik, hogy a HSPG-ok

egyúttal a VEGF extracelluláris raktárai is [50]. A HSPG-ok további feltételezett

szerepe a VEGF receptoraihoz való kötodésének modifikálása. Kis koncentrációban a

heparin elosegíti a VEGF humán melanoma sejtekhez való kötodését, míg nagy

koncentrációban gátolja azt [73]. A glipikán-1 - glikozil-foszfatidilinozitolhoz kötött

HSPG - elosegíti a VEGF heparináz kezelt sejtekhez való kötodését [74].

a1

a2

b1

b2 c

25

4.5. A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja

A VEGF receptorait a VEGF különbözo izoformáin kívül számos, a VEGF

családba tartozó faktor is (VEGFR1: placenta növekedési faktor 1 és 2 (PIGF-1 és 2),

VEGF-B; VEGFR2: VEGF-C és D) aktiválja [60].

Ugyan a VEGFR1 VEGF iránti affinitása jóval nagyobb, mint a VEGFR2-jé

[60], tirozinkináz aktivitása viszont csak a tizede a VEGFR2-jének [75].

A VEGFR1 intracelluláris tirozinkináz doménjén több autofoszforilációs helyet

azonosítottak (Tyr 794, 1169, 1213, 1242, 1327, 1333) [76, 77]. Ennek ellenére azonban

a receptor muködéséhez nincs feltétlen szükség a receptor foszforilációjára. A VEGFR1

tirozinkináz doménjének deléciója ugyanis nem befolyásolja a VEGF angiogenezist

serkento potenciálját [78].

A receptor 794-es és a 1169-os tirozin autofoszforilációja úgy tunik fontos

szerepet tölt be a VEGFR1 foszfolipáz C??(PLC?????protein kináz C (PKC)

szignáltranszdukciós kaszkád aktiválásában [76] (6. ábra).

A VEGFR1 aktiválása számos, az avián szarkóma vírus onkogén (Src) családhoz

tartozó molekula (Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), Yamaguchi szarkóma vírus

onkogén homológ (Yes)) foszforilációjához vezet, ennek jelentosége azonban nem

ismert [79] (6. ábra).

A VEGFR2 intracelluláris tirozinkináz doménjén is több autofoszforilációs

helyet azonosítottak (Tyr 801, 951, 996, 1054, 1059, 1175) [80, 81]. A foszforilált

VEGFR2 aktiválja a PLC?? PKC rendszert. Ebben kiemelt jelentosége van a 801-es és a

1175-ös tirozin foszforilációjának. Az aktivált PLC??aktiválja a PKC -t (elsosorban a

PKC?? t). Ezt követoen azonban, más tirozinkináz receptoroktól szokatlan módon, a

PKC?? közvetlenül aktiválja a Raf-1-et, majd az tovább aktiválja a mitogén-aktivált

protein kináz kináz (MEK) aktiválásán keresztül a mitogen-aktivált protein kináz

(MAPK) rendszert [82] (6. ábra).

Más vizsgálatok szerint a VEGFR2 foszforilációjakor a MAPK az Sch

növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2) - guanin nukleotid kicserélo faktor

(Sos) - Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1 ( Ras) - v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén

homológ (Raf) - MEK rendszeren keresztüli aktivációja is tetten érheto [83] (6. ábra).

26

A VEGFR2 foszforilációjakor beszámoltak még az Nck mediátor fehérje (Nck),

a fehérje-tirozin foszfatáz 1 és 2 (SHP-1 és SHP-2) aktiválódásáról is, ezek jelentosége

jelenleg kevéssé ismert [84].

A VEGFR2 foszforilációja aktiválja a foszfatidilinozitol 3’-kinase (PI3K) - anti-

apoptikus kinázt (Akt) rendszert is [85] (6. ábra).

Mindkét receptor foszforilációja aktiválja a fokális adhéziós kinázt (FAK) [86].

A VEGFR2 esetén a FAK foszforilációja a Grb2 és az Shc fehérjéken keresztül valósul

meg [80] (6. ábra).

6. ábra: A VEGFR1 és a VEGFR2 fobb szignáltranszdukciós útvonalai.

A VEGFR1, illetve VEGFR2 szignáltranszdukciós útvonalai. Rövidítések: fokális adhéziós kinázt (FAK),

Nck mediátor fehérje (Nck), diacilglicerol (DAG), Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), GTPáz aktíváló

fehérje (GAP), növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2), inozitol 1,4,5, -trifoszfát (IP3), mitogén-

aktivált protein kináz (MAPK), mitogén-aktivált protein kináz kináz (MEK), foszfatidilinozitol-

biszfoszfát (PIP2), fehérje kináz C (PKC), foszfolipáz C (PLC), v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén

homológ (Raf-1), Ras-GTP-áz aktivitásúfehérje 1 (Ras), schwannomin (Sch), fehérje-tirozin foszfatáz

(SHP), guanin nukleotid kicserélo faktor (Sos), Yamaguchi sarcoma vírus onkogén homológ (Yes).

Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4: D141-D520, 1999.

VEGFR1 VEGF

köto hely

Adhézió

VEGFR2

27

4.6. A VEGF biológiai hatásai

4.6.1. VEGF, VEGFR1 és VEGFR2 knock-out egerek

Egerekben a VEGF gén inaktiválása, még a heterozigótákban (VEGF +/-) is

korai, a 11-12. embrionális napon bekövetkezo elhulláshoz vezet [87]. A VEGF

heterozigóta knock-out embriók fejlodése retardált, számos fejlodési rendellenességet

mutatnak. Jelentos a szív, a nagy erek fejletlensége és a különbözo szervek érellátásának

hiánya. A erek és az érrendszer fejletlensége mellett szembetuno az egerek

idegrendszeri fejletlensége.

Homozigóta VEGFR1 knock-out egerek már az embrionális fejlodés 8-9. napján

elpusztulnak. Ezekben az állatokban az endotélsejtek kialakulása ugyan zavartalan, de a

sejtek nem formálnak er eket [88].

A VEGFR2 knock-out egerek szintén korán, a 8-9. embrionális napon

elpusztulnak. Ezekben az állatokban az érképzési zavar mellett a hematopoetikus

ossejtek zavart fejodése is kimutatható [89].

4.6.2. A VEGF hatása az erek permeabilitására

A VEGF-et eloször, mint az erek permeabilitást fokozó faktort írták le [90]. Ezt

a hatását különbözo mechanizmus ok révén fejti ki. A fokozott érpermeabilitás

közvetítésében jelentos a VEGFR2 szerepe. A VEGFR2-höz kötodni nem képes VEGF

mutáns hatására ugyanis nem fokozódik az erek permeabilitása [91].

A NO, illetve a PGI2 szerepét a VEGF érpermeabilitást fokozó hatásának

közvetítésében számos in vivo kísérlet igazolja. A ciklooxigenáz gátló indometacin,

illetve az endoteliális nitrogén-monoxid szintáz (eNOS) gátló N(G)-nitro-l-arginin metil

észter (L-NAME) hatására jelentosen csökken a VEGF indukálta érpermeabilitás [6].

A PLC? és a PKC foszforilációját, illetve az intracelluláris Ca2+ mobilizációját a

vénák VEGF indukálta permeabilitás fokozódásban tartják fontosnak [92].

A fenesztrált endotélsejtek elofordulása az élo szervezetben bizonyos szövetekre

korlátozott (vese glomerulus, gyomor-bélrendszer, endokrin szer vek, az agy bizonyos

28

területei). In vitro a VEGF hatására az erek endotéljének fenesztrációját figyelték meg a

mellékvesekéreg [93] és az agyi hajszálerek endotélsejtein [94] is.

A VEGF fokozza a nemrégiben felfedezett veziko-vakuoláris sejtorganellumok

(VVO) jelenlétét is. A VVO több, mint 100 szolofürtszeruen összekapcsolódó vezikula

által alkotott sejtorganellum (7. ábra), amely kapcsolatot létesít az endotélsejtek érlumen

felöli és az azzal ellentétes, abluminális oldala között, biztosítva ezzel a plazmafehérjék

transzportját [95].

7. ábra: Az endotélsejteket áthidaló VVO-k elektromikroszkópos képének

háromdimenziós rekonstrukciója.

Az endotélsejtek 12-14 nm-es metszeteinek elektronmikroszkópos képének háromdimenziós

rekonstrukcióján jól látszik a VVO-k (zöld) az egész sejtet áthidaló szerkezete. Lefelé az érlumen feloli

sejtfelszín, felfelé pedig az abluminális sejtfelszín (piros) látható. Dvorak AM. és mtsai.: J Histochem

Cytochem . 49: 419-432, 2001.

4.6.3. A VEGF sejtproliferációs hatásai

A VEGF sejtproliferációs hatását számos, mindkét VEGF receptoron keresztül

mediált szignáltranszdukciós út biztosítja. A VEGF hatására aktiválódó mitogen-

aktivált protein kinázok (MAPK1 és MAPK2) a c-Jun N-terminális protein kináz (JNK)

29

aktiválásán keresztül fokozzák az endotélsejtek mitózisát. A VEGF hatást az MAPK

gátló PD98059, illetve a JNK egy funkció nélküli negatív mutánssal való helyettesítése

teljesen felfüggeszti [96].

A VEGF a PLC? - PKC szignáltranszdukciós útvonalon keresztül is befolyásolja

a sejtek osztódását. A PLC ??aktiválódása a diacilglicerol (DAG), illetve az inozitol

1,4,5,-trifoszfát (IP3) képzodésén keresztül vezet a PKC? és a PKC ? aktiválódásához,

valamint az intracelluláris Ca2+ mobilizációjához. A PKC inhibitort felhasználó,

valamint az izoformaspecifikus antiszensz kísérletek igazolják a PKC? és a PKC?

központi szerepét a VEGF mitogén hatásának közvetítésében [97].

A VEGF mitogén hatásának közvetítésében fontos szer epe van a NO által

közvetített PKC ? gátlásnak is [98]. A PKC? fokozott aktivitása gátolja az endotélsejtek

proliferációját [99].

4.6.4. VEGF hatása a sejtmigrációra

A bazálmembrán degradációja fontos, eleme az endotélsejtek migrációjának és

egyúttal az angiogenezisnek is [100]. A VEGF számos ponton befolyásolja az

endotélsejtek migrációját.

Kimutatták, hogy a VEGF fokozza a kötoszöveti elemek lebontásáért felelos

metalloproteáz (MMP), a gelatináz A szintézisét [101].

A VEGF fokozza a FAK tirozin foszforilációját [85, 86]. Az aktív FAK központi

szerepet játszik a sejtek adhéziójában, az aktin filamantek szervezodésében és ezen

keresztül a sejtmigráció folyamatában [102]. A FAK aktiválását jelentosen befolyásolja

a Hsp90 jelenléte is. Hsp90 geldanamicinnel történo gátlása meggátolja a sejtek VEGF

indukálta migrációját is [103].

Egyre több az adat, melyek szerint a NO fontos szerepet játszik az endotélsejtek

VEGF indukálta migrációjában [104, 105]. Az eNOS 1177-es szerinjének Akt

dependens foszforilációja elengedhetetlen a VEGF indukálta sejtmigráció folyamatában

[106]. Másrészt a NO elosegíti a FAK foszforilációját [105].

30

4.6.5. VEGF angiogenezist befolyásoló hatásai

Az angiogenezis során a már meglévo erekbol képzodnek újabbak. A különbözo

hatásokra (hipoxia, citokinek, mechanikai stressz, stb.) aktiválódó endotélsejtek

MMP-okat termelnek. A MMP-k feloldják az erek körüli extracelluláris mátrixot, teret

engedve az endotélsejtek osztódására, vándorlására. Az angiogenezisben számos VEGF

által szabályozott folyamat (érpermeabilitás fokozódása, endotélsejt proliferáció és

migráció) vesz részt.

A VEGF angiogenezist szabályozó hatásainak fontos szerepet tulajdonítanak

mind, az embrionális fejlodésben mind, pedig a posztnatális életben (sebgyógyulás,

menstruációs ciklus, iszkémiás betegségek, tumorok) [107].

Egerekben a VEGF gén egyetlen alléljának inaktiválása is kóros érfejlodéshez és

az embrionális élet 11-12. napján halálhoz vezet [87]. A VEGF 165-ös és 189-es

izoformájának hiánya szintén az egerek korai elhullásához vezet [108]. Az egerekben

kóros érfejlodés, szívmegnagyobbodás és csökkent szívizomkontraktilitás alakul ki.

Régóta ismert, hogy a tumorok méretének növekedésével párhuzamosan no a

tumorok érdenzitása is [109]. Ezzel összhangban fokozott VEGF szintézist mutattak ki

számos humán tumorban. A VEGF hatásainak gátlása számos tumor növekedését

csökkenti. Klinikai vizsgálatok tanúsítják, hogy konzervatív antitumor terápiát humán

rekombináns anti-VEGF neutralizáló antitesttel kiegészítve mind a nem kissejtes

tüdodaganatos [110] mind, pedig a kolorektális daganatos betegek túlélése javul [111].

4.6.6. A VEGF antiapoptotikus hatása

A VEGF-nek a sejtek túlélését elosegíto hatását elsoként a retina endotélsejtjein

igazolták [10]. Ezt követoen a VEGF hasonló, a sejtek túlélését elosegíto hatását más

sejteken, így a humán vénás köldökzsinór endotélsejteken (HUVECs) [112] és vese

tubuláris epitélsejtjein is igazolták [11].

31

A VEGF a VEGFR2 foszforilációján és az azt követo PI3K aktiváción keresztül

aktiválja az Akt-ot, amely a Bcl-2 antagonista (BAD), illetve a kaszpáz-9 gátlásán

keresztül fejti ki az antiapoptotikus hatását [84, 113].

A VEGF hosszú távú antiapoptotikus hatását a Bcl-2, illetve a Bcl-2 kapcsolt

fehérje A1 szintézisének fokozásán keresztül fejti ki [10]. Ezek az antiapoptotikus

fehérjék gátolják a kaszpázok aktivációját és fokozzák az apoptózis inhibitorok (IAP)

szintézisét. A VEGF fokozza a survivin és az X-kromoszómához kötött IAP szintézisét,

amelyek gátolják a kaszpáz 3, illetve 7 muködését [114].

A VEGF fokozza a FAK és a FAK tirozinkináz 2 (Pyk2) aktivitását és a FAK

FAK asszociált fehérje, a paxillin kapcsolódását, elosegítve ezzel az endotélsejtek

túlélését [115, 116].

Mindezeken túl más szignáltranszdukciós utak is szerepet játszhatnak a VEGF

mediálta antiapoptotikus folyamatokban, így a PLC? - PKC is. Nemrégiben egy PKC

aktivátorról, a forbol misztrát acetátról mutatták ki, hogy elosegíti a HUVEC-ek

túlélését [117].

4.6.7. A VEGF hatása a nitrogén-monoxid és a prosztac iklin szintézisre

A VEGF hatására fokozódik a NO és a PGI2 szintézise, valamint sejtekbol való

felszabadulása [6, 117]. Egyúttal a NO és a PGI2 a VEGF számos biológiai hatását is

közvetíti. A NO és a PGI2 jól ismert vazodilatatív és angiogenezist fokozó hatásaik

mellett számos más protektív érhatással is rendelkeznek. Gátolják a simaizomsejtek

proliferációját [118, 119] és a trombociták aggregációját [120, 121]. Minden bizonnyal

a VEGF is rendelkezik hasonló ér -protektív hatásokkal [122].

A VEGF számos mechanizmuson keresztül befolyásolja a NO, illetve a PGI2

szintézisét, illetve azok endotélsejtekbol való felszabadulását.

Rövidtávú hatásként a VEGF fokozza az eNOS konstitutív formájának

aktivitását a PLC ??- IP3 szignáltranszdukciós útvonalon az intracelluláris Ca2+ szint

megemelésén keresztül [8].

A VEGF a Hsp90 aktiválásán keresztül az eNO S aktivitás gyors fokozódásához

vezet [123].

32

Hosszú távú hatásként a VEGF a PI3K – AKT szignáltranszdukciós útvonalon

az eNOS 1177-es szerinjének foszforilálásán keresztül fokozza az eNOS mRNS és

fehérje expresszióját [106].

A VEGF fokozza a PGI2 szintézisét a PLC? – PKC – Raf – MEK – MAPK –

PLA2 szignáltranszdukciós útvonalon [124] keresztül. A VEGF egyúttal fokozza a PGI2

endotélsejtekbol való felszabadulását is a PLC??- IP3 szignáltranszdukciós útvonalon az

intracelluláris Ca2+ szint megemelésén át [6].

4.7. A VEGF szintézisének és a vese iszkémia/reperfúziós károsodásának

kapcsolata

A vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása és az annak következtében

kialakuló akut veseelégtelenség számos gyakori kórkép (trauma, égési sérülés,

szívsebészeti beavatkozások, vesetranszplantáció) szövodményeként jelentkezhet.

A vese I/R károsodásának patomechanizmusa komplex folyamat, amelyben

központi szerepet játszanak az erek hemodinamikai változásai. A vese I/R károsodása

során az endotél sejtek megduzzadnak [125], beszukül az érlumen, és végül kialakul az

úgynevezett „no-reflow” jelenség [126]. A csökkent vesekeringés elosegíti, illetve

fenntartja a vesetubulus sejtjeinek károsodását [127, 128] is.

Bár a VEGF-et elsosorban, mint egy potens, a hipoxia által indukált

angiogenezist serkento növekedési faktort tartják számon [5], legalább ilyen fontosak

az endotélsejtek funkcióit befolyásoló hatásai is. A VEGF ismerten fokozza az

endotélsejtek NO és PGI2 szintézisét [6] ugyanakkor gátolja az endotélsejtek

apoptozisát [10] a trombusképzodést [7] a gyulladást [9] és az erek simaizom sejtjeinek

proliferációját is [8].

Korábbi in vitro vizsgálatok a hipoxia hatására fokozott VEGF mRNS, illetve

fehérje szintézist igazoltak a legkülönbözobb sejtes rendszerekben [5, 21]. Hasonlóan az

in vitro eredményekhez fokozott VEGF szintézist igazoltak a különbözo szervek I/R

károsodása kapcsán is [129, 130, 131, 132].

Meglepo módon azonban a vese akut I/R [133, 134], illetve krónikus hipoxiás

[135] károsodása kapcsán a VEGF szintézisének a korábbiaktól meroben eltéro

33

jellegérol számoltak be. Ellentétben a más szerveken tapasztaltakkal a vese I/R

károsodása kapcsán mind mRNS mind, pedig fehérje szinten a VEGF szintézis

fokozódásának teljes hiányáról számolnak be [133, 134]. Ugyanakkor az

immunhisztológiai vizsgálatok a VEGF bazolaterális elmozdulását írták le a vese

tubuláris epitélsejtjeiben [133].

A vese I/R károsodása gyakori kórkép és kezelése csak részben tekintheto

megoldottnak. Az irodalmi adatok alapján feltételezheto a VEGF jótékony szerepe az

erek és a vese tubulus sejtek integritásának megorzésében, illetve regenerálódásukban a

vese I/R károsodását követoen.

4.8. A hisztamin és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkémia/reperfúziós

károsodása során

A veseszövetek már az iszkémia idotartalma alatt is károsodnak. Az ezt követo

reperfúzió során a szöveteket oxigéndús vér árasztja el, szabadgyökök szabadulnak fel,

melyek tovább fokozzák a szövetek károsodását. A vese károsodott sejtjeibol számos

mediátor, például hisztamin szabadul fel [136].

Korábban fokozott plazma hisztamin szintet mutattak ki a vese I/R károsodása

során is [136]. Az intravénásan beadott diamin oxidáz – a hisztamin lebontásáért felelos

enzim – jelentosen csökkentette az I/R károsodás kiváltotta érpermeabilitást,

csökkentette a vese szöveti károsodását és normalizálta a vesefunkciót [136].

A hisztamin számos folyamat szabályozásában játszik szerepet. Befolyásolja a

gyulladásos folyamatokat [137], a sejtosztódást [138], és az erek permeabilitását [139].

A vesében korábban már igazolták hisztamin kettes receptorának (HR2) jelenlétét [140].

A hisztamin HR2-án keresztül csökkenti az érellenállást és fokozza a vese

vérátáramlását [140]. A hisztamin által szabályzott biológiai folyamatok számos

átfedést mutatnak a VEGF hatás aival. A VEGF egy potens érpermeabilitást fokozó

növekedési faktor, amely egyúttal az endotélsejtek számos funkcióját is befolyásolja [6,

7, 8, 9, 10]. Ismert, hogy in vitro a hisztamin HR2-án keresztül is fokozza a VEGF

34

szintézisét [141]. Ugyanakkor a hisztamin in vivo a VEGF szintézisére gyakorolt

hatásáról nincs adat.

4.9. A dehidro-epiandrosztendion és a VEGF szintézis kapcsolata a vese

iszkém ia/reperfúziós károsodása során

A dehidro-epiandrosztendiont (DHEA) a mellékvesekéreg termeli. Annak

ellenére, hogy a DHEA a legnagyobb mennyiségben termelodo szteroid hormon [142]

keveset tudunk a pontos biológiai funkcióiról.

Számos adat szól a DHEA-nak az erek állapotára kifejtett jótékony hatásáról

[143]. Epidemiológiai adatok számolnak be a plazma DHEA szint, az ateroszklerózis és

a kardiovaszkuláris megbetegedések közötti kapcsolatról [144].

DHEA gátolja a trombociták aggregációját [145] és az erek simaizomsejtjeinek

proliferációját [146]. Ugyanakkor a DHEA fokozza a vazodilatátor NO szintézisét

[147, 148] és befolyásolja az erek mikrocirkulációját [149, 150]. A DHEA által

szabályzott biológiai folyamatok számos átfedést mutatnak a VEGF erek állapotát

befolyásoló hatásaival hatásaival. A vese I/R károsodása során az erek

hemodinamikájának változása szorosan összefügg a vese tubuláris sejtek károsodásával

[125, 126]. A csökkent vérátáramlás kiválthatja, illetve súlyosbíthatja a vesetubulusok

károsodásait [127, 128].

Kimutatták a DHEA jótékony hatását az iszkémiás szív [151] és agyi [152]

károsodás kapcsán. Kevés adat van azonban a DHEA kezelésnek a vese I/R

károsodására kifejtett hatásairól [153].

4.10. A patkány VEGF izoformáinak mRNS szintu kimutatása

A VEGF az angiogenezis [60] mellett, számos biológiai folyamat

szabályozásában vesz részt. A VEGF fokozza a NO [6] és a PGI2 [6] szintézisét,

valamint gátolja a sejtek apoptózisát [10, 11] a trombusképzodést [60] és a

simaizomsejtek proliferációját [60]. Ezeken a folyamatokon keresztül a VEGF-nek

35

számos betegség, így a tumorképzodés, az iszkémiás és a gyulladásos folyamatok

patomechanizmusában is fontos szabályzó szerepe van.

A patkány VEGF génjének alternatív mRNS splicingja során (a humán VEGF

génhez hasonlóan) számos izoforma keletkezhet (VEGF120, VEGF144, VEGF164,

VEGF188, VEGF205) [12]. Ezek az izoformák biológiai hozzáférhetoségükben jelentosen

a különböznek egymástól. Míg a VEGF 120-as izoformája szabadon szec ernálódik a

sejtekbol [48], a VEGF 144-es, 164-es, 188-as és 205-ös izoformája elsosorban a

sejtekhez, illetve extracelluláris mátrixhoz (ECM) kötve fordul elo [18, 48, 49, 50].

Ugyanakkor nem ismert a különbözo izoformák szöveti eloszlása, és biológiai funkciója

közötti különbség. Az elmúlt években számos stratégiát dolgoztak ki a VEGF és az által

szabályozott folyamatok, így a tumorképzodés, tumoráttétképzodés gátlására.

Mindazonáltal a különbözo VEGF izoformák specifikus gátlása a mai napig sem

megoldott.

A VEGF biológiájának jobb megértését, illetve az egyes izoformák specifikus

gátlásának kifejlesztését, nagyban elosegítené egy olyan módszer, amely alkalmas a

VEGF izoformák egymástól elkülönült detektálása.


retinopátiájának kapcsolata

Az elmúlt évtizedekben jelentosen javultak a koraszülöttek túlélési esélyei, ezzel

együtt azonban a szövodmények száma is megnott. A fejlett országokban a

koraszülöttek retinopátiája (ROP) ma is a gyermekkorban kialakuló vakság

leggyakoribb oka.

A retina ereinek fejlodése a negyedik gesztációs hónapban indul meg [154]. A

ROP incidenciája és súlyossága fordítottan arányos a születési korral. Jelentosen

ritkábban alakul ki ROP a 32 hét után született újszülöttekben [155].

A retinális erek fejlodésében több más citokin mellett központi szerepe van a

VEGF-nek, amely egy hipoxia indukálta növekedési faktor [156]. A retina erei

növekedésük során mindig a fokozott oxigénigényu, relatív hipoxiás területek felé

haladnak. A születést követoen a relatív hipoxiás intrauterin környezet a hirtelen

36

megváltozik. Ilyenkor a szükségesnél több oxigén jut a retina ereibe. Ennek hatására

csökken a VEGF lokális szintje, a retina erei összehúzódnak, sot akár el is záródhatnak.

Az ekkor kialakuló érkárosodást tovább fokozzák a hirtelen kialakult hiperoxia miatt

képzodött reaktív oxigéngyökök. Az erek fejlodése megáll. Az így kialakult érkárosodás

következtében az ismét hipoxiássá váló retinában fokozódik a VEGF szintézise, az

ekkor beinduló érképzodés azonban már rendellenes erek kialakulásához és

hegképzodéshez vezet. Ez a késobbiekben a retina leválását és vakságot okozhat [156].

Mindezen folyamatokat és így a ROP kialakulását genetikai faktorok is

befolyásolják. Ezt bizonyítja az a tény is, miszerint az afro-amerikaiak között jelentosen

ritkábban alakul ki ROP [157].

Vizsgálatok igazolják, hogy a VEGF gén egy-egy nukleotidját érinto

polimorfizmusai (SNP) befolyásolják a VEGF szintézisét [158, 159]. A VEGF

funkcionális, a VEGF szintézisét befolyásoló SNP-inek vizsgálata hasznos lehet a

koraszülött ek ROP kockázatának becslésében.

37

5. CÉLKITUZÉSEK

Kísérleteink során vizsgálatuk a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

(VEGF) szintézisét a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása során, felállítottunk

egy a patkány VEGF izoformáinak detektálására alkalmas real time RT -PCR rendszert,

illetve vizsgáltuk a VEGF gén promoter genetikai polimorfizmusainak, a kis születési

súlyú koraszülöttek retinopátiájának kockázatával való kapcsolatát.

5.1. A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkém ia/reperfúziós patkánymodellben

1. Kimutatható-e VEGF szintézisének mRNS, illetve fehérje szintu változása a vese

I/R károsodás során?

2. Változik-e a VEGF immunhisztológiai lokalizációja a I/R károsodás során?

3. Hogyan változik az interleukin 1? (IL-1??, illetve az interleukin 6 (IL-6) szintézise

a vese I/R károsodás során?

5.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelés

hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós

patkánymodellben

4. Befolyásolja-e a hisztamin, illetve a ranitidin kezelés a patkányok vese I/R

károsodását, követo túlélését?


károsodása során a VEGF, illetve az IL-6 mRNS szintézisét?


károsodása során a VEGF fehérje szintézisét?

38

5.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF

szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben

7. Befolyásolja-e a dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelés a patkányok vese I/R

károsodását, követo túlélését?

8. Befolyásolja-e a DHEA kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF, az

IL-1? és az IL-6 mRNS szintézisét?

9. Befolyásolja-e a DHEA kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF

fehérje szintézisét ?


10. Kialakítható-e olyan real time RT-PCR rendszer, amely alkalmas a különbözo

VEGF izoformák detektálására?

11. Kimutatható-e a patkány szövetekben, a humán mintákban leírt 205-ös VEGF

izoforma?


retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata

12. Van-e kapcsolat a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátia kockázata és a VEGF

gén T-460C, illetve G+405C genetikai polimorfizmusai között?

39

6. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

6.1. In vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek

6.1.1. A kísérletek során felhasznált állatok

Kísérleteink során ivarérett, hím Wistar patkányokat használtunk. A patkányokat

állandó 21°C homérsékleten, 75%-os páratartalom és 12 óránként váltakozó (világos-

sötét) megvilágítás mellett tartottuk. Az állatok szabadon fogyaszthattak rágcsáló tápot

(Ssniff, ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Németország), illetve vizet.

6.1.2. Mutéti beavatkozás

A mutéti beavatkozást intraperitoneális pentobarbitál (50 mg/ttkg, Nembutal,

Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) anesztéziában végeztük. A mutét, illetve az

azt követo ébredés alatt az állatok rektális homérsékletét 37? 0,5°C-on tartottuk. A mutét

során median laparotomiát követoen kipreparáltuk a bal veseereket (a. és v. renalis),

majd a vesét egy atraumatikus mikrovaszkuláris ércsipesszel (Rudolf GmbH

Medizintechnik, Fridingen, Németország) 50 (hisztamin és ranitidin kezelt hím Wistar

patkányok és a hozzájuk tartozó kezeletlen kontroll patkányok), illetve 55 (kezeletlen

hím Wistar, valamint dehidro-epiandrosztendion (DHEA) és propilén-glikol (PG) kezelt

patkányok) percre kirekesztettük a keringésbol. Az iszkémiás periódus alatt az állatok

hasfalát a túlzott folyadékveszteség elkerülése érdekében átmenetileg zártuk. Az

iszkémiás periódus vége elott eltávolítottuk az állatok jobb veséjét. Ezután a bal

veseerekrol eltávolítottuk az ércsipeszt és zártuk a hasfalat. Mutéti kontrollként altatott,

jobboldali nefrektómizált, de intakt, nem iszkemizált bal oldali veséju (áloperált) állatok

szolgáltak. Az állatokat a teljes ébredésig obszerváltuk, majd a ketreceikbe helyeztük

oket vissza.

Vizsgáltuk a megmutött állatok vese iszkémiát követo túlélését. Az állatok

túlélését, a mutétet követo egy hétig követtük figyelemmel, mivel korábbi kísérletes

40

tapasztalataink szerint az elso hét után még élo állatok között további elhullás nem

várható. A továbbiakban vizsgáltuk az iszkemiát követo reperfúzió 2., 16., illetve 24.

órájában (T2, T1 6, illetve T24), illetve az áloperált, nem iszkemizált (T0) állatokból vett

szérum, illetve a veseminták, molekulárbiológiai és hisztológiai elváltozásait.

6.1.3. Kezelési protokollok

Kezeletlen állatokat használtunk a VEGF és a vese I/R károsodás alapveto

kapcsolatainak vizsgálatához. Szintén kezeletlen állatokat használtunk a hisztamin,

illetve ranitidin kezelt állatok kezelési kontrolljaként. Az állatok fennmaradó csoportjait

hisztaminnal, ranitidinnel, dehidro-epiandrosztendionnal (DHEA), illetve

propilén-glikollal (PG) kezeltük.

Hisztamin kezelés: az állatokat a mutét elott egy héttel kezdtük el kezelni, napi 4

mg/ttkg hisztamin (ICN Pharmaceuticals Inc., CA, USA) szubkután adásával. A

kezelést az egész kísérlet során fenntartottuk. Kontrollként kezeletlen állatok szolgáltak.

Ranitidin kezelés: az állatokat a mutét elott egy héttel kezdtük kezelni, napi

4 mg/ttkg rantitidin (ICN Pharmaceuticals Inc., CA, USA) per os adásával (ivóvízben

oldva). A kezelést az egész kísérlet során fenntartottuk. A kezelés kontrolljaként

kezeletlen állatok szolgáltak.

DHEA kezelés: az állatok kezelését Lohman és munkatársai által leírtak alapján

végeztük [149]. Az állatok kezelését a mutéti beavatkozás elott egy nappal kezdtük meg

és a kísérlet végéig fenntartottuk. Az állatok szubkután injekció formájában napi

4 mg/ttkg DHEA-t kaptak, 0,1 ml PG-ban feloldva (mindketto: Sigma Chemical Co.,

MO, USA). A kezelés kontrolljaként PG kezelt állatok szolgáltak.

6.1.4. Szérum kreatinin és karbamid meghatározás

41

A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának meghatározását Hitachi

717-es automata spektrofotométeren végeztük el (F. Hoffmann-la Roche Ltd, Basel,

Svájc).

6.1.5. A veseszövetek hisztológia vizsgálata

A vesedarabokat formalinban fixáltuk (4%, pH=7.4). A mintákat paraffinba

ágyazás és metszés után hematoxilin-eozinnal festettük meg. A metszetek

fénymikroszkópos vizsgálata során a tubuláris, glomeruláris és interstitiális

elváltozásokat 0-tól 3-ig pontoztuk (0 = nincs elváltozás, 1 = enyhe fokú elváltozás,

2 = közepes fokú elváltozás, 3 = súlyos fokú elváltozás).

A többi kísérlettol eltéroen a hisztaminnal és ranitidinnel kezelt, illetve az azok kezelési

kontrolljául szolgáló kezeletlen állatok veséinek tubuláris károsodását 0-4-ig terjedo

skálán pontoztuk (0 = nincs tubuláris károdsodás, 1 = a tubulusok <25%-a károsodott,

2 = a tubulusok 26-50%-a károsodott, 3 = a tubulusok 51-75%-a károsodott, 4= a

tubulusok >75%-a károsodott).

6.1.6. Hisztamin ELISA

A szérum hisztamin szintet ELISA teszttel, a gyártó protokollja szerint

határoztuk meg (IBL, Hamburg, Németország). A méréseket duplikátumban végeztük.

Az ELISA kit adatai: szenzitivitás: 0,25 ng/ml; intraassay variáció: 4,7-11%; interassay

variáció: 11,1-12,2%

6.1.7. DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát radioimmunoassay

A patkányok szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát (DHEA-S)

szintjeit direkt radioimmunoassay (RIA) teszttel határoztuk meg. Az intra- és interassay

42

variációs koefficiens a DHEA meghatározásnál 7,2%, illetve 11,3% míg a DHEA-S

esetében 7,8%, illetve 10,5% volt [160].

6.1.8. Szemikvantitatív és kompetitív RT-PCR mérések

6.1.8.1. RNS izolálás

A veseszöveteket feldolgozásig -80°C-on, lízispufferben tároltuk. Az RNS-t a

Qiagen protokollja alapján az RNeasy? Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden,

Németország) segítségével izoláltuk. A kinyert RNS mennyiségét és minoségét

fotometrálással határoztuk meg. Az RNS mintákat felhasználásig -80°C-on tároltuk.

6.1.8.2. Komplementer DNS szintézis

A reverz transzkripció (RT) során 1 ? g RNS-t konvertáltunk komplementer

DNS-sé (cDNS) 20 ? l reakció végtérfogatban, 200 U SuperScript II? RNase H - reverz

transzkriptáz, 40 U RNaseOUT ? inhibitor és 0,5 ? g oligo dT12-18 primer jelenlétében

(Gibco/BRL, Eggenstein, Németország). A reakcióelegyet 20°C-on 10 percig, majd

42°C-on 45 percig és végül 99°C-on 5 percig inkubáltuk, majd 4°C-ra lehutöttük és

felhasználásig -20°C-on tároltuk.

6.1.8.3. Szemikvantitatív PCR (patkány GAPDH, IL-1???IL-6, VEGF)

A szemikvantitatív PCR-eket 50 ? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM

MgCl2, 0,2 mM dezoxi nukleotid trifoszfát (dNTP), 0,4-0,4 ? M primer (sense és

antisense primerek), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL, Eggenstein,

Németország)] reakcióelegyben végeztük 2 ?l cDNS felhasználásával.

A patkány specifikus IL-1?, illetve VEGF mRNS szekvenciákat az NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nukleotid adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével

választottuk ki (NCBI: 1IL-1??- E01884 és VEGF - AF215725). A primerek

tervezéséhez a Primer3? (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/ primer3.cgi;

43

Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for Biomedical

Research), illetve a DNAStar? (DNASTAR, Inc., Madison, USA) szoftvereket

használtuk. A patkány specifikus VEGF primereket a különbözo izoformák közös

szakaszára (1.-5. exon) illesztettük, ezért azok az össz VEGF mRNS mennyiségének

mérésére alkalmasak. A patkány glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) és

IL-6 specifikus primereket Strehlau J. és munkatársaitól [161], illetve Volk HD. és

munkatársaitól [162] vettük át. A PCR-ek során alkalmazott primerek adatait

táblázatban foglaltuk össze (1. táblázat).

1. táblázat: A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek adatai.

Gén Primerek Annealing Termékhossz

VEGF Sense: 5’- gtg cac tgg acc ctg gct tta c -3’

Antisense: 5’ - ttt tct ggc ttt gtt cta tct ttc -3’ 56 oC 398 bp

IL-6 Sense: 5’- ctt cca gcc agt tgc ctt ct -3’

Antisense: 5’ - tcc cga cca ttg ctg ttt cc -3’ 66 oC 496 bp

IL-1? Sense: 5’- gca ctg cag gct tcg aga tga –3’

Antisense: 5’ - ggt ggg tgt gcc gtc t t t ca -3’ 57 oC 220bp

GAPDH Sense: 5’- ggt gaa ggt cgg agt caa cg -3’

Antisense: 5’ - caa agt tgt cat gga tga cc -3’ 55 oC 496 bp

A táblázat a szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek optimális annealing hojét és a PCR során

keletkezo termékek hosszadatait mutatja be.

A PCR-okat a primerekre jellemzo annealing homérséklet kivételével azonos

körülmények között vitt ük véghez. A kezdeti 5 perces 94°C-on végzett denaturáció

után a cDNS templátokat 35 cikluson [94°C, 15 mp (denaturáció), 55oC (GAPDH )

56°C (VEGF), 57°C (IL-1????66oC (IL-6) 30 mp (annealing), 72°C 30 mp (extenzió)]

keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72°C-on történo inkubáció során

tettük teljessé az extenziót.

44

PCR vizsgálatainkat minden esetben duplikátumban, pozitív és negatív kontrollok

felhasználásával végeztük. A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker

(Ready-Load? , Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával kontrolláltuk.

45

6.1.8.4. Kompetitív patkány VEGF specifikus PCR tervezése

A patkány specifikus kompetitív PCR rendszerünket az NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nukleotid adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével,

a kódoló szekvenciák alapján terveztük meg. A kompetitív VEGF PCR rendszer

tervezéséhez felhasznált forrás: Rattus Norvegicus VEGF188 mRNS (NCBI

AF215725). A primerek tervezéséhez a Primer3? (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer/ primer3.cgi; Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead

Institute for Biomedical Research) szoftvert használtuk.

Kompetitív PCR rendszerünk tervezésénél a következo alapelveket követtük: 1) a

primereket és a kompetitort az elso 5, minden VEGF izoformában közös szakaszra

terveztük; 2) a kvantifikálásra kerülo PCR termék, és a kompetitor hossza közti

különbség (két termék hosszának ˜ 10%-a (40-60 bp) legyen elegendo a termékek

agaróz gélen való futtatás a utáni, hossz alapján való elkülönítéséhez.

Kompetitor unk tervezése során a kvantifikálandó cDNS szakaszra a tervezett

sense vagy antisense primerektol upstream irányban terveztünk egy harmadik primert,

mely PCR rendszerünkkel kompatibilis (primer olvadási ho, primer-termék olvadási ho

különbsége, optimális annealing homérséklet) (8. ábra).

8. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR rendszer kialakítása során

felhasznált primerek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésének sematikus ábrája.

Az ábrán patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompetitor kialakít ásához tervezett két primerpár

sematikus, egymáshoz képesti elhelyezkedését mutatjuk be. A piros, kék, illetve a zöld színu téglalapok a

primer párok egyes tagjait jelölik. A VEGF gén kódoló szakaszának piros, kék, illetve a zöld csíkos

területei a (piros kék, zöld) primerekkel komplementer szakaszoknak felelnek meg.

24 bázis

20 bázis

A VEGF gén kódoló szakasza

A VEGF gén kódoló szakasza

330 bázis

22 bázis

398 bázis

68 bázis

46

Kompetitorunk ezek után az a PCR termék lett, melyet a harmadik primer, és a hozzá

közel eso primer fúziójával eloállított primerrel (42 bp hosszúságú oligo) és az

ellenoldali primer rel elvégzett PCR során kaptunk (9. ábra).

9. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompetitor

felépítésének sematikus ábrája.

Az ábrán patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompetitor eloállításának sémáját mutatjuk be. A

piros, kék, illetve a zöld színu téglalapok a primer párok egyes tagjait jelölik. A VEGF gén kódoló

szakaszának piros, kék, illetve a zöld csíkos területei a hozzájuk tartozó (piros kék, zöld) primerekkel

komplementer szakaszoknak felelnek meg.

A PCR reakció során nyert PCR terméket (kompetitor) Low Melting Gel? (ICN

Pharmaceuticals Inc., CA, USA) agaróz gélben elektroforetikusan szeparáltuk. A gélbol

QIAquick? (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) extrakciós kittel izoláltuk a

felszaporított terméket. Az így kitisztított kompetitort spektrofotometriás módszerrel

kvantifikáltuk.

6.1.8.5. Kompetitív patkány specifikus PCR-ek (GAPDH, IL-6 és VEGF)

A VEGF kompetitív mesterséges templátot az elozoekben leírtak szerint állítottuk

elo. A kompetitív IL-6 és GAPDH PCR-ekhez a mesterséges templátot Dr. Volk HD.

[162], illetve Dr. Strehlau J. [161] szívességébol kaptuk. A PCR-ek során alkalmazott

primerek azonosak a szemikvantitatív PCR-ek során alkalmazottakkal (1. táblázat). A

kompetitív PCR-ek során keletkezo vad, illetve mesterséges termékek (a kompetitornak

megfelelo) hosszadatait a második táblázatban foglaltuk össze (2. táblázat).

A VEGF gén kodoló szakasza

47

2. táblázat: A kompetitív PCR termékek hosszadatai.

Gén Termékhossz – cDNS Termékhossz - kompetitor

VEGF 398 bp 352 bp

IL-6 496 bp 379 bp GAPDH 496 bp 442 bp

A táblázat a kompetitív PCR-ek során keletkezo termékek hosszadatait mutatja be.

A kompetitív PCR-eket 50 ? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM MgCl2, 0,2

mM dNTP, 0,4 ? M primer (mindkét primer esetén), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz

(Gibco/BRL, Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük 1-1 ?l kompetitor,

illetve vad cDNS templát felhasználásával.

Mindhárom reakciót, a primerekre specifikusan jellemzo annealing homérséklet

kivételével, azonos paraméterekkel optimalizáltuk: Kezdeti 5 perces 94°C-on végzett

denaturáció után a templátokat 35 cikluson [94°C, 15 mp (denaturáció), 55 oC

(GAPDH) 56°C (VEGF), 66oC (IL-6) 30 mp (annealing), 72°C 30 mp (extenzió)]

keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72°C-on történo inkubáció során

tettük teljessé az extenziót.

PCR vizsgálatainkat minden esetben pozitív és negatív kontrollok

felhasználásával ellenoriztük. A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker

(Ready-Load? , Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával kontrolláltuk.

6.1.8.6. A szemikvantitatív és a kompetitív PCR-ek értékelése

Mind a szemikvantitatív, mind a kvantitatív PCR-ek eredményeit a Gel-Pro™

szoftver (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) segítségével denzitometráltuk és

értékeltük.

48

6.1.9. A patkány vesék szöveti VEGF szintjének meghatározása Western blottal

6.1.9.1. Minta elokészítés

A vesemintáinkhoz lízis puffert [10 mM TRIS-HCl (1 M) pH=8.0, 10 ? g/ml

leupeptin, 0,5 mM EGTA (0,5 M), 2% Na-ortovanadát, 2% NaF, 1% Triton-X 100,

25 mM PMSF (fenil-metil-szulfonil fluorid)] adtunk. A szövetmintákat jégen

homogenizáltuk. A homogenizátumot centrifugáltuk (13000 RPM, 5 perc). A felülúszó

összfehérje koncentrációját spektrofotometriás módszerrel, Bradford szerint határoztuk

meg. A minták fehérje-koncentrációját 1 mg/ml-re állítottuk be. A mintákat

felhasználásig -80°C-on tároltuk.

6.1.9.2. Western blot kontrollok

Technikai kontrollként a Santa Cruz Biotechnology Western blot pozitív

kontrollját (sc-4045 WB, Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA), illetve ismerten

VEGF pozitív patkány (Wistar) szívizomszövetet használtunk. Ismerten VEGF negatív

szövet hiányában negatív kontrollunk nem volt.

6.1.9.3. Antitestek

Primer, patkány VEGF specifikus ellenanyagként monoklonális ellenanyagot

használtuk (VEGF(C-1), mouse monoclonal IgG 2a, Santa Cruz Biothechnology Inc.,

CA, USA). Az IgG2a alosztályba tartozó monoklonális antitest a human VEGF elso 140

aminosavára specifikus.

A másodlagos antitestként torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-mouse IgG

antitest (Sigma Chemical Co., MO, USA) használtunk.

49

6.1.9.4. SDS-PAGE

A mintákhoz treatment puffert [30% glic erol, 20% merkapto-etanol, 0,7 M SDS,

0,25 M Tris-HCl pH=6,8] adtunk, majd a mintákat 3 perc forralással denaturáltuk.

A 12,5%-os SDS-poliakrilamid gél zsebeibe denaturált, 15-15 ?g összfehérjének

megfelelo mennyiséget vittünk fel. Koncentráló gélként 4%-os SDS-poliakrilamidot

használtunk. Mintáink mellé molekulasúly markert (BenchMarkTM, Gibco/BRL,

Eggenstein, Németország) és pozitív kontrollt vittünk fel.

Az elektroforézist 2 órán keresztül 120 V-on 20 mA-rel végeztük, hutött

rendszerben.

6.1.9.5. Blottolás

A szeparált fehérjéket az SDS-poliakrilamid gélrol a nitrocellulóz membránra

(HybondTM ECLTM, AP Biotech, Buckinghamshire,UK) blottoltuk át (70 V, 220 mA,

80 perc), TRIS-HCl, glicin és metanol tartalmú standard transzfer pufferben, hutött

rendszerben. A fehérjetranszfer sikerességét 1% Ponceau S (Sigma Chemical Co., MO,

USA) és 25% ecetsav (Reanal, Budapest, Magyarország) tartalmú festékkel

ellenoriztük.

6.1.9.6. Immunoblotting

Az immunoblottinghoz szükséges ellenanyag koncentrációkat elozetesen dot-blot

technikával határoztuk meg.

A blotmembránt szobahomérsékleten, 1 órán keresztül blokkoló oldatban (5%

zsírmentes tejpor, 10% PBS puffer) inkubáltuk. Blokkolás után a membránt további 1

órán keresztül az elso, VEGF specifikus ellenanyaggal (0,4 ? g/? l koncentrációban)

inkubáltuk szobahomérsékleten mosó oldatban (1% zsírmentes tejpor, 0,1%

Tween™20 detergens, 10% PBS puffer).

50

Mosások után (3 x 10 perc) a második, HRP jelölt ellenanyaggal, 0,2 ? g/?l

koncentrációt alkalmazva 30 percig inkubáltuk a blotmembránt, majd további

mosásokkal (3 x 20 perc) távolítottuk el az ellenanyag feleslegét.

6.1.9.7. Az immunoreaktív helyek detektálása

Az immunoreaktiv helyek kemilumineszcens szignálját Amersham Pharmacia

protokoll szerint ECLplus reagenssel, Hyperfilm ECL™-en (AP Biotech,

Buckinghamshire, UK) detektáltuk. A Western blot-ok eredményeit a Gel-Pro™

szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) denzitometráltuk.

6.1.10. Immunhisztológia

Az immunhisztológiai vizsgálatokat formalinban (4%, pH=7,4) fixált, majd

paraffinba ágyazott mintákon végeztük. A fixációs ido egy hét volt.

A mintákat xylolban (2 x 20 perc), majd etil-alkoholban (10-10 perc ˜ 100%, 90%,

70%, 50%, 30%-os etanolban) deparaffináltuk. A deparaffinálást, majd desztillált vizes

mosást követoen a mintákat tris-pufferben (TBS, pH=8,0) 7 percig, 600 W-on

mikrohullámú sütobe helyeztük. A mintákat lehulésüket követoen 10 percig 0,03%

hidrogén peroxid oldatban mostuk.

Ezután foszfátpufferben (PBS) (Sigma Chemical Co., MO, USA) történo mosás

után (5 perc) a mintákat 3% tejport tartalmazó PBS-ben (Sigma Chemical Co., MO,

USA) blokkoltuk fél óráig, szobahomérsékleten.

Újabb PBS -ben történo mosás után a mintákat 1 órán át inkubáltuk az

elsodleges, VEGF elleni monoklonális antitest (VEGF(C-1), mouse monoclonal IgG2a,

Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA) és 1,5% tejport tartalmazó PBS 1:50 arányú

keverékében.

Majd újabb PBS-es mosás (3 x 5 percig) után a mintákat szobahomérsékleten,

fél óráig inkubáltuk a másodlagos ellenanyag (DAKO, CA, USA) és 1,5% tejport

tartalmazó PBS 1:2000 arányú keverékében.

51

A mintákat (3 x 5 perc PBS-ben) mosás után a DAB oldószer és DAB 1:50-es

hígításában 5 percig inkubáltuk. Ezt követoen a mintákat desztillált vizes mosás után

hematoxilinnal festettük meg (Mayers’s Lillie’s Modification, DAKO, CA, USA). A

metszeteket Vecta Mount mounting médiummal (Vector Laboratories Inc., CA, USA)

fedtük.

6.1.11. Az in vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek statisztikai analízise

Az állatok túlélésének statisztikai analíziséhez Kaplan-Mayer analízist

(Log-rank test) használtunk (Statistica, StatSoft, OK, USA).A western blot, a

szemikvantitatív, a kompetitív RT-PCR és az ELISA és RIA, valamint a szérum

kreatinin, karbamid mérések eredményeinek statisztikai analíziséhez ANOVA-t

használtunk (Statistica, StatSoft, OK, USA). A hisztológiai adatok elemzéséhez

Kruskal-Wallis, majd Mann-Whitney U tesztet végeztünk (Statistica, StatSoft, OK,

USA). A Mann-Whitney U teszt eredményeit Holm modszere szerint értékeltük. Az

adatokat akkor tekintettük szignifikánsnak, ha p értéke kisebb volt, mint 0,05.

6.2. A patkány VEGF izoformáinak mRNS szintu kimutatása real time RT-PCR-

fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével

6.2.1. A VEGF különbözo izoformáinak detektálásához használt real time RT-PCR

rendszer tervezése során felmerülo megfontolások

A VEGF gén kódoló szakaszának, a VEGF 205-ös izoformájára specifikus 6b

exon kivételével, nincsenek a különbözo izoformákra specifikusak exonjai (10. ábra).

Ugyanakkor, minden izoformában található csak az adott izoformára jellemzo exon-

exon határ. Ezért a VEGF izoformáinak detektálására egyetlen lehetoség van: a PCR

során felhasznált primer párok egyik tagjának a VEGF gén elso 5 exonján (minden

izoformában jelen lévo szakasz) kell elhelyezkedni, míg a másiknak az egyes

izoformákra specifikus exon-exon határokon (piros kapoccsal jelölve). Ez alól csak a

52

VEGF 205-ös izoformája kivétel, ahol a hatos exont (E6a) követo intronikus szakasz

válik kódoló szakasszá az mRNS alternatív splicingja során (E6b). Ennek bizonyítéka

azonban csak humán mintákban ismert.

10. ábra: A patkány VEGF izoformáinak szerkezete.

A különbözo patkány VEGF izoformák a gén exonjainak alternatív splicingja során jönnek létre. A 6b

exon pat kány szövetekben való megléte nem bizonyított , ennek létezését a patkány és a humán gén

szerkezetének összehasonlítása után valószínusítettük .

További nehézséget jelent, hogy az egyes izoformákra specifikus primer párok

exon-exon határokra tervezett tagjai (piros kapocs) a PCR során beköthetnek az exon-

exon határt alkotó, azonban más izoformákban is eloforduló exonokra (zöld és

narancssárga) anélkül, hogy az adott exonok egymás mellett helyezkednének el (11.

ábra).

E1-E5 E8 VEGF120


E1-E5 E7 E8 VEGF164


E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF205

53

11. ábra: Az ábra a VEGF 120-as izoformáján keresztül mutatja be a VEGF

izoformákra specifikus primerek aspecifikus bekötodésének lehetoségeit.

Az ábra a VEGF 120-as izoformára specifikus primeren (piros) keresztül mutatja be a VEGF izoformákra

specifikus primerek más izoformákon való lehetséges kötodéseit (zöld és narancssárga). Jól látható, hogy

a VEGF 120-as izoformájára specifikus primer (piros), minden más izoformán is rendelkezik olyan

kötohellyel (zöld), amely a termék hossza alapján nem különítheto el. Bár elméletben a primerek

narancssárgával jelölt cDNS-hez való bekötodése nem eredményezhet PCR terméket a gyakorlat, mégis

ennek az ellenkezojét bizonyította.

Az így keletkezo az adott izoformára aspecifikus PCR termékek nem különíthetok el a

termékhossz alapján a helyestol. Ezért az egyes izoformákra valóban specifikus PCR

reakciók beállításához elengedhetetlen a megfelelo kontrollok biztosítása. Erre a célra

két rekonbináns DNS molekulát állítottunk elo. Mindketto tartalmazza a minden VEGF

izoformára, illetve a VEGF 205-ös izoformájára jellemzo DNS szakaszokat (elso öt,

illetve a 6b exon). Ezen DNS szakaszok mellett az egyik rekombináns molekula a

VEGF 120-as és a 188-as izoformájára specifikus, míg a másik a VEGF 144-es és a

164-es izoformájára jellemzo exon-exon határokat tartalmazza (12. ábra).

E1-E5 E8 VEGF120


E1-E5 E7 E8 VEGF164


E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF205

54

12. ábra: A rekombináns DNS molekulák sematikus ábrája, valamint azok

nukleotidsorrendje.

VEGFK/120/188/205

GTGCACTGGACCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACGACAGAAGGGGAGCAGAAAGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTACCAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAATGCGGTGTGCGGGCTGCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACGTCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCTCACCAAAGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGGCCAGAAAAATGTGACAAGCCAAGGCGGTGACCTGGAGCGTTCACTGTGAGCCTTGTTCAGAGCGGAGGTACGTTGGTGCCGCTGCTGTCTAATTCCTTGGAG

VEGFK/144/164/205

GTGCACTGGACCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACGACAGAAGGGGAGCAGAAAGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTACCAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAATGCGGTGTGCGGGCTGCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACGTCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCTCACCAAAGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCAAGGCGGTGAGCCAGAAAATCACTGTGAGCCTTGTTCAGAGCGGAGGTACGTTGGTGCCGCTGCTGTCTAATTCCTTGGAG

A képen a VEGF izoformaspecifikus real time RT-PCR-ek beállításhoz, illetve kvantifikálásához

szükséges két rekombináns DNS molekula sematikus ábráját , valamint azok nukleotidsorrendjét

ábrázolt uk. Az 5-ös és a 6a exon egymás mellett fekvo szakaszait (E 5, E 6a) narancssárga a 7-es és 8-as

exonét (E 7, E8) zöld a 6b exont (E 6b) pedig piros szín jelöli.

Az így megépített két rekombináns DNS molekula egyúttal egymás negatív

kontrolljául is szolgálnak a real time RT-PCR-ek beállítása során, lehetové téve az

aspecifikus kötések kiküszöbölését. A PCR nem tökéletes beállítása esetén ugyanis az

a VEGF minden izoformában közös szakasza E 6b E 5 E 8 E 6a E 7

a VEGF minden izoformában közös szakasza E 6b E 6a E 8 E 5 E 7

55

egyik rekombináns DNS molekulán specifikus kötohellyel rendelkezo primer a másik

rekombináns DNS molekulához is beköthet (ahogy azt a 9. ábrán a VEGF 121-es

izoformára specifikus primer kapcsán is bemutattuk) aspecifikus termékeket hozva létre.

A rekombináns molekulák mindezen túl lehetové teszik a real time RT-PCR-ek

kvantifikálását is.

6.2.2. Rekombináns DNS molekulák eloállítása

A rekombináns DNS molekuláknak a minden VEGF izoformában eloforduló

szakaszát patkány vesemintából eloállított cDNS-bol amplifikáltuk fel PCR során. A

PCR-t 50 ? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP,

0,4-0,4 ? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz (Invitrogen, CA, USA)]

reakcióelegyben végeztük 2 ? l cDNS felhasználásával. A PCR során alkalmazott

primerek a következok voltak: sense: 5’- gtg cac tgg acc ctg gct tta c -3’ és antisense:

5’- ttt tct ggc ttt gtt cta tct ttc -3’. A PCR-t a kezdeti 5 perces 94°C-on végzett

denaturáció után a 35 cikluson [94°C, 15 mp (denaturáció), 56°C, 30 mp (annealing),

72°C, 30 mp (extenzió)] keresztül végeztük, végül egy 20 percig tartó 72°C-on történo

inkubáció során tettük teljessé az ext enziót.

A rekombináns DNS molekuláknak a VEGF izoformákra specifikus

szakaszának megfelelo, egyszálú DNS szakaszokat a VBC Genomics-tól rendeltük meg

(VBC Genomics, Bécs, Ausztria). A szimpla szálú DNS molekulákat PCR reakció

során tettük duplaszálúvá. A PCR-t 50 ?l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM

MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,4-0,4 ? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz

(Invitrogen, CA, USA)] reakcióelegyben végeztük 10 pmol egyszálú DNS szakasz

felhasználásával. A PCR során alkalmazott primerek a következok voltak: sense: 5’- ctg

cag gcc aga aaa atg tga caa gc -3’ és antisense: 5’- ctc caa gga att aga cag cag cgg c-3’.

A PCR-t a kezdeti 5 perces 94°C-on végzett denaturáció után a 35 cikluson [94°C, 15

mp (denaturáció), 61°C, 20 mp (annealing), 72°C, 30 mp (extenzió)] keresztül

végeztük, végül egy 20 percig tartó 72°C-on történo inkubáció során tettük teljessé az

extenziót.

56

Ezután mindkét szakaszt (minden VEGF izoformában eloforduló, illetve az

egyes izoformákra specifikus DNS) 37°C-on egy teljes éjszakán át Pst I-el (Sigma

Chemical Co., MO, USA) emésztettük. Így a DNS szakaszok megfelelo egymás felé

nézo részein ragadós végek alakultak ki. Az emésztett termékeket 2%-os agaróz gélbol

tisztítottuk vissza (Qiagen GmbH, Hilden, Németország).

A két (rekombináns molekulánként) így kitisztított ragadós véggel rendelkezo

DNS szakaszt T4DNA ligázzal (Invitrogen, CA, USA) egyesítettük (25C°, 60 perc).

Majd PCR-val felsokszoroztuk. A PCR-t 50 ?l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2

mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,4-0,4 ? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz

(Invitrogen, CA, USA)] reakcióelegyben végeztük 2 ? l DNS felhasználásával. A PCR

során alkalmazott primerek a következok voltak: sense: 5’- gtg cac tgg acc ctg gct tta c -

3’ és antisense: 5’- ctc caa gga att aga cag cag cg-3’. A PCR-t a kezdeti 5 perces 94°C-

on végzett denaturáció után a 35 cikluson [94°C, 15 mp (denaturáció), 58°C, 20 mp

(annealing), 72°C, 30 mp (extenzió)] keresztül végeztük, végül egy 20 percig tartó

72°C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót.

6.2.3. A rekombináns DNS molekulák klónozása

A felszaporított PCR temékeket (a két rekombináns DNS molekulát) TOPO TA

Cloning Kit (Invitrogen, CA, USA) segítségével klónoztuk. A rekombináns DNS-eket

tartalmazó plazmidokat kompetens E. coli-ba (Invitrogen, CA, USA) transzfektáltuk. A

baktériumokat 100mg/ml Ampicillint (Bristol Myer, New York, USA) tartalmazó

szilárd LB-agaron (Invitrogen, CA, USA) tenyésztettük (37°C, 24 óra), majd

klónonként felvettük oket. A klónokat további 24 órán keresztül 100mg/ml ampicillint

(Bristol Myer, New York, USA) tartalmazó folyékony LB tápoldatban szaporítottuk el.

Ezután a klónokból plazmidot izoláltunk (Invitrogen, CA, USA), majd szekvenáltuk

azokat (ABI310-es automata szekvenátor-BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit

((Applied Biosystems, CA, USA) - Genoid Kft.)

57

6.2.4. A VEGF izoformáinak detektálása real time RT-PCR-fluoreszcens rezonancia

energia transzfer segítségével

PCR-eket 20 ? l végtérfogatú [10% LC FastStart DNA Master hybridization

Probe, 4 mM MgCl2 , 0,5 n? mindkét primer, 0,17 nM mindkét próba] reakcióelegyben

végeztük, 5 ? l DNS felhasználásával. A VEGF izoformákra specifikus primerek

exon-exon határokat áthidaló szakaszain a vizsgált cDNS-sel nem komplementer

bázisokat, mismatch-eket helyeztünk el az aspecifikus kötések kiküszöbölésére. A

VEGF izofor mákra specifikus primerek a következok voltak: sense primer: 5’-aga cgg

cag tca cta g-3’ (minden VEGF izoformaspecifikus PCR-ben ez a sens primer);

antisense primerek: VEGF120 : 5’-ccg cct tgg ctt gtc atc g tt ttc 3’; VEGF144:5’-ccg cct tgg

ctt gtc atc gac gct-3’; VEGF164: 5’-ctc tga aca agg ctc aca gga ctt ttc-3’; VEGF188:5’-ctc

tga aca agg ctc aca aga cac gct-3’; VEGF205: 5'- gaa tta gac agc agc ggc acc aac -3’

(vastag betukkel a mismatch-eket jelöltük).

A real time RT -PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferes (FRET)

mérések során az egyik próba 5’ végét Light Cycler Red 640 fluoroforral jelöltük: 5’-

tgc cca cgt cgg aga gc -3’; a másik próba 3’ végét fluoresceinnel jelöltük: 5’ - gca atg

atg aag ccc tgg agt g- 3’ (Tibmolbiol, Berlin, Németország). A PCR-kat a kezdeti

95°C-on végzett 8 perces denaturáció után 42-55 cikluson [95°C, 2 mp (denaturáció),

55 oC 10 mp (annealing), 72°C 25 mp (extenzió)] át végeztük. Az izoformaspecifikus

real time RT-PCR-eket mindig az egyes izoformákra pozitív és negatív kontrollként

szolgáló rekombináns DNS molekulákon végzett PCR-ekkel párhuzamosan végeztük.



6.3.1. A vizsgálatba bevont kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai

115 ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval nem kezelt (kontroll) és

86 ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, kis születési súlyú

koraszülött (VLBW) esetében határoztuk meg a VEGF T-460C-as és a G+405C-ös

58

SNP-ket (3. táblázat). A vizsgált VEGF SNP-k nevezéktanában nincs irodalmi

konszenzus. Az általunk vizsgált -460-as, illetve +405-ös lokusz a dolgozat 12.-16.

oldalán található géntérképen a -1507-es (-460), illetve -633-as (+405) pozícióban

található meg.

3. táblázat: A VEGF gén T-460C-as és a G+405C -ös polimorfizmusainak vizsgálatába

bevont 201 kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai.

ROP miatt krioterápiával v.

fotokoagulációval nem kezelt kis

születési súlyú koraszülöttek


fotokoagulációval kezelt kis születési

súlyú koraszülöttek

Betegszám

(fiú/lány) 115 (60/55) 86 (55/31)

0-1 2 2-plusz 3 4 5 ROP stádium

betegszám 75 40 19 52 6 9

gesztációs kor

(hét) 29,2 ± 2,9 28,5 ± 2,0

Születési súly

(gramm) 1200 ± 270 1160 ± 300

Oxigénterápia

idotartalma (nap) 7 [0-47] 15 [0-92]

A táblázat a VEGF gén T-460C-as és a G+405 C -ös gén polimorfizmusainak vizsgálatába bevont 201 beteg

klinika adatait tartalmazza. A ROP stádium beosztását a nemzetközi klasszifikációnak megfeleloen

állapítottuk meg [163]. A gesztációs kor és a születési súly adatait átlag ± szórás, míg az oxigénterápia

hosszát átlag [tartomány] formájában adtuk meg.

6.3.2. DNS izolálás

A mérésekhez az újszülöttek fenilketonuria szurésére használt, szuropapírra

cseppentett vérmintáit használtuk. A DNS izolálás során a szuropapírból kivágott,

mintegy 10 mm2 felületu mintára 200 ?l 5%-os Chelex 100-at mértünk. Ezután a

mintákat elobb 90 percig 56°C-on, majd 10 percig 100°C-on inkubáltuk. Az így

59

elokészített mintákat szobahomérsékletre hutöttük, majd megkevertük. Végül 10000

rpm-en 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat. A további vizsgálatokig a felülúszót -20°C-

on tároltuk.

6.3.3. A VEGF T -460C polimorfizmusának detektálása real time PCR-fluoreszcens


A VEGF gén T -460C polimorfizmusának meghatározását real time

PCR- FRET technikával végeztük.

PCR-eket 20 ? l végtérfogatú [10% LC FastStart DNA Master hybridization

Probe, +2mM MgCl2, 0,5 n? mindkét primer, 0,17nM mindkét próba] reakcióelegyben

végeztük, 2 ?l DNS felhasználásával.

A primerek és a próbák a következok voltak: sense primer:

5’-aga cgg cag tca cta g-3’; antisense primer: 5’-aat att gaa gg ggg cag-3’; az egyik

próbát az 5’ végén Light Cycler Red 640 fluoroforral jelöltük: 5’ LC640-agc ggg gag

aag gcc agg g-3’; a másik próba 3’ végét fluoresceinnel jelöltük: 5’-tgt ggg gtt gag ggc

gtt-F 3’ (Tibmolbiol, Berlin, Németország). A PCR-kat a kezdeti 95°C-on végzett 8

perces denaturáció után 42-55 cikluson [95°C, 2 mp (denaturáció), 55oC 5 mp

(annealing), 72°C 15 mp (extenzió)] át végeztük. A PCR-eket pozitív és negatív

kontrollok felhasználásával ellenoriztük.

A PCR termékeink olvadáspont analízisét a következo paraméterek szerint végeztük:

95 oC 10 mp, majd 20oC/mp sebességu hutés után 15 mp-ig 40 oC-on tartottuk a

mintákat. Ezt követoen 20oC/mp sebességu futéssel 85oC-ra melegítettük fel a mintákat.

6.3.4. A VEGF G+405 C polimorfizmusának detektálása PCR-restrikciós fragment hossz

polimorfizmus segítségével

A VEGF gén G+405C polimorfizmusának meghatározását PCR-restrikciós

fragment hossz polimorfizmus (RFLP) technikával végeztük el. Az Chelex 100-al

izolált DNS minták megfelelo szakaszát PCR reakcióval szaporítottuk fel. PCR-eket

60

50 ? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 1 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,4-0,4 ? M

primer (sense és antisense primerek), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL,

Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük 2 ? l DNS felhasználásával. A

primerek tervezéséhez a Primer3? (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/

primer3.cgi; Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for

Biomedical Research) szoftvert használtuk. A PCR reakció során felhasznált primerek

a következok voltak: sense: 5’-ccg acg gct tgg gga gat tg-3’ és antisense: 5’ -cgg cgg

tca ccc cca aaa g-3’. A PCR-eket a kezdeti 5 perces 94°C-on végzett denaturáció után a

templátokat 40 cikluson [94°C, 15 mp (denaturáció), 60oC, 30 mp (annealing), 72°C

30 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72°C-on történo

inkubáció során tettük teljessé az extenziót. PCR reakciókat pozitív és negatív

kontrollok felhasználásával végeztük. A termék várt hosszát (197 bázis) 100 bp DNS

marker (Ready-Load? , Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával

kontrolláltuk.

A PCR 197 bázis hosszúságú végtermékét BsmF I (5’GGGAC(N)10*3’)

restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs, MA, USA) emésztettük. A hasítási

termékek 26, illetve 171 bázis hosszúságuak voltak.

6.3.5. A populációs adatok statisztikai feldolgozása

A koraszülött populáció vizsgálata során a születési súly és a gesztációs kor

adatainak összehasonlítását a ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval nem

kezelt (kontroll) és a ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, kis

születési súlyú koraszülöttek között Mann-Whitney U teszttel végeztük, az allél és

genotípus frekvenciákat ? 2 teszttel és Fisher exact teszttel vizsgáltuk (Statistica,

StatSoft, OK, USA). A haplotípus analíziseket (az egyes allélek kombinációit), a

linkeage-disequilibrium tesztet, a Hardy-Weinberg egyensúly vizsgálatát és ROP miatt

kezelt , illetve a nem kezelt populáció allél prevalencia vizsgálatát az Arlequin™

szoftverrel (http://lgb.unige.ch/arlequin/; Swiss National Science Foundation) végeztük.

61

7. EREDMÉNYEK

Adataink közül elsoként mindig az adott állatmodellt igazoló, így az akut

vesekárosodást, illetve a kezeléseink eredményességét igazoló adatokat mutatjuk be.

7.1. A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkém ia/reperfúziós patkánymodellben

Ivarérett, hím Wistar patkányok szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait

vizsgáltuk 2 (T2), illetve 24 (T2 4) órával az 55 perces vese iszkémiáját követoen.

Kontrollként áloperált, nem iszkémizált veséju (T 0) patkányokat használtunk.

7.1.1. A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai

Az 55 perces bal oldali iszkémiát követoen megemelkedett szérum kreatinin és

karbamid szintek jelzik a kialakult akut vesekárosodást (4. táblázat).

4. táblázat: a patkányok szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változása a vese

iszkémiát követoen 2, illetve 24 órával (T2, T 24).

T0 T2 T2 4

Kreatinin (? mol/l) 48 ± 3 96 ± 7 * 368 ± 16 * #

Karbamid (mmol/l) 4,8 ± 1,2 7,8 ± 0,8 * 44,8 ± 4,3 * #

A táblázat a patkányok 55 perces vese iszkémiát követo szérum kreatinin és karbamid szintjének

változásait mutatja. * p?0,05 vs. T0; # p?0,05 vs. T2. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

62

7.1.2. A vesék szövettani elváltozásai

A T0 vesék szövettani vizsgálata ép vesestruktúrát mutatott, minden

glomeruláris, tubuláris vagy intersticiális elváltozás nélkül.

Az 55 perces vese iszkémiáját követoen a T2 vesékben a tubuláris epitélsejtek

enyhe nekrózisa és fokozott bazolaterális eozin festodése volt megfigyelheto (tubuláris

nekrózis: 1,5 (1-2); p<0,05 vs. T0 vesék).

A T2 4 vesékben súlyos fokú tubuláris nekrózis volt jelen (tubuláris nekrózis: 3,0

(2-3); p<0,05 vs. T0 és T2 vesék). Glomeruláris vagy intersticiális elváltozás egyik

csoportban (T0, T2, T24) sem volt megfigyelheto (13. ábra).

13. ábra: A nem iszkemizált, kontroll (A) és az iszkémizált veseminták 2 (B), illetve 24

(C) óra reperfúziót követo hematoxilin-eozin festett metszetei.

A nem iszkemizált (T0), kontroll állatok veséi

(A) ép tubuláris epitélsejteket mutatnak. A

tubuláris epitélsejtek enyhe nekrózist és

fokozott bazolaterális eozinfestodést mutatnak

a T2 vesékben (B) (nyilak). A tubuláris

epitélsejtek súlyos nekrózist mutatnak

(csillagok) a T 24 vesékben (C). Az eredeti

nagyítás: A-C x400

63

7.1.3. VEGF, IL-6 és az IL-1? mRNS expresszió változásai a patkány vesékben

A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az interleukin 1? (IL-1?? és az

interleukin 6 (IL-6) mRNS expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a T 0,

illetve a T2 és a T24 vesékben.

Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a ?VEGF (14.-15. ábra) és az IL-1??

(14. és a 17. ábra) mRNS expressziója a T0 vesékhez képest változatlan maradt a T2 és T24

mintákban. Az IL-6 (14. és a 16. ábra) mRNS expressziója, mintegy 30-szorosára fokozódott

a T2 vesékben (p<0,01 vs. T0). A T24 vesék IL-6 mRNS expressziója nem különbözött a

kontroll (T0) vesékétol.

14. ábra: VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mRNS expressziójának változása a kontroll (T0) és

az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen (reprezentatív

ábra).

Az ábra a VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mRNS expressziós vizsgálatok (szemikvantitatív RT -PCR)

reprezentatív eredményeit mutatja a kontroll (T 0) vesékben, illetve az 55 perces vese iszkémiát követoen a T2 és

a T24 vesékben. A VEGF és az IL-1? mRNS expressziója nem mutat változást. Az IL-6 mRNS expressziója

fokozott a T2 vesékben.

VEGF

IL-6

IL-1?

GAPDH

398 bp

496 bp

220 bp

496 bp

Kontroll T2 T24 T0

64

15. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a kontroll (T0) és az iszkémizált

vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen.

Az ábra a VEGF mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T2 és a T 24

vesékben (szemikvantitatív RT -PCR). A VEGF mRNS expressziója az iszkémiát követoen nem mutat

statisztikailag szignifikáns változást . Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

16. ábra: Az IL-6 mRNS expressziójának változása a kontroll (T 0) és az iszkémizált


Az ábra az IL- 6 mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T2 és a T 24

vesékben (szemikvantitatív RT-PCR). Az IL- 6 mRNS expressziója fokozott a T2 vesékben ( * p<0,01 vs.

kontroll). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

0

0,5

1

1,5

2

kontroll T2 T24

VE

GF

/ G

AP

DH

re

latív

egy

sége

k

T0

0

10

20

30

40

kontroll T2 T24

IL-6

/ G

AP

DH

re

latív

egy

sége

k

*

T0

65

17. ábra: Az IL-1? mRNS expressziójának vált ozása a kontroll (T0) és az iszkémizált


Az ábra az IL-1? mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T2 és a T 24

vesékben (szemikvantitatív RT -PCR). Az IL-1? mRNS expressziója az iszkémiát követoen nem mutat

statisztikailag szignifikáns változást. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

7.1.4. A VEGF fehérje szint változásai a patkány vesékben

A kontroll és a posztiszkémiás vesék Western blot analízise egy határozott csíkot

eredményezett 23 kD-nál (18. ábra).

18. ábra: VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban

2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen (reprezentatív ábra).

Az ábra a VEGF fehérjeszintjének (Western blot) reprezentatív eredményeit mutatja a kontroll vesékben, illetve

az 55 perces vese iszkémiát követoen a T 2 és a T24 vesékben.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

kontroll T2 T24

IL-1

b / G

AP

DH

reltí

v eg

ység

ek

T0

VEGF 23kD

Kontroll T2 T24 T 0

66

Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a VEGF fehérjeszintje a kontroll (T0)

vesékhez képest magasabb a T2 és a T24 posztiszkémiás vesemintákban (* p<0,01 vs. (T0))

(18., illetve 19. ábra).

19. ábra: A VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált


Az ábra VEGF fehérje szintjének az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T2 és a T24 vesékben

(western blot). A VEGF szintje mind a T2 , mind a T 24 vesékben emelkedett a kontroll vesékhez képest (*

p<0,01 vs. kontroll) . Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

7.1.5. A VEGF szöveti eloszlása a vesében

A vesemetszetek kis nagyítású áttekinto képén (A) jól látható a vese kéreg-velo

határának intenzív VEGF immunpozitív festodése. Ez a jelenség a kontroll és a

posztiszkémiás vesékben egyaránt megfigyelheto.

Az immunhisztológiai vizsgálat során VEGF pozitívnak találtuk a vese tubuláris

epitélsejtjeit, a Bowman tok parietális falát, a glomeruláris érgomolyagot, a makula denzát és

a vesemedence urotéliumát (19. ábra).

0

100

200

300

400

kontroll T2 T24

VE

GF

re

latív

egy

sége

k

*

*

T0

67

20. ábra: A VEGF lokalizációjának immunhisztológiai vizsgálata a kontroll (T0) és az

iszkemizált vesékben.

A kontroll vesék (A) kéreg-velo határa intenzíven VEGF immunoreaktivitást mutat. VEGF immunopozitívak a

vese tubuláris epitelsejtjei (B-D), gyujtocsatornái (E), a Bowman tok (F) parietális fala (nyílhegy), a

glumeruláris kapillárishálózat (F) (nyíl), a makula denza (F) (csillag), az urotélium (G) (nyíl) és az erek (H)

simaizomsejtjei (nyíl). A kontroll vesék (B) diffúz citoplazmatikus VEGF immunreaktivitást mutatnak. A T 2

vesékben (C) a VEGF immunreaktivitás a vese tubuláris epitélsejtjeinek basolaterális oldalára lokalizált. A T24

vesék (D) a kontroll vesékhez hasonlóan diffúz citoplazmatikus VEGF immunreaktivitást mutatnak. Az eredeti

nagyítás: A x50; B-H x400.

68

A kontroll vesék tubuláris epitélsejtjeiben a VEGF immunreaktivitás diffúzan, az

egész citoplazmára kiterjedoen jelen volt. Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a

VEGF immunreaktivitás bazolaterális lokalizációja volt megfigyelheto a T2 vesék tubuláris

epitélsejtjeiben mind a vesekéregben mind, pedig a veloállományban.

A T24 vesék tubuláris epitélsejtjeinek többségében a VEGF immunreaktivitás

megoszlása, a kontrollokéhoz hasonlóan diffúz volt. Néhány vesetubulusban azonban még

jelen volt a bazolaterális VEGF immunreaktivitás (19. ábra).

7.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista, ranitidin kezelés hatásának

vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben

Hisztamin és ranitidin kezelt, illetve kezeletlen, ivarérett, hím Wistar patkányok

szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait vizsgáltuk 2 (T2), illetve 16 (T16) órával az 50

perces vese iszkémiáját követoen. Mutéti kontrollként, áloperált, nem iszkémizált veséju (T0)

patkányokat használtunk.

7.2.1. A patkányok vese iszkémiát követo túlélése

A 12 kezeletlen, kontroll állatból 2 élte túl az 50 perces vese iszkémiát követo egy

hetes vizsgálati periódust.

A hisztamin kezelés szignifikánsan rontotta az állatok túlélését. A 10 hisztaminnal

kezelt patkányból egy sem élte túl az iszkémiát követo 3. napot.

Másrészrol a HR2 antagonista ranitidinnel kezelt állatok túlélése szignifikánsan jobb

volt a másik két kezelési csoport állataiénál. A 13 ranitidinnel kezelt patkányból 5 élte túl az

iszkémiát követo egy hetes vizsgálati periódust (20. ábra).

69

21. ábra: A hisztamin, illetve a ranitidin kezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese

iszkémiát követo egy hetes túlélésére.

A hisztamin (n = 10 db), illetve a ranitidin (n = 13 db) elokezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese

iszkémiát követo túlélésére. Kontrollként (n = 12 db) kezeletlen állatok szolgáltak. A ranitidn elokezelést

követoen az állatok túlélése szignifikánsan javult (* p<0,05 vs. kontroll, + p<0,05 vs. hisztamin). A hisztamin

kezelés rontotta az állatok túlélését (+ p<0,05 vs. hisztamin).

7.2.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai

Az állatok vese iszkémiáját megelozoen (T0) szérum kreatinin, illetve karbamid

koncentrációjában nem volt szignifikáns különbség a kezelési csoportok között.

Az 50 perces bal oldali vese iszkémiát követoen (T2 és T16) mindhárom csoportban

szignifikánsan megemelkedett a szérum kreatinin és karbamid koncentrációja. Két órával az

iszkémiát követoen a hisztaminnal kezelt állatok szérum kreatinin, illetve karbamid

koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a ranitidinnel kezelt, illetve a kontroll

állatokénál, ez a különbség azonban már T16-nál már nem volt megfigyelheto (5. táblázat).

Kontroll Hisztamin Ranitidin

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Ido (napok)

Túlé

lés

(%)

+

* +

70

5. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum kreatinin és

karbamid értékei az egyoldali vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16

órával (T2, T 16).

Mintavételi idopontok

Kezelés T0 T2 T16

Kontroll 53? 1,1 93?1,2 § 299? 12,4 §#

Hisztamin 55? 1,8 127?4,8 *§ 312? 13,2 §#

Kreatinin

(? mol/l) Rranitidin 52? 1,4 104?2,8 +§ 291?9,7 §#

Kontroll 4,8? 0,28 7,8? 0,07 § 27,2?1,48 §#

Hisztamin 5,5? 0,25 9,7?0,58 *§ 31,2?1,70 §#

Karbamid

(mmol/l) Rranitidin 5,6? 0,15 9,6?0,40 *§ 28,7?1,36 §#

A táblázat a szérum kreatinin és karbamid szint változásait mutatja a különbözo kezelési csoportokban az 50

perces vese iszkémiát követoen 2 (T2), illetve 16 (T16) órával . Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg.

* p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, § p?0,05 vs. T 0 érték, # p?0,5 vs. T2 érték.

7.2.3. A patkányok vese tubuláris károsodásának változásai

Az állatok vese iszkémiáját megelozoen (T0) egyik csoportban sem volt detektálható

hisztológiai eltérés.

Két órával az állatok 50 perces vese iszkémiát követoen enyhe tubuláris károsodás volt

megfigyelheto a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt állatokban. A hisztamin kezelt

állatokban ez az eltérés sokkal kifejezettebb volt.

Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen minden csoportban súlyos vesetubulus

károsodás volt megfigyelheto. Glomeruláris vagy intersticiális elváltozás egyik vizsgált

idopontban sem volt jelen (T0, T2, T16) a különbözo csoportokban (6. táblázat).

71

6. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok tubuláris károsodása a

vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T16).

Mintavételi idopontok Kezelés

T0 T2 T16

Kontroll 0 (0-0) 2 (1-3) § 4 (4-4) §#

Hisztamin 0 (0-0) 4 (2-4) §* + 4 (4-4) § Tubuláris

károsodás Ranitidin 0 (0-0) 1,5 (1-3) § 4 (4-4) §#

A táblázat a vese tubuláris károsodásának mértékét mutatja az 50 perces vese iszkémiát követoen a különbözo

kezelési csoportok T2 és a T16 veséiben. Az adatokat medián (tartomány) formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K,

+ p?0,05 vs. R, § p?0,05 vs. T0 érték, # p?0, 05 vs. T2 érték.

7.2.4. A patkányok szérum hisztamin koncentrációjának változásai

A vese iszkémiát megelozo, T0 idopontban a hisztaminnal kezelt állatok szérum

hisztamin szintje a másik két csoportéhoz képest szignifikánsan magasabb volt.

Két órával az 50 perces vese iszkémiát követoen a kontroll és a hisztaminnal kezelt

állatok szérum hisztamin szintje szignifikánsan csökkent a T0 értékhez képest, majd 16 órával

az iszkémiát követoen visszatért a kiindulási értékre.

Ezzel szemben a ranitidinel kezelt állatok szérum hisztamin szintje minden idopontban

a kontroll állatok T0 értékéhez volt hasonló, nem volt eltérést a különbözo idopontokban vett

minták hisztaminszintjei között (7. táblázat).

72

7. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum hisztamin

értékei a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T16).


T0 T2 T16

Kontroll 45,7?4,04 21,5?6,48 § 33,7? 9,88

Hisztamin 68,8?3,13 * 32,9?8,10 § 59,4?0,95 *#

Hisztamin

(pmol/l) Ranitidin 38,5? 4,79 + 33,7?6,44 38,9? 6,04 +

A táblázat a szérum hisztamin szint változásait mutatja a különbözo kezelési csoportokban az 50 perces vese

iszkémiát követoen 2 (T2), illetve 16 (T16) órával. Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg.

* p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, § p?0,05 vs. T 0 érték, # p?0,05 vs. T2 érték.

7.2.5. A patkányok VEGF mRNS expressziójának változásai a vesében

Az állatok 50 perces vese iszkémiáját megelozoen (T0) gyujtött veseminták VEGF

mRNS expressziójának kompetitív RT-PCR-rel történo meghatározása során nem volt

detektálható különbség a kezelési csoportok között.

A kontroll állatokban a VEGF mRNS expressziója az egész kísérlet alatt változatlan

maradt

Két órával a vese iszkémiát követoen a hisztaminnal kezelt állatok VEGF mRNS

expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt

állatoké. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen ez a különbség tovább fokozódott.

Az állatok ranitidin kezelése a kontrollokéhoz képest nem okozott változást a VEGF

mRNS expressziójában egészen a vese iszkémiát követo tizenhatodik óráig. Tizenhat órával a

vese iszkémiát követoen a ranitidin kezelt állatok VEGF mRNS expressziója szignifikánsan

csökkent a kontroll, illetve a hisztaminnal kezelt állatokéhoz képest (21. ábra).

73

22. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a

ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16


Az ábra az VEGF mRNS expressziójának a vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési

csoportok T2 és a T16 veséiben (kompetitív RT-PCR). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg.

* p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, § p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T2.

7.2.6. A patkányok IL-6 mRNS expressziójának változásai a vesében

Az állatok 50 perces vese iszkémiáját megelozoen gyujtött veseminták IL-6 mRNS

expressziójának kompetitív RT-PCR-rel történo meghatározása egyik csoportban sem

mutatott detektálható mRNS expressziót.

Két órával az állatok vese iszkémiáját követoen az IL-6 mRNS expressziója minden

csoportban szignifikánsan megemelkedett a kiindulási értékhez képest. Az IL-6 mRNS

expressziójának emelkedése a legmagasabb értéket a hisztamin kezelt állatokban érte el. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen az IL-6 mRNS expressziója minden

csoportban szignifikánsan csökkent a T2 értékekhez képest. T16-nál a ranitidin kezeltek IL-6

mRNS expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a többi csoporténál (22. ábra)

§

* §

* + § #

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

T0 T2 T16

VE

GF

/ G

AP

DH

rela

tív e

gysé

gek

Kontroll

Histamin

Ranitidin

74

23. ábra: Az IL-6 mRNS expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a



Az ábra az IL- 6 mRNS expressziójának az 50 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo

kezelési csoportok T2 és a T16 veséiben (kompetitív RT -PCR). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában

adtuk meg. * p?0,05 vs. K, § p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T2.

7.2.7. A patkányok VEGF fehérje szintjeinek változásai a vesében

A vesék VEGF fehérjeszintjeit Western blot analízissel határoztuk meg. A különbözo

kezelési csoportok 50 perces ves e iszkémiát megelozo vese VEGF fehérjeszintjében nem volt

szignifikáns különbség.

Két órával a vese iszkémiát követoen a kontroll és a hisztaminnal kezelt állatok VEGF

fehérje szintjében mintegy kétszeres növekedés állt be. A ranitidinnel kezelt állatokban ez a

változás még kifejezettebb volt.

Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt

állatokban további VEGF fehérje szint növekedése már nem volt megfigyelheto. Ezzel

szemben a hisztaminnal kezelt állatokban a VEGF fehérje szintje további emelkedést mutatott

és elérte a ranitidinnel kezelt állatokban megfigyelt VEGF fehérje szint növekedésének

mértékét (23. ábra).

§

* §

§

# # #*

0

0,01

0,02

0,03

0,04

T0 T2 T16

IL-6

/ G

AP

DH

rela

tív e

gysé

gek

Kontroll

Hisztamin

Ranitidin

75

24. ábra: A vese VEGF szint változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt

állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 16 órával (T2, T16).

Az ábra a VEGF fehérje szintjének a vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok

T2 és a T 16 veséiben (Western blot). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg. A VEGF fehérje

szintjei a kiindulási T0 értékek százalékaiban. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, § p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T2.

7.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére

patkány vese iszkémia/reperfúziós modellben

Dehidro-epiandrosztendionnal (DHEA), illetve propilén-glikol (PG; kezelési kontroll)

kezelt, ivarérett, hím Wistar patkányok szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait vizsgáltuk

2 (T2), illetve 24 (T24) órával az 55 perces vese iszkémiáját követoen. Mutéti kontrollként,

áloperált, nem iszkémizált veséju (T0) patkányokat használtunk.

7.3.1. A patkányok vese iszkémiáját követo túlélése

Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen mind a tizenkét PG kezelt állat

meghalt az elso hét során. Tizenegy az iszkémiát követo második napon, míg a további egy

*+

§ §

*# *

0

100

200

300

400

500

600

2 hours 16 hours

VE

GF,

A T

0 ér

téke

k %

-ban

T2 T16

Kontroll

Hisztamin

Ranitidin

76

állat az ötödik napon halt meg. Ezzel szemben a 12 DHEA kezelt állatból 10 túlélte a az

iszkémiát követo második napot. Nyolc állat halt meg az iszkémiát követo harmadik napon és

ketto túlélte az iszkémiát követo elso hetet. A DHEA kezelt állatok túlélése szignifikánsan

hosszabb volt (* p<0,05) (24. ábra).

25. ábra: A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo

túlélésére.

A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo egy hetes túlélésére (n=12/kezelési

csoport). * p<0,05 vs. PG.

7.3.2. A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai

A szérum kreatinin, illetve karbamid koncentrációk nem különböztek a két kezelési

csoportban. Az 55 perces bal oldali vese iszkémiát követoen a megemelkedett szérum

kreatinin és karbamid koncentrációk jelzik a mindkét kezelési csoportban kialakult akut

vesekárosodást (8. táblázat).

GDHEA GK

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7

Ido (napok)

Túl

élés

(%)

DHEA PG

*

77

8. táblázat: A DHEA, illetve PG kezelt állatok szérum kreatinin és karbamid értékei a vese

iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T24).


T0 T2 T24

PG 58,8 ± 2,84 99,42 ± 7,48 * 378,60 ± 32,46 * # Kreatinin

(? mol/l) DHEA 55,50 ± 3,39 94,25 ± 5,95 * 380,33 ± 27,11 * #

PG 5,78 ± 0,97 7,82 ± 0,71 35,66 ± 4,57 * # Karbamid

(mmol/l) DHEA 5,65 ± 0,56 7,36 ± 0,83 39,62 ± 6,55 * #

A táblázat a szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változását mutatja a különbözo kezelési csoportokban az

55 perces vese iszkémiát követoen 2 (T2), illetve 24 (T24) órával. Az adatokat átlag (tartomány) formájában adtuk

meg. * p?0,05 vs. T 0; # p?0,05 vs. T2

7.3.3. A vesék szövettani elváltozásai

A két kezelési csoport vese mintái között nem volt szövettanilag észlelheto különbség.

Mindkét kezelési csoport T0 veséinek szövettani vizsgálata ép vesestruktúrát mutatott,

glomeruláris, tubuláris vagy intersticiális elváltozás nélkül. Az állatok 55 perces vese

iszkémiáját követoen a T2 vesékben a tubuláris epitélsejtek enyhe nekrózisa volt

megfigyelheto mindkét kezelési csoportban (tubuláris nekrózis: DHEA kezelt állatok: 1,5 (1-

2); PG kezelt állatok: 1,5 (1-2); mindketto p<0,05 vs. T0 vesék). A T24 vesékben a kezeléstol

függetlenül súlyos fokú tubuláris nekrózis volt jelen (tubuláris nekrózis: DHEA kezelt állatok:

3 (2-3); PG kezelt állatok: 3 (2-3); mindketto p<0,05 vs. T0 és T2 vesék). Glomeruláris vagy

intersticiális eltérés egyik vizsgált idopontban (T0, T2, T24) sem volt jelen a különbözo

kezelési csoportokban.

78

7.3.4. A DHEA kezelés hatása a szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát

koncentrációjára

A szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát (DHEA-S) koncentrációk

minden vizsgált idopontban magasabbak voltak a DHEA, mint a PG kezelt állatokban.

Az 55 perces vese iszkémiát követoen a szérum DHEA koncentrációja a kiindulási, T0

értekhez képest emelkedett volt a T2 és a T24 PG kezelt állatokban. A DHEA kezelt állatok

szérum DHEA koncentrációja a T24 állatokban emelkedett volt a T2 állatokéhoz képest (9.

táblázat).

A vese iszkémiát követoen a PG kezelt állatok szérum DHEA-S koncentrációja nem

változott szignifikáns mértékben a T 0 értekhez képest. A szérum DHEA -S koncentrációja a T0

értekhez képest emelkedett volt a T2 és a T24 DHEA kezelt állatokban.

9. táblázat: A DHEA, illetve a PG kezelt állatok szérum DHEA és DHEA-S értékei a vese



T0 T2 T24

PG 0,89 ± 0,07 1,40 ± 0,24 * 1,25 ± 0,34 * DHEA

(nmol/l) DHEA 49,31 ± 5,72 + 44,95 ± 11,06 + 57,47 ± 6,87 # +

PG 7,50 ± 0,76 8,37 ± 1,08 6,92 ± 1,54 DHEA-S

(nmol/l) DHEA 107,60 ± 13,86 + 158,03 ± 15,23 * + 194,33 ± 24,64 * +

A táblázat a szérum DHEA és DHEA- S szintjeinek változását mutat ja a különbözo kezelési csoportokban az 55

perces vese iszkémiát követoen 2 (T2), illetve 24 (T24) órával (RIA). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk

meg. * p?0,05 vs. T0; # p?0,05 vs. T2; + p?0,05 vs. PG

79

7.3.5. A patkányok VEGF mRNS expressziójának változásai a vesében

A VEGF mRNS expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA

és a PG kezelt állatok T0, T2, illetve T24 veséiben.

A VEGF mRNS expressziója a PG kezelt csoportban az egész kísérlet alatt

változatlan maradt. Bár a DHEA kezelt állatokban az 55 perces vese iszkémiáját követoen

fokozódott a VEGF mRNS expressziója a T0 értékhez képest, ez azonban nem érte el a

szignifikáns mértéket.

Míg a két kezelési csoport T0 veséink VEGF mRNS expressziójában nem volt

különbség, addig a DHEA kezelt állatok T2 és T24 veséinek VEGF mRNS expressziója

szignifikánsan magasabb volt, mint a PG kezelteké (25. ábra).

26. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a

vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24).

Az ábra a VEGF mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo

kezelési csoportok T2 és a T24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR). Az adatokat átlag ± szórás formájában

adtuk meg. * p<0,05 vs. PG

0

1

2

3

4

5

T0 T2 T24

VEG

F / G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA

0

1

2

3

4

5

T0 T2 T24

VEG

F / G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA* *

80

7.3.6. A patkányok IL-1? mRNS expressziójának változásai a vesében

Az IL-1? mRNS expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA


Az IL-1? mRNS expresszió mindkét kezelési csoportban az egész kísérlet alatt

változatlan maradt. A DHEA kezelt állatok T0 veséjének IL-1? mRNS expressziója

szignifikánsan alacsonyabb volt a PG kezeltekénél. A T0 vesékhez hasonlóan a DHEA kezelt

állatok T2 és T24 veséinek IL-1? mRNS expressziója is alacsonyabb volt a PG kezeltekénél,

de a különbség nem volt szignifikáns (26. ábra).

27. ábra: A IL-1? mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese


Az ábra az IL- 1? mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo

kezelési csoportok T2 és a T24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk

meg. * p<0,05 vs. PG

7.3.7. A patkányok IL-6 mRNS expressziójának változásai a vesében

Az IL-6 mRNS expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA


0

1

2

3

T0 T2 T24

IL-1

b / G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA

0

1

2

3

T0 T2 T24

IL-1

b / G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA

*

81

Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen az IL-6 mRNS expressziója

szignifikánsan megemelkedett mindkét kezelési csoport T2 veséiben, majd a T24 vesékben

visszatért a T0 vesék kiindulási értékéhez.

Az IL-6 mRNS expressziója a DHEA kezelt állatok T0 és T2 veséiben szignifikánsan

alacsonyabb volt, mint a PG kezelt állatokéban. Az IL-6 mRNS expressziójában nem volt

különbség a kezelési csoportok között (27. ábra).

28. ábra: A IL-6 mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese


Az ábra az IL- 6 mRNS expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo

kezelési csoportok T2 és a T24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR) . Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk

meg. * p<0,05 vs. PG # p<0,05 vs. T0 és T24 mindkét kezelési csoportban

7.3.8. A patkányok VEGF fehérjeszint változásai a vesében

A DHEA és a PG kezelt állatok veséinek VEGF fehérje szintjeit Western blot

analízissel határoztuk meg.

*

* #

0

10

20

30

40

T0 T2 T24

IL-6

/ G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA

0

10

20

30

40

T0 T2 T24

IL-6

/ G

APD

Hre

latív

egy

sége

k

PG

DHEA

82

Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen mindkét kezelési csoportban

emelkedett vese VEGF fehérje szintet találtunk (mindkét csoportban a T2 és T24 p<0,05 vs.

T0). Bár a DHEA kezelt állatok VEGF fehérje szintje minden vizsgált idopontban

alacsonyabb volt a PG kezeltekénél. Ez a különbség azonban csak T0 idopontban volt

szignifikáns (28. ábra).

29. ábra: A VEGF fehérje szint változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát

megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24).

Az ábra a VEGF fehérje szintjének az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési

csoportok T2 és a T24 veséiben (Western blot). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * P<0,05 vs.

m indkét kezelési csoport T0 ; § p<0,05 vs. PG.

7.4. A patkány VEGF izoformák mRNS expressziójának real time RT-PCR-fluoreszcens

rezonancia energia transzferrel történo kimutatása

A hím Wistar patkány vesébol izolált cDNS-en állítottuk be a VEGF izoformáinak

kimutatására alkalmas real time RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET)

méréseket. Az alábbi ábrák (30. ábra) az egyes izoformák kimutatásának reprezentatív képeit

mutatják.

*

§

0

100

200

300

T0 T2 T24

VE

GF

rela

tív e

gysé

gek

PG

DHEA *

83

Kontrollként minden izoforma kimutatásakor a cDNS mintával párhuzamosan, egy

pozitív és egy negatív kontroll plazmidot (rekombináns DNS molekulák amelyek

tartalmazzák a minden VEGF izoformára, illetve a VEGF 205-ös izoformájára jellemzo DNS

szakaszok mellett az VEGF 120-as és a 188-as izoformájára specifikus, illetve a VEGF

144-es és a 164-es izoformájára jellemzo exon-exon határokat (12. ábra)) alkalmaztunk. Ez

segített kiküszöbölni az álnegatív, illetve az álpozitív eredményeket.

8.4.1. A VEGF120 mRNS expressziójának kimutatása.

30. ábra: A VEGF120 mRNS expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll

plazmidokban.

Az ábrán a VEGF 120-as izoforma mRNS expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának

egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cDNS minta a

26., illetve 40. ciklus körül lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja

nem indult meg a real time RT -PCR során.

Ciklusszám

F

luor

eszc

enci

a (F

2/F1

)

Negatív kontroll

cDNS Pozitív kontroll

84

7.4.2. A VEGF144 mRNS expressziójának kimutatása


plazmidokban.

Az ábrán a VEGF 144-es izoforma mRNS expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának


30., illetve 42 . ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid

amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során.

Ciklusszám

F

luor

eszc

enci

a (F

2/F1

)

Negatív kontroll

Pozitív kontroll

cDNS

85



plazmidokban.



34., illetve 42. ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid


Ciklusszám

Flu

ores

zcen

cia

(F2/

F1)

Negatív kontroll

Pozitív kontroll

cDNS

86



plazmidokban.

Az ábrán a VEGF 188-as izoforma mRNS expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának




Ciklusszám

Flu

ores

zcen

cia

(F2/

F1)

Negatív kontroll

Pozitív kontroll

cDNS

87



plazmidokban.





Ciklusszám

F

luor

eszc

enci

a (F

2/F1

)

Negatív kontroll

cDNS

Pozitív kontroll

88

7.5. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú koraszülöttek

retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata

7.5.1. A VEGF promoter régió -460-as lokusz vizsgálatának reprezentatív real time

PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer eredményei

A koraszülöttek DNS mintáiban real time PCR-FRET vizsgálattal határoztuk meg a

vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) T-460C lokuszának polimorfizmusát (34.

ábra).

35. ábra: A VEGF -460 lokuszának real time PCR - fluoreszcens rezonancia energia transzfer

vizsgálata.

Reprezentat ív ábrák a vaszkuláris endot eliális növekedési faktor (VEGF) T-460C lokuszának polimorfizmus

vizsgálatáról. (A) Az ábra VEGF T-460C lokuszára specifikus, jelzett próbák az olvadáspont-analízis során a DNS

templátról bekövetkezo disszociációját mutatja. (B) Az ábra a VEGF T-460C lokuszára specifikus próbák

olvadáspont-analízis függvények második deriváltját ábrázolja.

A B

Flu

ores

zcen

cia

– d

(F2/

F1)

/dT

Homérséklet (°C) Homérséklet (°C)

Flu

ores

zcen

cia

– d

(F2/

F1)

/dT

89

7.5.2. A VEGF +405-ös lokusz vizsgálatának reprezentatív PCR-RFLP eredményei

A koraszülöttek DNS mintáiban PCR - restrikciós fragment hossz polimorfizmus

(RFLP) vizsgálattal határoztuk meg a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF)

G+405C lokuszának polimorfizmusát (35. ábra).

36. ábra: A VEGF +405 lokuszának PCR-RFLP vizsgálata.

Reprezentatív ábra a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) +405-ös lokuszának polimorfizmus

vizsgálatáról. A PCR reakció 197 bázis hosszúságú végtermékét BsmF I restirkciós endonukleázzal emésztettük.

Az így kapott hasítási termékek 26, illetve 171 bázis hosszúságúak (a 26 bázis hosszúságú hasítási termék a

használt agaróz gél feloldóképessége miatt nem látható). 1.-3. és 6. minta: G allélre homozigóta; 4, minta: C

allélre homozigóta; 5. és 7. minta: CG heterozigóta. M = DNS marker.

7.5.3. A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus frekvenciái

A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus frekvenciáját a

10. táblázatban foglaltuk össze.

200 bázis

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. M

90

10. táblázat: A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP

fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis

születési súlyú koraszülöttekben.


fotokoagulációval nem kezelt

kis születési súlyú

koraszülöttek

ROP miatt krioterápiával, v.

fotokoagulációval kezelt kis


VEGF T-460C genotípus

A VEGF -460C allél

frekvenciáját (%) 49,5 41

TT T C CC TT TC CC A VEGF T-460C genotípus

frekvenciáját (%) 24 53 23 31 55 14

VEGF G+405C genotípus

A VEGF +405C allél

frekvenciáját (%) 30 41*

GG GC CC GG GC CC A VEGF G+405C genotípus

frekvenciáját (%) 48 46 6 35 48 17**

A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP fokozott kockázata miatt kezelt,

illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. A VEGF +405C allél hordozók nemre, az oxigénterápia

idotartalmára és a gesztációs korra adjusztált odds aránya * [95% CI]: 2,00 [1,02- 3,92], p=0,045; a VEGF C+405C

genotípusnak a nemre, az oxigénterápia idotartalmára és a gesztációs korra adjusztált odds aránya ** [95% CI]:

3,37 ([1,17 -9,65], p=0,011.

7.5.4. A kis születési súlyú koraszülöttek haplotípus megoszlása

A vizsgált 110 kontroll, illetve a 64 ROP-os kis születési súlyú koraszülött haplotípus

megoszlását a 11. táblázat mutatja be.

91

11. táblázat: A VEGF polimorfizmus-haplotípusok megoszlása a ROP miatt krioterápiával,

illetve fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben.

VEGF T-460C/ G+405C

haplotípus


fotokoagulációval nem kezelt

kis születési súlyú

koraszülöttek ( %)

(n=115)

ROP miatt krioterápiával, v.

fotokoagulációval kezelt kis


(%)

(n=86)

-460CC/+405GG 12 13

-460CC/+405GC 8 1

-460CC/+405CC 3 0

-460TC/+405GG 24 17

-460TC/+405GC 26 35

-460TC/+405CC 3 2

-460TT/+405GG 11+ 5

-460TT/+405GC 12 12

-460TT/+405CC 1 15**

A VEGF T- 460C és G+405C polimorfizmusainak haplotipusai a ROP miatt krioterápiávalvagy fotokoagulációval

kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. Az adatokat a vizsgált betegek százalékában

adtuk meg. A nemre, az oxigénterápia hosszára és a gesztációs korra adjusztált odds arányok * [95% CI]: 16,2

[ 1,96 - 134], p=0,01, illetve + [95% CI]: 0,25 [ 0,06 – 1,10], p=0,067

92

8. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK

8.1. A patkányvesék iszkémia/reperfúziós károsodása során a VEGF szintézisében

bekövetkezo változások megbeszélése

Az irodalmi adatok alapján minden eddig megvizsgált in vitro , illetve in vivo

rendszerben a hipoxiás, illetve iszkémiás károsodást követoen fokozódott a vaszkuláris

endoteliális növekedési faktor (VEGF) mRNS expressziója, illetve fehérje szintje [5, 21, 129-

132]. Ezek alapján a vesében is hasonló, a VEGF szintézisének fokozódása lenne várható az

iszkémiás inzultust követoen. Ennek ellenére az utóbbi években több olyan közlemény is

megjelent, ami a VEGF szintézis változásának teljes hiányáról számol be a posztiszkémiás

vesében, mind mRNS mind, pedig fehérje szinten [133-135].

Ezekben a kísérletekben Kanellis és munkatársai 40 perces vese iszkémiát követoen

vizsgálták a reperfúzió elso 80 percében mutatkozó molekuláris biológiai (a VEGF mRNS és

fehérje szintézis változásait, illetve a VEGF szöveti lokalizációját) elváltozásokat [133, 134].

Az állatmodell és a vizsgálatok némi módosításával mi ugyanezeket a paramétereket

vizsgálatuk. Saját kísérletünk során, mind az alkalmazott vese iszkémia idotartalmát (40 perc

vs. 55 perc) mind, pedig a vizsgált posztiszkémiás idoperiódust (80 perc vs. 24 óra)

megnyújtottuk. Ez utóbbit azért tartottuk fontosnak, mert ritka, hogy egy fehérje szintjében

olyan rövid ido alatt, mint 80 perc, változás következzen be.

Eredményeink részben megegyeznek Kanellis és munkatársai által a posztiszkémiás

vesében találtakkal [133]. Bár a mi RT-PCR rendszerünk (a VEGF izoformák összességében

bekövetkezo változástok együttes detektálása) különbözött a Kanellis és munkatársai által

használttól (az egyes VEGF izoformákban külön-külön bekövetkezo változások detektálása)

mi sem találtunk változást a posztiszkémiás vese VEGF mRNS expressziójában. Ugyanakkor

fokozott VEGF fehérje szintézist találtunk már a reperfúzió második órájában. Ez a fokozott

VEGF fehérje szint még 24 órával az iszkémiás periódust követoen is jól detektálható volt. A

Kanellis és munkatársai, illetve az általunk végzett kísérlet megfigyelései közti különbség

elsosorban a felhasznált állatmodell különbségeivel, az iszkémiás ido és a vizsgált

posztiszkémiás periódus eltéro hosszával magyarázható.

93

A posztiszkémiás vesében a VEGF fehérje szintjének fokozódása az mRNS

expresszió változásának hiánya mellett a poszt-transzkripciós szabályozás fontosságára hívja

fel a figyelmet. In vitro a VEGF szintézisének szabályozása kapcsán több, a mi

eredményeinket, alátámasztó mechanizmust is leírtak. Kimutatták, hogy a hipoxia, más AU

gazdag 3’UTR-rel rendelkezo mRNS-ekhez hasonlóan, stabilizálja a VEGF mRNS-ét [32].

Ebben a folyamatban az RNS-köto fehérje, a HuR szerepét valószínusítik [33]. A hipoxia

során stabilizálódó VEGF mRNS féléletideje többszörösére no meg (40 perc vs. 180 perc )

[34]. A stabilizált, hosszabb féléletideju mRNS pedig nyilvánvalóan kedvezo a transzláció

szempontjából. Mindemellett a VEGF mRNS 5’UTR-jén található egy, a transzláció

elindításáért felelos szakasz (IRES), ami hipoxiás körülmények között is, amikor más

fehérjék szintézise csökken, elosegíti a VEGF fehérje szintézisét [17]. Feltételezésünk szerint

tehát a vese sem kivétel és más szervekhez hasonlóan a posztiszkémiás vesében is fokozódik

a VEGF szintézise [129-132]. Ugyanakkor a vese VEGF szintézise, minden eddig ismert más

szervtol eltéroen, elsosorban poszt -transzkripcionálisan szabályozott.

A VEGF szintézisét a hipoxián kívül számos más tényezo is befolyásolja. Számos, az

I/R okozta akut vesekárosodás patomechanizmusában is résztvevo citokinrol kimutatták,

hogy fokozza a VEGF szintézisét [36, 37, 38]. Modellünkben a VEGF fehérje szintézisének

fokozódásával párhuzamosan az interleukin 6 (IL-6) szintézisének gyors fokozódását

mutattuk ki a posztiszkémiás vesében. Bár a vesében nem ismert a hipoxia indukált IL-6

szintézis mechanizmusa, a folyamatban feltételezhetjük a nukleáris faktor IL-6 szerepét (NF

IL-6). Hipoxia hatására az NF IL-6 az IL-6 promoteréhez kötve fokozza a gén

transzkripcióját in vitro [164, 165]. Az IL-6, illetve a VEGF szintézisének párhuzamos

változásai a posztiszkémiás vesében az irodalmi adatokkal [37, 38] összhangban felveti a

lehetoségét annak, hogy a két citokin szintézise valamilyen módon kapcsolódik egymáshoz a

vesében.

Ezt a hipotézist támasztja alá az a megfigyelés miszerint az IL-6 hatására

foszforilálódik az eukarióta iniciációs factor-4E [166], ami fontos szerepet tölt be a VEGF

transzlációjában [167]. Mindezeken túl, az IL-6 fokozza az IRES függo traszláció

hatékonyságát [166], amely egyúttal fontos eleme a VEGF hipoxiás körülmények közti

transzlációjának is [168].

94

A VEGF szöveti lokalizációjára irányuló immunhisztológiai vizsgálataink fokozott

VEGF jelenlétet mutattak a vese kéreg-velo határán, mind a kontroll mind, pedig a

posztiszkémiás vesékben. Bá r a VEGF vese kéreg-velo határán lévo fokozott jelenlétének a

jelentosége nem ismert, a vese ezen régiója speciális az oxigén ellátottság és az

energiafelhasználás szempontjából. A parciális oxigénnyomás még a nem hipoxiás

körülmények között is alacsony, az energiafelhasználás pedig magas a vese kéreg-velo

határán [169, 170]. Az állandóan alacsony parciális oxigénnyomás és az oxigénigényes

folyamatok együttes jelenléte magyarázhatja a fokozott VEGF szintézist a vese kéreg-velo

határán.

A posztiszkémiás vese tubuláris epitélsejtekben talált átmeneti bazolaterális VEGF

akkumulációt Kanellis és munkatársai a VEGF aktív szecernálásával magyarázzák [133]. A

saját kísérleti modellünkben is hasonló átmeneti bazolaterális VEGF immunreaktivitás volt

megfigyelheto a vese tubuláris epitélsejtjeiben. Jól ismert azonban, hogy az iszkémiás

károsodásra a vese tubuláris epitélsejtjei nagyon érzékenyek. Iszkémia hatására alapvetoen

megváltozik a vese tubuláris epitélsejtek szerkezete [171]. Az iszkémiás károsodást követoen

a VEGF-éhez hasonló, intracelluláris megoszlást mutattak ki más citoszkeletális [172] és nem

citoszkeletális [173] fehérjék kapcsán is a vese tubuláris epitélsejtjeiben. Mindezek mellett a

mintáink hematoxilin eozin festése is hasonló bazolaterális fehérje akkumulációt mutatott a

posztiszkémiás vese tubulusok epitélsejtjeiben. Ezért szemben Kanellis és munkatársaival, mi

úgy gondoljuk, hogy a VEGF fokozott jelenléte a T2 vesék tubuláris epitélsejtjeinek

bazolaterális oldalán sokkal inkább a posztiszkémiás sejtkárosodás, mintsem a VEGF aktív

szecernálásának következménye.

Eredményeinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a változatlan VEGF mRNS

expresszió ellenére a VEGF fehérje szintézise fokozott a posztiszkémiás vesében. Adataink –

ellentétben a más szervek kapcsán tapasztaltakkal - a VEGF szintézis a poszt-transzkripciós

szintu szabályozásnak a fontosságára utalnak a posztiszkémiás vesében. A fokozott IL-6

szintézis az in vitro irodalmi adatoknakkal összhangban, szerepet játszhat a VEGF

szintézisének szabályzásában.

95

8.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelésnek a

posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése

Adataink demonstrálják, hogy a hisztamin kettes receptorán (HR2) keresztül szerepet

játszik a vese akut I/R károsodásának patomechanizmusában. A hisztamin kezelés rontotta az

állatok vese iszkémiát követo túlélését és fokozta a vese tubuláris epitélsejtek károsodását.

Ezzel szemben az állatok HR2 antagonista ranitidin kezelése javította a vese iszkémiát követo

túlélést. Ezekben a folyamatokban szerepe lehet a vese I/R károsodás során fokozódó VEGF

szintézisnek is.

A hisztamin számos ponton befolyásolja a vese iszkémiás károsodását. A hisztamin

aktiválja a fehérvérsejteket [174], a trombocitákat [175] és fokozza az erek permeabilitását

[139]. A kombinált hisztamin egyes receptor és HR2 antagonista kezelés csökkenti a vese

posztiszkémiás károsodás át [136]. Kísérletünk során a HR2 antagonista ranitidin kezelés

javította az állataink vese iszkémiát követo túlélését. Eredményeinkhez hasonlóan a ranitidin

jótékony hatását figyelték meg patkányok máj iszkémiáját követoen is. A ranitidin kezelés

csökkenti a májsejtek TNF? termelést és a neutrofil granulociták aktiválódását és a [176].

Állataink hisztamin kezelése szignifikáns mértékben megemelte a szérum hisztamin

szintjét. Két órával a vese iszkémiát követoen mind a kontroll mind, pedig a hisztaminnal

kezelt állatokban lecsökkent a szérum hisztamin szintje, majd 16 órával a vese iszkémiát

követoen visszatért a kiindulási értékre. A korábbi vizsgálatok adatai a szérum hisztaminszint

iszkémiás károsodást követo változásairól ellentmondásosak. A súlyos vese [136], illetve bél

iszkémiát [177] követoen korai, 15 perccel az iszkémiát követoen jelentkezo szérum

hisztaminszint növekedés tapasztalható, ugyanakkor az iszkémia idotartalmával arányosan

csökkeno hisztaminszintrol számoltak be a bél mukózájában. A mukóza csökkent

hisztaminszintjét a hízósejtek iszkémiát követo degranulációja okozta [178]. Az általunk

megfigyelt vese iszkémiát követo átmeneti szérum hisztaminszint csökkenést szintén

magyarázhatja a hisztamin korai, posztiszkémiás degranulációja, illetve fokozott

metabolizmusa. Ezt azonban késobb, feltehetoen a hisztamin újbóli szintézise visszaállítja a

kiindulási értékre. Érdekes módon a ranitidinnel kezelt állatok szérum hisztaminszintje nem

mutat a konroll vagy a hisztaminnal, kezelt állatokhoz hasonló posztiszkémiás ingadozást

jelezve, hogy a ranitidin valamilyen módon befolyásolja a hisztamin metabolizmusát.

96

Kísérletünkben, a hisztamin, illetve a ranitidin kezelésnek az IL-6 és a VEGF

szintézisére kifejtett hatását vizsgáltuk a vese I/R károsodása kapcsán. Számos adat szól

amellett, hogy in vitro az IL-6 és a VEGF befolyásolják egymás szintézisét [37, 38]. Ezek a

citokinek fontos szabályzói az endotélsejtek funkcióinak [6, 10], így hatással lehetnek a vese

mikrocirkulációra is.

Két órával a vese iszkémiát követoen az IL-6 mRNS expressziója mindhárom kezelési

csoportban fokozódott. A korábbi irodalmi adatokkal megegyezoen a posztiszkémiás vesében

a hisztamin kezelés tovább fokozta az IL-6 amúgy is fokozott mRNS expresszióját [179].

Ezzel ellentétben tizenhat órával az iszkémiát követoen a ranitidin kezelés szignifikánsan

csökkentette az IL-6 mRNS expresszióját, megerosítve a hisztamin és HR2 szerepét az IL-6

szintézisének szabályozásában.

A VEGF mRNS expressziója számos, ha nem minden szervben fokozódik az

iszkémiás inzultust követoen [129-132]. Ennek ellenére, mint ahogyan ezt saját adataink

(kontroll vesék) is alátámasztják, a közelmúltban több cikk is beszámol arról, hogy a VEGF

mRNS expressziója nem változik a posztiszkémiás vesében [133, 134]. Ugyanakkor a

hisztamin kezelt állatok posztiszkémiás veséiben fokozott VEGF mRNS expressziót találtuk.

Korábban Ghosh és munkatársai kimutatták, hogy a hisztamin a HR2-n keresztül befolyásolja

a VEGF szintézisét [180]. A HR2 szerepére hívja fel a figyelmet, hogy az állatok HR2

antagonista ranitidin kezelése csökkentette a VEGF mRNS expresszióját.

Érdekes módon a változatlan mRNS expresszió ellenére, fokozott VEGF fehérje

szintet találtunk a kontroll állatok posztiszkémiás veséiben. Ez látszólag ellentmondásban van

a korábban Kanellis és munkatársai által a posztiszkémiás vesében leírt változásokkal.

Kanellis és munkatársai ugyanis a vese iszkémiás inzultusát követoen a VEGF de novo

szintézisének tejes hiányáról számoltak be [133, 134]. Bár az általunk és Kanellis és

munkatársai által használt kísérleti modell számos ponton, mint az iszkémia idotartalma (50

vs. 40 perc) és kivitelezése (termokontrolált vs. nem termokontrolált), a használt patkány törzs

(Wistar vs. Sprague-Dawley), eltér egymástól a VEGF fehérje szintjében talált különbség

legvalószínubb oka, mégis a mintavétel ideje (az iszkémiás periódus után 2, 24 óra vs. 0, 20,

40, 80 perc) [133].

97

A ranitidinnel kezelt állatokban a 16 órával a vese iszkémiát követoen talált csökkent

VEGF mRNS expresszió ellenére is gyorsan fokozódó VEGF fehérje szintet találtunk a

posztiszkémiás vesékben, aminek része lehet az állatok jobb túlélésében is.

A kontroll és ranitidinnel kezelt állatokban a változatlan, illetve csökkent VEGF mRNS

expresszió ellenére kimutatott fokozott VEGF fehérje szint a poszt-transzkripciós szabályozás

jelentoségére hívja fel a figyelmet az iszkemizált vesében. Ennek lehetoségét több

mechanizmus is alátámasztja. A hipoxia, egy RNS-köto fehérjén, a HuR-on keresztül

stabilizálja a VEGF mRNS-ét [32, 33], ami kedvezo a VEGF transzlációja szempontjából.

Mindemellett a VEGF mRNS-ének egy, a transzláció elindításáért felelos szakasza (IRES)

biztosítja a hipoxiás körülmények ellenére is a fokozott VEGF szintézist [17] . Feltételezésünk

szerint tehát a vese VEGF szintézise, minden eddig ismert más szervtol eltéroen, elsosorban

poszt-transzkripc ionálisan szabályozott.

A hisztaminnal kezelt állatokban talált fokozott VEGF fehérje szint hátterében,

ellentétben a kontroll és a ranitidinnel kezelt állatokkal, a fokozott VEGF mRNS

expressziónak is szerepe lehet.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a hisztamin kettes receptorán keresztül fontos

szabályzója a posztiszkémiás vesék károsodásának. A hisztamin fokozta, míg a szelektív HR2

antagonista ranitidin enyhítette a vese I/R károsodásának következményeit. A hisztamin

fokozta mind az IL-6, mind a VEGF mRNS expresszióját. A ranitidin kezelés csökkentette az

IL-6 mRNS expresszióját és fokozta a VEGF fehérje szint emelkedését, ami meghatározó

eleme lehet a az állatok jobb túlélésének.

8.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF

szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése

Ismert a dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelés jótékony hatása a szív [151],

illetve az agy [152] I/R károsodása kapcsán, kevés azonban az irodalmi adat a DHEA kezelés

hatásáról a vese I/R károsodása kapcsán [153]. Mi a rövid távú DHEA kezelés vese iszkémiát

követo túlélésére és a vesében lezajló molekuláris biológiai változásokra gyakorolt hatásait

vizsgáltuk.

98

Vizsgálataink során nem találtunk különbséget sem a DHEA kezelt és a kontroll (PG

kezelt) állatok szérum kreatinin, illetve karbamid szintjének posztiszkémiás változásaiban

sem a vese hisztopatológiai elváltozásaiban. Ugyanakkor a DHEA kezelés, ugyan

mérsékelten, de javította az állatok vese iszkémiáját követo túlélését. Eredményeink részben

megegyeznek Arango és munkatársai által a posztiszkémiás vesén megfigyelteknek [153].

Arango és munkatársai a hosszú távú DHEA elokezelés hatásait vizsgálva azt találták, hogy a

DHEA elokezelés javítja a posztiszkémiás vese funkcióját és csökkenti a vese szövettani

elváltozásainak mértékét. Adataink a DHEA kezelésnek a vese I/R károsodása során (más

szervek I/R károsodásához hasonlóan) kifejtett jótékony hatására hívják fel a figyelmet.

A DHEA kezelés vese I/R károsodásra kifejtett jótékony hatásában szerepe lehet a

DHEA jól ismert antioxidáns hatásának. Arango és munkatársai a kontroll állatok

posztiszkémiás veséjéhez képest kevesebb reaktív oxigén, illetve nitrogén gyököt találtak a

DHEA elokezelt állatok posztiszkémiás veséiben [152]. A DHEA antioxidáns hatása mellett,

azonban jól ismert a DHEA kezelés különbözo citokinek szintézis ét befolyásoló [181, 182],

valamint a szöveti mikrocirkulációt ért hipoxiás károsodástól való védo hatása [149, 150] is.

A vese iszkémiás károsodásának patomechanizmusában is fontos szerepe van a

hemodinamikai változásoknak. A vese keringésének iszkémiát követo csökkenése fenntartja,

illetve fokozza a vese tubuláris epitélsejtjeinek károsodását [127, 128]. Nem kizárt tehát,

hogy a DHEA kezelésnek a különbözo szervek iszkémiás károsodása kapcsán megfigyelt

jótékony hatása a szövetek mikrocirkulációjára kifejtett hatásán keresztül valósul meg.

Kísérletünkben, a DHEA kezelésnek a VEGF, IL-1? és IL-6 szintézisére kifejtett

hatását vizsgáltuk a vese I/R károsodása kapcsán. Ezek a citokinek fontos szabályzói az

endotélsejt funkcióknak [6, 10], az apoptózisnak [11, 183] és a gyulladásnak [184], valamint

befolyásolják a szervek mikrocirkulációját is [6, 185,186]. Ezért feltételeztük szerepüket a

DHEA kezelés vese károsodására kifejtett hatásának közvetítésében.

Kísérletünkben a nem iszkémizált, T0 vesék VEGF mRNS expressziója nem

különbözött a DHEA kezelt és a kontroll állatokban. Ugyanakkor a VEGF fehérje szintje

szignifikánsan alacsonyabb volt a DHEA kezelt állatok T0 veséiben, mint a kontroll

állatokéiban. A VEGF fehérjeszintjéhez hasonlóan az IL-1??és az IL-6 mRNS expressziója

szintén alacsonyabb volt a DHEA kezelt állatok T0 veséiben.

99

Az irodalomból ismert a VEGF az IL-1? ?és az IL-6 szintézise közötti kapcsolat in

vitro. Az IL-1? ?[36] és az IL-6 [37, 38] fokozott szintézise együtt jár a VEGF fokozott

szintézisével. Ugyanakkor az irodalomból nem ismert az alacsony IL-1?? illetve IL-6 szint és

a VEGF szint kapcsolata. Kísérleti adataink szerint az állatok DHEA kezelése egyaránt

csökkenti a vese VEGF, IL-1?? valamint IL-6 szintézisét. Ez az általunk vizsgált citokinek

szintézise közötti in vivo is meglévo kapcsolatra utal.

A posztiszkémiás vesékben változatlan VEGF mRNS expressziót és fokozott

fehérjeszintet mértünk mindkét kezelési csoportban. A DHEA kezelés hatására azonban a

VEGF mRNS expresszió, bár nem szignifikáns mértékben, de fokozódott. Ugyanakkor

kontroll állatokéhoz képest a DHEA kezelt állatok VEGF fehérje szintje az IL-1? és IL-6

mRNS expressziójával párhuzamosan csökkent a posztiszkémiás vesében.

Ezek a mérési eredményeink tovább erosítik korábbi megfigyeléseinket, melyek

szerint a posztiszkémiás vesében a VEGF szintézise elsosorban poszt-transzkripcionálisan

szabályozott folyamat. Több olyan mechanizmus is ismert, amely elosegíti a VEGF fehérje

szintézisét, akár hipoxiás körülmények között is, amikor más fehérjék szintézise alapvetoen

csökkent. Maga a hipoxia/iszkémia stabilizálja a VEGF mRNS-ét [34]. Ez részben, a VEGF

mRNS-ének 3’ UTR-ján található AU gazdag régiókhoz kötodo RNS-kötofehérjén, a HuR -on

keresztül valósul meg [32]. Ezen kívül a VEGF mRNS-ének 5’UTR-jén elhelyezkedo IRES

is elosegíti a VEGF fehérjeszintézisét [17].

A magasabb VEGF mRNS expresszió ellenére a VEGF fehérje szintje kevésbé

fokozódik a DHEA kezelt állatok veséiben, mint a kontroll állatok esetében. Az elobbiekben

felsorolt mechanizmusok nem magyarázzák a DHEA kezelés VEGF mRNS és fehérje

szintézisére gyakorolt ellentétes hatását. Ugyan nem zárható ki, hogy a DHEA kezelés

ellentétes hatása csak látszólagos és a fokozott VEGF mRNS expresszió hatása a fehérje

szintézisre csak egy késobbi, általunk már nem vizsgált idopontban nyilvánul meg. Ez

azonban nem túl valószínu, mivel a jelen modellben a VEGF transzlációs ideje 1-2 óra és a

már fokozott fehérjeszint tartósan fennmarad. Így nem valószínu, hogy az iszkémiát követo 2.

órában talált fokozott VEGF mRNS expresszió több, mint 24 órával az iszkémiát követoen

érzékeltetné hatását.

Fontos megállapítanunk, hogy a nem iszkémizált vesékhez hasonlóan a

posztiszkémiás vesékre is jellemzo, hogy a VEGF fehérje szintjével párhuzamosan változik

100

az IL-1? és az IL-6 mRNS expressziója a DHEA kezelt állatokban. Ez tovább erosíti azt a

megállapításunkat, hogy ezeknek a citokineknek a szabályozása szoros kapcsolatban áll

egymással.

Eredményeinket összefoglalva megállapítjuk, hogy az állataink DHEA kezelése a

vese csökkent VEGF fehérje, illetve IL-1? és IL-6 mRNS expresszióhoz vezet mind a nem

iszkémizált mind, pedig az iszkémizált vesékben. Adataink a korábbi in vitro eredményekkel

összhangban a vizsgált citokinek (VEGF, IL-1? IL-6) szintézisének szoros kapcsolatára

utalnak. DHEA kezelés túlélésre kifejtett hatása feltevésünk szerint kettos: egyrészt az

irodalomból ismert antioxidáns hatása révén kedvezo lehet, másrészt a vese mikrocirkulációja

szempontjából jótékony hatású VEGF szintjének csökkentése révén kedvezotlen a túlélés

szempontjából. Ez részben magyarázhatja a DHEA kezelésnek az állatok túlélésére gyakorolt

mérsékelten kedvezo hatását.

101

8.4. A patkány VEGF izoformák detektálására kialakított real time RT-PCR-

fluoreszcens rezonancia energia transzfer rendszer eredményeink megbeszélése

Sikerült kifejlesztenünk egy olyan real time RT-PCR- fluoreszcens rezonancia energia

transzfer (FRET) rendszert, amely alkalmas a különbözo patkány VEGF izoformák egymástól

elkülönült, mRNS szintu detektálására.

A korábbiakban a VEGF detektálására két különbözo stratégia állt rendelkezésre. Az

egyik esetben a primerek mindegyike a VEGF elso öt exonjának (a VEGF elso öt exonja

minden izoformában jelen van) egy-egy szakaszával komplementer [187]. Az ezekkel a

primerekkel végzet PCR a VEGF összes izoformájában együttesen bekövetkezo mRNS

expresszió változásról ad felvilágosítást. Ennek a rendszernek az a hátránya, hogy a

különbözo VEGF izoformák mRNS expressziója összemosódik.

A másik stratégia során az egyik primer a VEGF elso öt exonjának valamelyikével a

másik primer pedig, a VEGF nyolcas exonnjával komplementer (az elso öt és a nyolcas exon

minden izoformában jelen van) [133]. Ebben az esetben egy PCR reakció során, elvileg a

mintában lévo összes izoforma detektálásra kerül és azok az agaróz gélben való futtatás során

hosszuk alapján elkülöníthetok egymástól. Ebben a rendszerben azonban az egyes izoformák

között kompetició van, az egyes izoformák gátolhatják egymás amplifikációját a PCR során.

Ezért ez a rendszer nem alkalmas a különbözo minták közötti mennyiségi összehasonlításra.

Az általunk fejlesztet rendszerben az egyik primer a VEGF elso öt exonjának

valamelyikével, míg a másik primer az egyes izoformákra specifikus exon-exon határokkal

komplementer. Ez a rendszer alkalmas a VEGF izoformáinak egymástól teljesen független

detektálására. Rendszerünk kiküszöböli a korábbi mérési stratégiák hibáit, alkalmas a VEGF

izoformáinak tényleges mennyiségét meghatározni a különbözo szövetekben. Mindez

lehetové teszi, hogy a különbözo kísérleti rendszerekben külön-külön vizsgáljuk meg az egyes

VEGF izoformák mennyiségét, egymáshoz viszonyított arányát. Így vizsgálhatóvá váltak az

egyes izoformák közti tényleges biológiai különbségek.

Méréseink során sikerült kimutatni egy új patkány VEGF izoformát, a már ismert

humán 206-os VEGF izoforma megfelelojét. A molekula teljes jellemzéséhez azonban hátra

van a teljes patkány VEGF 205-ös izoforma cDNS könyvtárból való izolálása, a molekula

klónozása és szekvenálása. E nélkül csak abban lehetünk biztosak, hogy a humán VEGF 6b

102

exonhoz hasonlóan a patkányok ezzel homológ intronikus szakasza is kódoló szakasszá válik

gén alternatív splicingja során.

8.5. A VEGF promoter polimorfizmus ainak és a kis születési súlyú koraszülöttek

retinopátia kockázatának megbeszélése

A VEGF +405C allélja, valamint a -460TT/+405CC haplotípus elofordulása szignifikánsan

gyakoribb volt a krioterápiát vagy fotokoagulációs kezelést igénylo retinopátiában szenvedo

kis születési súlyú koraszülöttekben (VLBW). Ez függetlennek bizonyult a koraszülötteknél

alkalmazott oxigénterápiától és a születési kortól egyaránt, melyek a ROP jól ismert

rizikótényezoi [156].

Adataink a vizsgált VEGF polimorfizmusoknak a kis születési súlyú koraszütöttek

retinopátiájának kialakulásában betöltött szerepére utalnak. Eredményeinkkel összhangban, a

diabéteszes retinopátia kapcsán - melynek patomechanizmusa hasonlít a ROP-éhoz - is leírták

a +405C allél fokozott elofordulási gyakoriságát [159]. Továbbá a diabéteszes retinopátiások

haplotípus analízise is felhívta a figyelmet a VEGF T-460C és a VEGF G+405C SNP-k

jelentoségére.

Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a különbözo VEGF genotípusok és a ROP rizikója

közötti kapcsolatot a gentípusnak a VEGF szintézisére kifejtett hatásai teremtik meg. Atawa

és munkatársai a homozigóta VEGF +405C allélt hordozók szérumát vizsgálva fokozott VEGF

szintet igazoltak [159]. Watson és munkatársai ugyanakkor alacsonyabb VEGF szinteket

találtak a homozigóta VEGF +405C allél hordozók LPS-sel indukált fehérvérsejtjeinek

felülúszójában [158]. A két cikk közti különbséget a felhasznált modell és a metodikai

különbségek magyarázhatják.

Adataink alapján az sem zárható ki, hogy a ROP rizikója független a VEGF T -460C és a

VEGF G+405C SNP-knek a VEGF szintézisét befolyásoló hatásaitól. Nem szabad ugyanis

megfeledkeznünk arról sem, hogy a VEGF génhez szoros közelségben számos más a ROP

patomechanizmusában esetleg szintén szerepet játszó gén (EGE-R, FGF-R, HSP72) is van.

Eredményeink nem zárják ki, hogy más géneknek az általunk vizsgált SNP-kel való kapcsolt

öröklodése az eredményeink hátterében lévo valódi ok.

Mindazonáltal adataink arra utalnak, hogy a VEGF G+405C és T-460C SNP-k vizsgálata

hasznos információt ad a kis születési súlyú koraszülöttek ROP rizikójának becslésére.

103

9. EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE

Vizsgálataink eredményeit a célkituzések címu fejezetnek (6.1 - 6.3) megfeleloen az

alábbiakban összegezzük.

9.1. A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben

1. A vese I/R patkánymodellünkben változatlan VEGF mRNS expresszió mellett fokozott

VEGF fehérje szintet találtunk a posztiszkémiás vesékben. Adataink a VEGF

szintézis ének poszt-transzkripciós szintu szabályzására utalnak az iszkémizált vesében.

2. Fokozott VEGF immunoreaktivitást találtunk a vese kéreg-velo határán. Mivel a VEGF

szintézis legerosebb induktora a hipoxia, a vese kéreg-velo határának alacsony parciális

oxigénnyomása és magas energiafelhasználása magyarázhatja a fokozott VEGF

immunopozitivitását.

A nem iszkemizált, kontroll vesék tubuláris epitélsejtjeiben a VEGF immunreaktivitás

diffúzan, az egész citoplazmára kiterjedoen jelen volt. A posztiszkémiás vesében a VEGF

immunoreaktivitás, átmeneti bazolaterális elmozdulását figyeltük meg a T2 vesék

tubuláris epitélsejtjeiben. Mivel a vese hematoxilin-eozin festése is hasonló képet

mutatott, a VEGF immunoreaktivitás bazolaterális elmozdulását a posztiszkémiás

sejtkárosodás nem specifikus jelének tart juk.

3. Az interleukin 6 (IL-6) mRNS expressziója, illetve a VEGF fehérje szintje párhuzamosan

fokozódott a posztiszkémiás vesékben. Ez az irodalommal összhangban a két citokin

szintézisének szoros kapcsolatára utal.

9.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelés hatásának

vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben

4. Az állatok hisztamin kezelés e rontotta, míg a hisztamin kettes receptor antagonista

ranitidin kezelése javította a vese iszkémiát követo túlélést.

104

5. A kontroll állatokban a vese VEGF mRNS expressziója a kísérlet alatt nem változott. A

hisztamin kezelt állatok posztiszkémiás veséiben a VEGF mRNS expressziója fokozódott.

A ranitidin kezelt állatok VEGF mRNS expressziója tizenhat órával a vese iszkémiát

követoen a kiindulási értékhez képest csökkent. Az IL-6 mRNS expressziója egyik

kezelési csoportban sem volt detektálható a vese iszkémiát megelozoen. Két órával a vese

iszkémiát követoen az IL-6 mRNS expressziója minden csoportban megemelkedett, a

legmagasabb értéket a hisztamin kezelt állatokban érte el. Tizenhat órával a vese

iszkémiát követoen a ranitidin kezelt állatok IL-6 mRNS expressziója volt a

legalacsonyabb, de minden csoportban csökkent a T2 értékekhez képest.

6. Fokozott VEGF fehérje szintet találtunk minden kezelési csoport posztiszkémiás veséiben.

A ranitidinnel kezelt állatokban volt a legdinamikusabb VEGF szintézisének fokozódás a.

Adataink demonstrálják, hogy a hisztamin kettes receptorán keresztül szerepet játszik a

vese akut I/R károsodásának mechanizmusában. Ezekben a folyamatokban szerepe lehet a

vese I/R károsodás során fokozódó VEGF szintézisnek is.

9.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese

iszkémia/reperfúziós patkánymodellben

7. DHEA kezelés javította az állatok vese iszkémiáját követo túlélését. Eredményeink

összhangban vannak mások vese I/R modellben kapott eredményeivel.

8. Kísérletünk során a DHEA kezelés fokozta a posztiszkémiás vesék VEGF mRNS

expresszióját, ugyanakkor minden idopontban csökkentette az IL-1??és az IL-6 mRNS

expresszióját.

9. Bár a posztiszkémiás vesékben, mindkét csoportban fokozott VEGF fehérjeszintet

találtunk a DHEA kezelés minden idopontban csökkentette a vesék VEGF szint

emelkedésének mértékét. A DHEA kezelés túlélésre kifejtett hatása feltevésünk szerint

kettos: egyrészt antioxidáns hatása révén kedvezo, másrészt a vese mikrocirkulációja

szempontjából jótékony hatású VEGF szintjének relatív csökkentése révén kedvezotlen a

túlélés szempontjából.

105


10. Készítettünk két olyan rekombináns DNS molekulát, amelyeket kontrollként használva

sikerült kialakítani egy, a különbözo VEGF izoformákra specifikus real time

PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer rendszert. Ez a rendszer alkalmas az egyes

patkány VEGF izoformáknak a különbözo szövetekboli mennyiségi meghatározására.

11. Feltételezésünkkel összhangban sikerült patkány veseszövetbol kimutatni a humán

mintákban már leírt 205-ös VEGF izoformát.

9.5. A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiája

közti kapcsolat vizsgálata

12. A VEGF +405C allélja, valamint a -460TT/+405CC haplotípus elofordulása gyakoribb volt a

krioterápiát vagy fotokoagulációs kezelést igénylo retinopátiában szenvedo kis születési

súlyú koraszülöttekben (VLBW). Adataink alapján a VEGF G+405C és T-460C

polimorfizmusok vizsgálata segíthet a kis születési súlyú koraszülöttek ROP rizikójának

becslésekor.

106

10. IRODALOMJEGYZÉK

1. Damert A, Miquerol L, Gertsenstein M, Risau W, Nagy A. Insufficient VEGFA activity in

yolk sac endoderm compromises haematopoietic and endothelial differentiation.

Development. 129: 1881-1892, 2002.

2. Takeshita S, Rossow ST, Kearney M, Zheng LP, Bauters C, Bunting S, Ferrara N, Symes

JF, Isner JM. Time course of increased cellular proliferation in collateral arteries after

administration of vascular endothelial growth factor in a rabbit model of lower limb vascular

insufficiency. Am J Pathol. 147: 1649-1660, 1995.

3. Senger DR, Ledbetter SR, Claffey KP, Papadopoulos-Sergiou A, Peruzzi CA, Detmar M.

Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability factor/vascular endothelial

growth factor through cooperative mechanisms involving the alphavbeta3 integrin,

osteopontin, and thrombin. Am J Pathol. 149: 293-305, 1996.

4. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer. 32A: 2413-2422, 1996.

5. Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by

hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359: 843-845, 1992.

6. Murohara T, Horowitz JR, Silver M, Tsurumi Y, Chen D, Sullivan A, Isner JM. Vascular

endothelial growth factor/vascular permeability factor enhances vascular permeability via

nitric oxide and prostacyclin. Circulation. 97: 99-107, 1998.

7. Waltham M, Burnand KG, Collins M, McGuinness CL, Singh I, Smith A. Vascular

endothelial growth factor enhances venous thrombus recanalisation and organisation.

Thromb Haemost. 89: 169-176, 2003.

8. Laitinen M, Zachary I, Breier G, Pakkanen T, Hakkinen T, Luoma J, Abedi H, Risau W,

Soma M, Laakso M, Martin JF, Yla-Herttuala S. VEGF gene transfer reduces intimal

thickening via increased production of nitric oxide in carotid arteries. Hum Gene Ther. 8:

1737-1744, 1997.

9. Scalia R, Booth G, Lefer DJ. Vascular endothelial growth factor attenuates leukocyte-

endothelium interaction during acute endothelial dysfunction: essential role of endothelium-

derived nitric oxide. FASEB J. 13: 1039-1046, 1999.

10. Alon T, Hemo I, Itin A, Pe'er J, Stone J, Keshet E. Vascular endothelial growth factor acts

as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of

prematurity. Nat Med. 1: 1024-1028, 1995.

107

11. Kanellis J, Fraser S, Katerelos M, Power DA. Vascular endothelial growth factor is a

survival factor for renal tubular epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol. 278: F905-F915,

2000.

12. Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC, Abraham JA.

The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded

through alternative exon splicing. J Biol Chem. 266: 11947-11954, 1991.

13. Kimura H, Weisz A, Kurashima Y, Hashimoto K, Ogura T, D'Acquisto F, Addeo R,

Makuuchi M, Esumi H. Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth

factor gene mediates transcriptional regulation by nitric oxide: control of hypoxia-inducible

factor-1 activity by nitric oxide. Blood. 95: 189-197, 2000.

14. Huez I, Creancier L, Audigier S, Gensac MC, Prats AC, Prats H. Two independent

internal ribosome entry sites are involved in translation initiation of vascular endothelial

growth factor mRNA. Mol Cell Biol. 18: 6178-6190, 1998.

15. Hyder SM, Nawaz Z, Chiappetta C, Stancel GM Identification of functional estrogen

response elements in the gene coding for the potent angiogenic factor vascular endothelial

growth factor. Cancer Res. 60: 3183-190, 2000.

16. Abraham JA, Whang JL, Tumolo A, Mergia A, Friedman J, Gospodarowicz D, Fiddes JC.

Human basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization. EMBO

J. 5: 2523-2528, 1986.

17. Derynck R, Jarrett JA, Chen EY, Eaton DH, Bell JR, Assoian RK, Roberts AB, Sporn

MB, Goeddel DV. Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence

and expression in normal and transformed cells. Nature. 316: 701-705,1985.

18. Ferrara N, Houck K, Jakeman L, Leung DW. Molecular and biological properties of the

vascular endothelial growth factor family of proteins. Endocr Rev. 13: 18-32, 1992.

19. Poltorak Z, Cohen T, Sivan R, Kandelis Y, Spira G, Vlodavsky I, Keshet E, Neufeld G.

VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular

matrix. J Biol Chem. 272: 7151-7158, 1997.

20. Goldberg-Cohen I, Furneauxb H, Levy AP. A 40-bp RNA element that mediates

stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by HuR. J Biol Chem. 277: 13635-

13640, 2002.

21. Ladoux A, Frelin C. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor

mRNA expression in the heart. Biochem Biophys Res Commun. 195: 1005-1010,1993.

22. Wiener CM, Booth G, Semenza GL. In vivo expression of mRNAs encoding hypoxia-

inducible factor 1. Biochem Biophys Res Commun. 225: 485-488, 1996.

108

23. Wang GL, Semenza GL. Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of

DNA binding activity by hypoxia. J Biol Chem. 268: 21513-21518, 1993.

24. Liu Y, Cox SR, Morita T, Kourembanas S. Hypoxia regulates vascular endothelial growth

factor gene expression in endothelial cells. Identification of a 5' enhancer. Circ Res. 77: 638-

643, 1995.

25. Jiang BH, Agani F, Passaniti A, Semenza GL. V-SRC induces expression of hypoxia-

inducible factor 1 (HIF-1) and transcription of genes encoding vascular endothelial growth

factor and enolase 1: involvement of HIF-1 in tumor progression. Cancer Res. 57: 5328-5335,

1997.

26. Sasaki H, Ray PS, Zhu L, Galang N, Maulik N. Oxidative stress due to

hypoxia/reoxygenation induces angiogenic factor VEGF in adult rat myocardium: possible

role of NFkappaB. Toxicology. 155: 27-35, 2000.

27. Schafer G, Cramer T, Suske G, Kemmner W, Wiedenmann B, Hocker M. Oxidative stress

regulates vascular endothelial growth factor-A gene transcription through Sp1- and Sp3-

dependent activation of two proximal GC-rich promoter elements. J Biol Chem. 278: 8190-

8198, 2003

28. Salnikow K, Kluz T, Costa M, Piquemal D, Demidenko ZN, Xie K, Blagosklonny MV.

The regulation of hypoxic genes by calcium involves c-Jun/AP-1, which cooperates with

hypoxia-inducible factor 1 in response to hypoxia. Mol Cell Biol. 22: 1734-1741, 2002.

29. Brenneisen P, Blaudschun R, Gille J, Schneider L, Hinrichs R, Wlaschek M, Em ing S,

Scharffetter-Kochanek K Essential role of an activator protein-2 (AP-2)/specificity protein 1

(Sp1) cluster in the UVB-mediated induction of the human vascular endothelial growth factor

in HaCaT keratinocytes. Biochem J. 369: 341-349, 2003.

30. Takagi H, King GL, Robinson GS, Ferrara N, Aiello LP. Adenosine mediates hypoxic

induction of vascular endothelial growth factor in retinal pericytes and endothelial cells.

Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: 2165-2176, 1996.

31. Mukhopadhyay D, Tsiokas L, Zhou XM, Foster D, Brugge JS, Sukhatme VP. Hypoxic

induction of human vascular endothelial growth factor expression through c-Src activation.

Nature. 375: 577-581, 1995.

32. Stein I, Neeman M, Shweiki D, Itin A, Keshet E. Stabilization of vascular endothelial

growth factor mRNA by hypoxia and hypoglycemia and coregulation with other ischemia-

induced genes. Mol Cell Biol. 15: 5363-5368, 1995.

33. Levy NS, Chung S, Furneaux H, Levy AP. Hypoxic stabilization of vascular endothelial

growth factor mRNA by the RNA-binding protein HuR. J Biol Chem. 273: 6417-6423, 1998.

109

34. Liu LX, Lu H, Luo Y, Date T, Belanger AJ, Vincent KA, Akita GY, Goldberg M, Cheng

SH, Gregory RJ, Jiang C. Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by

hypoxia-inducible factor 1. Biochem Biophys Res Commun. 291: 908-914, 2002.

35. Stein I, Itin A, Einat P, Skaliter R, Grossman Z, Keshet E. Translation of vascular

endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation

under hypoxia. Mol Cell Biol. 18: 3112-3119, 1998.

36. Levitas E, Chamoun D, Udoff LC, Ando M, Resnick CE, Adashi EY. Periovulatory and

interleukin-1 beta-dependent up-regulation of intraovarian vascular endothelial growth factor

(VEGF) in the rat: potential role for VEGF in the promotion of periovulatory angiogenesis

and vascular permeability. J Soc Gynecol Investig. 7: 51-60, 2000.

37. Dankbar B, Padro T, Leo R, Feldmann B, Kropff M, Mesters RM, Serve H, Berdel WE,

Kienast J. Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in paracrine tumor-stromal

cell interactions in multiple myeloma. Blood. 95: 2630-2636, 2000.

38. Gloddek J, Pagotto U, Paez Pereda M, Arzt E, Stalla GK, Renner U. Pituitary adenylate

cyclase-activating polypeptide, interleukin-6 and glucocorticoids regulate the release of

vascular endothelial growth factor in pituitary folliculostellate cells. J Endocrinol. 160: 483-

490, 1999.

39. Akagi M, Kawaguchi M, Liu W, McCarty MF, Takeda A, Fan F, Stoeltzing O, Parikh

AA, Jung YD, Bucana CD, Mansfield PF, Hicklin DJ, Ellis LM. Induction of neuropilin-1

and vascular endothelial growth factor by epidermal growth factor in human gastric cancer

cells. Br J Cancer. 88: 796-802, 2003.

40. Stavri GT, Zachary IC, Baskerville PA, Martin JF, Erusalimsky JD.Basic fibroblast

growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular

smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia. Circulation. 92: 11-14, 1995.

41. Gille J, Swerlick RA, Caughman SW. Transforming growth factor -alpha-induced

transcriptional activation of the vascular permeability factor (VPF/VEGF) gene requires AP-

2-dependent DNA binding and transactivation. EMBO J. 16: 750-759, 1997.

42. Benckert C, Jonas S, Cramer T, Von Marschall Z, Schafer G, Peters M, Wagner K, Radke

C, Wiedenmann B, Neuhaus P, Hocker M, Rosewicz S. Transforming growth factor beta 1

stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human cholangiocellular

carcinoma cells. Cancer Res. 63: 1083-1092, 2003.

43. Gruden G, Araf S, Zonca S, Burt D, Thomas S, Gnudi L, Viberti G. IGF-I induces

vascular endothelial growth factor in human mesangial cells via a Src -dependent mechanism.

Kidney Int. 63: 1249-1255, 2003

110

44. Finkenzeller G, Marme D, Weich HA, Hug H. Platelet-derived growth factor-induced

transcription of the vascular endothelial growth factor gene is mediated by protein kinase C.

Cancer Res. 52: 4821-4823, 1992.

45. M, Edwards NA, Merrill MJ. Differential expression of vascular endothelial growth factor

(vascular permeability factor) forms in rat tissues. Growth Factors. 12: 11-15, 1995.

46. Anthony FW, Wheeler T, Elcock CL, Pickett M, Thomas EJ. Short report: identification

of a specific pattern of vascular endothelial growth factor mRNA expression in human

placenta and cultured placental fibroblasts. Placenta. 15: 557-561, 1994.

47. Cheung CY, Singh M, Ebaugh MJ, Brace RA. Vascular endothelial growth factor gene

expression in ovine placenta and fetal membranes. Am J Obstet Gynecol. 173: 753-759, 1995.

48. Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N. Dual regulation of vascular

endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem.

267: 26031-26037, 1992.

49. Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth

factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 161: 851-858,

1989.

50. Park JE, Keller GA, Ferrara N. The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms:

differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of

extracellular matrix-bound VEGF. Mol Biol Cell. 4: 1317-1326, 1993.

51. Neufeld G, Cohen T, Gitay-Goren H, Poltorak Z, Tessler S, Sharon R, Gengrinovitch S,

Levi BZ. Similarities and differences between the vascular endothelial growth factor (VEGF)

splice variants. Cancer Metastasis Rev. 15: 153-158, 1996.

52. de Vries C, Escobedo JA, Ueno H, Houck K, Ferrara N, Williams LT. The fms-like

tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science. 255: 989-991,

1992.

53. Terman BI, Dougher-Vermazen M, Carrion ME, Dimitrov D, Armellino DC,

Gospodarowicz D, Bohlen P. Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for

vascular endothelial cell growth factor. Biochem Biophys Res Commun. 187: 1579-1586,

1992.

54. Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Boocock CA, Ahmed A, Plevin R, Ferrara N, Smith

SK. Vascular endothelial growth factor receptor localization and activation in human

trophoblast and choriocarcinoma cells. Biol Reprod. 51: 524-530, 1994.

111

55. Takahashi T, Shirasawa T, Miyake K, Yahagi Y, Maruyama N, Kasahara N, Kawamura

T, Matsumura O, Mitarai T, Sakai O. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and

cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem

Biophys Res Commun. 209: 218-26, 1995.

56. Barleon B, Sozzani S, Zhou D, Weich HA, Mantovani A, Marme D. Migration of human

monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the

VEGF receptor flt-1. Blood. 87: 3336-3343, 1996.

57. Katoh O, Tauchi H, Kawaishi K, Kimura A, Satow Y. Expression of the vascular

endothelial growth factor (VEGF) receptor gene, KDR, in hematopoietic cells and inhibitory

effect of VEGF on apoptotic cell death caused by ionizing radiation. Cancer Res. 55: 5687-

5692, 1995.

58. Yang K, Cepko CL. Flk-1, a receptor for vascular endothelial growth factor (VEGF), is

expressed by retinal progenitor cells. J Neurosci. 16: 6089-6099, 1996.

59. Petrova TV, Makinen T, Alitalo K. Signaling via vascular endothelial growth factor

receptors. Exp Cell Res. 253: 117-130, 1999.

60. Zachary I, Gliki G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the

vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49: 568-581, 2001.

61. Wiesmann C, Fuh G, Christinger HW, Eigenbrot C, Wells JA, de Vos AM. Crystal

structure at 1.7 A resolution of VEGF in complex with domain 2 of the Flt-1 receptor. Cell.

91: 695-704, 1997.

62. Kendall RL, Wang G, Thomas KA Identification of a natural soluble form of the vascular

endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR. Biochem


63. Keyt BA, Nguyen HV, Berleau LT, Duarte CM, Park J, Chen H, Ferrara N. Identification

of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT -1 receptors.

Generation of receptor -selective VEGF variants by site-directed mutagenesis. J Biol Chem.

271: 5638-5646, 1996.

64. Shinkai A, Ito M, Anazawa H, Yamaguchi S, Shitara K, Shibuya M. Mapping of the sites

involved in ligand association and dissociation at the extracellular domain of the kinase insert

domain-containing receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 273: 31283-

31288, 1998.

65. Tanaka K, Yamaguchi S, Sawano A, Shibuya M. Characterization of the extracellular

domain in vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1 tyrosine kinase). Jpn J Cancer

Res. 88: 867-876, 1997.

112

66. Fuh G, Li B, Crowley C, Cunningham B, Wells JA. Requirements for binding and

signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor.

J Biol Chem. 273: 11197-11204, 1998.

67. Kendall RL, Thomas KA. Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by

an endogenously encoded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 10705-10709,

1993.

68. Kendall RL, Wang G, Thomas KA. Identification of a natural soluble form of the vascular

endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR. Biochem


69. Gitay-Goren H, Soker S, Vlodavsky I, Neufeld G. The binding of vascular endothelial

growth factor to its receptors is dependent on cell surface-associated heparin-like molecules. J

Biol Chem. 267: 6093-6098, 1992.

70. Soker S, Gollamudi-Payne S, Fidder H, Charmahelli H, Klagsbrun M. Inhibition of

vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced endothelial cell proliferation by a peptide

corresponding to the exon 7-encoded domain of VEGF165. J Biol Chem. 272: 31582-31588,

1997.

71. Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsbrun M. Neuropilin-1 is expressed by

endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth

factor. Cell. 92: 735-745, 1998.

72. Jonca F, Ortega N, Gleizes PE, Bertrand N, Plouet J. Cell release of bioactive fibroblast

growth factor 2 by exon 6-encoded sequence of vascular endothelial growth factor. J Biol

Chem. 272: 24203-24209, 1997.

73. Cohen T, Gitay-Goren H, Sharon R, Shibuya M, Halaban R, Levi BZ, Neufeld G.

VEGF121, a vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform lacking heparin binding

ability, requires cell-surface heparan sulfates for efficient binding to the VEGF receptors of

human melanoma cells. J Biol Chem. 270: 11322-11326, 1995.

74. Gengrinovitch S, Berman B, David G, Witte L, Neufeld G, Ron D. Glypican-1 is a

VEGF165 binding proteoglycan that acts as an extracellular chaperone for VEGF165.

J Biol Chem. 274: 10816-10822, 1999.

75. Waltenberger J, Claesson-Welsh L, Siegbahn A, Shibuya M, Heldin CH.Different signal

transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor.

J Biol Chem. 269: 26988-26995, 1994.

113

76. Cunningham SA, Arrate MP, Brock TA, Waxham MN. Interactions of FLT-1 and KDR

with phospholipase C gamma: identification of the phosphotyrosine binding sites.

Biochem Biophys Res Commun. 240: 635-639, 1997.

77. Ito N, Wernstedt C, Engstrom U, Claesson-Welsh L. Identification of vascular endothelial

growth factor receptor-1 tyrosine phosphorylation sites and binding of SH2 domain-

containing molecules. J Biol Chem. 273: 23410-23418, 1998.

78. Hiratsuka S, Minowa O, Kuno J, Noda T, Shibuya M. Flt-1 lacking the tyrosine kinase

domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U

S A. 95: 9349-9354, 1998.

79. Chou MT, Wang J, Fujita DJ. Src kinase becomes preferentially associated with the

VEGFR, KDR/Flk-1, following VEGF stimulation of vascular endothelial cells. BMC

Biochem. 3: 32-43, 2002.

80. Takahashi N, Seko Y, Noiri E, Tobe K, Kadowaki T, Sabe H, Yazaki Y. Vascular

endothelial growth factor induces activation and subcellular translocation of focal adhesion

kinase (p125FAK) in cultured rat cardiac myocytes. Circ Res. 84: 1194-1202, 1999.

81. Dougher-Vermazen M, Hulmes JD, Bohlen P, Terman BI. Biological activity and

phosphorylation sites of the bacterially expressed cytosolic domain of the KDR VEGF-

receptor. Biochem Biophys Res Commun. 205: 728-738, 1994.

82. Takahashi T, Ueno H, Shibuya M. VEGF activates protein kinase C-dependent, but Ras-

independent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells.

Oncogene. 18: 2221-2230, 1999.

83. D'Angelo G, Martini JF, Iiri T, Fantl WJ, Martial J, Weiner RI. 16K human prolactin

inhibits vascular endothelial growth factor-induced activation of Ras in capillary endothelial

cells. Mol Endocrinol. 13: 692-704, 1999.

84. Kroll J, Waltenberger J. The vascular endothelial growth factor receptor KDR activates

multiple signal transduction pathways in porcine aortic endothelial cells. J Biol Chem. 272:

32521-32527, 1997.

85. Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N. Vascular

endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol

3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol

Chem. 273: 30336-30343, 1998.

114

86. Matsumoto Y, Tanaka K, Hirata G, Hanada M, Matsuda S, Shuto T, Iwamoto Y. Possible

involvement of the vascular endothelial growth factor-Flt-1-focal adhesion kinase pathway in

chemotaxis and the cell proliferation of osteoclast precursor cells in arthritic joints. J

Immunol. 168: 5824-5831, 2002.

87. Carmeliet P, Ferreira V, Breier G, Pollefeyt S, Kieckens L, Gertsenstein M, Fahrig M,

Vandenhoeck A, Harpal K, Eberhardt C, Declercq C, Pawling J, Moons L, Collen D, Risau

W, Nagy A. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single

VEGF allele. Nature. 380: 435-439,1996.

88. Fong GH, Rossant J, Gertsenstein M, Breitman ML. Role of the Flt-1 receptor tyrosine

kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature. 376: 66-70, 1995.

89. Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi TP, Gertsenstein M, Wu XF, Breitman ML, Schuh AC.

Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376:

62-66, 1995.

90. Connolly DT, Olander JV, Heuvelman D, Nelson R, Monsell R, Siegel N, Haymore BL,

Leimgruber R, Feder J. Human vascular permeability factor. Isolation from U937 cells. J Biol

Chem. 264: 20017-20024, 1989.

91. Stacker SA, Vitali A, Caesar C, Domagala T, Groenen LC, Nice E, Achen MG, Wilks AF.

A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2

activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274: 34884-34892,

1999.

92. Wu HM, Yuan Y, Zawieja DC, Tinsley J, Granger HJ. Role of phospholipase C, protein

kinase C, and calcium in VEGF-induced venular hyperpermeability. Am J Physiol. 276:

H535-H542, 1999.

93. Esser S, Wolburg K, Wolburg H, Breier G, Kurzchalia T, Risau W. Vascular endothelial

growth factor induces endothelial fenestrations in vitro. J Cell Biol. 140:947-959, 1998.

94. Fischer S, Clauss M, Wiesnet M, Renz D, Schaper W, Karliczek GF. Hypoxia induces

permeability in brain microvessel endothelial cells via VEGF and NO. Am J Physiol. 276:

C812-C820, 1999.

95. Qu-Hong, Nagy JA, Senger DR, Dvorak HF, Dvorak AM. Ultrastructural localization of

vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal

plasma membrane and vesiculovacuolar organelles of tumor microvascular endothelium. J

Histochem Cytochem. 43: 381-389, 1995.

115

96. Pedram A, Razandi M, Levin ER. Extracellular signal-regulated protein kinase/Jun kinase

cross-talk underlies vascular endothelial cell growth factor-induced endothelial cell

proliferation. J Biol Chem. 273: 26722-26728, 1998.

97. Wellner M, Maasch C, Kupprion C, Lindschau C, Luft FC, Haller H. The proliferative

effect of vascular endothelial growth factor requires protein kinase C-alpha and protein kinase

C-zeta. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19: 178-185, 1999.

98. Shizukuda Y, Tang S, Yokota R, Ware JA. Vascular endothelial growth factor-induced

endothelial cell migration and proliferation depend on a nitric oxide-mediated decrease in

protein kinase Cdelta activity. Circ Res. 85: 247-256, 1999.

99. Harrington EO, Loffler J, Nelson PR, Kent KC, Simons M, Ware JA. Enhancement of

migration by protein kinase Calpha and inhibition of proliferation and cell cycle progression

by protein kinase Cdelta in capillary endothelial cells. J Biol Chem. 272: 7390-7397, 1997.

100. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386: 671-674, 1997.

101. Lamoreaux WJ, Fitzgerald ME, Reiner A, Hasty KA, Charles ST. Vascular endothelial

growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of

metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro. Microvasc Res. 55: 29-42,

1998.

102. Abedi H, Zachary I. Signalling mechanisms in the regulation of vascular cell migration.

Cardiovasc Res. 30: 544-556, 1999.

103. Rousseau S, Houle F, Kotanides H, Witte L, Waltenberger J, Landry J, Huot J. Vascular

endothelial growth factor (VEGF)-driven actin-based motility is mediated by VEGFR2 and

requires concerted activation of stress-activated protein kinase 2 (SAPK2/p38) and

geldanamycin-sensitive phosphorylation of focal adhesion kinase. J Biol Chem. 275: 10661-

10672, 2000.

104. Noiri E, Hu Y, Bahou WF, Keese CR, Giaever I, Goligorsky MS. Permissive role of

nitric oxide in endothelin-induced migration of endothelial cells. J Biol Chem. 272: 1747-

1752, 1997.

105. Goligorsky MS, Abedi H, Noiri E, Takhtajan A, Lense S, Romanov V, Zachary I. Nitric

oxide modulation of focal adhesions in endothelial cells. Am J Physiol. 276: C1271-C1281,

1999.

106. Dimmeler S, Dernbach E, Zeiher AM. Phosphorylation of the endothelial nitric oxide

synthase at ser-1177 is required for VEGF-induced endothelial cell migration. FEBS Lett.

477: 258-262, 2000.

116

107. Plate KH, Breier G, Risau W. Molecular mechanisms of developmental and tumor

angiogenesis. Brain Pathol. 4: 207-218, 1994.

108. Carmeliet P, Ng YS, Nuyens D, Theilmeier G, Brusselmans K, Cornelissen I, Ehler E,

Kakkar VV, Stalmans I, Mattot V, Perriard JC, Dewerchin M, Flameng W, Nagy A, Lupu F,

Moons L, Collen D, D'Amore PA, Shima DT. Impaired myocardial angiogenesis and

ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms

VEGF164 and VEGF188. Nat Med. 5: 495-502, 1999.

109. Folkman J. Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res. 43: 175-203, 1985.

110. Shepherd FA. Angiogenesis inhibitors in the treatment of lung cancer.

Lung Cancer. 34: S81-S89, 2001.

111. Berlin JD. Targeting vascular endothelial growth factor in colorectal cancer.

Oncology. 16: S13-S15, 2002.

112. Tran J, Rak J, Sheehan C, Saibil SD, LaCasse E, Korneluk RG, Kerbel RS. Marked

induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular

endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 264: 781-788, 1999.

113. Thakker GD, Hajjar DP, Muller WA, Rosengart TK. The role of phosphatidylinositol 3-

kinase in vascular endothelial growth factor signaling. J Biol Chem. 274: 10002-10007, 1999.

114. Tran J, Rak J, Sheehan C, Saibil SD, LaCasse E, Korneluk RG, Kerbel RS. Marked

induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular

endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 264: 781-788, 1999.

115. Abedi H, Zachary I. Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine

phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin

in endothelial cells. J Biol Chem. 272: 15442-15451, 1997.

116. Liu ZY, Ganju RK, Wang JF, Schweitzer K, Weksler B, Avraham S, Groopman JE.

Characterization of signal transduction pathways in human bone marrow endothelial cells.

Blood. 90: 2253-2259, 1997.

117. Ilan N, Mahooti S, Madri JA. Distinct signal transduction pathways are utilized during

the tube formation and survival phases of in vitro angiogenesis. J Cell Sci. 111: 3621-3631,

1998.

118. Sarkar R, Gordon D, Stanley JC, Webb RC. Dual cell cycle-specific mechanisms

mediate the antimitogenic effects of nitric oxide in vascular smooth muscle cells. J Hypertens.

15: 275-283, 1997.

117

119. Kothapalli D, Stewart SA, Smyth EM, Azonobi I, Pure E, Assoian RK. Prostacylin

receptor activation inhibits proliferation of aortic smooth muscle cells by regulating cAMP

response element-binding protein- and pocket protein-dependent cyclin a gene expression.

Mol Pharmacol. 64: 249-258, 2003.

120. Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. An L-arginine/nitric oxide pathway present in

human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 87: 5193-5197, 1990.

121. Moncada S, Herman AG, Higgs EA, Vane JR. Differential formation of prostacyclin

(PGX or PGI2) by layers of the arterial wall. An explanation for the anti-thrombotic

properties of vascular endothelium. Thromb Res. 11: 323-344, 1977.

122. Zachary I, Mathur A, Yla-Herttuala S, Martin J. Vascular protection: A novel

nonangiogenic cardiovascular role for vascular endothelial growth factor. Arterioscler

Thromb Vasc Biol. 20: 1512-1520, 2000.

123. Garcia-Cardena G, Fan R, Shah V, Sorrentino R, Cirino G, Papapetropoulos A, Sessa

WC. Dynamic activation of endothelial nitric oxide synthase by Hsp90.

Nature. 392: 821-824, 1998.

124. Wheeler-Jones C, Abu-Ghazaleh R, Cospedal R, Houliston RA, Martin J, Zachary I.

Vascular endothelial growth factor stimulates prostacyclin production and activation of

cytosolic phospholipase A2 in endothelial cells via p42/p44 mitogen-activated protein kinase.

FEBS Lett. 420: 28-32, 1997.

125. Flores J, DiBona DR, Beck CH, Leaf A. The role of cell swelling in ischemic renal

damage and the protective effect of hypertonic solute. J Clin Invest. 51: 118-126, 1972.

126. Summers WK, Jamison RL. The no reflow phenomenon in renal ischemia.

Lab Invest. 25: 635-643, 1971.

127. Basile DP, Donohoe D, Roethe K, Osborn JL. Renal ischem ic injury results in permanent

damage to peritubular capillaries and influences long-term function.

Am J Physiol Renal Physiol. 281: F887-F899, 2001.

128. Sutton TA, Fisher CJ, Molitoris BA. Microvascular endothelial injury and dysfunction

during ischemic acute renal failure. Kidney Int. 62: 1539-1549, 2002.

129. Banai S, Shweiki D, Pinson A, Chandra M, Lazarovici G, Keshet E. Upregulation of

vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia: implications

for coronary angiogenesis. Cardiovasc Res. 28: 1176-1179, 1994.

130. Bernaudin M, Tang Y, Reilly M, Petit E, Sharp FR. Brain genomic response following

hypoxia and re-oxygenation in the neonatal rat: Identification of genes that might contribute

to hypoxia-induced ischemic tolerance. J Biol Chem. 277: 39728-39738, 2002.

118

131. Christou H, Yoshida A, Arthur V, Morita T, Kourembanas S. Increased vascular

endothelial growth factor production in the lungs of rats with hypoxia-induced pulmonary

hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 18: 768-776, 1998.

132. Rissanen TT, Vajanto I, Hiltunen MO, Rutanen J, Kettunen MI, Niemi M, Leppanen P,

Turunen MP, Markkanen JE, Arve K, Alhava E, Kauppinen RA, Yla-Herttuala S. Expression

of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2

(KDR/Flk-1) in ischemic skeletal muscle and its regeneration. Am J Pathol. 160: 1393-1403,

2002.

133. Kanellis J, Mudge SJ, Fraser S, Katerelos M, Power DA. Redistribution of cytoplasmic

VEGF to the basolateral aspect of renal tubular cells in ischemia-reperfusion injury. Kidney

Int. 57: 2445-2456, 2000.

134. Kanellis J, Paizis K, Cox AJ, Stacker SA, Gilbert RE, Cooper ME, Power DA. Renal

ischemia-reperfusion increases endothelial VEGFR-2 without increasing VEGF or VEGFR-1

expression. Kidney Int. 61: 1696-1706, 2002.

135. Schweda F, Blumberg FC, Schweda A, Nabel C, Holmer SR, Riegger GA, Pfeifer M,

Kramer BK. Effects of chronic hypoxia on renal PDGF-A, PDGF-B, and VEGF gene

expression in rats. Nephron. 86: 161-166, 2000.

136. Kaneko H, Koshi S, Hiraoka T, Miyauchi Y, Kitamura N, Inoue M. Inhibition of post-

ischemic reperfusion injury of the kidney by diamine oxidase. Biochim Biophys Acta. 1407:

193-199, 1998.

137. Juhlin L, Baekken T. Histamine induced increase of basophil and eosinophil leukocytes

in inflammatory exudates. Acta Derm Venereol. 45: 349-354, 1965.

138. Bell L, Madri JA. Effect of platelet factors on migration of cultured bovine aortic

endothelial and smooth muscle cells. Circ Res. 65: 1057-1065, 1989.

139. Mortillaro NA, Granger DN, Kvietys PR, Rutili G, Taylor AE. Effects of histamine and

histamine antagonists on intestinal capillary permeability. Am J Physiol. 240: G381-G386,

1981.

140. Radke KJ, Selkurt EE, Willis LR. The role of histamine H1 and H2 receptors in the

canine kidney. Ren Physiol. 8: 100-111, 1985.

141. Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. Enhancement by histamine of vascular endothelial

growth factor production in granulation tissue via H(2) receptors. Br J Pharmacol. 134: 1419-

1428, 2001.

119

142. Baulieu EE, Corp'echot C, Dray F, Emiliozzi R, Lebeau MC, Mauvais -Jarvis P, Robel P.

An adrenal-secreted "androgen": dehydroisoandrosterone sulfate. Its metabolism and a

tentative generalization on the metabolism of other steroid conjugates in man. Recent Prog

Horm Res. 21: 411-500, 1965.

143. Kawano H, Yasue H, Kitagawa A, Hirai N, Yoshida T, Soejima H, Miyamoto S, Nakano

M, Ogawa H. Dehydroepiandrosterone supplementation improves endothelial function and

insulin sensitivity in men. J Clin Endocrinol Metab. 88: 3190-3195, 2003.

144. Feldman HA, Johannes CB, Araujo AB, Mohr BA, Longcope C, McKinlay JB. Low

dehydroepiandrosterone and ischemic heart disease in middle-aged men: prospective results

from the Massachusetts Male Aging Study. Am J Epidemiol. 153: 79-89, 2001.

145. Jesse RL, Loesser K, Eich DM, Qian YZ, Hess ML, Nestler JE. Dehydroepiandrosterone

inhibits human platelet aggregation in vitro and in vivo. Ann N Y Acad Sci. 774: 281-290,

1995.

146. Williams MR, Ling S, Dawood T, Hashimura K, Dai A, Li H, Liu JP, Funder JW, Sudhir

K, Komesaroff PA. Dehydroepiandrosterone inhibits human vascular smooth muscle cell

proliferation independent of ARs and ERs. J Clin Endocrinol Metab. 87: 176-181, 2002.

147. Simoncini T, Mannella P, Fornari L, Varone G, Caruso A, Genazzani AR.

Dehydroepiandrosterone modulates endothelial nitric oxide synthesis via direct genomic and

nongenomic mechanisms. Endocrinology. 144: 3449-3455, 2003.

148. Liu D, Dillon JS. Dehydroepiandrosterone activates endothelial cell nitric-oxide synthase

by a specific plasma membrane receptor coupled to Galpha(i2,3). J Biol Chem. 277: 21379-

21388, 2002.

149. Lohman R, Yowell R, Barton S, Araneo B, Siemionow M. Dehydroepiandrosterone

protects muscle flap microcirculatory hemodynamics from ischemia/reperfusion injury: an

experimental in vivo study. J Trauma. 42: 74-80, 1997.

150. Ayhan S, Tugay C, Norton S, Araneo B, Siemionow M. Dehydroepiandrosterone

protects the microcirculation of muscle flaps from ischemia-reperfusion injury by reducing

the expression of adhesion molecules. Plast Reconstr Surg. 111: 2286-2294, 2003.

151. Mitchell LE, Sprecher DL, Borecki IB, Rice T, Laskarzewski PM, Rao DC. Evidence for

an association between dehydroepiandrosterone sulfate and nonfatal, premature myocardial

infarction in males. Circulation. 89: 89-93, 1994.

152. Aragno M, Parola S, Brignardello E, Mauro A, Tamagno E, Manti R, Danni O, Boccuzzi

G. Dehydroepiandrosterone prevents oxidative injury induced by transient

ischemia/reperfusion in the brain of diabetic rats. Diabetes. 49: 1924-1931, 2000.

120

153. Aragno M, Cutrin JC, Mastrocola R, Perrelli MG, Restivo F, Poli G, Danni O, Boccuzzi

G. Oxidative stress and kidney dysfunction due to ischemia/reperfusion in rat: attenuation by

dehydroepiandrosterone. Kidney Int. 64: 836-843, 2003. 154. Provis JM. Development of the primate retinal vasculature. Prog Retin Eye Res.

20: 799-821, 2001.

155. Wheatley CM, Dickinson JL, Mackey DA, Craig JE, Sale MM. Retinopathy of

prematurity: recent advances in our understanding. Br J Ophthalmol. 86: 696-700, 2002.

156. Smith LE. Pathogenesis of retinopathy of prematurity. Acta Paediatr Suppl. 437: S26-

S28, 2002

157. Ng YK, Fielder AR, Shaw DE, Levene MI. Epidemiology of retinopathy of prematurity.

Lancet. 2: 1235-1238, 1988.

158. Watson CJ, Webb NJ, Bottomley MJ, Brenchley PE. Identification of polymorphisms within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in

VEGF protein production. Cytokine. 12: 1232-11235, 2000.

159. Awata T, Inoue K, Kurihara S, Ohkubo T, Watanabe M, Inukai K, Inoue I, Katayama S.

A common polymorphism in the 5'-untranslated region of the VEGF gene is associated with

diabetic retinopathy in type 2 diabetes. Diabetes. 51: 1635-1639, 2002.

160. Vasarhelyi B, Bencsik P, Treszl A, Bardoczy Z, Tulassay T, Szathmari M. The effect of

physiologic hyperinsulinemia during an oral glucose tolerance test on the levels of

dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfate (DHEAS) in healthy young adults born with

low and with normal birth weight. Endocr J. 50: 689-695, 2003. 161. Strehlau J, Pavlakis M, Lipman M, Shapiro M, Vasconcellos L, Harmon W, Strom TB.

Quantitative detection of immune activation transcripts as a diagnostic tool in kidney

transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 695-700, 1997.

162. Siegling A, Lehmann M, Platzer C, Emmrich F, Volk HD. A novel multispecific

competitor fragment for quantitative PCR analysis of cytokine gene expression in rats. J

Immunol Methods. 177: 23-28, 1994.

163. An international classification of retinopathy of prematurity. Prepared by an international

committee. Br J Ophthalmol. 68: 690-697, 1984

164. Matsui H, Ihara Y, Fujio Y, Kunisada K, Akira S, Kishimoto T, Yamauchi-Takihara K. Induction of interleukin (IL) -6 by hypoxia is mediated by nuclear factor (NF)-kappa B and

NF-IL6 in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 42: 104-112, 1999.

165. Yan SF, Tritto I, Pinsky D, Liao H, Huang J, Fuller G, Brett J, May L, Stern D.

Induction of interleukin 6 (IL-6) by hypoxia in vascular cells. Central role of the binding site

for nuclear factor-IL-6. J Biol Chem. 270: 11463-11471, 1995.

121

166. Yamagiwa Y, Marienfeld C, Meng F, Holcik M, Patel T.Translational regulation of x-

linked inhibitor of apoptosis protein by interleukin-6: a novel mechanism of tumor cell

survival. Cancer Res. 64: 1293-1298, 2004. 167. Crew JP, Fuggle S, Bicknell R, Cranston DW, de Benedetti A, Harris AL. Eukaryotic

initiation factor-4E in superficial and muscle invasive bladder cancer and its correlation with

vascular endothelial growth factor expression and tumour progression.

Br J Cancer. 82: 161-166, 2000.

168. Stein I, Itin A, Einat P, Skaliter R, Grossman Z, Keshet E. Translation of vascular

endothelial growth factor mRNA by internal ribosome entry: implications for translation

under hypoxia. Mol Cell Biol. 18: 3112-3119, 1998.

169. Brezis M, Rosen S. Hypoxia of the renal medulla-its implications for disease. N Engl J

Med. 332: 647-655, 1995. 170. Brezis M, Epstein FH. Cellular mechanisms of acute ischemic injury in the kidney. Annu

Rev Med. 44: 27-37, 1993.

171. Ashworth SL, Molitoris BA. Pathophysiology and functional significance of apical

membrane disruption during ischemia. Curr Opi n Nephrol Hypertens. 8: 449-458, 1999.

172. Brown D, Lee R, Bonventre JV. Redistribution of villin to proximal tubule basolateral

membranes after ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 273: F1003-F1012, 1997.

173. Aufricht C, Ardito T, Thulin G, Kashgarian M, Siegel NJ, Van Why SK. Heat-shock

protein 25 induction and redistribution during actin reorganization after renal ischemia. Am J

Physiol. 274: F215-F222, 1998. 174. Akdis CA, Blaser K. Histamine in the immune regulation of allergic inflammation. J

Allergy Clin Immunol. 112: 15-22, 2003.

175. Shah BH, Lashari I, Rana S, Saeed O, Rasheed H, Arshad Saeed S. Synergistic

interaction of adrenaline and histamine in human platelet aggregation is mediated through

activation of phospholipase, map kinase and cyclo-oxygenase pathways. Pharmacol Res . 42:

479-483, 2000.

176. Okajima K, Harada N, Uchiba M. Ranitidine reduces ischemia/reperfusion-induced liver

injury in rats by inhibiting neutriphil activation. J Pharmacol Exp Ther. 301: 1157-1165,

2002. 177. Caty MG, Schmeling DJ, Friedl HP, Oldham KT, Guice KS, Till GO. Histamine: a

promoter of xantine oxidase activity in intestinal ischemia/reperfusion. J Pediatr Surg. 25:

218-223, 1990.

178. Fujiskai J, Fujimoto K, Oohara A, Sakata T, Hirano M, Ohyama T, Iwakiri R,

Yamaguchi M. Roles of histamine and diamine oxidase in mucosa of rat small intestine after

ischemia-reperfusion. Dig Dis Sci. 38: 1195-1200, 1993.

Formázott: Magyar

122

179. Delneste Y, Lassalle P, Jeannin P, Joseph M, Tonnel AB, Gosset P. Histamine induces

IL-6 production by human endothelial cells. Clin Exp Immunol. 98: 344-349, 1994.

180. Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. Enhancement by histamine of vascular endothelial growth factor production in granulation tissue via H(2) receptors. Br J Pharmacol. 134: 1419-

1428, 2001.

181. Kimura M, Tanaka S, Yamada Y, Kiuchi Y, Yamakawa T, Sekihara H.

Dehydroepiandrosterone decreases serum tumor necrosis factor -alpha and restores insulin

sensitivity: independent effect from secondary weight reduction in genetically obese Zucker

fatty rats. Endocrinology. 139: 3249-3253, 1998.

182. Straub RH, Konecna L, Hrach S, Rothe G, Kreutz M, Scholmerich J, Falk W, Lang B.

Serum dehydroepiandrosterone (DHEA) and DHEA sulfate are negatively correlated with

serum interleukin-6 (IL-6), and DHEA inhibits IL-6 secretion from mononuclear cells in man in vitro: possible link between endocrinosenescence and immunosenescence. J Clin

Endocrinol Metab. 83: 2012-2017, 1998.

183. Hebert MJ, Gullans SR, Mackenzie HS, Brady HR. Apoptosis of endothelial cells is

associated with paracrine induction of adhesion molecules: evidence for an interleukin-1beta-

dependent paracrine loop. Am J Pathol. 152: 523-532, 1998.

184. Kasama T, Kobayashi K, Yajima N, Shiozawa F, Yoda Y, Takeuchi HT, Mori Y,

Negishi M, Ide H, Adachi M. Expression of vascular endothelial growth factor by synovial

fluid neutrophils in rheumatoid arthritis (RA). Clin Exp Immunol. 121: 533-538, 2000.

185. Fee D, Grzybicki D, Dobbs M, Ihyer S, Clotfelter J, Macvilay S, Hart MN, Sandor M, Fabry Z. Interleukin 6 promotes vasculogenesis of murine brain microvessel endothelial cells.

Cytokine. 12: 655-665, 2000.

186. Voronov E, Shouval DS, Krelin Y, Cagnano E, Benharroch D, Iwakura Y, Dinarello

CA, Apte RN. IL-1 is required for tumor invasiveness and angiogenesis.

Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 2645-2650, 2003.

187. Del Prete D, Forino M, Gambaro G, D'Angelo A, Baggio B, Anglani F. A comparative

kinetic RT/-PCR strategy for the quantitation of mRNAs in microdissected human renal

biopsy specimens. Exp Nephrol. 6: 563-567, 1998.

123

11. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE.

11.1. Ábrák.

1. ábra: A humán VEGF gén promoterének, kodoló szakaszának és részleges 3’ UTR-jának,

illetve FR-jának szerkezete.

2. ábra: A humán VEGF izoformániak szerkezete.

3. ábra: A VEGF receptorainak sematikus ábrája.

4. ábra: A VEGF homodimerek háromdimenziós modellje.

5. ábra: A neutropilin-1 sematikus szerkezete.

6. ábra: A VEGFR1 és a VEGFR2 fobb szignáltranszdukciós útvonalai.

7. ábra: Az endotélsejteket áthidaló VVO-k elektromikroszkópos képének háromdimenziós

rekonstrukciója.

8. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR rendszer kialakítása során felhasznált

primerek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésének sematikus ábrája.

9. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR -hez használt kompet itor felépítésének

sematikus ábrája.

10. ábra: A patkány VEGF izoformáinak szerkezete.

11. ábra: Az ábra a VEGF 120-as izoformáján keresztül mutatja be a VEGF izoformákra

specifikus primerek aspecifikus bekötodésének lehetoségeit.

12. ábra: A rekombináns DNS molekulák sematikus ábrája, valamint azok

nukleotidsorrendje.

13. ábra: A kontroll (A) és az iszkémizált veseminták 2 (B), illetve 24 (C) óra reperfúziót

követo hematoxilin-eozin festett metszete.

14. ábra: VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mRNS expressziójának változása a kontroll (T0) és

az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen. Reprezentatív

ábra.

15. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a kontroll (T0) és az iszkémizált


16. ábra: Az IL-6 mRNS expressziójának változása a kontroll (T 0) és az iszkémizált


17. ábra: Az IL-1? mRNS expressziójának változása a kontroll (T0) és az iszkémizált


124

18. ábra: VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban

2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen. Reprezentatív ábra.

19. ábra: A VEGF szintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban 2,

illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen.

20. ábra: A VEGF lokalizációjának immunhisztológiai vizsgálata a kontroll (T0) és az

iszkémizált vesékben.

21. ábra: A hisztamin, illetve a ranitidin kezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese

iszkémiát követo egy hetes túlélésére.

22. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a



23. ábra: Az IL-6 mRNS expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a



24. ábra: A vese VEGF szint változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt

állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 16 órával (T2, T16).

25. ábra: A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo

túlélésére.

26. ábra: A VEGF mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a

vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24).

27. ábra: A IL-1? mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese


28. ábra: A IL-6 mRNS expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese


29. ábra: A VEGF fehérje szint változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát

megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24).


plazmidokban.


plazmidokban.


plazmidokban.


plazmidokban.

125


plazmidokban.

35. ábra: A VEGF -460 lokuszának real time PCR - fluoreszcens rezonancia energia transzfer

vizsgálata.

36. ábra: A VEGF +405 lokuszának PCR-RFLP vizsgálata.

11.2. Táblázatok.

1. táblázat: A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek adatai.

2. táblázat: A kompetitív PCR termékek hosszadatai.

3. táblázat: A VEGF gén T-460C-as és a G+405C -ös polimorfizmusainak vizsgálatába bevont

201 kis születési súlyú koraszülött klinikai adatai.

4. táblázat: a patkányok szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változása a vese iszkémiát

követoen 2, illetve 24 órával (T2, T24).

5. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum kreatinin és

karbamid értékei az egyoldali vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16


6. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok tubuláris károsodása a

vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T16).

7. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum hisztamin

értékei a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T16).

8. táblázat: A DHEA, illetve PG kezelt állatok szérum kreatinin és karbamid értékei a vese


9. táblázat: A DHEA, illetve a PG kezelt állatok szérum DHEA és DHEA-S értékei a vese


10. táblázat: A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP

fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis

születési súlyú koraszülöttekben.

11. táblázat: A VEGF polimorfizmus-haplotípusok megoszlása a ROP fokozott kockázata

miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú

koraszülöttekben.

126

12. PUBLIKÁCIÓS LISTA

1. Vannay Á, Fekete A, Ádori C, Tóth T, Losonczy G, László L, Vásarhelyi B, Tulassay T,

Szabó A. Divergence of renal VEGF mRNA expression and protein level in postischemic

rat kidneys. Exp Physiol. 2004. (IF: 1,22)

2. Vannay Á, Fekete A, Müller V, Strehlau J, Viklicky O, Veres T, Reusz G, Tulassay T,

Szabó AJ. Effects of histamine and the H2 receptor antagonist ranitidine on ischemia-

induced acute renal failure: involvement of IL-6 and vascular endothelial growth factor.

Kidney Blood Press Res. 27: 105-113, 2004. (IF: 1,025)

3. Fekete A, Vannay Á, Vér Á, Vásárhelyi B, Müller V, Ouyang N, Reusz G, Tulassay T,

Szabó AJ. Sex differences in the alterations of Na(+), K(+)-ATPase following ischaemia-

reperfusion injury in the rat kidney. J Physiol. 555: 471-480, 2004. (IF: 4,352)

4. Fekete A, Treszl A, Toth-Heyn P, Vannay Á, Tordai A, Tulassay T, Vásárhelyi B.

Association between heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in

premature neonates. Pediatr Res. 54: 452-455, 2003. (IF: 3,064)

5. Müller V, Losonczy G, Heemann U, Vannay Á, Fekete A, Reusz G, Tulassay T, Szabó

AJ. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of

endothelin. Kidney Int. 62: 1364-1371, 2002. (IF: 5,016)

6. Szabó AJ, Tulassay T, Melegh B, Szabó T, Szabó A, Vannay Á, Fekete A, Süveges Z,

Reusz G. Hyperhomocysteinaemia and MTHFR C677T gene polymorphism in renal

transplant recipients. Arch Dis Child. 85: 47-49, 2001. (IF: 2,129)

127

13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet szeretnék mondani Prof. Tulassay Tivadarnak, hogy tudományos

munkámat tanácsaival irányította. Négy évvel ezelott az o irányítása alatt kezdtem el Ph.D.

munkámat. Bevont az Intézetben már folyamatban levo tudományos témákba, illetve önálló

kutatási feladatokkal látott el. Az általa létrehozott szellemi muhely adott lehetoséget arra,

hogy nemzetközi színvonalú kutatási programokban vehessek részt.

Köszönöm témavezetomnek, Dr. Szabó Andrásnak, hogy tudományos pályámon

elindított. Segítségével tanultam meg a helyes kérdésfelvetés, az adatgyujtés, az elemzés és az

értékelés módszereit. A módszerek beállításához és a mérések végzéséhez szükséges

vegyszerek anyagi hátterét is o biztosította.

Köszönöm Dr. Szabó Attilának és Dr. Müller Veronikának, hogy bevezettek az

állatokkal végzett in vivo munkába. Az is zkémia/reperfúziós vizsgálatok végzésekor adott

tanácsaik nélkülözhetetlenek voltak a hatékony kutatómunka szempontjából.

Prof. Reusz György segített hannoveri tanulmányutam megszervezésében és anyagi

támogat ásában. Szintén köszönöm Dr. Juergen Strehlau-nak, hogy tanulmányutam során

bekapcsolódhattam kutatócsoportjának munkájába. Ennek kapcsán sajátítottam el a

molekuláris biológiai vizsgálatok végzéséhez szükséges ismereteket, készséget.

Dr. Vásárhelyi Barna a Gyermekklinika kutatólaboratóriumában segített a kapott

eredmények értékelésében és közlésében, a betegek mintáinak a gyujtésében és a humán

genetikai vizsgálatok tervezésében és kivitelezésében. Köszönettel tartozom Dr. László

Lajosnak és Ádori Csabának az immumhisztológiai mérések során nyújtott segítségért. Prof.

Losonczy György az eredmények publikálásakor segített.

Köszönöm az I. sz. Gyermekklinika kutatóinak, Dr. Fekete Andreának, Dr. Treszl

Andrásnak, Dr. Héninger Erikának, Bányász Ilonának, Szebeni Beának, Dr. Rusai

Krisztinának, Dr. Derzbach Lászlónak, Dr. Balogh Ádámnak, Dr. Kocsis Istvánnak, Dr.

Gyorffy Balázsnak, Dr. Krikovszky Dórának és Dr. Tory Kálmánnak a kísérletes munkám

során nyújtott baráti támogatást, a technikai segítséget, az együttmuködést és az ösztönzo

ötleteket.

Külön köszönettel tartozom Bernáth Máriának, Czárán Istvánnénak és Kertay

Daisynek kísérleteim során nyújtott kituno technikai segítségükért.

Végül köszönettel tartozom az I.sz. Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy

segíto, baráti légkörben végezhettem doktori munkámat.

a vaszkulÁris endoteliÁlis nÖvekedÉsi faktor...

Documents