1การพฒนาวธวเคราะหอเทมบทอล โดยไฮเพอรฟอรแมนซลควด โครมาโทรกราฟ ตรวจวดโดยยว

นางสาว มนฤด วรรณะเอยมพกล นาย วระโชต ลาภผลอาไพ

โครงการพเศษนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร ปรญญาเภสชศาสตรบณฑต

คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล พ.ศ. 2549

2Development of HPLC with UV detection method for determination of ethambutol

MISS Monruedee Wanna-iampikul MR. Weerachod Lapponampai

A SPECIAL PROJECT SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENT FOR

THE BACHELOR DEGREE OF SCIENCE IN PHARMACY FACULTY OF PHARMACY

MAHIDOL UNIVERSITY

3โครงการพเศษ เรอง การพฒนาวธวเคราะหอเทมบทอล โดยไฮเพอรฟอรแมนซลควด

โครมาโทรกราฟ ตรวจวดโดยยว

ลายเซน ........................................................

( นางสาวมนฤด วรรณะเอยมพกล)

ลายเซน .........................................................

( นายวระโชต ลาภผลอาไพ )

ลายเซน ......................................................... ( รศ.ดร. พสมย กลกาญจนาธร ) อาจารยทปรกษา

ลายเซน

......................................................... (อ. ชตมา มธยสถสข) อาจารยทปรกษารวม

4บทคดยอ การพฒนาวธวเคราะหอเทมบทอล

โดยไฮเพอรฟอรแมนซลควดโครมาโทรกราฟ ตววจวดโดยยว

มนฤด วรรณะเอยมพกล, วระโชต ลาภผลอาไพ อาจารยทปรกษา: พสมย กลกาญจนาธร, ชตมา มธยสถสข ภาควชาเภสชเคม คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล คาสาคญ: อเทมบลทอล, การวเคราะห, ไฮเพอรฟอรแมนซลควดโครมาโทรกราฟ อเทมบทอล(ethambutol) เปนยารกษาวณโรคทใชกนมากในปจจบน อเทมบทอลเปนสารประกอบ aliphatic amine ไมมโครงสรางทจะดดกลนแสงอลตราไวโอเลท โครงการพเศษน ทาการศกษาและ พฒนาวธวเคราะหหาปรมาณ อเทมบทอล โดยวธไฮเพอรฟอรแมนซลควดโครมาโทรกราฟและเครองตรวจวดแสงอลตราไวโอเลต โดยอาศยการเกดสารประกอบเชงซอนของอเทมบทอลกบ ไดวาเลนท แคทอออน ไดแก ทองแดงซงจะดดกลนแสงสงสดมความยาวคลน 260 นาโนเมตร ทาการทดลองหาสภาวะทเหมาะสมโดยใชคอลมน C18 พบวาเฟสเคลอนททเหมาะสมคอ เททราไฮโดรฟแรน (tetrahydrofuran) และ สารละลายนา(aqueous solvent) ในอตราสวน 30 : 70 ซง สารละลายนา ประกอบดวย ทองแดง ความเขมขน 2.4 มลลโมลาร, โซเดยม-1-ออคเทนซลโฟเนท โมโนไฮเดรต (sodium 1-octane sulfonate monohydrate) ความเขมขน 3 กรม/ลตรในนากลน วดคาการดดกลนแสง ท 260 นาโนเมตร ใหความสมพนธเชงเสนตรงกบความเขมขนของอเทมบทอล เทากบ 25 – 300 ไมโครกรม/มลลลตร(r2 = 0.9996) มความถกตองและแมนยา มความไวมากกวาวธวเคราะหโดยสเปคโตรโฟโตเมตร วธการทศกษานสามารถนาไปหาปรมาณ อเทมบทอลในยาเมดได

5Abstract Development of HPLC with UV detection method

for determination of ethambutol

Monruedee Wanna-iampikul, Weerachod Lapponampai Project adviser: Pisamai Kulkanjanathon, Chutima Matayatsuk Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University Keyword: Ethambutol, determination, HPLC Ethambutol is an aliphatic amine used for the treatment of tuberculosis and it has not chromophore to absorb UV/ visible. The development of HPLC-UV method for determination of ethambutol HCl was the objective of this study. The complexation of ethambutol free base with cupric ion was applied. HPLC condition was reversed-phase C18 column. The presence of ethambutol-copper (II) complex was observed at 260 nm with UV detector. The suitable mobile phase was a mixture of tetrahydrofuran and distilled water containing 2.4 mM of copper sulfate and 3g/L of sodium-1-octane sulfonate monohydrate, 3:7 (v/v). The linearity range of ethambutol HCl was 25 – 300 µg/ml (r2 = 0.9996) with good accuracy and precision. This method was more sensitive than UV method and suitable for assay of ethambutol in tablets.

6กตตกรรมประกาศ

โครงการพเศษนสาเรจลลวงตามความมงหมายไดดวยความชวยเหลอและคาแนะนาจากอาจารยทปรกษาโครงการ คอ รศ. ดร. พสมย กลกาญจนาธร และ อ. ชตมา มธยสถสข ภาควชาเภสชเคม คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล นอกจากน ตองขอขอบคณ คณสรนทร อยยง และคณประดษฐา รตนวจตร ทอานวยความสะดวก และชวยเหลอในระหวางทาการทดลอง

ผทาการวจย

7สารบญ

หนา บทคดยอ ก Abstract ข กตตกรรมประกาศ ค สารบญ ง สารบญตาราง จ สารบญรป ฉ สญลกษณและคายอ ช บทนา 1 ทบทวนวรรณกรรม 3 วสด, อปกรณทใช และการเตรยมสารเคม 7 วธการวจย 10 ผลการวจย 14 วจารณผลการวจย 28 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ 31 เอกสารอางอง 33

8สารบญตาราง ตารางท หนา 1. แสดงเฟสเคลอนท และอตราสวนของ aqueous phase 11 ตอ organic phase 2. ผลการทดลองการปรบเฟสเคลอนท 15 3. ผลการทดลองการปรบ pH 15 4. ผลการทดลองการปรบสดสวนของ organic phase: aqueous phase 17 5. ผลการทดลองเมอเปลยนแปลงอณหภม 18 6. ผลการทดลองเมอปรบความเขมขน copper (II) sulfate 20 7. ผลการทดลองการปรบปรมาณ ion pairing agent 22 8. แสดงคา peak area และความเขมขนของ Ethambutol 24 ความยาวคลน 260 นาโนเมตร 9. แสดงผลการทดลอง Intraday precision 25 10. แสดงผลการทดลอง Interday precision 26 11. แสดงคา %recoveryของวธการวเคราะหดวย HPLC 26 12. ผลการทดลองการวเคราะหปรมาณ ethambutol ในตารบยาเมด 27 13. เปรยบเทยบวธวเคราะห ethambutol โดยใช HPLC / UV detector 31

9สารบญรป รปท หนา 1. โครงสรางของ ethambutol และ ethambutol-copper(II) complex 1 2. กราฟแสดงคาการดดกลนแสงดวยเครอง spectrophotometer 14 3. แสดง chromatogram เปรยบเทยบ pH ของ mobile phase 16 4. แสดง chromatogram เปรยบเทยบ สดสวนของ organic solvent 17 5. แสดง chromatogram เปรยบเทยบผลของ อณหภม ตอ 19 retention time และ peak area 6. ผลการทดลองเมอปรบความเขมขน copper(II) sulfate 21 7. ผลการทดลองการปรบปรมาณ ion pairing agent 23 8. แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางความเขมขนของ ethambutol HCl 25 กบ peak area, คา r2

10สญลกษณและคายอ

λmax = maximum wavelength nm = นาโนเมตร pH = ความเปนกรด-ดาง µg = ไมโครกรม mL = มลลลตร r2 = coefficient of determination mg = มลลกรม USP = The United State Pharmacopoeia oC = องศาเซลเซยส RSD = relative standard deviation CV = coefficient of variation X = คาเฉลยของผลการวเคราะห SD = คาเบยงเบนมาตรฐานจากคาเฉลย UV = ultraviolet mM = millimolar HPLC = High Performance Liquid Chromatography

11

CH3CH2

HO H2C

CH NH CH2CH2 NH CH CH2CH3

OHCH2

บทนา

Ethambutol เปนยารกษาวณโรค โดยใชรวมกบยารกษาวณโรคตวอนๆ ไดแก isoniazid, rifampicin และ pyrazinamide เปนตน ขนาดยาทใช 15-25 mg/kg/day มรายงานความเปนพษของ ethambutol ตอประสาทตาเปนผลใหประสาทตาเลวลง และไมอาจแยกสแดงและสเขยวได ปรมาณยาในรางกายมความสาคญ ตองมปรมาณทเหมาะสมทจะใหผลในการรกษา และตองไมมากจนกอใหเกดความเปนพษตอรางกาย(1,2)

USP กาหนดวธวเคราะหหาปรมาณ ethambutol โดยวธ non-aqueous titration(5) ซงเปนวธทสะดวก แตมความไวตา โครงการพเศษนมวตถ ประสงคทจะพฒนาวธวเคราะหยา ethambutol โดยใชวธ high performance liquid chromatography(HPLC)/UV detector โดยทดลองหาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะหหาปรมาณ ethambutol เพอใหไดวธการทมความไวสง ถกตอง แมนยา และเปนวธทดกวาวธทกาหนดใน USP

ethambutol มโครงสรางทางเคมเปน aliphatic amines ดงแสดงในรปท 1.1

รปท1.1 โครงสราง ethambutol จากโครงสรางทางเคมของ ethambutol พบวาไมมโครงสราง chromophore ทจะดดกลนรงสอลตราไวโอเลตและไมสามารถทาการวเคราะหดวย spectrophotometry หรอ HPLC/UV detector ได Figure 1

12

มรายงานการประยกตใช divalent cationic metals ทาปฏกรยากบ ethambutol HCl เกดเปนสารประกอบ(4) ซงสามารถดดกลนแสง UV ได(รปท1.2) ซงจะทาให วเคราะหหาปรมาณของ ethambutol โดย spectrophotometry หรอ HPLC/UV detector ได ในการพฒนาวธวเคราะหจะตองศกษาหาสภาวะทเหมาะสมในการเกดและความคงตวของ ethambutol-complex สภาวะททาการศกษาไดแก pH อตราสวนของ ethambutolและ metal เปนตน เนองจากตองให ethambutol และ copper เกดการcoupling กอนทจะถง detector ในทางกลบกน ควรมความคงตวและไมเกดการเปลยนสภาพกอนทจะถง detector ดวย

รปท1.2 โครงสรางethambutol-copper (II) complex

วตถประสงค 1. หาสภาวะทเหมาะสม เพอวเคราะหปรมาณ ethambutol โดยใช HPLC/UV

detector 2. ประเมนวธวเคราะห 3. วเคราะหหาปรมาณยา ethambutol ในเภสชภณฑยาเมด

13

ทบทวนวรรณกรรม Ethambutol HCl มสตรโครงสรางเปน aliphatic amines ชอทางเคมคอ 1-butanol, 2,2-(1,2-ethanediyldiimine)bis-, dihydrochlorideหรอ (+) -2,2 (ethylenediimino)-di-1-butanol dihydorchloride ดงแสดงในรปท 1 ใชในการรกษาวณโรคโดยใชรวมกบยาอน คณสมบตทางกายภาพ(1)

Ethambutol HCl มลกษณะเปนผงผลกสขาว ไมมกลน ไมมส มรสขม มจดหลอมเหลว 200.0 – 202.0 °C มคา specific rotation + 6.0 ° และ +6.7° สามารถละลายไดดในนา ละลายไดในเอธานอล และละลายไดนอยมากในอะซโตนและ คลอโรฟอรม สวน free bases ของ ethambutol เปนกรดออน มคา pKa 6.6 และ 9.5 สารละลายของ ethambutol HCl ในเอธานอลไมมการดดกลนแสงในชวง UV/Visible การเกบรกษา Ethambutol HCl tablet ควรเกบใหพนแสง ความชน ความรอน และควรเกบในภาชนะทปดสนท ทอณหภม 15-30 °C ขอบเขตการออกฤทธ Ethambutol มฤทธยบยงเชอ Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium kansasii ไดผลด และมผลตอบางสายพนธของ Mycobacterium spp. อนๆ โดยไมมฤทธตอเชอแบคทเรยกลมอน ยบยงเชอวณโรคทดอตอ isoniazid และ streptomycin ได การดอ ethambutol ในหลอดทดลองเกดขนคอนขางชา กลไกการออกฤทธ กลไกการออกฤทธของ ethambutol ยงไมแนชด อาจยบยงการนา mycolic acid เขาสผนงเซลล หรอยบยงการสราง RNA หรออาจยบยงการสงเคราะห metabolites ของเซลล mycobacteria โดยยาจะมฤทธเฉพาะกลมแบคทเรยทกาลงแบงตวอยางรวดเรวเทานน

14

ประโยชนทางการแพทย ใชรกษาวณโรครวมกบยาอนๆ โดยรบประทานในขนาด 15-25 mg/kg วนละครง หรอ 25-30 mg/kg สปดาหละ 3 ครง สาหรบผปวยทเคยไดรบการรกษามากอนแตไมหาย แนะนาใหใชในขนาด 25 mg/kg/day เปนเวลา 60 วน แลวจงลดลงเหลอ 15 mg/kg/day ฤทธไมพงประสงค ฤทธไมพงประสงคทสาคญของ ethambutol คอ การทาใหประสาทตาอกเสบ พบมากเมอใชยาขนาดสงหรอใชยาเปนเวลานาน จะมผลทาใหสายตาเลวลง และไมสามารถแยกสแดงและสเขยวได อาการกลบเปนปกตไดเมอหยดยา อาจพบอาการขางเคยงอนๆ ไดแก ผน คน มไข ปวดขอ ไมสบายทอง ปวดศรษะ วงเวยน สบสน ประสาทหลอน ไดบางแตไมมาก หากใชยาในขนาดไมเกน 15 mg/kg/day พบอาการขางเคยงคอนขางนอย การวเคราะหปรมาณ ethambutol HCl

1. Non-aqueous titration(3) ละลาย ethambutol HCl ใน glacial acetic acid แลวเตม mercuric acetate TS เตม Crystal violet TS เปน indicator แลวไตเตรทดวย 0.1 N perchloric acid ได end point ส blue-green

2. Colorimetric method(5) อาศยหลกการ คอ การเกดสารประกอบเชงซอนระหวาง bromothymol blue และ ethambutol เกดเปนสารประกอบสเหลองสามารถวดคาการดดกลนแสงไดดวยเครอง spectrophotometer

3. High-performance liquid chromatography with fluorescence detection(6)

คอลมนเปน เฟสยอนกลบ (Spherisorb CN) เฟสเคลอนททใชคอ acetonitrile : H3PO4 ความเขมขน 0.01 M ปรบใหม pH 2.5 ดวย KOH(30 : 70, v/v) , flow rate 1 ml/min ใช fluorimetric detector

15

4. HPLC/UV detector 4.1 ethambutol ทาปฏกรยา complex กบ copper salts โดยใชคอลมน silica (LiChrosorb Si 60, 5 µm) เฟสเคลอนท คอ water : acetonitrile (50 : 50)(7)

4.2 คอลมนใช เฟสยอนกลบ C18 เฟสเคลอนททใชคอ tetrahydrofuran :Cu (II) ความเขมขน 1 mM + sodium-1-heptane sulphonate 4 g/L ในนาทปรบ pH 4.5 (30 : 70) อณหภมคอลมน 35 oC flow rate 1.5 ml/min(4)

การตรวจสอบความถกตองของวธการวเคราะห (Method validation)(3,8,9) ผลการวเคราะหทถกตอง แมนยา และเชอถอได ขนอยกบวธการวเคราะหทด ดงนนจะตองทาการตรวจสอบความแมนยา และความถกตองของวธการวเคราะห(validation) และตองทาการตรวจสอบเปนระยะ สาหรบการวเคราะหในงานประจา เพอควบคมความแปรปรวนทอาจเกดขนไดจากปจจยตางๆ เชน เครองมอ นกวเคราะห สารเคม เปนตน ซงคณสมบตทใชในการตรวจสอบวธวเคราะหมดงน

1. ความสมพนธโดยตรงของคาทวเคราะหไดกบคาทเปนจรง (Linearity and range) โดยคาทวเคราะหไดควรเปนสดสวนกบปรมาณของตวยาทอยจรง ซงวธวเคราะหทดควรมคา correlation coefficient (r2) ไมตากวา 0.99

2. ความแมนยา (Precision) ความแมนยาเปนการวด ความแปรปรวนหรอการกระจายของผลการวเคราะหจาก

คาเฉลยในการวเคราะหซาหลายๆครง เนองจากสภาวะแวดลอมอนๆ วธวเคราะหทดจะตองมคาความแปรปรวนตา ซงคานจะเปนคาทใชแสดงความแมนยาของวธวเคราะห ในการทดลองความแมนยาของวธวเคราะห จะทาการทดลองหาคา relative standard deviation (RSD) หรอ coefficient of variation(CV)

RSD (หรอ CV) = SD × 100

X โดย X คอ คาเฉลยของผลการวเคราะห SD คอ คาเบยงเบนมาตรฐานจากคาเฉลย

16

คาความแมนยาของวธวเคราะหแยกไดเปน intraday precision โดยทาการทดลองซาหลายๆครงในชวงวนเดยวกน โดยผทาการทดลอง สภาวะการทดลอง และหองปฏบตการเดยวกน และ interday precision โดยทาการทดลองซาตางวนหรอตางหองปฏบตการ มการเตรยมนายาตางๆ และเครองมอใหมในการทดลอง

วธวเคราะหทด มความแมนยาสง คา %RSD ไมควรเกน 2.0

3. ความถกตอง(Accuracy) วธทดสอบความถกตองของวธการวเคราะหทนยมม 2 วธคอ 1.1 Spiked-placebo recovery method

วธนทาโดยเตรยมตวอยาง โดยเตรยมสวนผสมอนๆ เชนเดยวกบทมในตวอยางทกประการ แตไมมตวยาทตองวเคราะห มาผสมกบตวยามาตรฐานททราบปรมาณแนนอนใหเขาเปนเนอเดยวกน แลวนามาวเคราะหหาปรมาณตวยาโดยวธวเคราะหทตองการทดสอบ เพอใหการทดสอบครอบคลมอตราสวนของตวยาสาคญกบสวนผสมอนๆ ไดกวาง ใหเตรยมตวอยางทมระดบความแรงตางๆ โดยทวไปใหทดสอบความถกตองในความแรง รอยละ80 ของคาตาสดทกาหนดถง รอยละ120 ของปรมาณตวยาสงสดทกาหนด วธทดสอบนมขอเสยคอสวนผสมของตวอยางทเตรยมขนมาจะไมเหมอนตวอยางจรงทผานกระบวนการผลต โดยเฉพาะอยางยงในกรณทการผลตทาใหเกดการสลายตวหรอเกดปฏกรยาระหวางสวนผสมตางๆ

1.2 Standard addition method

วธตรวจสอบความถกตองของผลการวเคราะห ทาไดโดยการเตรยมสารมาตรฐานททราบปรมาณแนนอน เตมลงในสารตวอยาง โดยทปรมาณสารตวอยางจะเทากนแตจะเปลยนแปลงทปรมาณของสารมาตรฐาน คานวณออกมาในรป %recovery

วธการวเคราะหทดนน ผลการวเคราะหทไดจะตองม %recovery อยในชวง 90-110, %RSD < 2.0

17

วสดและอปกรณทใช

อปกรณทใชในการทดลอง

1. volumetric flask ขนาด 500, 250, 100, 50,25, 10 mL 2. beaker ขนาด 1000,600 ,400 ,250 ,100 ,50 mL 3. measuring pipet ขนาด 10,5 ,2 ,1 mL 4. volumetric pipet ขนาด 5, 4, 3, 2, 1 mL 5. cylinder 100, 25, 10, 5 mL 6. จกยาง 7. weighing bottle 8. dropper 9. stirring rod 10. test tube 11. pH meter 12. spectrophotometer Shimadzu UV-160A 13. HPLC 14. vacuum pump

18

สารเคมทใช

1. Ethambutol analytical grade (Sigma-Alrich, Switzerland) 2. Copper sulfate pentahydrate (Fluka Garantie, Switzerland) 3. Sodium-1-Octane Sulfonate Monohydrate (Sigma-Alrich, Switzerland) 4. Boric acid analytical grade (May & Baker LTD. Dagenham, England) 5. Sodium hydroxide analytical grade (Eka Nobel, Sweden) 6. Glacial acetic acid analytical grade (Lab scan, Thailand) 7. Hydrochloric acid analytical grade (Lab scan, Thailand) 8. Methanol HPLC grade (Lab scan Asia, Thailand) 9. Acetonitrile HPLC grade (Lab scan Asia, Thailand) 10. Tetrahydrofuran HPLC grade (Lab scan Asia,Thailand) 11. Ethambutol HCl 400 mg tablet (องคการเภสชกรรม Lot No. 400308, Thailand) 12. Distilled water 13. Water for injection

19

การเตรยมสารละลาย

1. เตรยม ethambutol standard stock solution 1.8 mM ชง ethambutol HCl 125 mg ละลายในนาและปรบปรมาตรจนครบ 250 mL

2. เตรยม copper sulfate solution 50 mM ชง copper(II) sulfate pentahydrate 3.125 กรม ละลายในนาและปรบปรมาตรจน

ครบ 250 ml 3. เตรยม borate buffer

ชง boric acid ประมาณ 1.24 กรม ลงใน volumetric flask ขนาด 100 ml ละลายในนาประมาณ 90 ml ปรบ pH ของ buffer ใหเปน 9 โดยใช sodium hydroxide ความเขมขน 5 N ปรบปรมาตรดวยนาใหครบ 100 ml

20

วธทาการวจย

1. หาสภาวะทเหมาะสมใการวเคราะห ethambutol HCl ดวยเครอง HPLC โดย UV detector 1.1 การทดลองหา pH และความยาวคลนทดดกลนสงสดในการเกดปฏกรยา

ระหวางethambutol กบ copper การทดลองหา pH ทาไดโดย pipet copper sulfate solution 25 mM ลงใน

volumetric flask ขนาด 100 mL จานวน 3 flask, flaskละ 10 mL จากนนเตมนาใหมปรมาตรประมาณ 90 mL ปรบpHแตละflaskเปน pH7, pH10, pH4 โดยใช 0.1 N NaOH และ 0.1N acetic acid แลวปรบปรมาตรเปน 100 mL สงเกตลกษณะทางกายภาพของ copper sulfate solution

การทดลองหาความยาวคลนทดดกลนสงสด ทาไดโดย pipet ethambutol HCl 1.2 mM ลงใน volumetric flask ขนาด 10 mL จานวน 2 flask, flask ละ 2 mL โดย flask หนงนาไปเตมสารละลาย copper(II)sulfate ความเขมขน 25 mM 2 mL อก flask หนงไมใสสารละลาย copper (II) sulfate ปรบปรมาตรของ flask ทง 2 ดวยนากลน จากนนนาแตละ flask ไปวดคาการดดกลนแสงดวยเครอง spectrophotometer โดยทาการ scan λ ชวง200-400 นาโนเมตร ณ อณหภมหอง

1.2 พฒนาวธวเคราะหาปรมาณ ethambutol HCl โดยใช HPLC ทาการทดลองปรบสภาวะตางๆเพอใหไดวธวเคราะหทเหมาะสม โดยใช flow rate

1.0 mL/min วดทความยาวคลน 260 นาโนเมตร โดยใชสารละลายของ standard ethambutol ความเขมขน 0.45 mM จานวน 20 µL เปรยบเทยบ chromatogram ทได โดยดจาก retention time, peak symmetry, peak area เพอเลอกสภาวะทเหมาะสม สภาวะททาการทดลองไดแก

1.2.1 สภาวะของเฟสเคลอนท (mobile phase condition) เลอกใชเฟสเคลอนทและสดสวนของ aqueous phase ตอ organic phase

ดงตารางท 1

21

ตารางท1 แสดงเฟสเคลอนทและอตราสวนของ aqueous phase ตอ organic phase

1.2.2 pH

aqueous phase คอ copper (II) sulfate 2.5 mM+ sodium-1-octane sulfonate monohydrate 4g/L ในนา จากนนปรบเปนกรดดวย HCl ใหม pH4.5 และไมปรบ pH

1.2.3 สดสวนของ organic solvent ทาการเปลยนแปลง organic phase : aqueous phase จากผลการวจยขอ

1.2.1 ในสดสวน 25 : 75, 30 : 70, 35 : 65, 40 : 60 1.2.4 อณหภม

จากผลการวจยขอ 1.2.3 ปรบอณหภมของคอลมนท อณหภมหอง, 35, 40, 45 oC

1.2.5 ความเขมขนของสารละลาย copper (II)sulfate จากผลการทดลองขอ 1.2.4 ปรบความเขมขนของสารละลาย copper (II)

sulfate ใน aqueous phase เปน 2.5, 1.89, 1.26, 0.63 mM 1.2.6 ปรมาณของ ion pairing agent

จากผลการทดลองขอ 1.2.5 ปรบปรมาณของ sodium 1-octane sulfonate monohydrate ใน aqueous solvent เปน 4.5, 4, 3, 0 g/L สรปสภาวะทเหมาะสมตางๆและกาหนดเปนวธวเคราะห ethambutol โดย HPLC/UV detector จากผลการเปรยบเทยบ chromatogram โดยดจาก retention time, peak symmetry, peak area

Aqueous phase : Organic phase สดสวน Copper(II) 25 mM in borate buffer(pH 4.5): MeOH 70 : 30 Copper(II) 25 mM + Sodium 1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L : Acetronitrile

75 : 25

Copper(II) 4 mM + Sodium 1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L adjust pH 4.5 with Acetic acid : Tetrahydrofuran(THF)

75 : 25

Copper(II) + Sodium 1-octane sulfonate monohydrate + adjust pH 4.5 with HCl : THF

75 : 25

22

2. Method validation จากวธวเคราะห ethambutol โดย HPLC/UV detector ทไดจากขอ 1.2 ทาการประเมนวธวเคราะหในหวขอตางๆดงน

2.1 Linearity เตรยม calibration curve โดยใชสารละลาย ethambutol ใหมความเขมขน 25.04,

50.08, 100.16, 150.24, 200.32, 250.40, 300.48 µg/mL ความเขมขนละ 3 flask นาไปวเคราะหดวย HPLC/UV ทกาหนด คานวณหาความสมพนธระหวางความเขมขนและพนทใตรปกราฟ

2.2 Precision 2.2.1 Intraday precision

การตรวจสอบความแมนยาทาโดย เตรยมสารละลาย ethambutol ใหมความเขมขน 50.08, 100.16, 150.24, 200.32, 250.40 µg/mL ความเขมขนละ 6 flask นาไปวเคราะหดวย HPLC/UV ทกาหนด จากpeak area ทได คานวณหาคาความเบยงเบน

2.2.2 Interday precision การตรวจสอบความแมนยาทาโดย เตรยมสารละลาย ethambutol ใหมความ

เขมขน 50.08, 100.16, 150.24, 200.32, 250.40 µg/mL ความเขมขนละ 1 flask นาไปวเคราะหดวย HPLC/UV ทกาหนด ทาการทดลองแบบเดยวกน 4 วน จาก peak area ทได คานวณหาคาความเบยงเบน

2.3 Accuracy

การตรวจสอบความถกตองทาโดยใชวธ standard addition โดยการเตมสารละลายมาตรฐานของ ethambutol ททราบปรมาณทแนนอน 4 ความเขมขน คอ 50.08, 100.16, 150.24, 200.32 µg/mL ในสารละลายทมสารละลายตวอยางทมปรมาตร ethambutolเทากน คอ 104.04 µg/mL ทา 3 ซา นาสารละลายแตละflaskไปวเคราะหดวย HPLC/UV ทกาหนด จาก peak area ทได คานวณหาคาความเบยงเบน

23

3. การวเคราะหปรมาณ ethambutol HCl ในตารบยาเมด 3.1 Calibration curve

ใช standard calibration curve ของ ethambutol ใหมความเขมขน 50.08 – 250.40 µg/mL วเคราะหดวยเครองHPLC สรางความสมพนธเชงเสนตรงระหวางความเขมขนของ ethambutol กบpeak area

3.2 สารละลายตวอยาง ชงยาเมด ethambutol HCl 20 เมด หานาหนกเฉลย บดใหละเอยดชงผงยาใหมตวยา ethambutol HCl 100 mg ละลายนาใหครบ 100 mL กรองสารละลายผาน membrane ขนาด 0.45 ไมครอน โดยใช vaccuum pump จากนน pipet มา 1 mL ลงใน volumetric flask ขนาด 10 mL ปรบปรมาตรดวยนา

จากสารละลายตวอยางทเตรยมไว นามาวเคราะหดวยHPLC แลวนาคา peak area ทได มาหาคานาหนกจาก calibration curve เทยบนาหนกของยาเมดethambutolทพบกบนาหนกของ standard หารอยละของนาหนกฉลาก (%labeled amount)

24

ผลการวจย

1. หาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะห ethambutol HCl ดวยเครอง HPLC โดย UV detector 1.1 การทดลองหา pH และ ความยาวคลนทดดกลนสงสดในการเกดปฏกรยาระหวาง

ethambutol กบcopper ผลการเปลยนแปลง pH ของสารละลาย copper sulfateพบวา ในสารละลายcopper

(II)sulfate pH 7 และ pH 10 พบตะกอนขนขาว ไมสามารถใชทาทดลองตอไปได สวนสารละลาย copper sulfate pH 4 สงเกตไดสฟาใส จงใชในการทดลองขนตอไป

ผลของการดดกลนแสง พบวา reaction flask ทม standard ethambutol และ copper (II) sulfate solution สามารถวดคาการดดกลนแสงโดยใชเครอง spectrophotometer ม λmax ท 260 nm และ reaction flask ทไมใส copper(II) sulfate solution ไมสามารถวดคาการดดกลนแสงโดยใชเครอง spectrophotometer ดงแสดงในภาพท 2a และ ภาพท 2b

รปท2a รปท2b

รปท2 กราฟแสดงคาการดดกลนแสงดวยเครอง spectrophotometer; (2a) reaction flask ทไมม copper (II) ion; (2b) reaction flask ทม copper (II) ion และ ethambutol

25

1.2 พฒนาวธวเคราะหหาปรมาณ ethambutol HCl โดยใช HPLC 1.2.1 สภาวะของเฟสเคลอนท

ผลการวจยพบวาเฟสเคลอนททเหมาะสมทสด คอ copper(II)sulfate 2.5 mM + sodium 1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L ปรบความเปนกรดดวย HCl ใหได pH 4.5 ในนา : THF (75 : 25) ไดผลดง HPLC chromatogramท 1 และผลการทดลองแสดงดงตารางท 2 ตารางท2 ผลการทดลองการปรบเฟสเคลอนท

Mobile phase Retention time (min) peak area copper(II)25 mM in borate buffer: MeOH (70:30) -* - Copper(II)25 mM+ Sodium-1-octane sulfonate

monohydrate 4 g/L: acetonitrile (75:25) - -

Copper(II)4 mM+ Sodium-1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L adjust pH 4.5 with acetic

acid : tetrahydrofuran(THF) (75:25)

- -

Copper(II)2.5 mM+ Sodium-1-octane sulfonate monohydrate 4g/L adjust pH 4.5 with HCl : THF

(75:25)

13.789 2,599,185

*หมายเหต - หมายถง ไมปรากฏผลการทดลอง 1.2.2 pH

ผลการเปรยบเทยบ HPLC chromatogramท1 และ รปท 2 พบวา aqueous phase ทเหมาะสม คอ copper(II)sulfate 2.5 mM + sodium 1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L ในนา ไมปรบ pH จะได pH 4.7 ผลการทดลองแสดงดงตารางท 3และรปท3 ตารางท3 ผลการทดลองการปรบ pH

pH Retention time(min) peak area 4.5 13.789 2,599,185

ไมปรบpH 13.212 2,847,555

26

รปท 3 แสดง chromatogram เปรยบเทยบ pH ของ mobile phase Condition : Copper(II) 2.5 mM + Sodium 1-octane sulfonate monohydrate 4 g/L : THF (75 : 25) at room temperature , flow rate 1.0 ml/min, λmax 260 nm; (3a) ปรบ pH ดวย HCl ใหมpH4.5; (3b) ไมปรบ pH

รปท3a

รปท3b

27

1.2.3 สดสวนของ organic solvent ผลการเปรยบเทยบ HPLC chromatogram พบวาสดสวน organic phase

: aqueous phase ทเหมาะสมในการทดลอง คอ 30 : 70 ผลการทดลองแสดงดงตารางท4 และรปท4

ตารางท4 ผลการทดลองการปรบสดสวนของ organic phase: aqueous phase Organic phase: aqueous phase Retention time(min) Peak area

25:75 13.212 2,847,555 30:70 6.968 2,569,337 35:65 4.059 2,690,738 40:60 2.822 2,438,902

รปท 4a รปท 4b

รปท 4 แสดง chromatogram เปรยบเทยบ สดสวนของ organic solvent

28

รปท 4c

รปท 4d

รปท 4(ตอ) แสดง chromatogram เปรยบเทยบ สดสวนของ organic solvent Condition : tetrahydrofuran : distilled water containing 2.5 mM of copper (II) and 3g/L of sodium-1-octane sulfonate monohydrate at room temperature , flow rate 1.0 ml/min, λmax 260 nm; (4a) 25:75 ; (4b) 30:70 (4c) 35:65 (4d) 40:60

1.2.4 อณหภม ผลการเปรยบเทยบ HPLC chromatogram พบวาอณหภมทเหมาะสมตอ

การทดลอง คอ ทอณหภมหอง ผลการทดลองแสดงดงตารางท 5 และรปท 5 ตารางท5 ผลการทดลองเมอเปลยนแปลงอณหภม

Temperature (องศาเซลเซยส) Retention time (min) Peak area อณหภมหอง 6.968 2,569,337

35 8.698 2,563,595 40 7.183 2,611,403 45 6.139 2,623,648

29

รปท 5a รปท 5b รปท 5c

รปท 5 แสดง chromatogram เปรยบเทยบผลของ อณหภม ตอ retention time และ peak area

30

รปท 5d

รปท 5(ตอ) แสดงchromatogramเปรยบเทยบผลของอณหภมตอ retention timeและ peak area Condition : tetrahydrofuran : distilled water containing 2.5 mM of copper (II) and 4 g/L of sodium-1-octane sulfonate monohydrate (70 : 30), flow rate 1.0 mL/min, λmax 260 nm; (5a) room temperature; (5b) 350C; (5c) 400C; (5d) 450C

1.2.5 ความเขมขนของสารละลาย copper (II)sulfate ผลการเปรยบเทยบ HPLC chromatogram พบวาความเขมขนทเหมาะสม

ทสดของสารละลาย copper (II) sulfate ในการทดลองคอ 2.5mM ผลการทดลองแสดงดงตารางท6 และรปท 6

ตารางท6 ผลการทดลองเมอปรบความเขมขน copper(II) sulfate Copper(II) sulfate concentration (mM) Retention time(min) Peak area

2.5 6.968 2,569,337 1.89 7.364 2,544,873 1.26 11.271 1,675,134 0.83 10.926 2,930,032

31

รปท 6a รปท 6b รปท 6c

รปท 6 แสดง chromatogram เปรยบเทยบ ความเขมขน copper(II) sulfate

32

รปท 6d

รปท 6(ตอ) แสดง chromatogram เปรยบเทยบ ความเขมขน copper(II) sulfate Condition : tetrahydrofuran : distilled water containing copper (II) and 4 g/L of sodium-1-octane sulfonate monohydrate (70 : 30),room temperature, flow rate 1.0 ml/min, λmax 260 nm; (6a) Cu (II) 2.5 mM; (6b)1.89 mM; (6c) 1.26 mM; (6d) 0.83 mM

1.2.6 ปรมาณของ ion pairing agent ผลการเปรยบเทยบ HPLC chromatogram พบวาปรมาณของ sodium-1-

octane sulfonate monohydrate ทเหมาะสมคอ 3 g/L ผลการทดลองแสดงดงตารางท 7 และ รปท7

ตารางท7 ผลการทดลองการปรบปรมาณ ion pairing agent

Sodium-1-octane sulfonate monohydrate concentration (g/L)

Retention time (min) Peak area

0 2.523 2936960 3 6.617 3221835 4 6.968 2569337

4.5 8.035 2370584

33

รปท 7a รปท 7b รปท 7c

รปท 7 แสดง chromatogram เปรยบเทยบปรมาณ ของ ion pairing agent

34

รปท 7(ตอ) แสดง chromatogram เปรยบเทยบปรมาณ ของ ion pairing agent Condition : tetrahydrofuran : distilled water containing 2.5 mM of copper (II) and sodium-1-octane sulfonate monohydrate (70 : 30),room temperature, flow rate 1.0 mL/min, λmax 260 nm; (7a) sodium-1-octane sulfonate monohydrate 0 g/L;(7b) 3 g/L; (7c) 4 g/L; (7d) 4.5 g/L 2. Method validation

2.1 Linearity คา peak area ของการวเคราะห ethambutol HCl ดวย HPLC ทความยาวคลน 260

นาโนเมตร ในความเขมขนระหวาง25.04-300.48 µg/mL แสดงในตารางท 8 ซงใหสมการ linearity y = 19200x + 8475.3 และ r2=0.9997 ดงรปท 8

ตารางท8 แสดงคา peak area และความเขมขนของ Ethambutolทความยาวคลน 260 นาโนเมตร

Ethambutol HCl(µg/mL) peak area (Mean ± SD, n =3) 25.04 475,804± 13,799 50.08 976,092 ± 13,677

100.16 190,6709 ± 12,601 150.24 289,2341 ± 50,858 200.32 3,917,321 ± 28,977 250.40 4,836,508 ± 32,836 300.48 5,727,955 ± 95,208

รปท 7d

35

Linearity

y = 19200x + 8475.3

R2 = 0.9997

0200000040000006000000

0 100 200 300 400

Concentration(µg/mL)

peak

are

a

รปท 8 แสดงสมการเชงเสนระหวางความเขมขนของ ethambutol HCl กบ Peak area

2.2 Precision 2.2.1 Intraday precision

จากการทดลองซา 5 ความเขมขน ความเขมขนละ 6 ครงพบวา %RSD อยในชวง0.49-1.65 ดงตารางท 9

ตารางท 9 แสดงผลการทดลอง intraday precision

Conc. Of standard (µg/mL)

peak area (mean ± SD, n=6)

%RSD

50.08 954710.7 ± 4927.04 0.51 100.16 1816444 ± 23175.13 1.27 150.24 2882107 ± 47545 1.65 200.32 3805498 ± 18833.08 0.49 250.40 4750366 ± 49050.99 1.03

2.2.2 Interday precision

จากการทดลอง 5 ความเขมขน ความเขมขนละ 1 ครงตอวน ทาซาในวนทแตกตางกน เปนเวลา 4 วน พบวา%RSD อยในชวง 0.48-3.14 ดงตารางท 10

36

ตารางท10 แสดงผลการทดลอง Interday precision Conc. Of standard

(µg/mL) peak area (average)

SD (n=4)

%RSD

50.08 987570.75 30964.03 3.14 100.16 1925610.25 26813.33 1.39 150.24 2917862.75 14068.93 0.48 200.32 3816477.50 80656.35 2.11 250.40 4872456.75 65199.62 1.34

3.1.3 Accuracy

เมอทาการทดลองวเคราะหปรมาณสารมาตรฐาน ethambutol ทเตมในสารตวอยาง (standard addition) 4 ความเขมขนโดยทาซา 3 ครง พบวา %recovery อยในชวง 93.63-97.59% ดงแสดงในตารางท 11 ตารางท 11 แสดงคา%Recoveryของวธการวเคราะหดวย HPLC

Amount add(µg/mL)

Amount found (µg/ml), n=3 %recovery Average of %recovery

±SD

50.08 45.88 48.60 47.74

91.62 97.04 95.32

94.66 ± 2.77

100.16 95.15 94.00 92.19

95.00 93.85 92.04

93.63 ± 1.49

150.24 146.85 141.16 151.85

97.75 93.96

101.07

97.59 ± 3.56

200.32 190.76 187.96 189.22

95.22 93.83 94.46

94.51 ± 0.70

37

3. การวเคราะหปรมาณ ethambutol HCl ในตารบยาเมด การทดลองวเคราะห ethambutol HCl ในตารบยาเมดโดยวธ HPLC ทงซา 3ครง ได

ปรมาณยาเปนรอยละของฉลากระบเทากบ 101.30, 96.28, 98.71 (คาเฉลย ± %SD = 98.76± 2.51) ผลการทดลองแสดงดงตารางท 12 ตารางท12 ผลการทดลองการวเคราะหปรมาณ ethambutol ในตารบยาเมด

ปรมาณตามฉลากระบ (µg/mL)

ปรมาณทวเคราะหได((µg/ml) (n=3)

รอยละของนาหนกฉลาก (%labeled amount)

1053.965 1001.684 1026.975

101.30 96.28 98.71

Average of %labeled amount

98.76

1040.44

%RSD 2.54

สตรในการคานวณหาปรมาณยา ethambutol HCl ในตารบยาเมดดวยวธ HPLC

ปรมาณ ethambutol HCl ทมในตวอยาง (mg) = นาหนกยาทชงไดจรง (mg) นาหนกยาเฉลย 20 เมด (mg) x 4 % labeled amount = ปรมาณ ethambutol HCl ทวเคราะหได x 100 ปรมาณ ethambutol HCl ทมในตวอยาง

38

วจารณผลการวจย

1. หาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะห ethambutol HCl ดวยเครอง HPLC

โดย UV detector 1.1 การทดลองหา pH และความยาวคลนทดดกลนสงสดในการเกดปฏกรยาระหวาง

ethambutol กบ copper การเกดปฏกรยาระหวาง ethambutol กบ โลหะ นาจะอยในรป ionized form หรอใน pH

ตา ซงจากการทดลองพบวาสารละลายท pH 7 จะมการตกตะกอนของ copper จงทาการทดลองในสารละลาย pH ประมาณ 4-4.5 เพราะสารละลาย copper (II) sulfate ในนา มคาpH ประมาณ 4-5 และสารละลาย ethambutol-copper complex ในนา ใหการดดกลนแสงสงสดท260 nm

การทดลอง พบวา ethambutol ไมสามารถดดกลนแสงอลตราไวโอเลตได เนองจากโครงสรางไมม chromophore จาเปนตองใช divalent cationic metals เพอทาปฏกรยา เกด complex ทมรปรางคงรป และ อเลคตรอนสามารถเคลอนทไดมากขน เปนผลใหสามารถดดกลนรงสอลตราไวโอเลต และสามารถวเคราะหไดดวย spectrophotometer และ HPLC/UV detector

1.2 พฒนาวธวเคราะหาปรมาณ ethambutol HCl โดยใช HPLC 1.2.1 สภาวะของเฟสเคลอนท

จากผลการทดลอง พบวา MeOH และ acetonitrile ซงใชเปน organic phase ไมพบpeak ethambutol-copper(II) complex คาดวาเกดจากcopper complex จบกบ stationary phaseไดดกวา หรอออกจากคอลมนในรป free form มากกวา ethambutol complex เพราะวา MeOH และ acetonitrile มขวมากเกนไปจงเปลยนมาใช THF ซงสามารถปรากฏ peak ของสารทตองการศกษา

การใช ion pairing agent sodium-1-octane sulfonate monohydrate ใน aqueous phase เพอใหประจลบของ sulfonate ion จบ ethambutol-copper (II) complex ไดสารทมขวลดลง ยบยงการจบกบ silanol ในคอลมน จงทาใหสามารถแยก ethambutol-copper (II) complex ออกจาก column ไดงายขน

39

1.2.2 pH จากการเปรยบเทยบผลทดลอง เลอกใชเฟสเคลอนท ทไมปรบ pH เนองจาก

ม chromatogram ไมแตกตางจาก เฟสเคลอนท ทปรบ pH ดวย HCl และ เตรยมไดงายกวา 1.2.3 สดสวนของ organic solvent

จากการเปรยบเทยบผลการทดลอง พบวาทสดสวนเฟสเคลอนท 35 : 65 และ 40 : 60 ไมสามารถแยก peak ของ ethambutol-copper(II) complex ออกจาก solvent front ได

เลอกสดสวน organic phase : aqueous phase ท 30 : 70 เนองจาก มคา retention time, resolution ทเหมาะสมทสด

1.2.4 อณหภม จากการเปรยบเทยบผลทดลอง พบวาอณหภมของคอลมนทสงขนทาให peak

area ของ ethambutol-copper(II) complex มคาสงขน แตไมมากนกเมอเปรยบเทยบกบทอณหภมหอง

เลอกใชอณหภมของคอลมนท อณหภมหอง เนองจากสามารถทาไดงาย และใหผลไมแตกตางการทอณหภมอนๆ ทศกษา

1.2.5 ความเขมขนของสารละลาย copper (II) sulfate จากผลเปรยบเทยบการทดลอง พบวา copper (II) sulfate ทความเขมขนนอย

มผลตอการเกด tailing ทมากกวาการใช copper(II) sulfate ทความเขมขนสง จงเลอกใช copper(II) sulfate ความเขมขน 2.5 mM ซงเปนความเขมขนสงสด ในการทดลอง

1.2.6 ปรมาณของ ion pairing agent จากผลการทดลอง พบวาเมอไมใส sodium -1-octane sulfonate

monohydrate จะทาให peak ของ ethambutol-copper (II) complex ม tailing มากและอยใกลกบ solvent front มากเกนไป ดงนนจงไมเหมาะสมในการทดลอง

การใสSodium 1-octane sulfonate monohydrate ปรมาณ 4.5, 4 , 3 g/L ให peak area และ tailing ของ ethambutol-copper(II) complex ไมแตกตางกน จงเลอกใช ปรมาณ 3 g/L เนองจาก ใชปรมาณของ ion pairing agent นอยทสดในการทดลองน

40

2. การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห(Method validation) 2.1 linearity

จากผลการทดลองพบวาความสมพนธระหวางคา peak area กบความเขมขนของethambutol มความสมพนธกนเปนเสนตรง ในชวงความเขมขน 25.04-300.48 µg/mL คาความสมพนธ (r2) เทากบ 0.9997

2.2 precision 2.2.1 intraday precision

จากผลการทดลอง intraday precision พบวาวธวเคราะหนมความแมนยาซงคานวณจากรอยละความเบยงเบนมาตรฐาน ไดคาอยในชวงทยอมรบได คอ 0.49-1.65

2.2.2 interday precision จากผลการทดลอง interday precision พบวาวธวเคราะหนมความแมนยาซง

คานวณจากรอยละความเบยงเบนมาตรฐาน ไดคาอยในชวง คอ 0.48-3.14 ซงคาความแมนยาควรจะมคาไมเกน 2.0 ซงในการทดลองจะมบางคาทสงไป ดงนนจงควรทาการทดลองซาอกครง เพอตรวจสอบความแมนยาของวธการทดลอง

2.3 accuracy จากผลการทดลอง พบวาวธวเคราะหนมความถกตอง ซงคานวณจาก %recovery ได

คาทยอมรบได คอ 93.63-97.59 และมคาความเบยงเบนเทากบ 0.70-3.56 3. การวเคราะหปรมาณยา ethambutol

เมอทาการวเคราะหปรมาณ ethambutol HClโดยวธ HPLC ในตวอยางยาเมด พบวาม คาเฉลยของ%labeled amount (±คารอยละความเบยงเบนมาตรฐาน) เทากบ 98.76 (±2.54)

41

สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ

สรปผลการวจย

1. การปรบสภาวะทเหมาะสมเพอใหอเทมบทอลเกดสารประกอบเชงซอนกบควปรกอออนทาใหพฒนาเปนวธวเคราะหอเทมบทอลโดย HPLC/UV detection โดยมสภาวะทเหมาะสมไดแก tetrahydrofuran : distilled water containing 2.5 mM of copper (II) and 3 g/L of sodium-1-octane sulfonate monohydrate (7 : 3, v/v),room temperature, flow rate 1.0 mL/min, λmax 260 nm

2. เมอประเมนวธวเคราะหพบวา 2.1 วธวเคราหนมคา %RSD ของ intraday precision อยในชวง 0.49 – 1.65 และ

interday precision อยในชวง 0.48 – 3.14 2.2 วธวเคราะหนม linearity range อยในชวง 25.04–300.48 µg/mL (r2 = 0.9997)

เปรยบเทยบการวจยหาปรมาณ ethambutol โดยใชเครอง spectrophotometer(10) ม linearity range เทากบ221-665 µg/ml พบวาการวเคราะหทพฒนาไดมความไวและชวงความเขมขนกวางกวา

2.3 วธวเคราะหนมความถกตอง(% recovery )อยในชวง 93.63 – 97.59 2.4 สามารถวเคราะห ethambutol HCl ในเภสชภณฑโดยใช HPLC ได

3. เมอเปรยบเทยบสภาวะในการทดลอง ทใชHPLC/UV(4) พบวามความแตกตางทปรมาณcopper sulfate และชนดกบปรมาณ ion pairing agent และวธทพฒาไดทาไดสะดวกกวา เพาะวาไมตองปรบ pH และทาการทดลองทอณหภมหอง (ตารางท13)

4. วธนสามารถนาไปประยกตใชในการวเคราะหหาปรมาณ ethambutol ในยาเมดได

42

ตารางท 13 เปรยบเทยบวธวเคราะห ethambutol โดยใช HPLC / UV detector

Condition Developed method Analytica Chimica Acta 456(2002) 189 – 192

Mobile phase -copper(II) sulfate -ion pairing agent -THF -pH

2mM

3g/L(octane sulfonate) 30% v/v

No adjust

1mM

4g/L(heptane sulfonate) 30% v/v

Adjust to 4.5

column Reversed phase C18 (hypersil)

Reversed phase C18 (bondapak)

Column temperature Room temperature 35 0C

ขอเสนอแนะ

1. เนองจาก CuSO4 ตกตะกอนใน pH ทเปนกลางและเบส ดงนนควรระวงในขนตอน การเตรยมสารเคม และระหวางทาการทดลอง

2. ในการทดลองหาคาความแมนยา(precision) ม %RSD บางคา ทมคามากกวา 2.0 ทงนเนองจากระยะเวลาในการทาการทดลองมจากด จงไมสามารถทาการทดลองซาหลายๆ ครงได ดงนนควรจะทาการทดลองซา เพอยนยนผลการทดลอง

3. ในการวจย สามารถใชเครอง HPLC ตรวจพบ ethambutol ในปรมาณทนอยได และมแนวโนมทสามารถนามา ประยกตใช ตรวจ ethambutol ใน biological fluid จงควรทาการศกษาคา limit of detection (LOD) และ limit of quantitative (LOQ) และทดลองตรวจวเคราะหปรมาณ ethambutol ในของเหลวจากรางกาย (biological fluid)

43

เอกสารอางอง

1. Brunton LL, Lazo JS, Parker KL, editors. Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of THERAPEUTICS, 11th ed. The United States of America, The McGraw-Hill Companies, 2006.

2. อโนชา อทยพฒน, นงลกษณ สขวาณชยศลป, บรรณาธการ. เภสชวทยา เลม 2. พมพครงท 2. กรงเทพฯ. บรษท นวไทยมตรการพมพ(1996) จากด, 2543.

3. United states Pharmaceutical Convention. The United stated Pharmacopiea 29, The National Formula 24. Webcom Limited, Toronto, Ontario 2005.

4. Jiang Z, Wang H, Locke DC. Determination of ethambutol by ion-pair reversed phase liquid chromatography with UV detection. Analytica Chimica Acta[Online] 2002 Jan 22; 456: [4 screens]. Available from: URL: http://www.elsevier.com/locate/aca

5. Lee CS, Benet LZ. Ethambutol hydrochloride in: Florey K, editor Analytical profiles of drug substances 1977; 7 : 231-249.

6. M. breda, P. Marrari, E. Pianezzola, M. Strolin. Determination of ethambutol in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of chromatography a[Online] 1996 Apr; 1-2: [6 screens]. Available from URL : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez /query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9004954&dopt=Abstract

7. Lacroix C, Cerutti F, Nouveau J, Menager S and Lafont O. Determination of plasma ethambutol with liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications volume 415[Online] 1987 Mar 20; 415(1): [10 screens]. Available from: URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=3584365&dopt=Abstract

8. Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR, Analytical chemistry: Introduction. 7th ed. Florida : Saunders college publing, 2000 : 595-601.

44

9. Mendham J, Denney RC, Barners TD, Vogel TM: Textbook of quantitative chemical analysis. 6th ed. London : Premtice Hall, 2000.

10. จกรพนธ พนธศรรตน, สาลน ศโรดม. การวเคราะหเอแธมบทลโดยวธสเปคโตรโฟโตเมตร. กรงเทพฯ. คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล. 2544