เชื้อรา aspergillus f lflavus สายพันธุ์ใหม่ ...aspergillus...

118 วารสารวิชาการเกษตร ปีที่ 33 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม - สิงหาคม 2558

เชื้อรา Aspergillus f lflavus สายพันธุ์ใหม่ที่ไม่สร้างสารพิษและศักยภาพการควบคุม

การเจริญเติบโตของเชื้อราที่สร้างสารพิษและยับยั้งสารแอฟลาทอกซินบี 1 ในข้าวโพด

Novel strains of Non-toxigenic Aspergillus flf lavus and their Potential to

Control Fungal Growth and Af lflatoxin B1 Production in Maize

อัจฉราพร ศรีจุดานุ1/ สุพี วนศิรากุล1/ มัทนา วานิชย์2/

Atcharaporn Srijudanu1/ Su-phi Wanasirakul1/ Mattana Wanich2/

ABSTRACT

Aspergillus spp. were isolated from soil and agricultural product of 25 provinces

across Thailand by soil dilution spread plate technique and agar plate method using

DG18 medium. The isolates were identified for morphological character using microscopy.

The Aspergillus spp. found in this study were A. flavus (602 isolates), A. tamarii (97

isolates) and A. nomius (20 isolates). Strains of A. flavus were preliminary screened for

aflatoxin production strains using coconut agar method. After 5 days of incubation in the

dark, plates were examined under UV light at 365 nm. Plate contained aflatoxin-producing

strains showed luminescent blue colour. One hundred and seven strains which did not

show blue colour were selected. The strains were re-checked for their ability to produce

aflatoxin using YES medium. Only 2 isolates did not produce aflatoxin. Two non-aflatoxin

producing strains (No. 400 and 561) were tested for antagonistic efficacy to control

aflatoxin-producing strains (A. flavus No. A39) by competition plate method. Strains No.

400 and 561 could suppress A39 strain which resulted to reduction of AFB1 contents for

100 and 99.1%, respectively. These two strains were genetically identified as A. flavus..

before being applied to maize for controlling aflatoxin-producing strains. Maize confined

1/ กองวิจัยและพัฒนาวิทยาการหลังการเก็บเกี่ยวและแปรรูปผลิตผลเกษตร กรมวิชาการเกษตร จตุจักร กทม. 109001/ Post-harvest and Processing Research and Development Division, Department of Agriculture, Chatuchak, Bangkok

10900 Thailand.2/ ศูนย์วิจัยพืชไร่ขอนแก่น สถาบันวิจัยพืชไร่และพืชทดแทนพลังงาน กรมวิชาการเกษตร จ.ขอนแก่น 400002/ Khon Kaen Field Crops Research Center, Field Crops and Energy Renewable Crops Research Institute, Department of

Agriculture, Khon Kaen province, 40000 Thailand.

Thai Agricultural Research Journal Vol. 33 No. 2 May - August 2015 119

with A. flavus No. 400 and 561 contained

AFB1 concentrations lower than control

group for 83.92 and 97.43 %. The result

indicated that A. flavus No. 400 and 561

could be a novel strain of non-toxigenic

fungi found in Thai land to repress

aflatoxin-producing strain of A. flavus

resulting to low contamination of aflatoxin in

maize.

Key words: Aspergil lus f lavus non-

toxigenic strains, aflatoxin B1, biocontrol,

maize

บทคัดย่อ

แยกเชื้อราสกุล Aspergi l lus จาก

ตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร ในพื้นที่ 25

จังหวัดของประเทศไทย โดยใช้วิธี Soil dilution

spread plate technique และ Agar plate

method บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Dichloran

Glycerol (DG 18) และจำแนกโดยใช้ลักษณะ

ทางสัณฐานวิทยาภายใต้ กล้ องจุ ลทรรศน์

สามารถแยกได้เชื้อรา Aspergillus flavus 602

ไอโซเลท (83.7%) A. tamarii 97 ไอโซเลท

(13.5%) A. nomius 20 ไอโซเลท (2.8%) เมื่อ

นำเชื้อรา A. flavus มาตรวจสอบการสร้างสาร

พิษเบื้องต้นบนอาหาร Coconut agar ในที่มืด 5

วัน เพื่อคัดแยกเชื้อราที่มีการสร้างสารแอฟลา

ทอกซินซึ่งจะเกิดการเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินภายใต้

แสงอัลตราไวโอเลตที่ช่วงคลื่น 365 นาโนเมตร

พบเชื้อรา A. flavus ที่ไม่มีการเรืองแสงจำนวน

123 ไอโซเลท นำเชื้อรามาทดสอบการสร้างพิษ

ในอาหารเหลว YES เพื่อยืนยันผลอีกครั้ ง

สามารถคัดเลือกได้เชื้อรา A. flavus จำนวน 2

ไอโซเลท (400 และ 561) เท่านั้นที่ไม่มีการสร้าง

สารพิษ นำเชื้อราทั้งสองไอโซเลทมาทดสอบ

การเป็นปฏิปักษ์โดยวิธี Competition plate

method บนอาหาร Potato dextrose agar

เป็นเวลา 7 วัน พบว่าเชื้อรามีการเจริญเติบโต

เร็วและสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อรา

A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39) ได้

เมื่อนำมาทดสอบการเป็นปฏิปักษ์ โดยวิธี Dual

culture method ในอาหารเหลว YES เป็นเวลา

14 วนั พบวา่ A. flavus ไอโซเลท 400 และ 561

สามารถลดปริมาณสารพิษ ได้ 100 และ 99.1%

ตามลำดับ จากนั้นนำเชื้อราไปตรวจวิเคราะห์

ดีเอ็นเอ และจำแนกชนิดเชื้อราด้วยเทคนิค

ชวีโมเลกลุ เชือ้ราทัง้ 2 ไอโซเลตเปน็ A. flavus นำ

มาทดสอบประสิทธิภาพการเป็นปฏิปักษ์กับเชื้อ

ราที่สร้างสารพิษในเมล็ดข้าวโพด พบวา่สามารถ

ลดปรมิาณสารแอฟลาทอกซนิ บ ี1 ในข้าวโพดได้

83.92 และ 97.43% ผลการทดลองแสดงให้

เห็นว่า A. flavus ไอโซเลท 400 และ 561 ไม่

สร้างสารพิษเป็นเชื้อราสายพันธุ์ใหม่ที่พบใน

ประเทศไทย มีประสิทธิภาพในการเป็นปฏิปักษ์

กบัเชือ้ราทีส่รา้งสารพษิ ทำใหส้ารแอฟลาทอกซนิ

ลดลง สามารถใช้ควบคุมการปนเปื้อนของเชื้อรา

และสารพิษในข้าวโพดได้


คำหลกั: Aspergillus flavus สายพนัธุท์ีไ่มส่รา้ง

สารพษิ, แอฟลาทอกซนิ บี 1, ข้าวโพด

คำนำ

ปัจจุบันประเทศไทยพบการปนเปื้อน

แอฟลาทอกซินในผลิตผลเกษตรหลายชนิด

แอฟลาทอกซินเป็นสารประกอบทุติยภูมิสร้าง

โดยเชื้อราสกุล Aspergillus เช่น Aspergillus

flavus และ A. parasiticus แอฟลาทอกซินที่

พบตามธรรมชาตมิอียู ่4 ชนดิ คอื แอฟลาทอกซนิ

บี 1 (AFB1) แอฟลาทอกซิน บี 2 (AFB

2)

แอฟลาทอกซนิ จ ี1 (AFG1) และแอฟลาทอกซนิ

จี 2 (AFG2) แต่แอฟลาทอกซิน บี 1 มีความ

สำคัญและก่อให้เกิดพิษรุนแรงทั้งในคนและสัตว์

โรคที่ตรวจพบในคน ได้แก่ โรคมะเร็งตับ โรคตับ

อักเสบ โรคตับแข็ง โรคสมองอักเสบ (IARC,

1993) แอฟลาทอกซินเป็นสารที่ก่อให้เกิดมะเร็ง

คณะกรรมาธกิารยโุรป (European Commission)

จึงมีข้อกำหนดระดับการปนเปื้อนสูงสุดของ

แอฟลาทอกซิน บี 1 ในอาหารบริโภค ได้ไม่เกิน

2 μg/kg (EU Regulation Commission,

2010) สำหรับประเทศไทยมีข้อกำหนดระดับการ

ปนเปือ้นสงูสดุ 20 μg/kg (กระทรวงสาธารณสขุ,

2529) เนื่องจากการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อรา

ในผลิตผลเกษตรหลังการเก็บเกี่ยวส่งผลกระทบ

ต่อสุขอนามัยของผู้บริโภคโดยตรง และถูกนำมา

ใช้เป็นเครื่องมือกีดกันทางการค้าทั้งในประเทศ

และระหว่างประเทศ เพื่อลดการใช้สารเคมี และ

แก้ปัญหาการปนเปื้อนสารพิษจากเชื้อรา จึง

พัฒนาวิธีการควบคุมแบบชีววิธี โดยการนำเชื้อ

รา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษมา

ประยุกต์ใช้ควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษในหลาย

ประเทศ (Cleveland et al., 2003)

มีการนำเชื้อราสกุล Aspergillus มาใช้

ประโยชน์ในการควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษโดย

มีกลไกรบกวนการสร้างเอนไซม์ที่จำเป็นต่อ

กระบวนการสรา้งสารพษิ ในประเทศสหรฐัอเมรกิา

มีงานวิจัย พบวา่เชือ้รา A. flavus สายพนัธุ ์AF36

(NRRL18543) สามารถควบคุมเชื้อรา A. flavus

สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (Atehnkeng et al.,

2008) และนำเชื้อรา A. flavus ที่ไม่สร้างสาร

พิษมาใช้ในการควบคุมเชื้อราที่สร้างสารพิษใน

พืชสําคัญทางเศรษฐกิจหลายชนิด ได้แก่ ฝ้าย

ถั่วลิสง ข้าวโพด มะเดื่อฝรั่ง และพิสตาชิโอ

เป็นต้น เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสาร

พิษ เป็นเชื้อราที่มีการวิจัยมากที่สุด และมีการนํา

ไปใช้ควบคุมเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่สร้าง

สารพิษมากที่สุด เนื่องจากเป็นเชื้อจุลินทรีย์ที่

แสดงศักยภาพในการควบคุมดีที่สุด โดยเชื้อรา

A. f lavus สายพันธุ์ที่ ไม่สร้างสารพิษ เป็น

จุลินทรีย์ที่มีความเฉพาะเจาะจงสูงต่อเชื้อรา

เป้าหมาย ปลอดภัยต่อมนุษย์ สัตว์ ศัตรู

ธรรมชาติที่มีประโยชน์ และต่อสิ่งแวดล้อม ได้

ผ่านการทดสอบจาก US Environmental

Protection Agency ประเทศสหรัฐอเมริกาเป็น

ที่ยอมรับและนําไปใช้ในประเทศที่พัฒนาแล้ว

ประเทศไทย Ehrlich et al. 2006 พบ

เชื้อรา A. f lavus , A. nomius และ

A. psudotamarii สายพันธุ์ที่สร้างสารแอฟลา

ทอกซินในดินปลูกพืชไร่ แสดงว่าโอกาสปน


เปื้อนเชื้อราและสารพิษในผลิตผลพืชไร่ของไทย

มีสูงแม้ว่าประเทศไทยจะพบเชื้อรา A. flavus

ชนิดที่เป็นโทษ อย่างไรก็ตามยังมีการค้นพบเชื้อ

รา A. flavus ที่เป็นประโยชน์ สามารถแย่ง

อาหารกับเชื้อราชนิดที่สร้างสารพิษ แต่ใน

ประเทศไทยยังไม่มีการใช้เชื้อรา A. flavus สาย

พันธุ์ไม่สร้างสารพษิในการยบัยัง้การสรา้งแอฟลา

ทอกซิน งานวิจัยครั้ งนี้มีวัตถุประสงค์ เพื่อ

คัดเลือกเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสาร

พิษจากดิน และผลิตผลเกษตรของประเทศไทย

มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการปนเปื้อนของเชื้อ

รา A. flavus และการสร้างแอฟลาทอกซินใน

ผลิตผลเกษตร

อุปกรณ์และวิธีการ

1. เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร และการ

คัดแยกเชื้อรา A. flavus

เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตรใน

พื้นที่ 25 จังหวัดของประเทศไทย จำนวน 206

แปลง ๆ ละ 5 จุด นำมาแยกเชื้อด้วยวิธี Soil

dilution spread plate technique นำตัวอย่าง

ดินจากแหล่งต่าง ๆ มาเจือจางในน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่า

เชื้อ หรือ 0.85% normal saline สเปรดลงบน

ผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อ DG18 บ่มไว้ที่อุณหภูมิ

ห้อง เป็นเวลา 7 วัน ทำการเก็บเมล็ดถั่วลิสง

ข้าวโพด เมล็ดธัญพืช และผลิตผลเกษตรจาก

แหล่งต่าง ๆ มาแยกเชื้อด้วยวิธี Agar plate

method โดยนำเมล็ดมาวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ

DG 18 เป็นเวลา 7 วัน คัดเลือกโคโลนีที่เป็น

สีเหลืองอมเขียว ซึ่งเป็นลักษณะของเชื้อรากลุ่ม

Aspergillus section Flavi หลังจากนั้นแยกเชื้อ

ราให้บริสุทธิ์ นำมาเลี้ยงบนอาหาร Malt

Extract Agar (MEA) และ Czapek’s Dox

Agar (CZA) ในหลอดทดลอง เก็บที่อุณหภูมิ

25 ํซ นาน 48 ชม.

2. จำแนกเชื้อรากลุ่ม Aspergillus section

Flavi โดยสัณฐานวิทยา

ทดสอบลักษณะการเจริญของเชื้อราบน

อาหาร CZA นำมาจำแนกลักษณะทางสัณฐาน

วิทยาใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อบ่งชี้ชนิด โดยเปรียบ

เทียบกับคู่มือการจำแนกเชื้อรา Klich (2002)

และเชื้อมาตรฐาน 2 ชนิด ได้แก่ A. oryzae

(TISTR3019) จากสถาบันวิจัยและพัฒนา

วิทยาศาสตร์ ประเทศไทย และ A. flavus สาย

พันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39) จากกองวิจัยและ

พัฒนาวิทยาการหลังการเก็บเกี่ยว และแปรรูป

ผลิตผลเกษตร กรมวิชาการเกษตร ทดสอบชนิด

ของเชือ้ราบนอาหารคดัเลอืก (Selective medium)

Aspergillus flavus and parasiticus Agar

(AFPA) บ่มที่อุณหภูมิ 30 ํซ เป็นเวลา 7 วัน

แยกและจำแนกชนิดเชื้อรา A. flavus และ A.

parasiticus ตามวิธีการของ Pitt et al., (1983)

3. ทดสอบการสรา้งสารพษิของเชือ้รา A. flavus

ที่คัดเลือกได้

3.1 ทดสอบการสร้างสารพิษบนอาหาร

Coconut Agar (CCA) เตรียมสารแขวนลอย

สปอร์ของเชื้อรา Aspergillus ในน้ำกลั่นผสม

0.05%Tween 80 ปริมาณสปอร์ 108 สปอร์/มล.


หยดสปอร์ลงบนอาหาร CCA บ่มที่อุณหภูมิ

30 ํซ ในที่มืดเป็นเวลา 5 วัน หลังจากนั้นนำจาน

เลี้ยงเชื้อรามาส่องภายใต้แสงอัลตราไวโอเลตที่

ช่วงคลื่น 365 นาโนเมตร ถ้าเชื้อรามีการสร้าง

สารพิษจะมีการเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินบนอาหาร

เปรียบเทียบกับชุดควบคุม (เชื้อรา A. flavus

สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ A39) ทดสอบเชื้อรา

ไอโซเลทละ 2 ซ้ำ

3.2 ทดสอบการสร้างสารพิษในอาหาร

เหลว Yeast Extract Sucrose (YES) นำ

สารละลายสปอร์ของเชื้อรา A. flavus ไอโซเลท

ที่ไม่สร้างสารพิษ ที่คัดเลือกจากข้อ 3.1 แต่ละ

ไอโซเลทปริมาตร 5 ไมโครลิตร มาเลี้ยงใน

อาหารเหลว YES ปริมาตร 9 มล. เป็นเวลา 14

วัน นำส่วนของอาหารเหลวมาตรวจสอบปริมาณ

สารแอฟลาทอกซนิ โดยชดุทดสอบ DOA-aflatoxin

ELISA Test Kit (Chinaphuti et al., 2002)

เปรียบเทียบกับชุดควบคุม (เชื้อรา A. flavus

สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ A39) กรรมวิธีละ 2 ซ้ำ

4. ประสิทธิภาพของเชื้อรา A. flavus สาย

พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในการยับยั้งการเจริญของ

เชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษและยับยั้งการ

สร้างสารแอฟลาทอกซินในระดับห้องปฏิบัติการ

4.1 ทดสอบการเป็นปฏิปักษ์ โดยวิธี

Competition plate method นำเชือ้ราไอโซเลท

ที่ไม่สร้างสารพิษที่คัดเลือกได้จากข้อ 3.2 แต่ละ

ไอโซเลทมาเลีย้งบน อาหาร PDA ประมาณ 4-5 วนั

หลังจากนั้นใช้ Cork Borer ขนาดเส้นผ่าน

ศูนย์กลาง 4 มม. ตัดชิ้นวุ้นที่มี เส้นใยของ

เชื้อรามาวางในจานทดสอบที่มีชิ้นเส้นใยของ

เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ (A39)

อยู่ด้วย โดยวางทั้งหมด 4 ตำแหน่ง บ่มจาน

ทดสอบไว้ที่อุณหภูมิ 30 ํซ เป็นเวลา 7 วัน วดั

เสน้ผา่นศนูยก์ลางของโคโลน ีA. flavus ที่สร้าง

สารพิษเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ ไม่ได้ใส่

A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ ทำการ

ทดสอบกรรมวิธีละ 3 ซ้ำ คำนวณเปอร์เซ็นต์

ยับยั้งการเจริญของเชื้อรา (Percent inhibition

of colony growth, PIRG) โดยใช้สูตร

(R

1 - R

2)

PIRG = x 100

R

1

เมื่อ R1 คือ ค่าเฉลี่ยรัศมีของเชื้อรา

A. flavus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษในจานเลี้ยง

เชื้อที่ไม่มีเชื้อราสายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ และ

R2 คือ ค่าเฉลี่ยรัศมีของเชื้อรา A. flavus สาย

พันธุ์ที่สร้างสารพิษในจานเลี้ยงเชื้อที่มีเชื้อราสาย

พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษ

4.2 ทดสอบประสิทธิภาพยับยั้งการ

สร้างสารแอฟลาทอกซินโดยวิธี Dual culture

method นำเชื้อราที่คัดเลือกไปเลี้ยงในอาหาร

เหลว YES พร้อมกับเชื้อรา A. flavus สายพันธุ์

ที่สร้างสารพิษ (A39) เป็นเวลา 14 วัน นำสาร

สกัดที่อยู่ในอาหารเหลวมาทดสอบปริมาณสาร

แอฟลาทอกซินโดยวิธี ELISA เปรียบเทียบกับชุด

ควบคมุ ทดสอบกรรมวธิลีะ 2 ซำ้ คำนวณปรมิาณ

สารแอฟลาทอกซินบี 1 ที่ลดลงโดยใช้สูตร


เปอร์ เซ็นต์การยับยั้ งการสร้างสารพิษ (%

Reduction) ดังนี้

(C - T)

% Reduction = x 100

C

เมื่อ C คือ ปริมาณสารพิษของเชื้อราใน

ชุดควบคุม และ T คือ ปริมาณสารพิษของเชื้อ

ราในชุดทดสอบ

5. จำแนกเชื้อราโดยเทคนิคอณูพันธุศาสตร์

5.1 การสกดัดเีอน็เอ นำสารละลายสปอร ์

ของเชื้อราที่คัดเลือกแต่ละไอโซเลทมาเตรียมเชื้อ

บริสุทธิ์โดยเลี้ยงบนอาหาร Malt Extract Agar

(MEA) ย้ายโคโลนีเดี่ยวของเชื้อรามาเลี้ยงใน

อาหาร Malt Extract Broth (MEB) ปริมาตร

250 มล. ในขวดลูกชมพู่ขนาด 500 มล. เขย่า

ความเร็ว 100 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 25 ํซ เป็น

เวลานาน 72 ชม. นำเส้นใยเชื้อราบริสุทธิ์

น้ำหนัก 1 ก. ไปสกัด DNA ด้วยชุดน้ำยา

DNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, USA)

5.2 การจัดลำดับยีน และการวิเคราะห์

ลำดับเบส ส่งดีเอ็นเอเชื้อรา Aspergillus ไป

วิเคราะห์หาลำดับเบสที่ศูนย์พันธุวิศวกรรมและ

เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ เพื่อการจำแนกและ

บ่งชี้ชนิดเชื้อราในระดับชีวโมเลกุล โดยเพิ่ม

ปริมาณดีเอ็นเอ นำมาจัดลำดับยีนไรโบโซมอล

บริเวณ internal transcribed spacer region

(ITSrDNA) ของเชื้อรา Aspergillus ด้วยเทคนิค

Polymerase Chain Reaction (PCR) ใช้

universal primer ITS1F (5¢’-TCCGTAGGTG

AACCTGCGG-3¢ ) ITS5F (5’¢ -GGAAGT

AAAAGTCGTAACAAGG-3¢) และ ITS4R (5’¢-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3¢) ตามวิธีของ

White et al . (1990) การทดสอบจะมียีน

ต้นแบบของ A. flavus (A39) และ A. oryzae

(TISTR3019) เป็นยีนเปรียบเทียบ

6. ประสิทธิภาพการยับยั้งการสร้างสารแอฟลา

ทอกซินบี 1 ในเมล็ดข้าวโพดในระดับห้อง

ปฏิบัติการ

นำเมล็ดข้าวโพดที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อ

100 ก. ใส่ในขวดแก้วฝาเกลียวขนาด 10 มล.

เติมสารละลายสปอร์เชื้อรา A. flavus สายพันธุ์

ที่ไม่สร้างสารพิษปริมาณเชื้อ 108 สปอร์/มล.

ปริมาตร 4 มล. พร้อมกับเชื้อรา A. flavus ที่

สร้างสารพิษปริมาณเชื้อ 107 สปอร์/มล. ปรมิาตร

4 มล. วางแผนการทดลองแบบ Complete

Randomize Design (CRD) มี 6 กรรมวิธี ๆ

ละ 5 ซ้ำ ดังนี้

1. กรรมวธิคีวบคมุ (ไมใ่สเ่ชือ้ราปฏปิกัษ)์

2. กรรมวธิคีวบคมุ (ใสเ่ชือ้รา A. flavus

A39)

3. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A

4. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก B

5. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A และ

A. flavus (A39)

6. ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก B และ

A. flavus (A39)


บ่มเป็นเวลา 7 และ 14 วัน จากนั้นนำ

เมล็ดข้าวโพดมาตรวจปริมาณแอฟลาทอกซิน

บี 1 โดยวิธี ELISA

ผลการทดลองและวิจารณ์

1. เก็บตัวอย่างดินและผลิตผลเกษตร และ

การคัดแยกเชื้อรา A. flavus

เก็บตัวอย่างดิน และผลิตผลเกษตรใน

พืน้ที ่25 จงัหวดั ของภาคตะวนัออกออกเฉยีงเหนอื

คอื จ.นครราชสมีา ขอนแกน่ ชยัภมู ิอบุลราชธาน ี

ภาคเหนือ คือ จ.เชียงใหม่ เชียงราย แพร่ พะเยา

ลำปาง อุตรดิตถ์ และน่าน ภาคกลาง คือ

จ.เพชรบูรณ์ สุโขทัย พิษณุโลก กาญจนบุร ี

กำแพงเพชร นครปฐม กรงุเทพมหานคร และลพบุรี

ภาคตะวนัตก คอื จ.เพชรบรุ ีตาก ภาคตะวนัออก

คือ จ.จันทบุรี ตราด และภาคใต้ คือ จ.พัทลุง

ชุมพร ได้จำนวนตัวอย่างทัง้หมด 256 ตวัอยา่ง

แยกเชื้อรากลุ่ม Aspergillus section Flavi ได้

จำนวน 719 ไอโซเลท (isolates) สามารถแยกเชื้อ

ราได้ 3 ชนิด (species) คือ A. flavus จำนวน

602 ไอโซเลท (83.7 %) A. tamarii พบจำนวน

97 ไอโซเลท (13.5 %) A. nomius จำนวน 20

ไอโซเลท (2.8 %) แต่ไม่พบ A. parasiticus

(Table 1)

2. การจำแนกเชื้อรากลุ่ม Aspergil lus

section Flavi โดยสัณฐานวิทยา

A. oryzae (TISTR3019) สายพันธุ์

เปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยา ซึ่ ง

โคนิเดียล เฮด (conidial head) มีสีีขาวครีม สี

น้ำตาลมะกอก ลักษณะผิวโคโลนีฟูคล้ายปุยสำลี

ไม่สร้างสเคลอโรเทียม (sclerotium) บนอาหาร

CZA และไม่สร้าง pigment สีส้มเหลืองภายใต้

โคโลนีบนอาหาร AFPA สร้างเวซิเคิล (vesicle)

รูปร่าง pyriform การจัดเรียงตัวของ sterigma

แบบชั้นเดียว (uniseriate) ขณะที่เชื้อรา A.

flavus และ A. nomius มีลักษณะ sclerotium

สีขาวหรือดำบนอาหาร CZA และสร้าง

pigment สีส้มเหลืองภายใต้โคโลนีบนอาหาร

AFPA รูปร่างของโคนิเดีย (conidia) ทรงกลมถึง

รูปไข่ ผิวไม่เรียบ conidial head เป็นสีเหลือง

ปนเขียว เชื้อรา A. flavus สร้าง vesicle รูปร่าง

globose การจัดเรียงตัวของ sterigma เป็น

แบบสองชั้น (biseriate) ในขณะที่เชื้อรา A.

nomius มีลักษณะของ vesicle รูปร่าง

pyriform การจัดเรียงตัวของ sterigma แบบ

uniseriate ลักษณะสัณฐานของเชื้อรา A.

tamarii รูปร่าง conidia ทรงกลมถึงรูปไข่ ผิวไม่

เรียบสีของ conidial head สีน้ำตาล สีส้ม หรือ

สีเขียว ผิวของโคโลนีฟู สีเขียว vesicle รูปร่าง

globose หรือ pyriform การจัดเรียงตัวของ

ster igma เรียงตัวแบบ uniser iate หรือ

biseriate ส่วนใหญ่ไม่สร้าง sclerotium แต่

สร้าง pigment สีส้มน้ำตาลภายใต้โคโลนีบน

อาหาร AFPA (Figure 1)

3. ทดสอบการสรา้งสารพษิของเชือ้รา A. flavus

ที่คัดเลือกได้

การเรืองแสงสีฟ้าน้ำเงินภายใต้แสง

อัลตราไวโอเลต เมื่อทดสอบบนอาหาร CCA


Table 1 Details of Aspergillus section Flavi isolates obtained from soil samples and

agricultural products from different sources in Thailand.

Region Province SampleNo. of tested

samples

Fungal isolates (%)

A.

f lavus

A.

tamarii

A.

nomiusNorth

east

Nakhon

Ratchasima

maize fif ield 10

Khon Kaen peanut fif ield 10Chaiyaphum maize f ield 4 11.7 0.8 0.0Nakhon

Ratchasima

maize kernel 6 (84) (6) (0)

Ubon

Ratchathani

dried chili 30

North Chiang Mai maize fif ield 10Chiang Rai maize fif ield 10Phrae maize and chili fif ield 25Phayao cantaloupe fif ield 3 27.3 4.2 2.1Lampang maize fif ield 6 (196) (30) (15)Uttaradit maize f ield 10Nan maize fif ield 10

Center Phetchabun maize, eggplant and chili f ield 13Sukhothai maize fif ield 5Phitsanulok maize fif ield 3Kanchanaburi maize, peanut, amaryllis and

chili fif ield

41

Kamphaeng Phet maize fif ield 5 32.1 3.6 0.7

Nakhon Pathom maize fif ield 4 (231) (26) (5)Bangkok seed 10Kamphaeng Phet dried chili 1

Loburi dried chili 1West Phetchaburi maize f ield 4 3.3 1.4 0.0

Tak maize fif ield 2 (24) (10) (0)

East Chanthaburi maize fif ield 10 4.3 2.9 0.0Trat maize field 10 (31) (21) (0)

South Puttalung maize and peanut fif ield 11 5.0 0.6 0.0Chumphon dried chili 2 (36) (4) (0)

Total 256 83.7(602) 13.5(97) 2.8(20)

* In the ( ) indicated the total isolates of Aspergillus spp.


พบว่าเชื้อ A. flavus (A39) สร้างสารพิษใน

ปริมาณมากจะแสดงลักษณะเรืองแสงสีฟ้า

น้ำเงินได้ชัดเจนในวันที่ 5 สอดคล้องกับผลการ

ทดสอบการสร้างสารพิษในอาหารเหลว พบว่ามี

ปริมาณสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 7,960

นาโนกรัม/มล. ผลการทดสอบนี้สามารถแยกได้

เชื้อรา A. flavus ไอโซเลทที่ไม่มีการเรืองแสงได้

ทั้งหมด 123 ไอโซเลทเมื่อทดสอบการสร้างสาร

พิษในอาหารเหลว YES สามารถคัดเลือกได้เชื้อ

ราไอโซเลทที่สร้างแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ

0-690 นาโนกรัม/มล. ได้จำนวน 27 ไอโซเลท

และพบว่าเชื้อราเพียง 2 ไอโซเลท คือ 400 และ

Table 2 Selection of non-toxigenic A. flavus on coconut agar and Aflatoxin B1

production in Yeast Extraet Sucrose

Isolate CCA*Aflatoxin B

1 production

(ng/ml)Crop Location

36 + 0 Maize Phetchabun37 - 70 Maize Phetchabun41 + 60 Maize Phetchabun42 - 100 Maize Phetchabun44 - 650 Maize Phetchabun47 - 400 Maize Phetchabun48 - 80 Maize Phetchabun50 - 690 Maize Phetchabun51 - 120 Maize Phetchabun52 - 80 Maize Phetchabun335 - 170 Maize Phetchabun338 - 600 Maize Chiang mai343 - 630 Maize Sukhothai347 - 690 Maize Chiang mai373 - 30 Sugarcane Kanchanaburi374 - 30 Sugarcane Kanchanaburi378 - 160 Maize Kanchanaburi379 - 200 Maize Kanchanaburi380 - 160 Maize Kanchanaburi381 - 160 Maize Kanchanaburi398 - 20 Maize Kanchanaburi400 - 0 Maize Lampang477 - 300 Maize Chiang mai478 - 460 Maize Chiang mai484 - 300 Maize Chiang mai561 - 0 Maize Chunthaburi562 - 70 Maize Chunthaburi

A39 (cotrol) +++ 7,960 Dried bael Bangkok

* + = Slight green,* +++ = Blue, - = Dark


561 ที่ ไม่พบการสร้างสารแอลฟลาทอกซิน

(0 นาโนกรัม/มล.) (Table 2)

4. ประสิทธิภาพของเชื้อรา A. flavus สาย

พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในการยับยั้งการเจริญของ

เชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษและยับยั้งการ

สร้างสารแอฟลาทอกซินในระดับห้องปฏิบัติการ

เชื้อรา A. flavus ไอโซเลท 400 และ

561 สามารถยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อรา

A. flavus (A39) ได้ 47.9 และ 46.5 % ตาม

ลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุม

A. flavus (A39) เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้เชื้อ

รามีความสามารถในการยับยั้งและสร้างสาร

Figure 1 Colony and sporing structures of Aspergillus section Flavi in Thailand on CZA

and AFPA at 30 ํC after 7 days (A-C) A. oryzae TISTR 3019 (D-F) A. flavus (G-I)

A. tamarii (J-L) A. nomius

9

Figure 2 Colonyand sporing structures of Aspergillus section Flavi in Thailandon

CZA and AFPAat 30 C after 7 days (A-C) A. oryzae TISTR 3019 (D-F) A. flavus(G-I) A. tamarii (J-L) A. nomius

3. A. flavus

การทดสอบการเรืองแสงสีฟาน้ําเงินภายใตแสงอัลตราไวโอเลต พบวาเช้ือมาตรฐาน A. flavus สายพันธุที่สรางสารพิษ (A39) ที่สรางสารพิษในปริมาณมากจะแสดงลักษณะเรืองแสงไดเดนชัดในวันที่ 5 สอดคลองกับผลการทดสอบการสรางสารพิษในอาหารเหลวในระยะเวลาการสรางสารพิษ 14 วันจะมีปริมาณสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 7,960 พีพีบีในขณะที่สามารถแยกไดเช้ือราA. flavus ไอโซเลทท่ีไมมีการเรืองแสงไดทั้งหมด123ไอโซเลทเม่ือทดสอบการสรางสารพิษในอาหารเหลว YES สามารถคัดเลือกไดเช้ือราไอโซเลทที่สรางแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 0-690 พีพีบี (ng/ml) จํานวน 27 ไอโซเลท สวนเช้ือราไอโซเลทที่ไมมีการเรืองแสงที่สอดคลองกับผลการทดสอบการสรางแอฟลาทอกซิน บี 1 ในระดับ 0พีพีบีในครั้งนี้พบเพียง 2 ไอโซเลท คือ 400 และ 561 เทาน้ัน (Table 2) Table 2Selection of non-toxigenic A. flavuson coconut agar and Aflatoxin B1 production

Isolate CCA* Aflatoxin B1 production

(ng/ml) Crop Place

36 + 0 Maize Phetchabun

CZA AFPA (forward) AFPA (reverse)

ทุติยภูมิที่มีฤทธิ์ต่อเชื้อราสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ

เนื่องจาก มีการเกิดแนวใสยับยั้ง (clear zone)

(Figure 2) เมื่อนําเชื้อรามาทดสอบประสิทธิภาพ

ยับยั้งการสร้างสารแอฟลาทอกซินบี 1 ในอาหาร

เหลวพบว่า A. flavus (400) และ A. flavus

(561) สามารถยับยั้งการสร้างสารแอฟลา

ทอกซนิ บี 1 (100 %) และ 99.1 % ตามลำดับ

(Figure 3)

5. การจำแนกเชื้อราโดยเทคนิคอณูพันธุศาสตร์

การจำแนกชนิดเชื้อราโดยการเปรียบ

เทียบลำดับเบส ITSrDNA ของเชื้อรา

Aspergillus ซึ่งมีลำดับเบสประมาณ 500-600

A

D

G

J

B

E

H

K

C

A. oryzae

A. tamaril

A. flavas

A. nomius

F

I

L

CZA PFPA(front) AFPA(backside)


คู่เบส พบว่าเชื้อราที่ไม่สร้างสารพิษทั้ง 2 ไอโซ

เลท คือ A. flavus 400 และ 561 และสายพันธุ์

สร้างสารพิษ A. flavus (A39) มีลำดับเบส

เหมือน (similarity) กับเชื้อรา A. flavus

ATCC9643 (Accession No. HQ026738) และ

ATCC20043 (Accession No. AY939782) ที่

พบในประเทศสหรัฐอเมริกาในระดับ 99-100 %

ขณะที่เชื้อราสายพันธุ์ A. oryzae TISTR3019

มีลำดับเบสเหมือนกับเชื้อรา A. parasiticus

(NRRL3386) ในระดับ 100 % (Table 3) ผล

การทดลองแสดงให้เห็นว่า A. flavus (400)

Figure 2 Efficacy of two non-toxigenic A. flavus isolate 400 and 561 inhibit on the growth

of A. flavus A39 (center) on PDA after 7 days incubation at 30° ํC.

Figure 3 Efficacy of two non-toxigenic A. flavus isolate 400 and 561 to reduce aflatoxin

production of A. flavus (A39) in YES medium after 14 days incubation

และ A. flavus (561) เป็น A. flavus ที่ไม่สร้าง

สารพิษจริง

6. ประสิทธิภาพการยับยั้งการสร้างสารแอฟลา

ทอกซินบี 1 ในเมล็ดข้าวโพดในระดับห้อง

ปฏิบัติการ

พบว่ากรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัด

เลือก A. flavus (400) และ A. flavus (561)

เพียงอย่างเดียวระยะเวลา 7 วัน สามารถยับยั้ง

การสร้างสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ในเมล็ดข้าว

โพดได้อย่างมีนัยสำคัญยิ่งเมื่อเปรียบเทียบกับไม่

11 ร า A. flavus(561) สามารถยับย้ังการยับย้ังการสรางสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ทําใหปริมาณสารพิษลดลงจากชุดควบคุม99.1 เปอรเซ็นต (Figure 5) Control Isolate 400 Isolate 561

5. ผลการจําแนกชนิดโดยการเปรียบเทียบลําดับเบส ITSrDNA ของเช้ือรา Aspergillus ซึ่งมีลําดับเบสประมาณ 500-600 คูเบส พบวาเช้ือราที่ไมสรางสารพิษทั้ง 2ไอโซเลท คือ A. flavus(400)และ(561) และสายพันธุสรางสารพิษA. flavus(A39)มีลําดับเบสเหมือน (similarity) กับเช้ือราA. flavus

Figure 4 Characteristics of two non-toxigenic A. flavus on the growth of A. flavus A39 (center) onPDA, colonies grown at 30 Cafter7 days.

Figure 5Non-toxigenic performance in mixtures on YES media for 14 days

A39 A39 A39

400 400 561 561

400 400 561 561 400 400 561 561

11 ร า A. flavus(561) สามารถยับย้ังการยับย้ังการสรางสารแอฟลาทอกซิน บี 1 ทําใหปริมาณสารพิษลดลงจากชุดควบคุม99.1 เปอรเซ็นต (Figure 5) Control Isolate 400 Isolate 561

5. ผลการจําแนกชนิดโดยการเปรียบเทียบลําดับเบส ITSrDNA ของเช้ือรา Aspergillus ซึ่งมีลําดับเบสประมาณ 500-600 คูเบส พบวาเช้ือราท่ีไมสรางสารพิษทั้ง 2ไอโซเลท คือ A. flavus(400)และ(561) และสายพันธุสรางสารพิษA. flavus(A39)มีลําดับเบสเหมือน (similarity) กับเช้ือราA. flavus

Figure 4 Characteristics of two non-toxigenic A. flavus on the growth of A. flavus A39 (center) onPDA, colonies grown at 30 Cafter7 days.

Figure 5Non-toxigenic performance in mixtures on YES media for 14 days

A39 A39 A39

400 400 561 561

400 400 561 561 400 400 561 561

A39 A39

400 561

400 561

400 561

400 561

A39

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

% A

FB1

Redu

ctio

n

isolate 400 isolate 400 isolate 400 isolate 400 isolate 561

99.1 100


Table 3 Molecular Identification of Aspergillus spp. based on rDNA sequences.

Species Isolate Reference strain* Similarity

A. flf lavus 561 ATCC9643, ATCC20043 99%A. flf lavus 400 ATCC9643, ATCC20043 99%A. flf lavus A39 ATCC9643, ATCC20043 100%A. parasiticus TISTR3019 NRRL3386 100%

* ATCC = The American Type Culture Collection, USA NRRL = The Northern Regional Research Center, USA

ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ (กรรมวิธีควบคุม 1) สามารถ

ลดปริมาณแอฟลาทอกซิน บี 1 ในข้าวโพดที่เกิด

ตามธรรมชาติได้ถึง 83.92 และ 97.43 % ขณะ

ทีร่ะยะเวลา 14 วนั ปรมิาณสารแอฟลาทอกซนิ บ ี1

ลดลงเพียง 34.53 และ 43.69 % (Table 4)

ที่ระยะเวลา 7 วัน กรรมวิธี 6 ที่ใส่เชื้อ

ราปฏิปักษ์ A. flavus (561) และ A. flavus

(A39) มปีระสทิธภิาพการยบัยัง้สารพษิ 50.24 %

ดีกว่ากรรมวิธี 5 ที่ใส่เชื้อราปฏิปักษ์ A. flavus

(400) และ A. flavus (A39) ปริมาณแอฟลา

Table 4 Reduction of Aflatoxin B1 content in maize kernels at 7 and 14 days after

inoculation with toxigenic and non-toxigenic strain.

Treatment

Aflatoxin B1 content (ug/kg)

7days after

inoculation *

Reduction

(%)

14 days after

inoculation **

Reduction

(%)

1. control (distilled water) 69.90 b -- 169.00 abc --

2. toxigenic A. f lflavus (A39) 120.30 c -- 246.70 c --

3. non-toxigenic A. flf lflavus (400) 16.50 a 83.92 112.80 ab 34.53

4. non-toxigenic A. flf lflavus (561) 7.90 a 97.43 97.90 a 43.69

5. non-toxigenic A. f lflavus (400) vs toxigenic

A. flf lflavus (A39)86.20 b 29.90 218.00 c 11.93

6. non-toxigenic A. flf lflavus (561) vs toxigenic

A. flf lflavus (A39)63.00 b 50.24 190.70 bc 23.29

C.V. (%) 42.6 37.1*Means in the same column followed by the same letter are not significantly different at 1% level by DMRT **Means in the same column followed by the same letter are not significantly different at 5% level by DMRT


ทอกซนิ บ ี1 ในขา้วโพดลดเพยีง 29.9 % เทา่นัน้

ที่ระยะเวลา 14 วัน กรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ A.

flavus (561) และ A. flavus (A39) และ

กรรมวิธีใส่เชื้อราปฏิปักษ์ที่คัดเลือก A. flavus

(400) และ A. flavus (A39) สามารถลดปริมาณ

สารแอฟลาทอกซนิ บ ี1 ได ้23.29 และ 11.93 %

ตามลำดับ (Table 4)

ประสทิธภิาพยบัยัง้การสรา้งแอฟลาทอกซนิ

บี 1 ของเชื้อราปฏิปักษ์ สายพันธุ์ที่ไปสร้างสาร

พิษมีประสิทธิภาพสูงเพียง 7 วัน หลังจากนั้น

ประสิทธิภาพลดลง

สรุปผลการทดลอง

สามารถคัดเลือกเชื้อรา A. flavus สาย

พันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษในประเทศไทย และมี

ประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของเชื้อรา

สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ และยับยั้งการสร้างแอฟ

ลาทอกซิน บี 1 ได้จำนวน 2 ไอโซเลท คือ A.

flavus (400) และ A. flavus (561) โดยเชื้อรา

A. flavus สายพันธุ์ที่ไม่สร้างสารพิษที่พบเป็น

เชื้อราที่แยกมาจากดินปลูกข้าวโพด พบว่า A.

flavus (400) และ A. flavus (561) สามารถ

ยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อรา A. flavus ที่

สร้างสารพิษ ได้ 47.9 และ 46.5 % และยับยั้ง

การสร้างแอฟลาทอกซินบี 1 ในอาหารเหลวได้

100 และ 99.1 % ตามลำดับ ในเมล็ดข้าวโพดที่

มีการปนเปื้อนสารแอฟลาทอกซินตามธรรมชาติ

เชื้อรา A. flavus (400) และ A. flavus (561)

สามารถลดสารพิษได้ 83.92 และ 97.43 %

ตามลำดับ เชื้อรา A. flavus (400) และ (561)

ไอโซเลทที่ไม่สร้างสารพิษมาทั้ง 2 สายพันธุ์มี

ศักยภาพในการควบคุมการเจริญของเชื้อรา และ

สามารถยบัยัง้การสรา้งสารแอฟลาทอกซนิได ้ ดงันัน้

สามารถนำไปพัฒนาต่อเป็นชีวภัณฑ์เพื่อใช้ในการ

ควบคุมเชื้อรา และสารแอฟลาทอกซินในข้าว

โพดต่อไป

คำขอบคุณ

ขอขอบคุณฝ่ายวิทยาศาสตร์ ชีวภาพ

สถาบันวิจัยและพัฒนาวิทยาศาสตร์ ซึ่งให้ความ

อนุเคราะห์ เชื้อรามาตรฐาน A. oryzae

TISTR3019

เอกสารอ้างอิง

กระทรวงสาธารณสุข. 2529. มาตรฐานอาหารที่

มีสารปนเปื้อน ใน: ราชกิจจานุเบกษา

ฉบับพิเศษ เล่มที่ 103 ฉบับที่ 98 ตอนที่

23. ลงวันที่ 16 กุมภาพันธ์ พ.ศ. 2529.

Atehnkeng, J., P.S. Ojiambo, M. Dornner,

T. Ikotun, R. A. Sikora, P.J. Cotty

and R. Bandyopadhyay. 2008.

Distribution and toxigenicity of

Aspergillus species isolated from

maize kernels from three agro-

ecological zones in Niger ia .

Internat ional Journal of Food

Microbiology 122: 74-84.

Chinaphuti, A., C. Trikarunasawat, A.

Wongurai and S. Kositcharoenkul.

2002. Production of In-house ELISA


Test Kit for Detection of Aflatoxin

in Agricultural Commodities and

Their Validations. Kasetsart J. (Nat.

Sci.) 36: 179-186.

Cleveland, T. E. , P. F. Dowd, A. E.

Desjardins, D. Bhatnagar and

P. J. Cotty. 2003. United States

Department of Agriculture-

Agricultural Research Service

research on pre-harvest prevention

of mycotoxins and mycotoxigenic

fungi in U.S. crops. Pest

Management Science 59: 629-642.

Ehrl ich, K. C, K. Kobbeman, B. G.

Montalbano and P. J. Cotty. 2006.

Aflatoxin-producing Aspergillus

species from Thailand. International

Journal of Food Microbiology 114:

153–159.

European Union. 2010. Maximum levels

for certain contaminants in

foodstuffs. Commission Regulation

(EU) No165/2010. 26 february 2010.

International Agency for Research on

Cancer. 1993. Monographs on the

Evaluation of Carcinogenic Risks to

Humans; Some Naturally Occurring

Substances : Food Items and

Constituents, Heterocyclic Aromatic

Amines and Mycotoxine. Lyon,

France: IARC, 56: 245-395.

Klich M. A. 2002. Identification of common

Aspergillus species. Centraalbureau

voor Schimmel cultures, Utrecht,

Netherlands. 116 pages.

Pitt, J. I., A. Hocking and D. R. Glenn.

1983. An improved medium for the

detection of Aspergillus flavus and

Aspergillus parasiticus. Journal of

Applied Bacteriology 54: 109-114.

White, T. J., T. Bruns, S. Lee and J.

Taylor. 1990. Amplification and

direct sequencing of fungal

r ibosomal RNA genes for

phylogenetics. In: PCR Protocols: a

guide to methods and applications.

(Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ,

White TJ, eds). Academic Press,

New York, USA: 315-322.

เชื้อรา aspergillus f lflavus สายพันธุ์ใหม่ ...aspergillus...

Documents