เอกสารประกอบ

รายวิชาปฏิบัติการชวีวิทยาทั่วไป

เรือ่ง กลองจุลทรรศนแบบตางๆ

2

Contrast

แมวากลองจุลทรรศนสมัยใหมจะสามารถใหรายละเอียด (resolution) ไดดีท่ีกําลังขยายสูงๆ แตความสามารถนั้นจะไมมีคาใดเลย หากภาพที่ไดขาด contrast เนื่องจากตัวอยาง (specimen) เหลานั้นจะกลืนไปกับพ้ืนหลัง (background) ตัวอยางหลายๆ ชนิด โดยเฉพาะอยางยิ่งตัวอยางท่ีไมไดรับการยอมสี หรือ ตัวอยางท่ีมีชีวิต จะมี contrast ท่ีนอยมาก และเราไมสามารถมองเห็นตัวอยางได ไมวากลองจะมีกําลังขยายมากเทาใดก็ตาม

Contrast คือ ความแตกตางของความเขมแสงระหวางภาพและพื้นหลังของภาพ เมื่อเทียบกับความเขมของพื้นหลังโดยรวม

Contrast ของตัวอยาง ในกลองจุลทรรศนเกิดจากความแตกตางของความเขมแสงหรือสี ซ่ึงทําใหรายละเอียดของตัวอยางปรากฎขึ้น โดยท่ัวไปคา Contrast ตองมีคาอยางนอย 0.02 หรือ 2% ตาของมนุษยจึงจะสามารถแยกแยะความแตกตางได ฟมล กลองดิจิตัล กลองวิดีโอ มีความสามารถในการตรวจจับ contrast ไดแตกตางกันออกไป

Percent Contrast (C) = ((I(s) - I(b)) x 100)/I(b)

I(b) : ความเขมแสงของพื้นหลัง (background)

I(s) : ความเขมแสงของภาพวัตถุ

จากกราฟแสดงความสัมพันธระหวางความเขมของภาพวัตถุและ contrast ท่ีความเขมของพ้ืนหลังคาตางๆ จะเห็นวา เมื่อพ้ืนหลังมีความเขมนอยมากๆ คือ เปนสีเทา (0.01) การเปล่ียนแปลงความเขมของภาพวัตถุจะทําให contrast มีการเปล่ียนแปลงมาก หากพื้นหลังมีความสวางมากขึน้ๆ เชนเมื่อ I(b) เทากับ 0.5 การเปลี่ยนความเขมของภาพ ทําใหเกิดการเปล่ียนแปลง contrast นอยมาก

3

การหักเหของแสง

หากตัวอยางมีคา Refractive index แตกตางไปจากสิ่งแวดลอม ตัวอยางจะทําใหแสงเกิดการหักเหหรือการกระจายของแสง

คา Refractive index คือ อัตราสวนระหวางความเร็วแสงในสุญญากาศตอความเร็วแสงเมื่อแสงวิ่งผานวัตถ ุคานี้จะมีคามากกวา 1 เสมอ

จากรูปท่ี 3 จะเห็นวาเมื่อแสงผานตัวอยาง แสงจะหักเห และสวนหนึ่งจะผานไปที่เลนสใกลวัตถุ แสงบางสวนจะไมผาน ทําใหภาพเกิดการบิดเบือนไปจากความจริงได คา NA จะเปนตัวบอกความสามารถในการ”ดัก” แสงท่ีหักเหนี้ เลนสท่ีมีคา NA สูงจะสามารถรับแสงไดมากกวา ทําใหไดภาพที่มีรายละเอียดดีกวา แสงท่ีไมถูกดักไวโดยเลนสใกลวัตถุ คือ รายละเอียดของภาพที่เสียไป

แสงท่ีหักเหไป และถูกจับไวโดยเลสนใกลวัตถุจะถูกนําไปรวมกันท่ีระนาบของภาพ (image plane) เพ่ือท่ีจะสรางรายละเอียดของภาพ ท่ีระนาบนี้คล่ืนแสงที่หักเหจะเกิดปรากฏการณ interference กับคล่ืนท่ีไมหักเห ความสามารถในการเห็น (visibility) หลังจาก interference ขึ้นกับ coherency ของแสง ซ่ึงถูกควบคุมโดย diaphragm ใต condenser การลดขนาดของรูของ diaphragm จะเพ่ิม coherence ของแสง ทําใหความสามารถในการเห็นเพ่ิมขึ้น โดยเฉพาะอยางยิ่งบริเวณขอบของตัวอยาง

การใชกลองชวยเพิ่ม contrast ของภาพและการแปลผล

นักวิทยาศาสตรสามารถใชกลองหลายชนิด ท่ีมีการจัดการแสงในรูปแบบตางๆ เพ่ือเพ่ิมความสามารถในการมองเห็นภาพ แตภาพที่ไดจากกลองแตละชนิดสะทอนความจริงมากนอยแคไหน?

• รูปท่ี 2a แสดงเซลลเยื่อบุขางแกมซ่ึงเปนเซลลใส ไมมีสี ภายใตกลองจุลทรรศนแบบธรรมดาที่ปรับใหแสงเขา condenser นอยลง เพ่ือใหเห็นขอบเขตของเซลล แตรายละเอียดในเซลลจะเสียไป

• เมื่อเทียบภาพที่ 2b ซ่ีงไดจากกลอง phase contrast จะเห็นวาบริเวณในเซลลมีความมืดกวาภาพ 1a แตจะเห็นรายละเอียดดีกวา นอกจากนั้นยังมีบริเวณที่สวางจารอบๆ เยื่อหุมเซลลและนิวเคลียส เรียกวา halo ซ่ึงเปนสิ่งท่ีไมมีอยูจริง (artifact)

• ภาพ 2c ซ่ึงเปนการใชเทคนิคอีกแบบจะเห็นวา ดานหนึ่งของรูปจะมืดและอีกดานจะสวางกวา ทําใหตาเห็นเปนภาพสามมิติเทียม (pseudo three-dimensional image)

จะเห็นวา แมวาเซลลเหลานี้จะเปนเซลลเดียวกัน แตภาพที่ปรากฎมีความแตกตางกัน ขึ้นอยูกับกลอง ดังนั้น นักชีววิทยาอาจแปลผลผิดพลาด หากไมทราบวาภาพแตละภาพเกิดจากกลองชนิดใด ดังนั้น นิสิตจําเปนตองเขาใจวาภาพที่เห็นมาจากกลองชนิดใด จึงจะสามารถศึกษาเซลลไดอยางถูกตอง

4

เทคนิคท่ีใชในการเพิ่ม Contrast

ตาของมนุษยสามารถแยกแยะความเขมและสีของแสงไดเทานั้น หรืออาจกลาวไดวา คุณสมบัติของคล่ืนแสงที่มีอยูหลายประการ เชน amplitude, phase, polarization และ wavelength นั้น ตาสามารถบอกความแตกตางของ amplitude ออกมาในรูปของความเขม และ wavelength ออกมาในรูปของสีตางๆ ไดเทานั้น ดังนั้นเทคนิคใดๆ ท่ีสามารถทําใหเกิดการเปล่ียนแปลงของสีและความเขมจะเพ่ิม Contrast ใหแกภาพได

1. การดัดแปลงตัวอยาง

การยอมสีเซลลเปนเทคนิคในการเพิ่ม contrast ใหกับภาพ เพราะตามนุษยสามารถแยกแยะความแตกตางของสีในชวง visible light ได สียอมจะดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นหนึ่งๆ หรือหลายคล่ืน แลวยอมใหแสงความยาวคลื่นอ่ืนๆ ผานหรือสะทอนได เชน สียอมสีน้ําเงินจะดูดกลืนแสงทุกสียกเวนสีน้ําเงิน ตัวอยางเชน การยอมสีทําใหนักชีววิทยาสามารถสังเกตเห็นเซลลท่ีสังเกตไดยากภายใตกลองจุลทรรศนแบบใชแสงได เชน การยอมสีแกรมแบคทีเรีย และหากสียอมนั้นมีความจําเพาะตอโครงสรางอยางใดอยางหนึ่งของเซลล การยอมหลายๆ สี ทําใหนักวิทยาศาสตรสามารถศึกษรายละเอียดของโครงสรางตางๆ ของเซลลได

ขอเสีย คือ การยอมสีสวนใหญจําเปนจะตองฆาเซลลหรือส่ิงมีชีวิตกอน วิธีการนี้จึงไมสามารถใชกับตัวอยางมีชีวิต และนอกจากนั้นกระบวนการเตรียมตัวอยาง อาจทําใหตัวอยางไมคงลักษณะด้ังเดิม หรืออาจทําใหเกิด artifact ได

2. การเปลี่ยนสภาพรอบๆ ตัวอยาง

วิธีการเพ่ิม contrast อีกวิธีหนึ่ง คือ การใช mounting medium ซึ่งมีคา refractive index แตกตางจากตัวอยาง จะทําใหตัวอยางแยกออกจากพื้นหลังไดดีขึ้น

3. การดัดแปลงระบบแสงในกลอง

วิธีการหนึ่ง ท่ีใชในการเพิ่ม contrast ในกลองจุลทรรศนแบบธรรมดาโดยไมตองดัดแปลงตัวอยาง ไดแก การปรับ diaphragm เพ่ือใหแสงเขา condenser นอยลง หรือการปรับ condenser ใหตํ่าลง จะทําใหมองเห็นตัวอยางท่ีใสได แตวิธีการนี้จะลดความละเอียดและความคมของภาพ

เรายังสามารถเพิม่ contrast ไดโดยการใชวิธีการทางแสง (optical methods) เพ่ือเพ่ิม contrast โดยมีหลักการวา แสงสามารถมีปฏิสัมพันธกับตัวอยางไดหลายแบบ เชน reflection, absorption, refraction, polarization, fluorescence และ diffraction โดยปฏิสัมพันธเหลานี้ขึ้นกับคุณสมบัติของตัวอยาง เชน ความสามารถในการหักเหแสง การดูดกลืนแสงที่ไมเทากันของแตละสวนของตัวอยาง ผลท่ีไดจากปฏิสัมพันธ เชน phase ท่ีเปล่ียนไป หรือ การหักเหของแสง สามารถถูกแปลผลใหเปนความแตกตางของความเขมแสงหรือเปนความแตกตางของสีเพ่ือใหตาสามารถแยกแยะความแตกตางได โดยการดัดแปลง optical components ของกลอง

ชนิดของตัวอยางและเทคนิคท่ีใชเพิ่ม Contrast

เราสามารถแบงตัวอยางตามความสามารถในการทําปฏิสัมพันธกับแสงไดหลายชนิด ตัวอยางแตละชนิดจําเปนตองใชเทคนิคทางแสงตางกัน เพ่ือเพ่ิม Contrast ใหแกภาพ

1. Amplitude objects ดูดแสงบางสวนหรือท้ังหมด ทําให amplitude ของคล่ืนแสงลดลง ทําใหสามารถสังเกตไดงายภายใตกลองจุลทรรศนแบบธรรมดา เชน ตัวอยางท่ีมีสีตามธรรมชาติ หรือตัวอยางยอมสีก็สามารถสังเกตไดงายเชนกัน ตัวอยางเหลานี้ดูดกลืนแสงขาวบางสวนและยอมใหท่ีเหลือผานหรือหักเหผาน

2. Phase objects จะไมดูดกลืนแสงใดๆ จะมีความใสมาก และสังเกตไดยากภายใตกลองจุลทรรศนธรรมดาแตวัตถุแบบนี้จะทําใหเกิดการเปลี่ยน phase เพราะแสงที่ผานตัวอยางกับแสงที่ผานรอบๆ ตัวอยางจะเดินทางดวยความเร็วตางกัน

3. Light Scattering Objects เมื่อแสงผานวัตถุบางชนิดจะทําใหเกิดการหะกเหของแสงไปในทิศทางตางๆ ได (อานเร่ืองการหักเหของแสง)

4. Anisotropic objects คือ ตัวอยางท่ีมีคา refractive index มากกวาสองคาขึ้นไป หรืออาจเรียกวา bi-refringent (doubly refracting) ตัวอยางเชน แรธาตุ, crystals, fibers, และตัวอยางทางชีววิทยาอื่นๆ เมื่อแสงผานวัตถุชนิดนี้ แสงจะหักเหเปนสองสาย แตละสายจะมีระนาบเดียว และตั้งฉากกัน และเดินทางดวยความเร็วตางกัน แสงโพลาไรซสองสายนี้สามารถนํากลับมารวมกัน โดย analyzer ทําใหไดภาพของตัวอยางท่ีมีสีสรรสวยงามและมี contrast (สําหรับ polarized)

5. Florescent objects คือ วัตถุท่ีปลอยแสงไดเมื่อถูกกระตุนดวยพลังงาน

5

Specimen Type Imaging Technique Phase Object (วัตถุใส) Bacteria, Spermatozoa,

Cells in Glass Containers, Protozoa, Mites, Fibers, etc.

Phase Contrast

Differential Interference Contrast (DIC)

Light Scattering Objects (วัตถุกระจายแสง) Diatoms, Fibers, Hairs,

Fresh Water Microorganisms, Radiolarians, etc.

Darkfield Illumination

Phase Contrast and DIC

Amplitude Specimens (วัตดุดูดกลืนแสง) Stained Tissue

Naturally Colored Specimens Hair and Fibers

Insects and Marine Algae

Brightfield Illumination

Fluorescent Specimens (วัตถุปลอยแสง) Cells in Tissue Culture

Fluorochrome-Stained Sections Smears and Spreads

Fluorescence Illumination

Birefringent Specimens (วัตถุหักเหแสงหลายทิศทาง) Mineral Thin Sections

Liquid Crystals Melted and Recrystallized Chemicals

Hairs and Fibers Bones and Feathers

Polarized Illumination

6

Darkfield Microscopy

เราคงคุนเคยกับดวงดาวในคืนท่ีฟามืด แสงจากดวงดาวนั้นเปนแสงที่เกิดจากดาวที่อยูไกลออกไปจากโลกมากและเปนแสงที่ออนมากๆ แตการที่เราสามารถมองเห็นดวงดาวได ก็เนือ่งจาก contrast ท่ีเกิดขึ้นเพราะฟาท่ีมืดสนิท โดยความจริงแลวดวงดาวสองแสงท้ังกลางวันและกลางคืน แตในเวลากลางวันแสงจากดวงอาทิตยกลบแสงจากดวงดาวเสียหมด หลักการนี้ถูกนํามาใชในกลอง darkfield ซ่ึงเปนวิธีการเพ่ิม contrast ท่ีงายและเปนท่ีนิยมมากที่สุด ทําใหนักชีววิทยาสามารถมองเห็นตัวอยางท่ีใสและไมยอมสีได ตัวอยางดังกลาวมักจะมีคา refractive indices ใกลเคียงกับสิ่งแวดลอม

ภาพนี้แสดงความแตกตางของ darkfield และ brightfield (กลองธรรมดา เรียกวา brightfield เพราะพื้นหลังสวาง) เมื่อใชดูตัวอยางของโปรโตซํว radiolarian ซ่ึงเปนสิ่งมีชีวิตท่ีอาศัยในทะเล ในภาพ a ซ่ึงเปนกลอง brightfield โครงสรางภายใน เห็นไดไมชัดเจน แมวาจะไดใชการลดปริมาณแสงที่เขา condenser แลวก็ตาม เพ่ือใหเกิด contrast แตรายละเอียดของภาพก็เสียไป ภาพ 2b เปนภาพที่ไดจาก darkfield จะเห็นวาไดรายละเอียดมากกวา โดนเฉพาะสวนบนของตัวอยาง นอกจากนั้นภาพยังดูเปนสามมิติมากกวา สวนภาพ 2c เปนการใชฟลเตอรสีแดง ชวยในการมองภาพจาก darkfield

องคประกอบของกลอง กลองชนิดนี้ จะมีอุปกรณพิเศษท่ีใชในการการก้ันแสงจากแหลงกําเนิดแสงที่ปกติจะผานตัวอยางโดยตรงไมใหผาน ในรูปจะเห็นวา Opaque light stop จะบังแสงเอาไว จากนั้นแสงจะสะทอนผาน convex mirror และ concave mirror ทําใหไดลําแสงเอียงๆ หากไมมีตัวอยางอยูรังสีเฉียงสองรังสีจะตัดผานกัน แตจะไมเขาสูเลนสใกลวัตถุ ทําใหภาพที่มองเห็นมืดสนิท หากมีตัวอยางอยู แสงเอียงท่ีผานตัวอยางจะหักเหเขาสูเลนสใกลวัตถุ ซ่ึงจะมากหรือนอยขึ้นกับ refractive index ชองตัวอยาง

สวนตางๆ ของตัวอยาง เชน เยื่อหุมเซลล นิวเคลียส ออรแกเนลล มีคา refractive index ตางกันจะทําใหความเขมแสงตางกันดวย และปรากฏเปนรายละเอียดท่ีตาสามารถแยกความแตกตางได

แมวาจะมีแสงปริมาณนอยมากที่หักเหผานเขาเลนสใกลวัตถุ แตเราสามารถมองเห็นไดชัดเจนในพื้นหลังสีดํา ภาพที่ไดจาก darkfield จะแสดงขอบเขตไดดี แตไมสามารถแสดงรายละเอียดภายในไดชัดเจนเทากับกลอง phase contrast หรือ DIC

ศึกษาหลักการของกลอง darkfield ไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/darkfield/cardioid/index.html

7

ตัวอยางสิ่งมีชีวิตท่ีนิยมใชสําหรับกลองชนิดนี้ ไดแก ส่ิงมีชีวิตขนาดเล็กๆ เชน helminth trematode (Echinostoma revolutum) ในภาพ 7b, diatoms, สาหราย, แมลงเล็กๆ เชน deer tick (Ixodes demmini) ในภาพ 7a, กระดูก, fibers, ผม, แบคทีเรียท่ีไมยอมสี, ยีสต, โปรโตซัว, เนื้อเยื่อ และโครงสรางเล็กๆ เชน trachea ของ silkworm ในรูป 7c การเตรียมตัวอยางนั้นควรทําตัวอยางใหบางมากที่สุด เพราะตัวอยางท่ีหนาอาจมีคุณสมบัติไมสม่ําเสมอ และบริเวณเหนือและใตจุด focus ก็สามารถที่จะหักเหแสงได อาจทําใหเกิด artifact

ศึกษาตัวอยางภาพไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/darkfieldgallery.html

หมายเหต ุแมวากลอง darkfield จะถูกสรางขึ้นเพ่ือใชศึกษาตัวอยางท่ีไมไดยอมสี แตตัวอยางท่ียอมสีก็สามารถนํามาสองดูภายใตกลอง darkfield ได และจะไดภาพที่มีความชัดเจนมากยิ่งขึ้นไปอีก

Phase Contrast Microscopy

กลอง Phase contrast ถูกสรางขึ้นโดยหองปฏิบัติการ Zeiss ในราวชวงทศวรรษ 1930-1940 ซ่ึงชวยเพ่ิม contrast และนิยมใชในการศึกษาเซลลหรือส่ิงมีชีวิตท่ียังมีชีวิตอยู ใหกับตัวอยางท่ีไมไดยอมสี โดยยังคงใหรายละเอียดท่ีดี

รูปท่ี 2 แสดงความแตกตางของเนื้อเยื่อสมองท่ีมีชีวิตภายใตกลอง

ลท่ี

หลักการทํางาน เมื่อแสงผานตัวอยางชนิดท่ีเรียกวา phase objects

แสงท่ีผานตัวอยางจะไปถึงระนาบของภาพ (image plane) ไมพรอมกับแสงที่

ตาของมนุษยไมสามารถบอกความแตกตางของ phase ของคล่ืนได าสามา

การดัดแปลงของกลอง phase contrast ทําโดย การเรง

ธรรมดา และ phase contrast ในกลองธรรมดา เซลลจะใส จะมีเฉพาะสวนท่ีหักเหแสงไดดี เชน เยื่อหุมเซลล นิวเคลียส และเซลไมยึดเกาะ (เซลลกลมๆ) ท่ีมองเห็นไดชัด เมื่อดูดวยกลอง phase contrast จะเห็นรายละเอียดไดดีกวา

(ไมดูดกลืนแสง มีความใส) แสงที่ผานตัวอยางจะเดินทางชาลงเมื่อเทียบกับแสงที่ผานรอบๆ ตัวอยาง โดยจะมีความแตกตางของ phase อยูเทากับ 1/4 ของความยาวคลื่น (90 องศา) การที่แสงเดินทางชาลง

เพราะตัวอยางสามารถหักเหแสงไดหรือเปนเพราะความหนาของตัวอยาง หรือท้ังสองปจจัย

ผานไปรอบๆ ตัวอยาง ดังนั้น แสงสองสวนจึง out of phase ท่ีระนาบของภาพคลื่นแสงที่ผานตัวอยางและที่ผานไปรอบๆ ตัวอยางจะเกิด interference แตก็ไมทําใหเกิดการเปล่ียนแปลง amplitude ของคล่ืนโดยรวมมากนัก

(ต รถบอกไดแคสวางมากนอย และบอกสีได) กลอง phase contrast มีการดัดแปลง เพ่ือเปลี่ยนความแตกตางของ phase ใหเปนความแตกตางของ amplitude หรืออาจกลาวไดวา เปล่ียน phase object ใหเปน amplitude object เทคนิคนี้ คิดคนโดย Zernike ซ่ึงทําใหเขาไดรางวัล Nobel prize สาขาฟสิกสในป 1953

ความเร็วของสงท่ีผาน งแ รอบๆ วัตถุไปอีก 1/4 ความยาวคลื่น หรือ 90 องศา ดังนั้น ความแตกตา ของ phase ระหวางคลื่นท่ีผานวตัถุและคล่ืน

8

ท่ีผานรอบวัตถุ จะมีคาสุทธิเปน ½ ของความยาวคลื่น หรือ 180 องศา หรือ มี phase ตรงขามกันพอดี และเมื่อคล่ืนแสงนี้ไปรวมกันทีระนาบของภาพ จะเกิดการหักลางกัน (destructive interference)

ศึกษาหลักการนี้ไดจาก

du/primer/java/interference/waveinteractions/index.html

ผลคือ ภาพที่ไดจะเปนภาพที่มืด และมีพ้ืนหลังท่ี วิธ

http://micro.magnet.fsu.e

ออนๆ ีการนี้ เรียกวา dark หรือ positive phase contrast อีกวิธีหนึ่ง คือ การลดความเร็วของแสงที่ผานรอบวัตถุ 1/4 ความยาวคลื่น ทําใหคล่ืนท่ีผานวัตถุและผารนอบวัตถุมี phase ตรวกัน ดังนั้นคล่ืนท้ังสองจะเสิรมกัน (constructive in rfere) ี่ระนาบของภาพ ผลทีไดคือ ภาพวัตถุท่ีสวางบนพื้นหลังท่ีมืด เรียกวิธีการนี้วา negative or bright phase contrast

te ท

ศึกษาหลักการนี้ไดจาก

com/tutorials/java/phasecont

ขอจํากัดของกลอง Phase contrast

• มักทําใหเกิด halos (บริเวณขาวๆ เรืองๆ) รอบๆ ขอบของตัวอยาง ซ่ึงเปน artifacts ทําใหขอบเขตของวัตถุไมชัดเจน

ต

สําหรับกลอง Phase contrast ออรแกเนลลท่ีมี refractive index สูง เชน vacuoles, cytoplasm, the interphase cleus,

ศึกษาตัวอยางภาพไดจาก

/primer/techniques/phasegallery.html

ในชวงทศวรรษ 1950 นักวิทยาศาสตรชาวฝรั่งเศษ ชื่อ Georges

หลักการ อุปกรณสําคัญท่ีตองมี คือ polarizer ทําหนาท่ีปรับใหแสงเปน

ศึกษาหลักการนี้ไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/dic/lightpaths/index.html

http://www.microscopyu.

rast/positivenegative/index.html

• กลอง phase contrast มีขอจํากัดเร่ืองของ numerical aperture ของระบบเลนสทําใหรายละเอียดของภาพลดลง • ไมสามารถทํางานไดดีกับตัวอยางท่ีมีความหนา เพราะการเปลี่ยน Phase สามารถเกิดขึ้นได จากบริเวณเหนือ หรือใ

ตัวอยาง ทําใหเกิดภาพท่ีไมเปนไปตามความจริงได

nu nucleolus, mitotic chromosomes, mitochondria จะมองเห็นเปนสีเขมกวาพ้ืนหลัง สวน pinocytotic vesicles, lipid droplets, และ air vacuoles ท่ีพบในพืช และในโปรโตซัว มี refractive index ตํ่ากวา cytoplasm จะแลดูเปนจุดสวางในเซลล

http://micro.magnet.fsu.edu

Differential Interference Contrast Microscopy

Nomarski ไดดัดแปลง Wollaston prism ใหสามารถใชในการบงบอกความเขมแสงได ในปจจุบัน แนวคิดนั้นไดพัฒนามาเปนระบบของกลองท่ีเรียกรวมๆ กันวา differential interference contrast (DIC)

โพลาไรซ จากนั้นแสงโพลาไรซท่ีส่ัน (vibrate) อยูในระนาบเดียวจะผาน Normarski prism สําหรับแยกแสงออกเปนสองสาย แสงท่ีออกจากปริซึมท้ังสองสายจะหักเหออกจากกันเล็กนอย โดยมีระยะหางกันนอยมากๆ แตมีระนาบของคล่ืนต้ังฉากซึ่งกันและกัน จึงไมเกิด Interference

9

จากนั้น เมื่อแสงผานไปที่ตัวอยาง ทิศทางของแสงจะเปลี่ยนไป ขึ้นกับสมบัติของตัวอยาง เชน ความหนา คา Refractive index ผิวท่ีไมสม่ําเสมอ แสงท่ีผานวัตถุจะผานเขาสูเลนสใกลวัตถุ (รูปท่ี 1) และผานไปสู prism ท่ีสองท่ีจะรวมลําแสงท้ังสองใหเปนลําแสงเดียว เพ่ือใหแสงท้ังสองลําเกิด Interference จะตองมี polarizer อีกอันหนึ่ง หรือบางครั้งเรียกวา analyzer ทําหนาท่ีปรับระนาบคลื่นใหอยูในระนาบเดียวกัน ภาพที่ไดจากกลองชนิดนี้จะทําใหดานหนึ่งของโครงสรางมืด และอีกดานหนึ่งสวางแลดูเหมือนมีภูเขาและหุบเขา หรือกลาวไดวาทําใหเกิดเงาขึ้น และทําใหภาพแลดูเปนสามมิติ (pseudo 3D) ภาพที่ไดจึงไมใชลักษณะท่ีแทจริงของวัตถุ แตเปนผลมาจากความหนาของสวนตางๆ ของตัวอยางท่ีไมเทากัน ดังนั้น จึงไมเหมาะสมท่ีจะใชภาพจากกลองชนิดนี้ในการหาคาความสูงหรือความลึก การหมุนต าง 108 องศา จะทําใหเกิดการเปลี่ยนแปลงจากภูเขาเปนเหว หรือในทางกลับกันได ตัวอยางเชน ภาพอัณฑะของแมว จะเห็นวาภาพไมแบนเสียทีเดียว แตมีสวนท่ีนูนขึ้นมาและบุมลงไป

ัวอย

ขอไดเปรียบของ DIC เมื่อเทียบกับ phase contrast คือ ใหรายละเอียดดีกวา เพราะไมมขีอจํากัดเร่ืองของ numerical aperture และสามารถทํา optical sectioning ได ดังนั้นตัวอยางจึงไมตองบางมาก เหมือน Phase contrast นอกจากนั้นยังไมมี halo ดวย

ศึกษาตัวอยางภาพไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/dic/dicgallery/index.html

Polarized Light Microscopy

ปกติคล่ืนแสงจะมีระนาบการสั่นต้ังฉากกับทิศทางการเคลื่อนท่ีของแสง โดยทิศทางการสั่นในแตละทิศทางมีโอกาสเกิดไดเทาๆ กันหมด ซ่ึงเรียกไดวาแสงขาวโดยทั่วไป สวนแสงโพลาไรซนั้น จะมีการสั่นเพียงระนาบเดียว ตาของมนุษยืไมสามารถบงบอกความแตกตางของการสั่นแตละระนาบได (แตตาสามารถบอกผลของความเขมแสงได เชน เมื่อเราใสแวนตากันแดด ท่ีเปน polarize) อุปกรณใดๆ ท่ีสามารถทําใหคล่ืนแสงสั่นในระนาบเดียวกัน เรียกกวา polarizer

กลอง Polarize ใชสําหรับตัวอยาง ท่ีมีคุณสมบัติเปน birefringent หรือมีการหักเหของแสงไดมากกวาสองทิศทางขึ้นไป กลองชนิดนี้มีความไวสูง สามารถใชท้ังในงานดานวิเคราะหดานปริมาณ และคุณภาพ

หลักการ กลองชนิดนี้มีการดัดแปลงจากกลองธรรมดา คือ มี polarizer ซ่ึงวางตําแหนงไวกอนแสงผานตัวอยาง และมี analyzer วางไวกอนหลังเลนสใกล กอนถึงจุดท่ีทําการสังเกตหรือบันทึกภาพ แสงท่ีผานตัวอยางท่ีมีคุณสมบัติเปน birefringent จะทําใหเกิดคล่ืนแสงสองคลื่น แตละคล่ืนสั่นในระนาบเดียว แตมีระนาบการสั่นต้ังฉากกัน (รูปท่ี 1) ความเร็วของคล่ืนท้ังสองจะไมเทากัน เมือแสงผานตัวอยางแลวจะไปรวมตัวกันอยางเสริมหรือหักลาง

Isotropic materials เชน แกว ของเหลว มีคุณสมบัตทางแสงเหมือนกัน ไมวาจะพิจารณาจากดานใด มีคา refractive index คาเดียว และมีขอจํากัดของระนาบการสั่นของคลื่นแสง แต anisotropic materials ซ่ึงไดแก ของแข็งสวนใหญ มีคุณสมบัติทางแสงตางกัน ขึ้นกับทิศทางของแสงที่มากระทบ และมีคา refractive index มากกวาสองคาขึ้นไป คุณสมบัตืท่ี

10

สําคัญ คือ มันสามารถแยกแสง 1 คล่ืนออกเปนคล่ืนแสงมากกวา 1 คล่ืนได (ปริซึมเปนตัวอยางท่ีดี) คล่ืนแสงสองคลื่นท่ีออการคลาย DIC มาก แตไมตองมีปริซึม) จาก anisotropic จะมีระนาบตั้งฉากซึ่งกันและกัน ดังรูป ท่ี 1 (หลักก

ลักษณะภาพที่เกิดจากกลองนี้ คือ เมื่อหมุนวอยาง จ ห

ในระยะแรกกลองชนิดนี้ใชมากในทางธรณีวิยา ใ ารตรวจ

ตรทาง

ตั ะเห็นการเปลี่ยนแปลงของความสวาง รือสีของตัวอยาง คุณสมบัตินี้ใชในการระบุชนิดของตัวอยางได

นก แร หิน ผลึกตางๆ ในทางชีววิทยา สามารถใชตรวจดู polymers เชน แปง, urea และ biological macromolecules ตอมามีการประยุกตใชในทางการแพทย วิทยาศาส ทะเล วัสดุศาสตร เทคโนโลยี

ทางอาหาร ตัวอยางท่ีสามารถนํามาตรวจสอบได เชน ผลึก gout หรือ monosodium urate (สําหรับคนเปนโรคเกาท), เนื้อเยื่อกลามเนื้อ, ฟน, แรธาตุ, fibers, ไขมัน, glasses, ceramics, metals

ศึกษาตัวอยางภาพไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/polarized/gallery/index.html

Fluorescence Microscopy

Photoluminescence เปนปรากฎการณ ท่ีอะตอมสงพลังงานแสงออกมา หลังจากไดรับพลังงานเขาไปจนอยูในภาวะ excited state พลังงานที่ไดรับเขาไป อาจเปนพลังงานแสง พลังงานกล เชน การเสียดสี หรือพลังงานจากปฏิกิริยาเคมีก็ได ปรากฏการณนี้แบงออกเปนสองประเภท คือ fluorescence และ phosphorescence Fluorescence เกิดจากการที่อะตอมดูดกลืนพลังงานแสงที่ความยาวคลื่นหนึ่ง และสงพลังงานแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกวาออกมาหลังจากชวงเวลาสั้นๆ สวน phosphorescence จะเกิดคลายๆ กัน แตมีชวงท่ีอะตอมอยูใน excited state นานกวา

ในรูปท่ี 1 โฟตรอน ของรังสี UV (ซ่ึงมีความยาวคลื่นสั้น และมีพลังงานสูง) ชนกับอิเลคตรอนทําใหอิเลคตรอนมีพลังงานมากขึ้นอยูในภาวะไมเสถียร อิเลคตรอนจะปลอยพลังงานนี้ออกมาในรูปแสงสีเขียว ซ่ึงมีความยาวคลื่นมากกวา

ตัวอยางบางชนิด เชน คลอโรฟลลของพืช มีความสามารถในการเปลงแสงโดยตรง เรียกวา autofluorescence จึงสามารถนํามาศึกษาดวยกลองชนิดนี้ได เราอาจเปลี่ยนตัวอยางท่ีไมมีความสามารถนี้ ใหมีความสามารถนี้ได โดยการใชสารเคมีท่ีเรืองแสง (fluorochromes) ไดติดสลากไปบนตัวอยาง (labeling) ตัวอยางท่ีถูกดัดแปลงนี้ เรียกวา secondary fluorescence

Fluorochromes คือ สียอมท่ีมีคุณสมบัติเปลงแสงได สียอมนี้มีคุณสมบัติท่ีจะเขาทําปฏิกิริยากับเซลลหรือองคประกอบยอยของเซลลอยางจําเพาะ ตัวอยางเชน 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) จะทําปฏิกิริยากับกรดนิวคลีอิค nucleic acids โดยจับกับบริเวณ A-T base pair ของ DNA จึงเปนท่ีนิยมใชในการบงบอกตําแหนงของนิวเคลียส DAPI จะใหสี

11

น้ําเงิน เมื่อถูกกระตุน สียอม นักวิทยาศาสตรสามารถใชสียอมชนิดตางๆ ท่ีมีความจําเพาะตอสวนตางๆ ของเซลล ในการบงชี้โครงสรางของเซลลหลายๆ โครงสรางพรอมๆ กัน

หลักการ กลอง fluorescence ทํางานโดยใหแสงกระตุน (excitation light) ซ่ึงปกติเปน UV สองไปที่ตัวอยาง และจากนั้นแยกแสงที่ตัวอยางปลอยออกมา (emission light) ซ่ึงออนมากๆ ออกจากแสงกระตุนซึ่งมีความเขมมากกวา และใหแสงท่ีจัวอยางปลอยออกมาไปสูตาผูสังเกต หรือไปบันทึกไวดวยกลอง (ภาพท่ี 3) ภาพที่ไดจะเปนสีตางๆ และมีพ้ืนหลังสีดํา

จากภาพที่ 3 แสง UV และแสงขาวจากแหลงกําเนิดแสงจะผาน exciter filter ซ่ึงจะยอมใหเฉพาะแสง UV ผานได แสง UV จะไปกระทบตัวอยาง จากรูปตัวอยางจะปลอยแสงสีน้ําเงินออกมา ซ่ึงจะกระจายไปทุกทิศทุกทางเชนเดียวกับแสง UV ท่ีสวนหนึ่งจะสะทอนไปทุกทิศทุกทาง แสงบางสวนจะหักเหไปสูตาผูสังเกต ซ่ึงจะตองมีการกรอง UV ออกไปโดย barrier filter และใหเฉพาะแสงสีน้ําเงินท่ีออนกวามากเทานั้นผานมาสูผูสังเกตได

กลองชนิดนี้สามารถใชในการระบุเซลลหรือองคประกอบของเซลลได โดยมีความไวและความแมนยําสูงอยางนาอัศจรรย ปจจุบัน กลอง fluorescence ใชกันอยางมากในการศึกษาชีววิทยาของเซลล

เสนทางเดินทางแสง รูปท่ี 1 แสดงการเดินทางของแสง จากแหลงกําเนิดแสง (Mercury Lamp) ลําแสงจะผานเลนสรวบรวมแสง และ aperture diaphragm และ field diaphragm และผาน excitation filter ซ่ึงสามารถเลือกไดวาจะยอมใหคล่ืนความยาวแสงเทาไรผาน (จากรูปหลังผานฟลเตอร แสงสีมวงจะถูกกรองและใหสีเขียวเทานั้นผาน) คล่ืนแสงที่ผานจะผานกระจกพิเศษ เรียกวา dichromatic beamsplitting mirror ซ่ึงมีคุณสมบัติพิเศษท่ีจะสะทอนคล่ืนท่ีมีความยาวคลื่นสัน้ แตยอมใหแสงท่ีมีความยาวคลื่นยาวผาน ดังนั้นแสง UV กระจกนี้จะวางเปนมุม 45 องศา ดังนั้นแสง UV จะถูกสะทอนไปที่วัตถุ (สังเกตทิศทางการเดินของแสงสีเขียวท่ีจะทํามุม 90 องศา) สวนแสงที่ตัวอยางปลอยออกมาจะกระจายไปทุกทิศทาง โดยแสงที่พุงขึ้นดานบนจะผานกระจก dichromatic beamsplitting mirror ไปไดตรงๆ เขาสูกลองและตาผูสังเกต แต UV บางสวนท่ีสะทอนกลับมาในทิศทางพุงขึ้นจะถูกกระจกสะทอนกลับไปในทิศทางเดิม (ไปสูแหลงกําเนดิแสง)

ศึกษาองคประกอบไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/lightpaths/fluorescence/index.html

ศึกษาตัวอยางภาพไดจาก

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorogallery.html

เรียบเรียงจาก Optical Microscopy Primer http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html