แบบเสนอโครงการวจย (research project)

ประกอบการเสนอของบประมาณ ประจ าปงบประมาณ พ.ศ. 2561

------------------------------------

ชอโครงการวจย (ภาษาไทย) กลไกการออกฤทธของเนเฟอรนตอเซลลไขมนชนดสามทสามแอลหนงในสภาวะดออนซลน

(ภาษาองกฤษ) Mechanism of actions of Neferine in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes ชอแผนงานวจย (ภาษาไทย) (กรณเปนโครงการวจยภายใตแผนงานวจย) ....................................................... (ภาษาองกฤษ) ............................................................................................................. ..........

สวน ก : ลกษณะโครงการวจย

โครงการวจยใหม

โครงการวจยตอเนอง ระยะเวลา...........ป...........เดอน ปนเปนปท.......................

1. ยทธศาสตรการพฒนาประเทศตามแผนพฒนาเศรษฐกจและสงคมแหงชาต ยทธศาสตร ยทธศาสตรการวจยท 8 : การพฒนาวทยาศาสตร เทคโนโลย วจย และนวตกรรม เปาประสงค -ไมตองระบ-

กลยทธ -ไมตองระบ- 2. นโยบายและยทธศาสตรการวจยของชาต ยทธศาสตร ยทธศาสตรการวจยท 3 : สงเสรมกลไกและกจกรรมการน ากระบวนการวจย ผลงานวจย องคความร

นวตกรรม และเทคโนโลยจากงานวจยไปใชประโยชนอยางเปนรปธรรม โดยความรวมมอของภาคสวนตาง ๆ กลยทธ 3.1 สงเสรมการจดการความรและสรางองคความร นวตกรรม และเทคโนโลยจากงานวจย

แผนวจย -ไมตองระบ- 3. ยทธศาสตรการวจยของชาตรายประเดน

ยทธศาสตรการวจยดานการพฒนาสมนไพร 4. ยทธศาสตรชาต

การพฒนาและเสรมสรางศกยภาพคน 5. นโยบาย/เปาหมายของรฐบาล

ระเบยบวาระแหงชาต ไมสอดคลอง

โครงการทาทายไทย ไมสอดคลอง

นโยบายรฐบาล 8. การพฒนาและสงเสรมการใชประโยชนจากวทยาศาสตร เทคโนโลย การวจยและพฒนา และนวตกรรม

6. ยทธศาสตรของหนวยงาน การวจยตามความเชยวชาญเฉพาะทางของนกวจย

การตรวจสอบทรพยสนทางปญญาหรอสทธบตรทเกยวของ

ไมมการตรวจสอบทรพยสนทางปญญา และ/หรอ สทธบตรทเกยวของ ตรวจสอบทรพยสนทางปญญาแลว ไมมทรพยสนทางปญญา และ/หรอ สทธบตรทเกยวของ ตรวจสอบทรพยสนทางปญญาแลว มทรพยสนทางปญญา และ/หรอ สทธบตรทเกยวของ หนวยงานรวมลงทน รวมวจย รบจางวจย หรอ Matching fund ชอหนวยงาน/บรษท ............................................................................................................... .................... ทอย ....................................................................................... ............................................ เบอรโทรศพท ............................................................................................................... .................... ชอผประสานงาน ............................................................................................................... .................... เบอรโทรศพทผประสานงาน .......................................................................... ......................................................... เบอรโทรสารผประสานงาน ............................................................................................................... .................... อเมลผประสานงาน ............................................................................................................... .................... การเสนอขอเสนอหรอสวนหนงสวนใดของงานวจยนตอแหลงทนอน หรอเปนการวจยตอยอดจากโครงการวจยอน

ม ไมม หนวยงาน/สถาบนทยน ............................................................................................................... .................... ชอโครงการ ............................................................................................................... .................... ระบความแตกตางจากโครงการน ............................................................................................................... .................... สถานะการพจารณา ไมมการพจารณา โครงการไดรบอนมตแลว สดสวนทนทไดรบ......................... % โครงการอยระหวางการพจารณา มาตรฐานการวจย

มการใชสตวทดลอง

มการวจยในมนษย

มการวจยทเกยวของกบความปลอดภยทางชวภาพ มการใชหองปฎบตการทเกยวกบสารเคม

สวน ข : องคประกอบในการจดท าโครงการวจย 1. ผรบผดชอบ

ค าน าหนา ชอ-สกล ต าแหนงในโครงการ สดสวนการม

สวนรวม เวลาทท าวจย

(ชวโมง/สปดาห)

นาย อ านาจ ออนสอาด หวหนาโครงการ 80 20 ผศ. ชยณรงค โตจรส ทปรกษาโครงการ 20 20

2. ประเภทการวจย การวจยพนฐาน สาขาการวจยหลก OECD 3. วทยาศาสตรการแพทยและสขภาพ สาขาการวจยยอย OECD 3.3 วทยาศาสตรการแพทยและสขภาพ : เทคโนโลยเภสชและผลตภณฑธรรมชาต ดานการวจย สขภาพ

3. สาขาวชาการ สาขาวทยาศาสตรการแพทย 4. ค าส าคญ (keyword) ค าส าคญ (TH) เนเฟอรน, เซลลไขมน, เบาหวาน, สภาวะดออนซลน, อะดโพเนคทน

ค าส าคญ (EN) Neferine, Adipocyte, Diabetes mellitus, Insulin resistance, adiponectin 5. ความส าคญและทมาของปญหาทท าการวจย เบาหวานเปนโรคไมตดตอทมแนวโนมเพมขนทกป จากรายงานของสหพนธเบาหวานโลกในป พ.ศ. 2558 พบวา ความชกของโรคเบาหวานในปจจบนสามารถพบผเทปวยเปนโรคเบาหวาน 1 คนจากจ านวนผใหญ 11 คน และคาดการณวา อก 25 ปขางหนาจะมผทเปนโรคเบาหวานเพมขนเปน 1 คนจาก 10 คน และผปวยโรคเบาหวานจากทวโลกจะมอตราการปวยดวยโรคนจากจ านวน 415 ลานคน เปน 642 ลานคนภายในป พ.ศ. 2583 (1) ส าหรบประเทศไทยจากรายงานสถตกระทรวงสาธารณสข กรมควบคมโรค พ.ศ.2550 – 2557 อตราการตายดวยโรคเบาหวานพบวามอตราการตายเพมสงขนอยางตอเนองในแตละป จากขอมลทางสถตของกระทรวงสาธารณสขพบวาในป พ.ศ. 2557 ประชากรไทยเสยชวตดวยโรคเบาหวาน 670,664 คน หรอคดเปน 1,032.50 คนตอประชากร 100,000 คน (2) จงกอใหเกดปญหาทเรอรงของกระบวนการจดการทางสาธารณสขทงในระดบบคคล ครอบครว ชมชนและระดบประเทศ อตราการเกดโรคเบาหวานทเพมขนอยางตอเนองนกอใหเกดผลกระทบทตามมาทงในเรองของงบประมาณ เศรษฐกจและการจดการทรพยากรตางๆมากมายในการบรหารจดการเพอดแลผปวยเบาหวาน โรคเบาหวานเปนโรคทเกดจากความผดปกตของระบบเมแทบอลซมของงรางกายกอใหเกดสภาวะน าตาลในเลอดสง (hyperglycemia) สงผลใหเกดการท าลายหรอเสอมสภาพทงทางโครงสรางและหนาทของอวยวะตางๆ รวมไปถงการเกดสภาวะแทรกซอนเรอรงทส าคญไดแก ตา ไต ระบบประสาทสวนปลาย รวมถงหวใจและหลอดเลอด (3-6) ดวยเชนกน จากการจดจ าแนกเบาหวานอาจแบงไดเปนประเภทใหญๆ 2 ชนดคอ เบาหวานชนดท 1 ซงเกดจากความบกพรองของเบตาเซลลทบรเวณ islets of Langerhans เปนบรเวณทมการสรางฮอรโมนอนซลน (Insulin) ซงเปนฮอรโมนทส าคญในการควบคมระดบน าตาลในเลอด โดยเบาหวานชนดท 1 พบไดไมมากนกประมาณ 5-10 เปอรเซนต และเบาหวานชนดท 2 เกดจากความผดปกตของเนอเยอเปาหมายไมตอบสนองตอฮอรโมนอนซลนหรอดอตออนซลน (Insulin resistance) พบไดมากทสดประมาณ 90-95 เปอรเซนต มกเกดในผใหญทมน าหนกเกนหรอมสภาวะอวน (Obesity) (7) ซงจดเปนหนงในหลายๆสภาวะทกอใหเกดทางกลมอาการความผดปกตทางเมแทบอ

ลซม (metabolic syndrome) และแนวโนมการมสภาวะอวนหรอน าหนกเกนมาตรฐานเพมขนอยางตอเนองจากทวโลก นอกจากนยงเปนททราบกนดวาสภาวะอวนหรอการมน าหนกเกนมาตรฐานนเปนปจจยเสยงหลกของการเกดสภาวะดอตอฮอรโมนอนซลน (insulin resistance) และจะพฒนาไปสโรคเบาหวานชนดท 2 (Type 2 diabetes) ซงจะสงผลกระทบและปญหาตอสขภาพมากมาย รวมไปถงอาการแทรกซอนตางๆ เชน โรคทางระบบหวใจรวมหลอดเลอด (Cardiovascular diseases) โรคไขมนพอกตบทไมเกยวของกบแอลกอฮอร (non-alcohol fatty liver disease) ความผดปกตของเรตนาหรอจอประสาทตา (retinopathy) ความผดปกตของหลอดเลอด ความผดปกตของไต ซงจะน าไปสปญหาดานสขภาพและเศรษฐกจในระดบระเทศรวมถงปญหาการจดสรรทรพยากรมนษยตางๆตามมาอกมากมาย โดยปกตแลวเนอเยอไขมนจะประกอบไปดวยเซลลหลายชนดทง preadipocytes adipocytes macrophages endothelium และ fibroblasts โดยท adipocytes ท าหนาทในการเกบพลงส ารองในรปไขมนหรอไตรกลเซอไรด โดยเซลล preadipocytes จะถกกระตนดวย adipogenic transcription factors ตางๆ เชน CCAAT/enhancer binding protein family (C/EBPs) และ peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) (8) ซงท าหนาทในการกระตนการสงเคราะหไขมนและเกบสะสมไวในเซลลเปนพลงงานส ารอง โดยจะท าหนาทรวมกบวถการสงสญญาณของฮอรโมนอนซลน (insulin signaling) ทจะมผลตอการขนสงกลโคสเขาเซลลจากนนจะถกเปลยนเปนกลเซอรอลและน ามาสงเคราะหเปนไตรกลเซอไรดสะสมไวในเซลลไขมนดงทไดกลาวมาแลวน ซงไตรกลเซอไรดทไดนจะถกสะลายเปนกรดไขมนเพอน ามาใชเปนพลงงานแทนเมอพลงงาน (ATP) จากกลโคสไมเพยงพอ เชน การออกก าลงกายอยางตอเนอง ในสภาวะดอตออนซลน (insulin resistance) เปนสภาวะทรางกายไมสามารถตอบสนองตอฮอรโมนอนซลน ในเซลลไขมนกไมมการตอบสนองตออนซลนเชนเดยวกบเซลลอนๆ ซงในสภาวะปกต insulin signaling จะสงสญญาณผาน Akt ไปเคลอนยาย GluT4 มาทผนงเซลลเพอน าเขากลโคสมาในเซลลไขมน (9) เมอมสภาวะดอตออนซลนจงท าใหไมสามารถน ากลโคสเขามาได ดงนนไขมนสะสมดงทไดกลาวมาแลวขางตนจะลดลง ซงหากไมสามารถน ากลโคสมาเกบสะสมในรปไตรกลเซอไรดไดจะท าใหระดบน าตาลในเลอดผทมสภาวะดอตออนซลนสงขน ถงแมเซลลไขมนจะไมไดควบคมระดบน าตาลกลโคสโดยตรงแตเปนแหลงเกบพลงงานส ารองแหลงใหญของรางกาย ซงอาจจะจดไดวาเปนการควบคมระดบของกลโคสทางออมไดเชนกน ผปวยทมสภาวะอวนหรอเปนโรคเบาหวานชนดท 2 จะพบวามระดบน าตาลในเลอดสงกวาปกต(Hyperglycemia) เนองจากเซลลดอตอการตอบสนองตอฮอรโมนอนซลนจงไมสามารถน าน าตาลเขาสเซลลได กอใหเกดการแทรกซอนมากมายดงทไดกลาวมาขางตน สงผลใหมสภาวะเสยงตอการเสยชวตเพม ดงนนผปวยเหลานจงจ าเปนตองไดรบการรกษาเพอควบคมระดบน าตาลในเลอดใหเปนปกต ไมวาจะเปนการปรบเปลยนพฤตกรรมประจ าวนหรอการออกก าลงกาย (10) นอกจากนผปวยทเปนเบาหวานชนดท 2 น มากกวา 40 เปอรเซนตตองรบยาฉดอนซลนและ/หรอยากนเพอลดระดบน าตาลในเลอดรวมดวย โดยการใชยาเหลานเปนเวลานานถงแมจะลดระดบน าตาลในเลอดไดแตกสงผลเสยตอรางกายเชนกน โดยอาจพบอาการทไมพงประสงค (adverse effects) เชน ระดบน าตาลในเลอดต า เกดพษทตบ เปนตน ยาทใชในการรกษาโรคเบาหวานเหลานจ าเปนตองน าเขามาจากตางประเทศเปนจ านวนมากท าใหประเทศไทยตองเสยดลการคาและมเงนตราออกนอกประเทศเปนจ านวนมากในแตละป แตอยางไรกตามประเทศไทยมหลกฐานแสดงต าหรบยาหรอผลตภณฑธรรมชาตซงมฤทธในการลดระดบน าตาลในเลอด

จ านวนมาก ซงถอเปนการรกษาแบบทางเลอก (alternative therapy) อกทางหนง โดยคาดการณวาผลตภณฑทมาจากธรรมชาตตางๆจะลดปจจยอนตรายจากอาการทไมพงประสงคดงทไดกลาวมาขางตน นอกจากนพชสมนไพรเหลานพบไดทวไปและหาซอไดงายเพราะจดเปนพชสมนไพรประจ าครวเรอน เชน มะระขนก กระเทยม บอระเพด เปนตน ทมขอมลทางการแพทยพนบานหรอแพทยแผนไทยวาลดระดบน าตาลในเลอดได จงเปนอกหนทางทจะเพมมลคาของพชสมนไพรไทยและเปนการสงเสรมพฒนาสขภาพของคนไทยอกดวย นอกจากนหากการศกษาสมนไพรเหลานไดถงคณสมบตทางเคมของสารส าคญ (active compounds) และกลไกการออกฤทธ (mechanism of actions) ของสารส าคญเหลานนจะท าใหเกดประโยชนตอการรกษาสงสดและลดโทษทเกดจากพษของสมนไพรเหลานนตอผใชหรอกลาวอกนยหนงวาสามารถลดผลขางเคยง (side effects) จากการใชพชสมนไพรเหลานไดอกดวย (11-13) ดบว (lotus seed embryo) พบทบรเวณแกนกลางของเมดบว ดบวมรปรางคลายรปสาก ความยาวประมาณ 1-1.5 เซนตเมตร ขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ 2 มลลเมตร พบใบออน 2 ใบมวนเปนรปคลายลกศร (ใบหนงมขนาดสน อกใบหนงยาว) สเขยวเขมหรอสเขยวอมเหลอง ตนออนตรงขนาดเลกมากอยระหวางใบออนทงสอง ดบวไมมกลน มรสขมจด เปนพชในตระกล Nelumbo สามารถพบไดทวไปในทวปเอเชย ซงในประเทศไทยพบวาบวถกน ามาใชเปนเครองสมนไพรไทยในต าหรบยาตางๆมากมายจาก เชน กลบและเกสรของดอกบว เพอใชรกษาโรคตางๆ สารส าคญทพบจากพชในกลมนมหลายชนด เชน สารกลม alkaloids flavonoids หรอ triterpenes (14) เปนตน สารกลม alkaloid ทพบในพชตระกลบวไดมากคอสารทมชอวา Neferine (bisbenzylisoquinoline alkaloid) ซงพบไดในดบวเปนหลก ฤทธทางเภสชวทยาของดบวมรายงานอยอยางกวางขวาง เชน ตานอนมลอสระ (antioxidant activity) (15) ตานการอกเสบ (anti-inflammation) (16) ตานการเกดมะเรง (anti-cancer) (17) ตานการเกดสภาวะหลอดเลอดแดงเขง (18) เปนตน การศกษาการออกฤทธของ neferine ตอการลดระดบน าตาลในเลอดยงมการศกษา

เพยงเลกนอย เชน Neferine ปองกนเยอบผนงหลอดเลอดในสภาวะน าตาลในเลอดสงผานทางวถ ROS/Akt/NF-кB (19) ฤทธตานการแสดงออกของยน chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5 or RANTES) ในผปวยเบาหวานชนดท 2 (20) และมรายงานวา neferine เพมความไวตอการกระตนดวยฮอรโมนอนซลนในหนขาวทมสภาวะดอตออนซลน (21) แตอยางไรกตามการศกษาฤทธทางเภสชวทยาและกลไกการออกฤทธของ neferine ในโรคเบาหวานยงมรายงานการศกษาเหลานเพยงเลกนอยเทานน โดยเฉพาะอยางยงในเซลลไขมนซงมผลตอการรกษาดลพลงงานส ารองของรางกายในรปไตรกลเซอไรดซงเกยวของและเชอมโยงกบวถการน ากลโคสเขาสเซลลไขมน และรวมถงกลไกตางๆในการท างานของ neferine ในเซลลไขมนทมสภาวะดอตออนซลน ซงทางคณะผวจยยงหวงเปนอยางยงวาเนเฟอรนจะสามารถออกฤทธตอกลไกตางๆทเปนประโยชนตอผปวยเบาหวานชนดท 2 หรอผทมสภาวะดอตออนซลนไดดยงขนไป ดงนนจงเปนทมาของการศกษาวจยในครงน 6. วตถประสงคของโครงการวจย

1. เพอศกษาฤทธของเนเฟอรนในเชงกลไกการท างาน (mechanism of actions) ในเซลลไขมน 3T3-L1 ในสภาวะดอตออนซลน

2. เพอศกษาฤทธของเนเฟอรนในการน ากลโคสเขาสเซลลไขมน 3T3-L1 ในสภาวะดออนซลน

3. เพอศกษาฤทธของเนเฟอรนในการหลง adiponectin ของเซลลไขมน 3L3-T1

4. เพอศกษาฤทธของเนเฟอรนตอการสะสมไขมน (lipid droplets) และไตรกลเซอไรดในเซลลไขมน 3T3-L1

ในสภาวะดออนซลน

7. ขอบเขตของโครงการวจย การศกษากลไกการออกฤทธของเนเฟอรนนน เปนการศกษาสารส าคญจากดบวทมองคประกอบของสารส าคญหลกในกลมอลคาลอยดคอ เนเฟอรนซงไดรบความอนเคราะหจาก ศ.ดร. อภชาต สขส าราญ ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยรามค าแหง สกด ท าบรสทธและควบคมคณภาพของเนเฟอรนดวย ซงการศกษาครงนจะท าการศกษาในหลอดทดลอง (in vitro model) ในเซลลไขมนเรมตนชนด 3T3-L1 แลวเซลลไขมนจะถกเปลยนแปลงพฒนาเปนเซลลไขมนเตมวน (mature adipocytes) โดยถกเหนยวน าใหมสภาวะดอตออนซลนดวย MDI hormone mixture (กลาวไวในขนตอนการทดลอง) แลวท าการศกษาผลของเนเฟอรนถงคณสมบตในการสรางกลมไขมน การสรางไตรกลเซอไรด การน ากลโคสเขาสเซลล การหลง adiponectin และการศกษาการกลไกการท างานผาน

โปรตนตางๆ คอ PPARγ C/EBPα และ GluT 4 นอกจากนศกษาระดบโปรตนฟอสโฟรเลชนของ Akt และ AMPK อกดวย 8. ทฤษฎ สมมตฐาน (ถาม) และกรอบแนวคดของโครงการวจย โรคอวนกอใหเกดสภาวะการดอตออนซลนและกอนใหเกดโรคเบาหวานและกลมอาการความผดปกตทางเมแทบอลซมตามมาอกมากมาย ทงยงกอใหเกดสภาวะแทรกซอนของโรคทกอใหเกดอนตรายตอผปวยเบาหวานอยางมาก โดยการศกษาครงนคณะผวจยจงเหนคณคาการใชประโยชนจากผลตภณฑธรรมชาตเพอเสรมสรางมลคาเพมและลดขอเสยของการใชยาตางๆ โดยคาดหวงวาเนเฟอรนจะสามารถออกฤทธในการกระตนการน าเขากลโคส และเกบสะสมในรปไตรกลเซอไรดเปนพลงงานส ารอง โดยการท างานผานกลไกตางๆในเซลลไขมนชนด 3T3-

L1 ในวถ Akt และ AMPK รวมถง PPARγ C/EBPα และGluT 4 ดวยเชนกน เพอกอใหเกดประโยชนในการรกษาผปวยเบาหวานไดตอไป

9. การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ (information) ทเกยวของ สภาวะอวนหรอสภาวะน าหนกเกนมาตรฐานนนจดเปนลกษณะของผมมมวลไขมนมากวาปกต และมแนวโนมเพมขนทกปทวโลกรวมถงประเทศไทยดวยเชนกน จากรายงานของสหพนธเบาหวานโลกป 2558 พบผปวยเบาหวาน 415 ลานคน (1 ใน 11 คน เปนเบาหวาน โดยไมรตว ทก 6วนาท มคนตายจากเบาหวาน) และคาดการณวาอก 25 ปขางหนา (2583) จะมผปวยเบาหวานเพมขนเปน 642 ลานคน (1) ส าหรบสถตโรคเบาหวานในไทยมแนวโนมเพมขนทกปเชนเดยวกบสถตการเกดโรคเบาหวานของโลก โดยส านกนโยบายและยทธศาสตรและส านกงานปลดกระทรวงสาธารณสขส ารวจรวบรวมขอมลและสรปรายงานวาในป 2557 มผเสยชวตจากโรคเบาหวานถง 670,664 คน (คดเปน 1,032.50 ตอประชากร 100,000 คน) (2) สภาวะอวนเปนปจจยหลกทกอใหเกดสภาวะดอตออนซลน (insulin resistance) ซงเปนฮอรโมนทควบคมระดบน าตาลในเลอดและน าไปสการเกดโรคเบาหวานชนดท 2 นอกจากนยงกอใหเกดโรคแทรกซอน ตางๆ เชน ตาบอด ไตวาย หวใจหยดเตน ปลายประสาทเสอมสภาพ เปนตน และกอใหเกดกลมอาการทผดปกตทางเมแทบอลซม (metabolic syndrome) (22)

เปนททราบกนดวาบทบาทหนาทหลกของฮอรโมนอนซลนเปนการสงสญญาณแบบ anabolic endocrine signal โดยมผลตอกระบวนการเมแทบอลซมตางๆของ คารโบไฮเดรต ลปด และโปรตน โดยทอนซลนจะไปเพมการน ากลโคสเขาสเซลล กระตนการสรางไกลโคเจนทตบและกลามเนอ เกบสะสมไตรกลเซอไรดในเนอเยอไขมน ซงเกยวของกบการรกษาสมดลพลงงานของรางกายทงสน เนอเยอไขมน (adipose tissue) เปนเนอเยอหลกในการเกบสะสมพลงงานส ารอง โดยในคนปกตจะมเนอเยอไขมน 20 เปอรเซนตในผชายและ 30 เปอรเซนตในผหญง จากมวลกายทงหมดและสามารถขยายไดถง 50 เปอรเซนตจากมวลกายทงหมดในคนอวน ซงภายในเนอเยอไขมนจะประกอบไปดวยเซลลหลายๆชนด เชน adipocytes เปนเซลลหลกในการเกบพลงงานส ารองในรปไตรกลเซอไรด preadipocytes macrophages endothelium และ fibroblasts เปนตน ซงฮอรโมนอนซลนจะกระตน endothelial lipoprotein lipase เพอยอยกรดไขมน (fatty acid, FA) ทมาในรปไลโปโปรตนใหอยในรปอสระและน าเขาสเซลลไขมนผานทางโปรตนขนสงกรดไขมน (FA transporters) และจะถก re-esterified โดยใช glycerol 3-phosphate ทไดจากกลโคส โดยการถกขนสงเขาสเซลลไขมนดวยการกระตนของฮอรโมนอนซลนสงสญญาณ (signal transduction) เพอเคลอนยายโปรตนขนสงกลโคสชนดท 4 (GluT4) มาทผนงเซลลไขมน น าไปสงเคราะหเปนไตรกลเซอไรดและเกบไวในหยดไขมน (lipid droplet) (23) ซงใสสภาวะทปวยเปนเบาหวานชนดท 2 หรอสภาวะดอตออนซลน จะท าใหการเกบสะสมพลงงานส ารองในรปไขมนนอยลงเนองจากการสงเคราะหกลเซอรอลทไดจากการน าเขากลโคสของอนซลนลดลงไปในเซลลไขมน สงผลทางออมใหระดบน าตาลในเลอดสงขน ซงหากมสารใดทสามารถเพมความไวตออนซลนในเซลลไขมนไดจะกอใหเกดประโยชนทางออมตอระดบน าตาลในเลอดของผปวยเบาหวานไดเชนกน (24) preadipocytes และ adipocytes เปนอวยวะเปาหมายหลกของฮอรโมนอนซลนในการควบคมการสงเคราะหไตรกลเซอไรด วถการสงสญญาณของ insulin-Akt/PKB (protein kinase B) (25) และ AMP-activated protein kinase (AMPK) (26) ซงเปนตวกลางในการสงสญญาณของอนซลนในเซลลไขมน โดยการกระตนของอนซลนและ AMPK จะสงสญญาณรวมกนเพอกระตนให GluT 4 ยายต าแหนงมาทผนงเซลลไขมนและน ากลโคสเขาสเซลล ซงการเปลยนแปลงเซลลจาก preadipocytes มาเปน mature adipocytes จะเกดขนพรอมๆกบการสะสมไขมนหรอพลงงานส ารองภายในเซลลซงถอวาเปนสญญาณวามการสรางเซลลไขมนเกดขน ซงการเปลยนแปลงพฒนาจาก preadipocytes ไปเปน adipocytes นนเกดจาก adipogenic transcription factor คอ peroxisome proliferator-

activated receptors (PPARs) และ CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBPs) ซงการกระตน PPARγ และ

C/EBPα จะสงเสรมทงกระบวนการสรางเซลลไขมน (adipogenesis) และเพมความไวตออนซลนดวยเชนกน (27) นอกจากน Adipnectin จดเปนสารกลม adipokine ทหลงออกมาจากเซลลไขมน โดยระดบของ adiponectin ทสงจะสามารถลดกระบวนการกอใหเกดโรคอวนและเบาหวานชนดท 2 ได โดยท adiponectin จะท างานรวมกบ AMPK เพอไปกระตนใหมการน ากลโคสเขาสเซลลมากขน นอกจากนยงเพมกระบวนการออกซเดชนของกรดไขมนอกดวยรวมไปถงเพมความไวตอฮอรโมนอนซลนในเซลลไขมนไดเชนกน (28-30) เพอศกษากลไกการท างานตางๆภายในเซลลไขมนดงทไดกลาวมาขางตนนน พบวามการศกษาตางๆเกดขนมากมายโดยการใชสารสกดจากพชสมนไพรในการกระตนผานกลไกตางๆของเซลลไขมนทมสภาวะดอตออนซลน เชน Kazinol B จาก Brouussonetia kazinoki ซงพบวาสามารถกระตนความไวตอการตอบสนองของ

อนซลนไดผานทางวถ Akt และ AMPK (31) β-arsarone เปนน ามนหอมระเหยทไดจาก Acorus calamus (32) เปน

ตน ซงสงผลเพมการน ากลโคสเขาสเซลลหรอกลาวอกนยคอสามารถลดระดบน าตาลในเลอดไดเชนกน สาเหตทมการศกษากลไกตางๆในการลดระดบน าตาลในเลอดโดยใชพชสมนไพรหรอผลตภณฑทไดจากธรรมชาต เนองจากการใชยามผลขางเคยงเกดขน ดงนนการศกษาโดยใชพชสมนไพรจากธรรมชาตอาจลดผลกระทบในการเกดอาการทไมพงประสงคตางๆลงและหากการศกษานสามารถศกษาถงสารส าคญและกลไกการออกฤทธทางเภสชวทยาของสารเหลานนจะกอใหเกดประโยชนและลดผลเสยตางๆตอรางกายผทมสภาะวะดออนซลนหรอผทปวยเปนเบาหวานชนดท 2 ไดอกดวย บว (Nelumbo nucifera) เปนททราบกนดเกยวกบการน ามารกษาโรคตางๆตามต าหรบยาแผนโบราณ Neferine ซงเปนสารส าคญในกลมอลคาลอยดทไดจากการสกดจากดบว (33, 34) ซงถกน ามาศกษาฤทธทางเภสชวทยาตางๆมากมายไมวาจะเปน ฤทธตานการอกเสบ ฤทธตานการเกดมะเรง ฤทธตานการเกาะกลมของเกลดเลอด ในป 2014 Jeong Soon You และคณะไดศกษาสารสกดเอทานอลจากรากบวในเซลลไขมนเรมตนของมนษยพบวามฤทธ ตานการสรางเซลลไขมน (anii-adipogenesis) ควบคไปกบการศกษาในหนทไดรบอาหารไขมนสงซงพบวาสามารถตานสภาวะอวน (anti-obesity) และตานอนมลอสระ (anti-oxidant) (35) ได แตอยางไรกตามการศกษา neferine เกยวกบโรคเบาหวานหรอสภาวะดอตออนซลนของเซลลไขมนมเพยงเลกนอยเทานนเชน การลดระดบน าตาลในเลอด Guoying และคณะไดรายงานวา neferine ยบยงการเกด apoptosis ทเยอบผนงหลอดเลอด

ผานกลไก ROS/Akt/NF-кB ฤทธตานการแสดงออกของยน CCL5 ในผปวยเบาหวานชนดท 2 นอกจากน neferine ยงคนพบวาสามารถเพมความไวตออนซลนในหนขาวไดอกดวยแตอยางไรกตามขอมลทไดจากการศกษาดงทไดกลาวมายงมเพยงเลกนอย รวมถงยงไมมการศกษากลไกตางๆทเกยวของดงทไดกลาวมาขางตน ดงนนคณะผวจยจงสนใจการใชเนเฟอรน เพอศกษาถงกลไกการท างานตางๆ ในเซลลไขมนทมสภาวะดอตออนซลน ทางคณะผวจยจงตระหนกถงประโยชนจากการใชสมนไพรโดยเฉพาะบวซงมกระจายอยทวไปของประเทศไทย โดยหวงเปนอยางยงทจะเพมมลคาของพชชนดนใหดยงๆขนไป โดยการศกษาฤทธของเนเฟอรนในเชงกลไกการท างาน (mechanism of actions) ในเซลลไขมน 3T3-L1 ในสภาวะดอตออนซลน รวมถง การน ากลโคสเขาสเซลลไขมน 3T3- การหลง adiponectin การสรางกลมไขมน (lipid droplets) และไตรกลเซอไรด 10. เอกสารอางองของโครงการวจย 1. International Diabetes Federation. IDF diabetic atlas. 7th ed. : Karakas print: Brussels, Belgium 2015. 2. สมาคมโรคเบาหวานแหงประเทศไทย ในพระราชปถมภ สมเดจพระเทพรตนราชสดาฯ สยามบรมราชกมาร. สถตโรคเรอรงประเทศไทย. กรมควบคมโรค; 2559 [เขาถงเมอ 20 ก.ค. 2559]. เขาถงไดจาก: http://www.dmthai.org/statistic 3. Fujita H, Fujishima H, Takahashi K, Sato T, Shimizu T, Morii T, et al. SOD1, but not SOD3, deficiency accelerates diabetic renal injury in C57BL/6-Ins2Akita diabetic mice. Metabolism. 2012;61(12):1714-24.

4. Hussain G, Rizvi SAA, Singhal S, Zubair M, Ahmad J. Serum levels of TGF-β1 in patients of diabetic peripheral neuropathy and its correlation with nerve conduction velocity in type 2

diabetes mellitus. Diabetes Metab Syndr: Clinical Research & Reviews. 2016;10(1, Supplement 1):S135-S9. 5. Martín-Merino E, Fortuny J, Rivero-Ferrer E, Lind M, Garcia-Rodriguez LA. Risk factors for diabetic retinopathy in people with Type 2 diabetes: A case–control study in a UK primary care setting. Prim Care Diabetes. 2016;10(4):300-8. 6. Yu TY, Jee JH, Bae JC, Hong W-J, Jin S-M, Kim JH, et al. Delayed heart rate recovery after exercise as a risk factor of incident type 2 diabetes mellitus after adjusting for glycometabolic parameters in men. Int J Cardiol. 2016;221:17-22. 7. Mohammad S, Ahmad J. Management of obesity in patients with type 2 diabetes mellitus in primary care. Diabetes Metab Syndr: Clinical Research & Reviews. 2016;10(3):171-81. 8. Jang B-C. Tetrandrine has anti-adipogenic effect on 3T3-L1 preadipocytes through the

reduced expression and/or phosphorylation levels of C/EBP-α, PPAR-γ, FAS, perilipin A, and STAT-3. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476(4):481-6. 9. Zhang D, Zhang Y, Ye M, Ding Y, Tang Z, Li M, et al. Interference with Akt signaling pathway contributes curcumin-induced adipocyte insulin resistance. Mol Cell Endocrinol. 2016;429:1-9. 10. Mozaffarian D, Peñalvo JL. The Global Promise of Healthy Lifestyle and Social Connections for Better Health in People With Diabetes. Am J Kidney Dis. 2016;68(1):1-4. 11. Giacometti J, Muhvić D, Pavletić A, Ðudarić L. Cocoa polyphenols exhibit antioxidant, anti-inflammatory, anticancerogenic, and anti-necrotic activity in carbon tetrachloride-intoxicated mice. J Funct Foods. 2016;23:177-87. 12. Kumar Im K, Issac A, Ninan E, Kuttan R, Maliakel B. Enhanced anti-diabetic activity of polyphenol-rich de-coumarinated extracts of Cinnamomum cassia. J Funct Foods. 2014;10:54-64. 13. Lee S-H, Jeon Y-J. Anti-diabetic effects of brown algae derived phlorotannins, marine polyphenols through diverse mechanisms. Fitoterapia. 2013;86:129-36. 14. Hu G, Xu R-a, Dong Y-y, Wang Y-y, Yao W-w, Chen Z-c, et al. Simultaneous determination of liensinine, isoliensinine and neferine in rat plasma by UPLC–MS/MS and application of the technique to pharmacokinetic studies. J Ethnopharmacol. 2015;163:94-8. 15. Baskaran R, Kalaiselvi P, Huang C-Y, Padma VV. Neferine, a bisbenzylisoquinoline alkaloid, offers protection against cobalt chloride-mediated hypoxia-induced oxidative stress in muscle cells. Integr Med Res. 2015;4(4):231-41. 16. Jung HA, Jin SE, Choi RJ, Kim DH, Kim YS, Ryu JH, et al. Anti-amnesic activity of neferine with antioxidant and anti-inflammatory capacities, as well as inhibition of ChEs and BACE1. Life Sci. 2010;87(13–14):420-30.

17. Yoon J-S, Kim H-M, Yadunandam AK, Kim N-H, Jung H-A, Choi J-S, et al. Neferine isolated from Nelumbo nucifera enhances anti-cancer activities in Hep3B cells: Molecular mechanisms of cell cycle arrest, ER stress induced apoptosis and anti-angiogenic response. Phytomedicine. 2013;20(11):1013-22. 18. Jun MY, Karki R, Paudel KR, Sharma BR, Adhikari D, Kim D-W. Alkaloid rich fraction from Nelumbo nucifera targets VSMC proliferation and migration to suppress restenosis in balloon-injured rat carotid artery. Atherosclerosis. 2016;248:179-89. 19. Guan G, Han H, Yang Y, Jin Y, Wang X, Liu X. Neferine prevented hyperglycemia-induced

endothelial cell apoptosis through suppressing ROS/Akt/NF-κB signal. Endocrine. 2014;47(3):764-71. 20. Li G, Xu H, Zhu S, Xu W, Qin S, Liu S, et al. Effects of neferine on CCL5 and CCR5 expression in SCG of type 2 diabetic rats. Brain Res Bull. 2013;90:79-87. 21. Pan Y, Cai B, Wang K, Wang S, Zhou S, Yu X, et al. Neferine enhances insulin sensitivity in insulin resistant rats. J Ethnopharmacol. 2009;124(1):98-102. 22. GLOBAL REPORT ON DIABETES [press release]. 2016. 23. Salans LB, Bray GA, Cushman SW, Danforth E, Glennon JA, Horton ES, et al. Glucose Metabolism and the Response to Insulin by Human Adipose Tissue in Spontaneous and Experimental Obesity: Effects of dietary composition and adipose cell size. J Clin Invest. 1974;53(3):848-56. 24. Kahn BB, Flier JS. Obesity and insulin resistance. J Clin Invest. 2000;106(4):473-81. 25. Mackenzie RWA, Elliott BT. Akt/PKB activation and insulin signaling: a novel insulin signaling pathway in the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Metab Syndr Obes: Targets and Therapy. 2014;7:55-64. 26. Coughlan KA, Valentine RJ, Ruderman NB, Saha AK. AMPK activation: a therapeutic target for type 2 diabetes? Diabetes Metab Syndr Obes: Targets and Therapy. 2014;7:241-53.

27. Rosen ED, Hsu C-H, Wang X, Sakai S, Freeman MW, Gonzalez FJ, et al. C/EBPα induces

adipogenesis through PPARγ: a unified pathway. Genes Dev. 2002;16(1):22-6. 28. Aleidi S, Issa A, Bustanji H, Khalil M, Bustanji Y. Adiponectin serum levels correlate with insulin resistance in type 2 diabetic patients. Saudi Pharm J. 2015;23(3):250-6. 29. Chang E, Choi JM, Park SE, Rhee E-J, Lee W-Y, Oh K-W, et al. Adiponectin deletion impairs insulin signaling in insulin-sensitive but not insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. Life Sci. 2015;132:93-100. 30. Nie T, Hui X, Gao X, Li K, Lin W, Xiang X, et al. Adipose tissue deletion of Gpr116 impairs insulin sensitivity through modulation of adipose function. FEBS Lett. 2012;586(20):3618-25.

31. Lee H, Li H, Jeong JH, Noh M, Ryu J-H. Kazinol B from Broussonetia kazinoki improves insulin sensitivity via Akt and AMPK activation in 3T3-L1 adipocytes. Fitoterapia. 2016;112:90-6.

32. Lee M-H, Chen Y-Y, Tsai J-W, Wang S-C, Watanabe T, Tsai Y-C. Inhibitory effect of β-asarone, a component of Acorus calamus essential oil, on inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells. Food Chem. 2011;126(1):1-7. 33. Zhao L, Wang X, Wu J, Jia Y, Wang W, Zhang S, et al. Improved RP-HPLC method to determine neferine in dog plasma and its application to pharmacokinetics. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;857(2):341-6. 34. Chen Y, Fan G, Wu H, Wu Y, Mitchell A. Separation, identification and rapid determination of liensine, isoliensinine and neferine from embryo of the seed of Nelumbo nucifera Gaertn. by liquid chromatography coupled to diode array detector and tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 2007;43(1):99-104. 35. You JS, Lee YJ, Kim KS, Kim SH, Chang KJ. Ethanol extract of lotus (Nelumbo nucifera) root exhibits an anti-adipogenic effect in human pre-adipocytes and anti-obesity and anti-oxidant effects in rats fed a high-fat diet. Nutr Res. 2014;34(3):258-67. 11. ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

1. สรางองคความรใหมเกยวกบกลไกส าคญในการออกฤทธของเนเฟอรนในสภาวะดอตออนซลนของเซลลไขมน 2. มการตพมพหรอเผยแพรผลงานทางวชาการในระดบชาต หรอระดบนานาชาต เชน Journal of Life

sciences, Journal of Ethnopharmacology เปนตน 3. เพอสงเสรมพฒนาและยกคณคาของสมนไพรไทยใหเปนผลตภณฑทลดสภาวะดอตออนซลนของเซลลไขมน 4. พฒนาและสรางนกวจยรวมไปถงนกศกษาทมองคความรความเขาใจ เสรมสรางทกษะการบรณาการความรใน

การวจยสมนไพรไทย 5. มการเผยแพรความรในการประชมวชาการตางๆ เพอสาธารณประโยชน

การน าไปใชประโยชนในดาน ดานวชาการ ดานนโยบาย ดานเศรษฐกจ/พาณชย/อตสาหกรรม

ดานสงคมและชมชน

หนวยงานทน าผลการวจยไปใชประโยชน 1. คณะวทยาศาสตรการแพทยมหาวทยาลยพะเยา 2. ประชาชนทวไปทมความสนใจตอผลทไดจากงานวจยน 3. หนวยงานของรฐทจะน าองคความรไปพฒนาเปนยา หรออาหารเสรม

4. ส านกงานสาธารณสขจงหวดพะเยา 5. ส านกงานเกษตรพะเยา

12. แผนการถายทอดเทคโนโลยหรอผลการวจยสกลมเปาหมาย 1. มการเผยแพรทางบทความทางวชาการ 2. มการน าเสนอและเผยแพรองคความรนเพอสรางฐานขอมลพนฐานทางวทยาศาสตรในการประชมวชาการ 3. สงเสรมการใชผลตภณฑและการแปรรปสมนไพรไทยเปนผลตภณฑเสรมอาหารหรอยารวมทงถายทอดองค

ความรผานหนวยงานรฐหรอภาคเอกชนทเกยวของ สความกาวหนาและเขมแขงของชมชลตอไป

13. วธการด าเนนการวจย 13.1 การสกดสารเนเฟอรน การสกดสารเนเฟอรน(Neferine) ซงเปนสารกลมแอลคาลอยด (alkaloid) โดยจะถกเตรยมจากดบว (lotus seed embryo) ไดรบความอนเคราะหจาก ศาสตราจารย ดร.อภชาต สขส าราญ ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยรามค าแหง 13.2 การเพาะเลยงเซลลไขมน 3T3-L1 (Preadipocytes) และการเปลยนแปลงของเซลลไขมนเรมตน (Preadipocyte differentiation) เซลลเรมตนของเซลลไขมน 3T3-L1 (Preadipocytes) จะถกน ามาเลยงในอาหาร Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ทม 10 เปอรเซนตซรม (fetal bovine serum) ควบคมอณหภม 37 องศาเซลเซยสในสภาวะทมคารบอนไดออกไซด 5 เปอรเซนต เปนเวลา 2 วน (differentiation day 0) หลงจากนนเซลลไขมนเรมตนจะถกเลยงในอาหาร DMEM ทม MDI hormone mixture (1 µg/ml isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1 µM dexamethasone และ 1 µg/ml insulin) เปนเวลา 2 วน (differentiation day 2) เซลลไขมนจะเปลยนอาหารเลยงเซลลเปน 10% FBS/DMEM ทม 1 µg/ml insulin ตลอดระยะเวลาการเปลยนแปลงเซลลไขมนเรมตนไปเปนเซลลไขมนนนเซลลจะถกเปลยนเปนอาหารเลยงเซลลทประกอบไปดวย 10% FBS/DMEM ทม 10 µg/ml insulin ทกๆ 2 วนจนกวาจะถกน ามาทดสอบในขนตอนตอไป 13.3 การทดสอบความเปนพษตอเซลล การทดสอบความเปนพษของสารเนเฟอรนตอเซลลไขมนดวยวธวเคราะห MTT โดยการเตรยมเซลล 3T3-L1 จ านวน 5 X 104 เซลลตอมลลลตรในจานเลยงเซลล 96 หลมและบมดวยเนเฟอรนทความเขมขนตางๆเปนเวลา 72 ชวโมง หลงจากนนท าการบมเซลลไขมนแตละหลมดวย 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) ท 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3 ชวโมงแลวดดสารละลาย MTT ทง เตม DMSO ปรมาตร 100 µl ลงแตละหลมเพอละลายผลกฟอรมาซาน (MTT formazan crystals) แลววดคาการดดกลนคลนแสงท 570 นาโนเมตรดวย microplate reader

13.4 การทดสอบการเกดกลมไขมน (lipid droplet formation) การสะสมของไขมนในเซลลไขมน 3T3-L1 (differentiated cells) จะท าการยอมดวย Oil red O (ORO) เซลลไขมนจะถกตรงสภาพของเซลลดวย 4 เปอรเซนตฟอรมาลดไฮดเปนเวลา 10 นาทแลวลางดวยน ากลน จากนนยอมเซลลดวย 5 mg Oil Red O ใน 1 ml isopropanol เปนเวลา 2 ชวโมง ลางผานดวยน ากลน 3 ครง น าไปสองดภายใตกลองจลทรรศนชนดใชแสง (light microscope) หรอ 13.5 การทดสอบการน ากลโคสเขาสเซลล เซลลไขมน 3T3-L1 (differentiated cells) น ามาบมในสภาวะทมซรมและกลโคสใน DMEM ต าเปนเวลา 12 ชวโมง ตามดวยการเตมเนเฟอรนบมตอเปนเวลา 24 ชวโมงหลงจากนนกระตนดวยอนซลนเปนเวลา 1 ชวโมงหลงจากนนเตม 20 µM กลโคสแอนาลอกทตดฉลากดวยสารฟลออเรสเซนตบมตอไปอกเปนเวลา 1 ชวโมง วดคาฟลออเรสเซนตทถกกกเกบไวในเซลลดวย microplate reader โดยความยาวคลนกระตน(excitation wavelength) ท 465 นาโนเมตร ความยาวคลนปลดปลอย (emission wavelength) ท 540 นาโนเมตร หรอ 13.6 การทดสอบระดบไตรกลเซอไรด การทดสอบไตรกลเซอไรดท าการทดสอบในเซลลไขมน 3T3-L1 (differentiated cells) ลางดวย PBS แลวยอยใหเปนเนอเดยวกน (homogenization) แลวท าการวดปรมาณไตรกลเซอไรดดวย GPO-PAP test kit (Merck, Germany) พรอมดวยวดปรมาณโปรตนทงหมดดวย DC Protein assay kit (Bio-Rad) ปรมาณไตรกลเซอไรดของเซลลจะถกน ามาแสดงเปนเปอรเซนตความสมพนธขององคประกอบไขมน [(ปรมาณไตรกลเซอไรด/ปรมาณโปรตน) X 100] หรอ 13.7การทดสอบการหลง adiponectin เซลลไขมนเรมตน 3T3-L1 (preadipocytes) ถกท าใหเปนเปลยนเปนเซลลไขมน (differentiated adipocytes) ดวยอาหารเลยงเซลลทมองคประกอบของ MDI hormone mixture ผสมกบเนเฟอรนเปนเวลา 5 วน หลงจากนนเกบอาหารเลยงเซลลไปวดปรมาณ adiponectin ดวย Mouse adiponectin/Acrp30 DuoSet, R & D System (Minneapolis, MN, USA) หรอ 13.8การทดสอบการแสดงออกของโปรตนดวยวธ western blot การทดสอบการแสดงออกของโปรตนด าเนนการโดยการทดสอบฤทธของเนเฟอรนตอระดบโปรตน

ของ PPARγ หรอ C/EBPα หรอ GluT4 หรออาจวดระดบโปรตนฟอสโฟรเลชนของ Akt หรอ AMPK ในเซลลไขมน 3T3-L1 ในสภาวะทบมดวยเนเฟอรน หรอไมบมดวยเนเฟอรน (control) โดยการน าเซลลทไดจะถกยอยดวย lysis buffer ทมองคประกอบของ:25 mM Tris-HCl (pH 7.5) 100 mM NaCl 1% NP-40 1% sodium deoxycholate 0.1% SDS ทมสวนผสมของprotease inhibitor หลงจากนนน ามาวเคราะหดวย SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis จากนนถายโอนโปรตนลงบนแผน PVDF น าแผนเมมเบรนทไดไปบมดวยแอนตบอดตวแรก

(primary antibody): anti-PPARγ หรอ anti-C/EBPα หรอ anti-GluT4 หรอ anti-phospho-Akt หรอ anti-

phospho-AMPK เปนเวลาขามคนหลงจากนนลางดวย Tris-Tris-Buffered Saline with Tween 20 (TBST) แลวน าไปบมดวยแอนตบอดตวทสอง (secondary antibody) ทตดกบ peroxidase ขนตอนสดทายน าไปบมดวย Immobilon Western (Millipore, MA, USA) แลวน าไปประกบฟลมเอกซ-เรยและน าภาพทไดมาวเคราะหปรมาณโปรตนดวยโปรแกรม Image-J 13.9 การวเคราะหสถต ผลการทดลองแสดงในรปแบบ Mean ± SD จากการท าซ า 3 ครงและคาความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตประเมนโดย one-way ANOVA และ Student’s t-testคาความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตจะถกจะถกวเคราะหเมอ P< 0.05 14. ระยะเวลาการวจย

ระยะเวลาโครงการ 1 ป 0 เดอน วนทเรมตน 1 ตลาคม 2560 วนทสนสด 30 กนยายน 2561

สถานทท าการวจย ในประเทศ/ ตางประเทศ

ชอประเทศ/จงหวด

พนททท าวจย ชอสถานท

ในประเทศ พะเยา หองปฏบตการ สาขาวชาชวเคมและโภชนาการ คณะวทยาศาสตรการแพทย ม.พะเยา ต.แมกา อ.เมอง จ.พะเยาภาควชา

ในประเทศ เชยงใหม หองปฏบตการ กายวภาคศาสตร คณะแพทยศาสตร ม.เชยงใหม ต.ศรภม อ.เมอง จ.เชยงใหม

แผนการด าเนนงานวจย

ป กจกรรม ต.ค. พ.ย. ธ.ค. ม.ค. ก.พ. ม.ค. เม.ย. พ.ค. ม.ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย.

2561 ประชมวางแผนการทดลอง X

2561 เตรยมสารเนเฟอรน X X X

2561 การเลยงเซลลและการเปลยนแปลงเซลลไขมน X X X X X X X X

2561 การทดสอบความเปนพษตอเซลลไขมน X X

2561 การทดสอบการเกดกลมไขมน X X

2561 การทดสอบการน ากลโคสเขาสเซลล X X

ป กจกรรม ต.ค. พ.ย. ธ.ค. ม.ค. ก.พ. ม.ค. เม.ย. พ.ค. ม.ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย.

2561 การทดสอบระดบไตรกลเซอไรด X X

2561 การทดสอบการหลง adiponectin X X

2561 การทดสอบการแสดงออกของโปรตนด วยว ธ western blot

X X X

2561 การวเคราะหผลการทดลองและวเคราะหทางสถต X X X X X X X X X

2561 รายงานผลการทดลองและเผยแพรผลงานวจย X X

15. ปจจยทเออตอการวจย (อปกรณการวจย โครงสรางพนฐาน ฯลฯ) ระบเฉพาะปจจยทตองการเพมเตม)

ประเภท ชอครภณฑ/สงกอสราง

สถานภาพในหนวยงาน

รายละเอยด เหตผลและความ

จ าเปน ประมาณการ

ราคา ครภณฑ ไมตองการเพม ม - - - สงกอสราง ไมตองการเพม ไมม - - -

16. งบประมาณของโครงการวจย

ป ประเภทงบประมาณ รายละเอยด จ านวน (บาท) 2561 งบด าเนนการ : คาใชสอย คาจางส าเนาเอกสาร คาจาเขาเลมเอกสาร

คาเบยเลยงเดนทาง 1,500

2561 งบด าเนนการ : คาใชสอย คาเบยเลยงเดนทาง 3,000 2561 งบด าเนนการ : คาตอบแทน คาตอบแทนคณะผวจย 20,000 2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสาร neferine 10,000 2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสารเคมจ าเปนในการศกษาความเปน

พษตอเซลล เชน MTT DMSO 5,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาอปกรณเลยงเซลล เชน 96 wells plate 6-wells plate eppendoff pipette tip

10,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาเซลล 3T3-L1 30,000 2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาอาหารเลยงเซลล 3T3-L1 เชน DMEM

isobutyl-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, insulin

15,000

ป ประเภทงบประมาณ รายละเอยด จ านวน (บาท) 2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสารเคมจ าเปนในการทดสอบ

adiponectin secretion เชน Mouse adiponectin/Acrp 30 DuoSet

10,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสารเคมจ าเปนในการทดสอบการเกดกลมไขมนและระดบไตรกลเซอไรด เชน Oil Red O Tris Isopropanol Formaldehyde EDTA GPO-PAP test kit

10,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสารเคมจ าเปนในการทดสอบการทดสอบการน ากลโคสเขาสเซลลและการหลง adiponectin เชน fluorescent glucose analog

20,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด คาสารเคมจ าเปนในการทดสอบการทดสอบการแสดงออกของโปรตนดวยวธ western blot เชน acrylamide PVDF protease inhibitor cocktail NP-40 X-ray film

15,000

2561 งบด าเนนการ : คาวสด แอนตบอดในการศกษาการแสดงออกชองโปรตน เชน primary antibodies: anti-

PPARγ, anti-C/EBPα anti- GluT4 anti-p-Akt หรอ anti—p-AMPK secondary antibody

80,000

2561 งบด าเนนการ : คาใชสอย คาสาธารณปโภค 25,500 รวมตลอดโครงการ 255,000

17. ผลส าเรจ

ป ผลส าเรจทคาดวาจะไดรบ ประเภท 2561 หากโครงการวจยเรอง กลไกการออกฤทธของเนเฟอรนตอเซลลไขมนชนดสามท

สามแอลหนงในสภาวะดออนซลนไดรบอนมต ผลส าเรจของโครงการวจยเมอด าเนนการส าเรจลลวงจะเปนผลส าเรจเบองตน และจะน าไปสการตอยอดงานวจยตอไป เพอประโยชนในการสงเสรมและเพมมลคาของสมนไพรไทย รวมถงองคความรทางวชาการทจะน าไปเปนยาหรอผลตภณฑเสรมอาหารในการรกษาผปวยเบาหวานหรอผทมสภาวะดอตออนซลน นอกจากนความรทไดจากการศกษานยง

Primary Result

ชวยผลกดนใหเกดนกวจยรนใหมๆ ทมความรความสามารถและมศกยภาพในงานวจยรวมไปถงนสตนกศกษาทจะไดมาศกษาทดลองในครงนหรอแมแตจะน าองคความรเหลานไปตอยอดไดดวยเชนกน นอกจากนหนวยงานตางๆไมวาจะเปนรฐบาล (กระทรวงเกษตรฯ กระทรวงสาธารณสข องคการเภสชฯ) หรอแมแตหนวยงานเอกชนทจะไดน าความรนไปพฒนาใหเกดประโยชนตอประเทศตอไป

18. โครงการวจยตอเนอง (ค ารบรองจากหวหนาโครงการวจยวาโครงการวจยไดรบการจดสรรงบประมาณจรงในปงบประมาณทผานมา) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

19. ค าชแจงอน ๆ (ถาม) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

20. ลงลายมอชอ หวหนาโครงการวจย พรอมวน เดอน ป

ลงชอ................................................. (ดร.อ านาจ ออนสอาด)

หวหนาโครงการวจย

วนท....... เดอน ………….... พ.ศ. ………....