1

การศึกษาตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ในการจําแนกพันธุพริก Study of Microsatellite Probes in Pepper Varieties Identification

ชลธิชา นิวาสประกฤติ และ จุลภาค คุนวงศ Cholticha Nivasprakit and Julapark Chunwongse

บทคัดยอ

การศึกษาชนิดของตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite และเปรียบเทียบการใชเอนไซมตัดจําเพาะ ในการตรวจสอบพันธุพริกที่เกบ็

รวบรวมโดยศูนยวิจัยและพัฒนาพืชผักเขตรอน มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร พบวา ตัวตรวจสอบ [GATA]8 มีความเหมาะสมที่สุดในการนํามาใชจัดจําแนกพันธุพริก เนื่องจากใหระดับความแตกตางและจํานวนตําแหนงของแถบดีเอ็นเอมากที่สุด สวนการเปรียบเทียบการใชเอนไซมตัดจําเพาะชนิดตาง ๆ โดยใช [GATA]8 เปนตัวตรวจสอบ พบวา เอนไซมตัดจําเพาะ DraI, HinfI และ TaqI ใหระดับความแตกตางของดีเอ็นเอสูงที่สุด จึงเหมาะในการนํามาใชตัดดีเอ็นเอของพริก แต DraI เปนเอนไซมที่มีราคาถูกที่สุด ทําใหคาใชจายในการตรวจสอบต่ําสุดดวย จึงเปนเอนไซมที่เหมาะสมในการใชควบคูกับตัวตรวจสอบ [GATA]8 เพื่อใชในการจําแนกพันธุพริก นอกจากนี้ ยังพบวามีปจจัยที่เกี่ยวของในการจัดจําแนกพันธุพริก หลายประการคือ ความเขมขนของดีเอ็นเอ ความเขมขนของวุนอะกาโรส ระยะเวลาในการแยกดีเอ็นเอบนแผนวุนอะกาโรส และความเขมขนของตัวตรวจสอบ

ABSTRACT

The study on the use of the microsatellite probes and restriction enzymes was conducted to identify pepper varieties which were collected at Tropical Vegetable Research Center, Kasetsart University. Microsatellite probe [GATA]8 were found to be suitable for using in identification of pepper varieties as it yielded higher number of DNA bands and higher level of DNA polymorphism. For the restriction enzymes used to reveal level of DNA polymorphisms, DraI, HinfI and TaqI were found to give the highest, and therefor be suitable for peppers DNA DraI, however, is the most inexpensive enzyme among the three and becomes an enzyme of choice in combination with [GATA]8 in pepper varieties identification. In addition, many experimental factors, namely, DNA concentration, agarose gel and probe concentration were found to be crucial to the success.

ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร ม.เกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม 73140 Department of Horticulture, Kasetsart University, Kamphaengsaen campus, Nakornpathom 73140

2

คํานํา

พริกเปนพืชวงศ Solanaceae อยูในสกุล Capsicum มีถิ่นกําเนิดอยูเขตรอนของทวีปอเมริกา (กฤษฎา, 2535) ปจจุบันพบวามีพริกพันธุตางๆ มากมายในทองตลาดแตกตางกันดานลักษณะทางกายภาพ รูปทรง สี กล่ินและรสชาติ (เมืองทอง และสุรีรัตน, 2525) มีการจําแนกพันธุพริกไวหลายกลุม โดยใชลักษณะทางสัณฐานวิทยา (กฤษฎา, 2535) แตในการใชลักษณะทางสัณฐาณวิทยาไมอาจครอบคลุมการจัดกลุมลักษณะตาง ๆ ได แมวาจะจัดไวเปนกลุมชนิด (Species) เดียวกัน ก็มีบางลักษณะที่ยังแตกตางออกไปภายในชนิดเดียวกัน (Sukprakarn และคณะ, 1995)

การจัดจําแนกพันธุพืชโดยใชลายพิมพดีเอ็นเอ (DNA Fingerprint) เปนเทคโนโลยีสมัยใหมซึ่งไดรับความสนใจจากนักวิทยาศาสตรโดยทั่วไป เปนเทคโนโลยีที่ใชในการตรวจสอบระดับความแตกตางของจีโนมของสิ่งมีชีวิตไดอยางรวดเร็วและครอบคลุมอยางกวางขวาง เปนการเปรียบเทียบดีเอ็นเอที่สุมหรือจําเพาะมาจากโครโมโซมโดยใชเทคนิคตางๆ ทางชีวโมเลกุล เนื่องจากดีเอ็นเอเปนสายพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตซึ่งมีความจําเพาะสําหรับส่ิงมีขีวิตแตละชนิด ลายพิมพดีเอ็นเอจึงเปนลักษณะเฉพาะในสิ่งมีชีวิตแตละชนิด สามารถบอกความแตกตางของสิ่งมีชีวิตนั้นๆ ไดเปนอยางดี และไมเปล่ียนไปตามสภาพแวดลอมที่เปล่ียนไป (Kirby, 1990 ; สุรินทร, 2536)

วิธีการในการศึกษาลายพิมพดีเอ็นเอสามารถกระทําไดหลายวิธีเชน วิธี Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) หรือ วิธี Polymerase Chain Reaction (PCR) แตวิธีที่นิยมใชกันมากไดแก การใช RFLP-minisatellite (Jeffrey และคณะ, 1991) Minisatellite และ Microsatellite เปน DNA ที่มีลําดับเบสซ้ํากันอยางตอเนื่อง มีความแตกตางกันคือจํานวนซ้ําที่มีมากนอยตางกันไปโดย Microsatellite จะมีจํานวนซ้ํานอยกวา Minisatellite ( Weising และ คณะ, 1995 ) ทั้ง Microsatellite และ Minisatellite พบอยูทั่วไปในโครโมโซมตางๆ ของสิ่งมีชีวิตชั้นสูง ที่พบในพืชมีอยูหลายชนิดเชน GACA, GATA, ATC, CA เปนตน Microsatellite บางชนิด เชน GACA หรือ GATA พบวาสามารถนํามาใชเปน Hybridization probe ในมะเขือเทศและสามารถใชในการจําแนกพันธุมะเขือเทศไดเปนอยางดี และพบวามีการกระจายตัวของ Microsatellite ทั้ง 2 ชนิดนี้อยูทั่วไปในจีโนมของมะเขือเทศ (Aren และคณะ, 1994; Phillips และคณะ, 1994)

สําหรับในพริกไดมีผูทําการศึกษาจัดจําแนกพันธุพริกลูกผสมโดยใช single copy probe-RFLP จําแนกพันธุพริกลูกผสมทางการคา (C. annuum) 2 สายพันธุ เพื่อคัดเลือกหาตนลูกผสมที่แทจริงโดยเปรียบเทียบแถบดีเอ็นเอของลูกผสมกับตนพอและตนแม (Livneh และคณะ, 1990) และหาความสัมพันธของวิวัฒนาการของพริก 3 species คือ Capsicum baccatum กับ C. pendulum และ C. annuum กับ C. baccatum พบวา C. baccatum และ C. pendulum มีวิวัฒนาการใกลเคียงกับ C. annuum นอยกวา C. annuum ดวยกันเอง (Lefebvre และคณะ, 1993)

มะเขือเทศและพริกเปนพืชในวงศมะเขือ ที่มีความสัมพันธกันทางดานวิวัฒนาการ จีโนม (Prince และคณะ, 1992) คาดวา Microsatellite ที่ใชไดในมะเขือเทศอาจมีประโยชนในการนํามาใชจําแนกพันธุพริกไดเชนกัน จึงไดดําเนินการศึกษาการนําเอา Microsatellite probe ชนิดตางๆ ไดแก [GATA]8, [TCT]10 และ [TGG]10 มาทดสอบในพริกพันธุตางๆ ที่ไดรวบรวมไวที่ศูนยวิจัยและพัฒนาพืชผักเขตรอน มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร (Sukprakarn และคณะ, 1995) ซึ่งไดมีการศึกษาลักษณะตางๆ ของแตละพันธุไวแลว แตก็ยังมีอีกหลายพันธุซึ่งไมสามารถจําแนกไดอยางชัดเจน จึงคาดวาเทคโนโลยี Microsatellite นี้จะสามารถนํามาใชในการจําแนกพันธุพริกตางๆ ได โดยมีจุดประสงค

1. ศึกษาชนิดของตัวตรวจสอบ 2. เปรียบเทียบการใชเอนไซมตัดจําเพาะในการตรวจสอบ 3. ศึกษาปจจัยตางๆ ที่เกี่ยวของกับการใชตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ในการจัดจําแนกพันธุพริก

3

อุปกรณ และวิธกีาร

พันธุพริกที่ใชในการทดลอง พันธุพริกจํานวน 37 พันธุ เก็บรวบรวมโดยศูนยวิจัยและพัฒนาพืชผักเขตรอนมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร

วิทยาเขตกําแพงแสน (Table 1) Table 1 Pepper Accessions used in this research

No. Accession Species Variety/Name 1. CA 417-1 Capsicum sp. - 2. CA 455-3 C.annuum - 3. CA 425 C.annuum Kawit 4. CA 393-2 C.annuum - 5. CA 431-1 C.annuum - 6. CA 374-2 C.annuum - 7. CA 471-2 C.annuum - 8. CA 429 C.annuum Yangiao 9. CA 425-6 C.annuum -

10. CA 489 C.annuum Ardei lung 11. CA 432-2 C.annuum - 12. CA 420-1 C.annuum - 13. CA 363-3 C.annuum - 14. CA 364-1 C.annuum - 15. CA 397 C.annuum LV. 1092 16. CA 405 C.annuum Hot brauty (F2) 17. CA 368 C.annuum Nok banglane 18. CA 370 C.annuum Sanpatong 19. CA 381 C.annuum Bandaima 3 20. CA 453 C.annuum Sweet banana 21. CA 447 C.annuum SU-31-1 22. CA 452 C.annuum Podarok Moldary 23. CA 452-3 Capsicum sp. - 24. CA 432 C.annuum Jawahar 128 25. CA 412 C.annuum Var. Pl-2289 26. CA 424 C.annuum MC-4 27. CA 439-2 C.annuum - 28. CA 500 C.annuum - 29. CA 416 C.annuum LV.2319 30. CA 426-3 C.annuum - 31. CA 424 C.annuum MC-4 32. CA 488 C. frutescens LOO 738 33. CA 399 C.annuum - 34. CA 401 C.annuum Phriknuangloei 35. CA 412-1 C.annuum - 36. CA 403 C.annuum Long chilli 37. CA 322 C.annuum Prik-kheenuu

ชนิดของตวัตรวจสอบชนิด Microsatellite ตัวตรวจสอบ Microsatellite จัดสรางโดย Bioservice unit มหาวิทยาลัย มหิดล และบริษัท Vector Research มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร เปนดีเอน็เอ

เสนเดีย่วโดยมีลําดับเบสดังนี ้[GATA]8= [GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA] [TGG]10 = [TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG] [TCT]10 = [TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT TCT]

4

เอนไซมตัดจําเพาะ ,สารเคมี และวัสดุตางๆ เอนไซมตัดจําเพาะ DraI, EcoRI, EcoRV, HinfI, HindIII และ TaqI ของบริษัท Promega Corp. ชุดสารเคมี

Genius kit ที่ใชในการติดฉลาก dig- dUTP และชุดสารเคมีในการตรวจสอบผลการ Hybridization ใชของบริษัท Boehringer Mannheim ไนลอนเมมเบรนเปนแบบเติมประจุบวก จากบริษัท Boehringer Mannheim

การสกัด DNA จากใบพริก

ใชใบพริกอายุประมาณ 75-80 วันนับจากวันหยอดเมล็ด ปลูกรวบรวมโดยศูนยวิจัยและพัฒนาพืชผักเขตรอน มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตรวิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม เก็บตัวอยางใบพริกประมาณ 10 กรัม แชน้ําแข็งทันท ีจากนั้นนําไปสกัดโดยวิธีดัดแปลงของ Fulton และคณะ (1995) ปนใบพริกในเครื่องปนน้ําผลไมกับสารละลาย Extraction buffer 50 มิลลิลิตร ประมาณ 1 นาที กรองดวยผาขาวบางลงในหลอดขนาด 50 มิลลิลิตร นําไปเหวี่ยงใหตกตะกอนดวยเครื่อง Centrifuge (Beckman) ความเร็วรอบ 3,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที เทสวนใสดานบนทิ้ง เติม Extraction buffer 1.75 มิลลิลิตร (0.019 M Sucrose,0.1 M Tris-base, 5 mM EDTA, pH 7.5), Nuclei lysis buffer 1.75 มิลลิลิตร (0.2 M Tris, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB), 0.6 มิลลิลิตร 5% Sarkosyl และ 0.2 มิลลิลิตร 20% SDS ผสมใหเขากัน บมที่ 65 องศาเซลเซียสนาน 30-60 นาที จากนั้นเติม Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) ผสมใหเขากันเบา ๆ นําไปแยกชั้นโดยใชเครื่อง Centrifuge (Beckman GS-6) ความเร็ว 3,000 รอบตอนาที นาน 10 นาที ดูดสวนใสดานบนใสหลอดใหม เติม Isopropanol ทําใหดีเอ็นเอ ตกตะกอนโดยการผสมเบาๆ ใชขอแกวเกี่ยวกอนดีเอ็นเอใสในหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตรที่มี 70 เปอรเซ็นตเอทธานอลเพื่อลางทําความสะอาดดีเอ็นเอ จากนั้นนําไปเหวี่ยงใหตกตะกอนดวยเครื่อง Centrifuge (Hettich Zentrifugen) ความเร็วรอบ 12,000 รอบตอนาที นาน 2 นาที เท 70 เปอรเซ็นตเอทธานอลออก ทิ้งไวใหแหง ละลายดีเอ็นเอดวย TE buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0) ประมาณ 200-300 ไมโครลิตรที่ 65 องศาเซลเซียสจนดีเอ็นเอละลายเก็บไวที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส หรือที่ 4 องศาเซลเซียสกอนนํามาใชในงานขั้นตอนตอไป ขั้นตอนการทํา RFLP

1. การทําฟลเตอรดีเอ็นเอของพริก นําดีเอ็นเอที่ตัดดวยเอ็นไชมตัดจําเพาะมาแยกโดยผานสนามไฟฟาบนวุนอะกาโรส 0.8 เปอรเซ็นต บัฟเฟอร

0.5x TBE ใชไฟ 20 โวลต นาน 24-36 ชั่วโมง ยอมดวยเอทธิเดียมโบรไมด 30 นาที ถายภาพเพื่อ เก็บขอมูล นําแผนวุนแชใน 0.4 โมลารโซเดียมไฮดรอกไซด 30 นาที เพื่อแยกคูสายดีเอ็นเอ จากนั้นนํามาเคลื่อนยาย ดีเอ็นเอจากเจลขึ้นไปอยูบนแผนไนลอนเมนเบรน ดวยแรง capillary นาน 16-24 ชั่วโมง นําแผนไนลอนเมนเบรนที่ไดไปอบที่ 120 องศาเซลเซียส 30 นาที

2. การติดฉลากตัวติดตาม ผสม DNA template และน้ําใหเขากัน ตมใหดีเอ็นเอแยกเปนสายเดี่ยวในน้ําเดือด 10 นาที แชในน้ําแข็ง

ทันที ทิ้งไวประมาณ 5 นาที หลังจากนั้นเติม Hexanucleotide mix, dNTP mix และ Klenow enzyme และบมที่ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 20 ชั่วโมง เติม 40 mM EDTA, 40 ng Glycogen, 0.1 M LiCl และ 70% เอทธานอล ผสมใหเขากัน บมที่ -80 องศาเซลเซียสนาน 30 นาที จากนั้นทําใหตกตะกอนดวยเครื่อง Centrifuge (Hettich Zentrifugen) ความเร็วรอบ 13000 รอบตอนาที นาน 15 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เทเอทธานอลออก และลางตะกอนดวย 70 เปอรเซ็นตเอทธานอล ทําใหตกตะกอนดวยเครื่อง Centrifuge เดิมอีกครั้ง ความเร็วรอบ 13000 รอบตอนาที นาน 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เทเอทธานอลออก ทําใหตะกอนแหง ละลายดวย TE บัฟเฟอร ทํา dot blot เพื่อตรวจสอบความเขมขนและประสิทธิภาพของการติดฉลาก (Boehringer Mannheim)

5

3. การทํา DNA - DNA Hybridization จากนั้น Prehybridization {5X SSC, 0.1% Sodium dodecyl sulfate, 1% w/v Blocking Reagent for

nucleic acid hybridization, ( Blocking reagent stock solution 100 mM Maleic acid, 150 mM NaCl, pH 7.5, containing 10% w/v Blocking Reagent for nucleic acid hybridization)} ที่ 65 องศาเซลเฃียสเปนเวลา 6 ชั่วโมง เมื่อครบกําหนดเวลานํามา Hybridization ดวย Microsatellite probe ที่ติดฉลาก dig - dUTP เปนเวลา 20 ชั่วโมง จากนั้นนําไปลางและตรวจสอบโดยใชตามคําแนะนําของผูผลิต (Boehringer Mannheim) นําแผนไนลอนเมมเบรนที่ไดไปใสไวบนฟลมเอ็กซเรยทิ้งไวประมาณ 45 นาที ลางแผนฟลมเอ็กซเรย ตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่ปรากฎกับมาตรฐานบันทึกผลการทดลองเพื่อนําไปวิเคราะหตอไป การวิเคราะหดัชนีความสัมพันธของดีเอ็นเอ 2 ตัวอยาง

1.แปลงขอมูลแถบดีเอ็นเอเปนขอมูลแบบ Binary โดยตําแหนงที่มีแถบดีเอ็นเอ จะใหคาเทากับ 1 ถาไมปรากฎแถบดีเอ็นเอใหคาเทากับ 0 2. ในการวิเคราะหความสัมพันธของแถบดีเอ็นเอในแตละตัวอยาง ออกมาในภาพเปอรเซ็นต Similarity Index ( SI) ระหวางแถบของดีเอ็นเอสองตัวอยาง (Nei and Li ,1979)

SI = 2X 1,2

X 1+ X2

โดยที่ X1, 2 คือจํานวนแถบดีเอ็นเอที่มีน้ําหนักโมเลกุลเทากัน (Molecular weight) ระหวางพันธุที่ 1กับ2 X 1 และ X2 เปนจํานวนแถบดีเอ็นเอที่มีทั้งหมดในพันธุที่ 1 และพันธุที่ 2

ผลการทดลองและวิจารณ

การเปรียบเทียบตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite

นําดีเอ็นเอของพริกที่ตัดดวยเอนไซม DraI มาแยกบนสนามไฟฟาและยายดีเอ็นเอไปบนไนลอนเมมเบรนจากนั้นนําเมมเบรนมาไฮบริไดซกับตัวตรวจสอบชนิดตางๆ คือ [GATA]8, [TGG]10 และ [TCT]10 พบวา [GATA]8 ใหขอมูลของจีโนมพริกไดมากกวา ตัวตรวจสอบอีก 2 ชนิด คือ [TGG]10 และ [TCT]10 (Figure 1 และ Figure 2) โดย [GATA]8 จะใหขอมูลแถบดีเอ็นเอจํานวนตั้งแต 9-19 แถบ เมื่อเทียบกับ [TGG]10 แลวจะไดแถบดีเอ็นเอประมาณ 2-5 แถบ และยังไมสามารถแยกความแตกตางระหวางพันธุได สวน [TCT]10 นั้นสามารถแสดงจํานวนแถบดีเอ็นเอ ไดบางแตความสามารถในการใชจําแนกพันธุตางๆ ไมมากเทากับ [GATA]8

[GATA]8 จึงเปนตัวตรวจสอบที่มีความเหมาะสมและสามารถนํามาใชในการจําแนกพันธุพริกไดเปนอยางดี ทั้งนี้ตัวตรวจสอบชนิด GATA นี้พบวาสามารถใชประโยชนในการจําแนกพันธุมะเขือเทศ ซึ่งเปนพืชใบเล้ียงคูในวงศมะเขือ (Solanaceae) เชนเดียวกันกับพริก สวน TGG และ TCT นั้นพบวา มีอยูปริมาณมาก สามารถใชไดดีในขาวซึ่งเปนพืชใบเล้ียงเดี่ยวในวงศหญา (Gramineae) (Panaud และคณะ, 1995) ซึ่งบอกถึงวิวัฒนาการของ Microsatellite DNA ในจีโนมของพืชตางชนิดกันยอมมีความแตกตางกันไป

6

การเปรียบเทียบชนิดของเอนไซมตัดจําเพาะที่เหมาะสม ดีเอ็นเอของพริกถูกนํามาตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ 6 ชนิดคือ DraI, EcoRI ,EcoRV ,HinfI ,HindIII และ

TaqI โดยใชตัดดีเอ็นเอของพริก 3 พันธุ คือ CA 500, CA 706 และหวยสีทน จากนั้นใชตัวตรวจสอบชนิด [GATA]8 ในการทําไฮบริไดซ หลังจากการทดลอง นับจํานวนแถบดีเอ็นเอที่ปรากฎพบวา เอนไซม DraI, HinfI และ TaqI ใหจํานวนแถบดีเอ็นเอมากกวา EcoRI, EcoRV และ HindIII แสดงวาเอนไซม DraI, HinfI และ TaqI สามารถทําใหเห็นระดับความแตกตางของดีเอ็นเอไดมากกวา EcoRI, EcoRV และ HindIII (Figure 3) การวิเคราะหดัชนีความสัมพันธ (Similarity Index, SI)

จากการทดลองขางตน สามารถเปรียบเทียบความสามารถของตัวตรวจสอบและชนิดของเอนไซมตัดจําเพาะในการใชจําแนกพันธุไดโดยการคํานวนคา SI ระหวางพันธุพริกแตละคูหรือดูระดับความเหมือนกันและตางกัน โดยสามารถนํามาวิเคราะห หาคา SI ไดดังนี้จาก Figure 3 หาความสัมพันธระหวางพันธุ CA 500 กับ CA 706, CA500 กับหวยสีทน และ CA 706 กับหวยสีทนที่ตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ DraI, HinfI และ TaqI ใช [GATA]8 เปนตัวตรวจสอบพบวา CA 500 กับ หวยสีทนมีคา SI สูงที่สุดแสดงวามีความใกลชิดระหวางสายพันธุมากกวา CA 700 กับ หวยสีทน แต CA 700 กับ หวยสีทนก็ยังมีความใกลชิดมากกวา CA 500 กับ CA 700 (Table 2)

เมื่อเปรียบเทียบความสามารถของแตละเอนไซมในการจัดจําแนกพันธุ คา SI ที่สูงแสดงใหเห็นความสามารถในการจัดจําแนกที่ต่ําเพราะคายิ่งสูงแสดงวามีความเหมือนกันมากในทางพันธุกรรม แตจากการทดลอง คา SI ของ TaqI มีคาต่ําสุด ความสามารถในการจําแนกพันธุนาจะสูงกวา แตแถบดีเอ็นเอของ TaqI คอนขางจะกวางและนับไดยากกวาแถบดีเอ็นเอที่ไดจาก DraI

จากการทดลองพบวามีปจจัยที่เกี่ยวของในการใชตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ในการจัดจําแนกพันธุพริกหลายประการ คือ

1. ความเขมขนตางๆ ของดีเอ็นเอที่ 3, 5 และ 12 ไมโครกรัม พบวา ที่ระดับความเขมขนดีเอ็นเอ 12 ไมโครกรัมทําใหการตรวจสอบเปนไปไดอยางรวดเร็วและมีประสิทธิภาพอีกทั้งทําใหมีผลที่ชัดเจนกวาความเขมขนอื่นๆ ดังนั้นจึงควรใชดีเอ็นเอปริมาณมากในการทดลอง

2. ในการเปรียบเทียบความเขมขนของอะกาโรสเจลในระดับ 0.8 เปอรเซ็นตและ 1.5 เปอรเซ็นต พบวาที่ระดับความเขมขนอะกาโรส 0.8 เปอรเซ็นตแยกแถบดีเอ็นเอไดดีกวาที่ 1.5 เปอรเซ็นต เนื่องจากแถบดีเอ็นเอเปนชิ้นสวนขนาดคอนขางใหญ การใชอะกาโรสในระดับสูงทําใหแถบดีเอ็นเอไมสามารถจะแยกจากกันไดดี

3. ระยะเวลาในการแยกดีเอ็นเอบนแผนวุนอะกาโรส พบวาที่ 36 ชั่วโมงจะใหความคมชัดในการแยกแถบดีเอ็นเอไดดีกวาที่ 24 ชั่วโมง โดยเฉพาะในแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดใหญและอยูติดกัน

4. ความเขมขนของตัวตรวจสอบ ถาปริมาณความเขมขนของตัวตรวจสอบสูงจะทําใหเกิดการ Hybridization แบบไมจําเพาะเจาะจง แตจะใชเวลาในการ expose กับฟลมเอ็กซเรยนอย และให background สูง แตถาปริมาณความเขมขนตัวตรวจสอบต่ํา ตอง expose นาน และจะทําใหเกิด background สูงไดอีกเชนกัน ระดับความเขมขนของตัวตรวจสอบจะตองมีการทดสอบในแตละชนิดเพื่อใหไดผลสูงสุด

5. ในการเลือกใชชนิดตัวตรวจสอบควรเลือกใชตัวตรวจสอบทําใหเกิดระดับความแตกตางของดีเอ็นเอมากที่สุด

6. จากการเปรียบเทียบเอนไซมตัดจําเพาะชนิดตางๆ เอนไซมที่เหมาะในการนํามาใชในการทดลองคือ DraI มากกวา HinfI และ TaqI เนื่องจากมีราคาถูกกวา (DraI ราคา unit ละ 1.5 บาท, HinfI ราคา unit ละ 2.2 บาท, TaqI ราคา unit ละ 2.6 บาท)

7

Figure 1 Differences of DNA pattern of 32 pepper accessions cut with restriction enzyme Dra I and probed with [GATA]8 (top) and [TGG]10 (bottom); Numbers on top of panels are explained in Table 1.

8

Figure 2 Differences of DNA profiles of five pepper accessions digested with Dra I and probed with [GATA]8 (left) and [TCT]10 (right); Numbers on top are explained in Table 1

9

Figure 3 Comparison of six restriction enzymes on three accessions of pepper using [GATA]8 as a probe, where 1=CA500, 2=CA706 and 3= Huaysithon

10

Table 2 Similarity Index among three pepper accessions namely CA 500, CA 706 and Huaysithon using three restriction enzymes, Dra I, Hinf I and Taq I and probed with [GATA]8

DraI Accession CA 706 Huaysithon

CA 500 0.27 0.59 CA 706 - 0.29

Huaysithon - - HinfI

Accession CA 706 Huaysithon CA 500 0.09 0.64 CA 706 - 0.25

Huaysithon - -

TaqI Accession CA 706 Huaysithon

CA 500 0.024 0.24 CA 706 - 0.11

Huaysithon - -

สรุป

1. ชนิดของตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ที่เหมาะสมในการทดลองจําแนกพันธุพริก คือ [GATA]8

เนื่องจากมีระดับความแตกตางและจํานวนตําแหนงของดีเอ็นเอมากที่สุด เมื่อเปรียบเทียบกับตัวตรวจสอบ [TGG]10 กับ [TCT] 10 ที่ใชในการทดลอง

2. เมื่อเปรียบเทียบเอนไซมตัดจําเพาะชนิดตางๆ หลังจากใชตัวตรวจสอบชนิดเดียวกันคือ [GATA] 8 พบวา DraI, HinfI และ TaqI ใหระดับความแตกตางของดีเอ็นเอสูงที่สุด

3. คา SI สามารถบอกความสัมพันธระหวางพริกแตละคูได ถาคูใดใหคา SI สูงแสดงวามีความใกลชิดกันมากกวาคูที่มีคา SI ต่ํา และเมื่อเปรียบเทียบชนิดของเอนไซมในการจําแนกพันธุพริกแตละคูเอนไซมที่ใหคา SI ต่ําความสามารถในการจัดจําแนกพันธุนาจะมากกวาที่มีคา SI สูง

คําขอบคุณ

ขอขอบคุณหนวย DNA Fingerprint ศูนยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ ที่ใหการสนับสนุน ดาน

วัสดุและอุปกรณวิจัย และศูนยวิจัยและพัฒนาพืชผักเขตรอน ม.เกษตรศาสตรที่ใหการสนับสนุน ดานการดูแลรักษาพืช และโรงเรือนปลูกพืชทดลอง

11

เอกสารอางอิง

กฤษฎา สัมพันธารักษ. 2535. การปรับปรุงพันธุพริก ภาควิชาพืชไรนา มหาวิทยาลัย เกษตรศาสตร กรุงเทพฯ. 96 น.

สุรินทร ปยะโชคณากุล. 2536. พันธุวิศวกรรมเบื้องตน. ภาควิชาพันธุศาสตร คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. กรุงเทพฯ. 258 น.

Aren, P.,P. Odinpt, A.W.Van Hensden, P. Lindhout and B. Vossman. 1995. GATA and GACA - repeats are not evenly distributed through out tomato genome. Genome. 38 : 84 - 90.

Fulton, T.M., J. Chunwongse and S.D. Tanksley. 1995. Microprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 13(3) : 201-209.

Jeffreys, A. J., A. Macleod, K. Tamaki, D.L. Neil and D.G. Monckton. 1991. Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing. Nature. 354(21) : 204-209.

Kirby, L.T.1990. DNA Fingerprinting An Introduction. New york. 365 p. Lefebvre, V., A. Palloix and M. Rives. 1993. Nuclear RFLP between pepper cultivars (Capsicum annuum L.)

Euphytica. 71 : 189-199. Livneh, O., Y. Nagler, Y. Tal, S.B. Harush, Y. Gafni, J.S. Beckmann and I. Sela. 1990. RFLP analysis of a

hybrid cultivar of pepper ( Capsicum Annunm ) and its use in distinguishing between parental lines and in hybrid identification. Seed Sci & Technol.18 : 209 - 214.

Nei, M. and W. H. Li. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in forms of restriction endonucleases. Proc. Acad. Sci. USA. 76. 5269-5273.

Panaud, O., X. Chen and S. R. McCouch. 1995. Frequency of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.). Genome. 38 : 1170-1176.

Phillips, W.J., C.G.D. Chapman and P.L. Jack. 1994. Molecular cloning and analysis of one member of a polymorphic family of GACA - hybridising DNA repeats in tomato. Theor Appl Genet. 88 : 848 - 851.

Prince, J. P., E. P. Pochard and S. D. Tanksley. 1992. Construction of a molecular linkage map of pepper and a comparison of synteny with tomato. Genome. 36 : 404- 417.

Sukprakarn S.B. Khongsamai, S. Dumrongkittikule and C. Somkul. 1995. Passpost Data & Charaetenzation of Capsicum sp. Tropical Vegetable Research Center Kasetsart University. AVRDC. Kasetsart University.

Weising, K., R.G. Atkinson and R.C. Gardner. 1995. Genomic Fingerprinting by Microsatellite - primed PCR : A Critical Evaluation. PCR Methods and Applications. 249 - 255 p.

12

ประวัติการศกึษาและประวัติการทํางาน ผูเสนอผลงาน นางสาวชลธิชา นิวาสประกฤติ ช่ือเรื่อง การศึกษาตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ในการจําแนกพันธุพริก สถานที่ทํางาน ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร ม.เกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม 73140 โทรศัพทที่สะดวก ตอการติดตอ 034-281-093 ประวัติการศึกษา วท.บ. (เกษตรศาสตร) คณะเกษตรศาสตร ม.ขอนแกน บัณฑิตศึกษา ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร ม.เกษตรศาสตร ประวัติการทํางาน - ประสบการณหรือความชํานาญพิเศษ -

ประวัติการศกึษาและประวัติการทํางาน ผูเสนอผลงาน นายจุลภาค คุนวงศ ช่ือเรื่อง การศึกษาตัวตรวจสอบชนิด Microsatellite ในการจําแนกพันธุพริก สถานที่ทํางาน ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร ม.เกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม 73140 โทรศัพทที่สะดวก ตอการติดตอ 034-281-093 ประวัติการศึกษา B.Agri.(Horticulture) Chiba University M.S. (Biology) Nagoya University Ph.D. (Plant Breeding) Cornell University ประวัติการทํางาน อาจารย ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร ม.เกษตรศาสตร ประสบการณหรือความชํานาญพิเศษ Plant Molecualr Biology, Plant Molecular Genetics