สถานภาพสุขภาพหนูสายพันธ์ุscid...
TRANSCRIPT
สถานภาพสขภาพหนสายพนธ SCID ของศนยสตวทดลองแหงชาต มหาวทยาลยมหดล Health status of Severe Combined Immunodeficiency (SCID) mice bred
at National Laboratory Animal Center, Mahidol University เยาวลกษณ พนาเวชกจกล1, ทวศกด เขตเจรญ1, อรอมา สงหะ1, สเมธ อ าภาวงษ1,
ดลก บตะเดช2, เอกรนทร กลนค าหอม2, ประเวศ ทองศร2, กาญจนา เขงคม3 Yaowaluk Panavechkijkul1, Taweesak Ketjareon 1, Ornuma Singha 1, Sumate Ampawong1,
Diloke Butadej2, Aekkarin Klincomhum2, Pravate Thongsiri2, Kanchana Kengkoom3
บทคดยอ ศนยสตวทดลองแหงชาต มหาวทยาลยมหดล ไดท าการผลตและบรการหนเมาสสายพนธ SCID (SCID line)
ภายใตระบบ Maximum barrier with HVAC แกนกวจย และนกวทยาศาสตรภายในประเทศ ซงเปนหนเมาสทมภมคมกนบกพรอง (Severe Combined Immunodeficiency) โดยมคณลกษณะประจ าสายพนธ ทส าคญคอ ไมมการเจรญของ B และ T lymphocyte นยมใชส าหรบการศกษาทางดานวทยาภมคมกน การปลกถายมะเรงเมดเลอดขาว รายงานฉบบนจดท าขนเพอน าเสนอสถานภาพสขภาพของหนเมาสสายพนธ SCID ทงในดานจลชววทยา โลหตวทยา ปาราสตวทยา และพยาธวทยา ซงพบวา สถานภาพสขภาพของหนเมาสสายพนธ SCID ยงคงความเปนสตวทดลองปลอดเชอจ าเพาะตาม Specific Pathogens List และมคณลกษณะประจ าพนธทคงท โดยมอบตการณเกดโรคมะเรงเมดเลอดขาวชนด T cell 17.33% (13/75) ทอายเฉลย 7 เดอน
ABSTRACT National Laboratory Animal Center, Mahidol University (NLAC-MU) is the facility for production
SCID mice (SCID line), under Maximum barrier with HVAC to serve the need of researcher and scientist thoughtout Thailand. They are the Severe Combined Immunodeficiency mice. The importance of genotype characteristic of SCID mice have been found to lack B and T Lymphocyte development which utilized in studies of Immunology and Leukemic transplantation. This purpose to present health status of SCID mice in term of microbiological, hematological, parasitological and pathological aspect. The results showed that this mice still categorized as SPF animal and free from all agents in specific pathogen list and genotypic characteristic have been consisted. There was an incidence of T cell lymphoma approximately 17.33% (13/75) in average 7 month old SCID mice. Key words: SCID, Lymphoma, Health status e-mail address: [email protected] 1 ส านกงานการสตวแพทยสตวทดลอง, 2ส านกงานประกนคณภาพ, 3ส านกงานบรการวชาการ ศนยสตวทดลองแหงชาต มหาวทยาลยมหดล นครปฐม 73170 1 Veterinary Medical Care Office, 2 Quality Assurance Office, 3 Academic Service Office, National Laboratory Animal Center, Mahidol University, Nakorn Pathom 73170
ค าน า
หนเมาสสายพนธ SCID คอหนเมาสทมภมคมกนบกพรอง(Severe Combined Immunodeficiency; SCID) โดยมคณลกษณะประจ าสายพนธทส าคญคอ ไมมการเจรญของ B และ T lymphocyte (Prochazka et al., 1992) และ Thy-1+ dendritic epidermal cell แต myeloid cells, antigen presenting cells และ natural killer cells ยงมการเจรญและท าหนาทไดปกต (Sundberg & Shultz, 1993) พยาธสภาพของหนเมาสสายพนธ SCID ทส าคญ คอ คาเมดเลอดขาวต า (Lymphopenia), ตอมไทมสไมพบสวนของ cortex, มามไมสามารถแยกสวน red และ white pulp ไดชดเจน และ ไมมการพฒนาของตอมน าเหลองในสวนของ bronchial และ gastrointestinal (Custer et al., 1985) และมแนวโนมทจะตายกอนถงวยเจรญพนธ เนองจากการเกดภาวะ Spontaneous thymic lymphomas (Monticello et al., 1994) ซงในสวนของหนเมาสสายพนธ SCID ทเลยงภายในศนยสตวทดลองแหงชาต มหาวทยาลยมหดล ถอเปน สตวทดลองปลอดเชอจ าเพาะ หรอ Specific Pathogen Free, SPF ทเลยงภายใตระบบ Maximum barrier with HVAC (Heat, Ventilating, and Air Conditioning system) โดยน าเขามาจาก CLEA JAPAN, INC. ประเทศญป น เพอผลตและบรการแกนกวจย และนกวทยาศาสตรภายในประเทศ หนสายพนธนมกนยมใชส าหรบการศกษาทางดานวทยาภมคมกน (Hendrickson, 1993) การปลกถายมะเรงเมดเลอดขาว (Monticello et al., 1994) และอนๆ (Sundberg & Shultz, 1993) รายงานฉบบนจดท าขนเพอน าเสนอสถานภาพสขภาพของหนเมาสสายพนธ SCID ทงในดานจลชววทยา โลหตวทยา ปาราสตวทยา และพยาธวทยา โดยเปนการยนยนวาสตวทดลองดงกลาวทศนยฯ ผลตและบรการมคณภาพ และยงคงคณลกษณะประจ าสายพนธทเหมาะสม
อปกรณและวธการ
การตรวจสอบคณภาพสขภาพสตวทดลอง
ท าการตรวจสอบคณภาพสตวทดลองจากการสมตวอยางสตวในโคโลนหนเมาสสายพนธ SCID ทงทางดานจลชววทยา โลหตวทยา ปาราสตวทยา และพยาธวทยาตามขอแนะน าของ Federal European of Laboratory Animal Science Association (Kraft et al., 1994) รวมกบการตรวจวนจฉยและ ชนสตรโรคจากสตวปวยทกตวทท าการคดทง วธการปฏบตตางๆ ในสตวทดลองไดรบการเหนชอบจากคณะกรรมการก ากบดแลการเลยงและการใชสตวทดลองของหนวยงาน (National Laboratory Animal Center – Animal Care and Use Committee, Mahidol University)
การตรวจทางจลชววทยา
เกบตวอยางเลอดสตวทดลองจาก Sentinel animal (คอ หนเมาสสายพนธ BALB/cMlac ทเลยงโดยการใหสมผสกบวสดรองนอนเกา หรอมลสตวของหนเมาสสายพนธ SCID เปนเวลานาน 2 เดอน) จ านวน 4 ตว/โคโลน เพอตรวจสอบระดบ Antibody ตอเชอไวรส (18 ชนด) เชอแบคทเรย (2 ชนด) และ ปาราสต (1 ชนด) ตาม Specific Pathogens List (Table 1) โดยท าการสงตรวจกบบรษท Charles River Research Animal Diagnostic Services ประเทศสหรฐอเมรกา
Table 1 List of Specific Pathogens selected for antibody titer detection.
Pathogen Test method Pathogen Test method Viruses Ectromelia virus MFIA
Sendai virus MFIA Mouse Adenovirus type 1,2 MFIA
Pneumonia virus of mice MFIA Mouse Cytomegalovirus MFIA
Mouse hepatitis virus MFIA K virus MFIA
Minute virus of mice MFIA Polyoma virus MFIA
Mouse Parvovirus MFIA Hanta virus MFIA
Parvo NS-1 MFIA Mouse thymic virus IFA
Murine norovirus MFIA Bacteria
Mouse encephalomyelitis virus MFIA Mycoplasma pulmonis MFIA
Reovirus MFIA Ciliary-Associated Respiratory Bacillus MFIA
Mouse rotavirus MFIA Parasites
Lymphocytic choriomeningitis virus MFIA Encephalitozoon cuniculi MFIA
IFA= Indirect fluorescent antibody: MFIA= Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay
การตรวจทางโลหตวทยา และเคมคลนค
เกบตวอยางเลอดจากหวใจในหนเมาสสายพนธ SCID (Generation F2) ทสมตวอยางมาเพอการตรวจสอบคณภาพ จ านวน 62 ตวอยาง และสตวปวย จ านวน 8 ตวอยาง เพอท าการตรวจทางดานโลหตวทยา และเคมคลนค ดวยเครอง Automate รน CELL-DYN 3700 (Abbott Laboratories, USA) และเครอง Automate รน Hitachi 902 (Boeringer Mannhalm, JAPAN) ตามล าดบ รวมทงท า Blood smear และยอมส Dip Quick® ในสตวปวยเพอตรวจสอบสณฐานของเมดเลอดขาวส าหรบการวนจฉยภาวะ Spontaneous thymic lymphomas
การตรวจทางปาราสตวทยา
เกบตวอยางอจจาระ (Feces) จากล าไสในสวน Caecum ของหนเมาสสายพนธ SCID (Generation F2) ทสมตวอยางมาเพอการตรวจสอบคณภาพ จ านวน 62 ตวอยาง และสตวปวย จ านวน 8 ตวอยาง ท าการตรวจทางดานปาราสตวทยา โดยวธ Direct Fecal Smear
การตรวจสอบทางจลพยาธวทยา
ชนสตรซากหนเมาสสายพนธ SCID (Generation F2) ทสมตวอยางมาเพอการตรวจสอบคณภาพ จ านวน 62 ตวอยาง ,สตวปวย จ านวน 8 ตวอยาง และสตวปวยตาย 5 ตวอยาง โดยเกบตวอยาง มาม ไทมส ปอด ตบ ไต ตบออน และหวใจ เพอท าการวนจฉยทางดานจลพยาธวทยา โดยวธการยอมส Hematoxylin-Eosin (H&E) และ Immunohistochemistry (IHC) staining CD3 (Pan T Cells) และ CD20 (Pan B Cells)
ผลการทดลองและวจารณ
ผลการตรวจทางจลชววทยา
ผลการตรวจตดตามสถานภาพสขภาพทางดานจลชววทยาพบวาหนเมาสสายพนธ SCID ปลอดจากเชอทกชนดใน Specific pathogen list (Table 1)
ผลการตรวจทางโลหตวทยา และเคมคลนก
ในสตวปกต (Normal SCID mice) มคาเมดเลอดขาว (2.51±0.22 ×1,000 cells/ml) และคาเมดเลอดขาวชนดลมโฟไซด (13.49±0.87%) ลดลง ในขณะทคาเมดเลอดขาวชนดนวโทรฟวส (72.48±1.34 %) สงขน เมอเทยบกบเกณฑคาเลอดของหนเมาสปกต (Fox et al., 2002) ซงสอดคลองกบรายงานของ Custer et al, 1985 ดง Table 2 นอกจากนน ยงพบวา คา Creatinine (0.08±0.01 mg/dl) ลดลง และคา Alkaline phosphatase (ALP) (89.83±2.02 mg/dl) สงขน เมอเทยบกบเกณฑคาเลอดของหนปกต ซงอาจบงชถงลกษณะการอกเสบเรอรง ซงนาจะสมพนธกบตวสตวทมอายมากขน Table 2 Range of Peripheral blood Leukocytes ,Leukocytes and Neutrophils in SCID mice.
Normal SCID mice
Clinical SCID mice
Normal SCID mice (Custer et al., 1985)
Normal mice (Fox et al., 2002)
Total leukocytes (×1,000 cells/ml) 2.51±0.22 2.4-288.0 1.5-4.5 5.1-11.6 Leukocytes (%) 13.49±0.87 23.5-98.6 14-31 63-75 Neutrophils (%) 72.48±1.34 0.1-63.6 66-81 6.7-37.2
ในสตวปวย (Clinical SCID mice) มคาเมดเลอดขาว (78.51±33.23; 2.4-288.0 ×103cells/m)l คาเมดเลอด
ขาวชนดลมโฟไซด (70.25±9.53; 23.5-98.6 %) และโมโนไซด (10.63±2.88; 0.3-22.7%) ขนสง คาเมดเลอดขาวชนดนวโทรฟวส (17.81±8.77; 0.1-63.6%) ลดลง ดง Table 2 คาน าตาลกลโคสในเลอด (183.08±133.40; 7.8-712.5 mg/dl) สง และคา ALP (87.80±26.08; 31.0-129.0 mg/dl) สงขน และจากการท า Blood smear พบเมดเลอดขาวชนด lymphoblast จ านวนมาก ดง Figure 1
A B Figure 1 ( A, B) Blood smear revealed lymphoblasts of SCID mice (clinical case)
ผลการตรวจทางปาราสตวทยา
จากการตรวจตวอยางอจจาระ (Feces) หนเมาสสายพนธ SCID ทงหมดไมพบการตดเชอปาราสต
ผลการตรวจทางจลพยาธวทยา
ในสตวปกต พบวา อวยวะภายในมขนาดปกต โดยมจลพยาธสภาพ ตางๆ กลาวคอ ตอมไทมส พบ histiocytes และ epithelial cell จ านวนมากและไมสามารถแยกสวน cortex กบ medulla ไดชดเจน (Figure 2) มาม พบวาสดสวนของ connective tissue / lymphoid cell ratio สง และม megakaryocytic component (M) แทรกตวอย โดยไมสามารถแยกสวน red และ white pulp ไดชดเจน (Figure 3) ซงมลกษณะทสอดคลองกบผลของ Custer et al, 1985
Figure 2 SCID thymus. Completely devoid of cortex. (H&E, 100x) Figure 3 SCID spleen. Empty splenic follicles. (H&E, 400x)
ในสตวปวย พบวา อวยวะภายในมขนาดใหญขน โดยเฉพาะ ตอมไทมส และมาม มขนาดใหญขนกวาปกต โดยมจลพยาธสภาพ ตางๆ กลาวคอ ตอมไทมส พบ lymphoid cell จ านวนมาก ม epithelial cell ประปราย พบ hemosiderin และ connective tissue แทรกเลกนอย (Figure 4A) มาม พบ lymphoid cell จ านวนมาก พบ hemosiderin และ connective tissue แทรกเลกนอย (Figure 4B) ปอด พบ lymphoid cell จ านวนมาก โดยเฉพาะรอบๆเสนเลอด ม alveolar macrophage แทรกใน interalveolar septum, alveoli โดนท าลายเกอบหมด พบ peribronchial lymphatic kupffing และ perivascular lymphatic kupffing (Figure 4C) ตบ พบ lymphoid cell จ านวนมาก กระจายอยรอบๆ portal vein และเนอเยอ parenchyma (Figure 4D) ไต พบ vascular engorgement และม hemosiderin แทรกตวอยตงแต Proximal duct ไปจนถง collecting duct (Figure 4E) หวใจ พบ lymphoid cell จ านวนมากทงในสวน myocardium และ epicardium (Figure 4F) สมอง พบ microglia จ านวนมากในทกสวนของเนอเยอสมอง (Figure 4G)
M
* *
A B
Figure 4 Generalized Lymphoma in SCID mice (clinical case); thymus, spleen, lung, liver, kidney, heart and brain (4A-4G respectively), indicated lymphoid hyperplasia (L). (H&E, 100x)
A B Figure 5 CD3 and CD20 Immunolabelling of thymus tissue in SCID mice (normal case) revealed CD3-negative (A: IHC, 10x) and CD20-negative (B: IHC, 10x)
C D
E F
L L
L
L
L
L
L
L
L
G L
A B
Figure 6 CD3 and CD20 Immunolabelling of thymus tissue in SCID mice (clinical case) revealed CD3-positive (A: IHC, 10x) and CD20-negative (B: IHC, 10x)
Immunohistochemistry (IHC) staining พบวา ในสตวปกตไมพบ Immunolabelled ของ CD3 (Pan T Cells) และ CD20 (Pan B Cells) (Figure 5) ในขณะทสตวปวยพบ Immunolabelled ของ CD3 (Pan T Cells) เทานน (Figure 6)
ผลการวนจฉยสตวปวย
ระหวาง Generation F0-F2 พบวาหนเมาสสายพนธ SCID ปวยทงสน 13 ตว (ปวย 8 ตว ตาย 5 ตว)แบงเปนเพศผ 1 ตว เพศเมย 12 ตว ทกตวมอาการหายใจเรว หลงโกง กนอาหารลดลง ไมคอยเคลอนไหว โดยมอายเฉลยของการปวยในแตละ Generation ลดลง กลาวคอ 6-11, 7-8 และ 4-6 เดอน ตามล าดบ (รวมเฉลย 7 เดอน) จากการวนจฉยสตวปวยทงหมดพบวาสาเหตการปวยเกดจากภาวะ Lymphoma หรอ โรคมะเรงตอมน าเหลอง ชนด T cell ชนดแพรกระจาย ซงเกดจากความผดปกตของเซลลเมดเลอดขาวชนด lymphocyte ทอยภายในตอมน าเหลอง โดยพบวา หนสายพนธ CD-1, C57BL/6, B6C3F1 และ B6;129 สามารถพบการเกดภาวะนได 10-50% ในหนทมอายมากขน ซงมกมตนก าเนดมาจาก B-cell (Jerrold, 2006) ในขณะทสามารถพบการเกดภาวะนในหน SCID mice ไดทกอาย และมแนวโนมทจะเกดในเพศผมากกวาเพศเมย โดยมลกษณะการเกดแบบ Spontaneous lymphomas ซงมกมตนก าเนดมาจาก thymic T cells (Custer et al,1985) 15% ของหน SCID mice ทเกดภาวะน มกมตนก าเนดมาจากตอมไทมส เปน lymphomas ชนดไมแพรกระจาย ประมาณ 44% และชนดแพรกระจาย (ไปยงปอด, ตบ, มาม, ตอมน าเหลอง และ ไต) ประมาณ 40% ทงนภาวะ Lymphoma ชนด T cell ทพบไดบอยในหน SCID mice นาจะมความเกยวของกบ SCID mutation หรอ gene leakage (Monticello et al., 1994)
สรปผลการทดลอง
สถานภาพสขภาพของหนเมาสสายพนธ SCID ทศนยสตวทดลองแหงชาตผลตขน ยงคงความเปนสตวทดลองปลอดเชอจ าเพาะ และมคณลกษณะประจ าพนธทคงท โดยมอบตการณเกดโรคมะเรงเมดเลอดขาวชนด T cell 17.33% (13/75) ทอายเฉลย 7 เดอน
เอกสารอางอง
Ito M and Suemizu H 2009. NOG mice Introduction and applications, CIEA J. G. Fox, L. C. Anderson, F. M. Loew, and F. W. Quimby 2002. Biology and Diseases of Mice.
Laboratory Animal Medicine 2nd edition. Academic Press, San diego, CA : 35-120
Custer RP, Bosma GC, Bosma MJ 1985. Severe Combined Immunodeficiency (SCID) in the Mouse Pathology, Reconstitution, Neoplasms. American Journal of Pathology Vol. 120 No. 3: 464-477.
D.A Rees and J.C Alcolado 2005. Animal models of diabetes mellitus. Diabetes UK. Diabetic
Medicine 22: 359-370. Jerrold M. Ward 2006. Lymphomas and leukemias in mice. Experimental and toxicologic
Pathology 57: 377-381 Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz Leonard D., Leiter, E. H., 1992. The nonobese diabetic scid mouse:
Model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. Vol. 89: 3290-3294 Sundberg, JP. and Shultz, LD. 1993. The Severe Combined Immunodeficiency (scid) Mutation.
JAX®NOTES Issue 453 National Research Council. 1996. Veterinary Medical Care; in Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals. National Academy Press. Washington, D.C. 56-70. Kagiyama, N., K., Goto, and A., Takakura 1988. A proposal on microbiological monitoring in animal
experimentation facilities. Proceeding 9th ICLAS International Symposium on Laboratory Animal
Science Bangkok. 279-286. Kraft, V., Blanchet, H.M., Boot, R., Deeny, A., Hansen, A.K., Hem, A., van Herck, H., Kunstyr, I., Needham,
J.R., Nicklas, W., Perrot, A., Rehbinder, C., Richard, Y. and de Vroey, G. 1994. Recommendations for health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig, and rabbit breeding colonies. Report of the FELASA working group on animal health. Laboratory Animals 28: 1-12.
Nicklas, W., P., Baneux, R., Boot, T., Decella, A.A., Deeny, M., Fumanelli, and B., Illgen-Wilcke 2002. Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental unit. Laboratory Animals 36:20-42.
Monticello, T. M., Green, D. S., Yang, H., Drain, R. L., Franco, C. T., and Durham, S. K. 1994. Spontaneous Thymic Lymphoma in Severe Combined Immunodeficiency (SCID) Mice Engrafted with Human Peripheral Blood Lymphocytes. Vet Pathology 31: 393-395
Hendrickson, Eric A. 1993. The SCID Mouse: Relevance as an Animal Model System for Studying Human Disease. American Journal of Pathology Vol. 143 no. 6: 1511-1522