คู่มือการปฏิบัติงานnih.dmsc.moph.go.th/data/data/61/lo_manual.pdfปฏิบัติการ...

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป III

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา

ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป

ศ.เกยรตคณ ดร.มาลย วรจตร ดร.วนทนา ปวณกตตพร

ดร.สวรรณา ตระกลสมบรณ นางสรางค เดชศรเลศ

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราIV

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป

จดท�ำโดย

สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข

ศนยความรวมมอไทย-สหรฐ ดานสาธารณสข

ทปรกษำ

นพ.อภชย มงคล

ศ.นพ.สมหวง ดานชยวจตร

นพ.สมชาย แสงกจพร

บรรณำธกำร

ศ.เกยรตคณ ดร.มาลย วรจตร

ดร.วนทนา ปวณกตตพร

ดร.สวรรณา ตระกลสมบรณ

นางสรางค เดชศรเลศ

สงวนสขสทธตามพระราชบญญตการพมพ

หามมใหท�าซ�า ท�าส�าเนา หรอลอกเลยนแบบโดยมไดรบอนญาต

พมพครงท 3 กนยายน 2561

จ�านวน 4,000 เลม

ISBN 978-616-11-3803-5

ออกแบบปกโดย บรษท พรเมยร มารเกตตง โซลชน จ�ากด

รปและภาพประกอบในเลมโดย ผนพนธ

พมพท

บรษท พรเมยร มารเกตตง โซลชน จ�ากด

เลขท 9/1 ซอยศรอกษร ถนนชองนนทร

แขวงทงมหาเมฆ เขตสาธร กรงเทพฯ 10120

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป V

ผนพนธ

ผศ.นพ.ก�าธร มาลาธรรม ประธานคณะกรรมการปองกนและควบคมการตดเชอในโรงพยาบาล รองผอ�านวยการโรงพยาบาลรามาธบด คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด มหาวทยาลยมหดล [email protected] นางสาวฉนทนา อรญญะ นกเทคนคการแพทยช�านาญการ โรงพยาบาลพระนงเกลา [email protected]

ดร.ณฏฐวรรณ ปนวน ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกวทยาศาสตรการแพทยเชยวชาญดานเชอราและพาราสตวทยากรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected]

นางสาวนตยา ธระวฒนกล นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ โรงพยาบาลสรรพสทธประสงค [email protected]

นายบญชวย เอยมโภคลาภ ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ สถาบนบ�าราศนราดร [email protected] นางปทมพศ วมลวตรเวท ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกวทยาศาสตรการแพทยเชยวชาญดานสอบเทยบการวเคราะห กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected]

ดร.ปยะดา หวงรงทรพย นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected]

นางเพญแข รตนพรยกลเจาพนกงานวทยาศาสตรการแพทยช�านาญงาน กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected]

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราVI

ศ.เกยรตคณ ดร.มาลย วรจตร ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงศาสตราจารยคณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด มหาวทยาลยมหดล

ผศ.ดร.วรดา สโมสรสข ผชวยศาสตราจารย คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร [email protected]

นางวรรณา เพงเรองโรจนชย ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ โรงพยาบาลราชบร [email protected]

ดร.วนทนา ปวณกตตพร นกวทยาศาสตรการแพทยช�านาญการพเศษ กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected] นางสาววภา ตรรตนวรพงษ นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ สถาบนสขภาพเดกแหงชาตมหาราชน [email protected]

นายสมชย หลกภชาต นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ ส�านกโรคเอดส กรมควบคมโรค [email protected]

นายสมศกด ราหล นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ โรงพยาบาลราชวถ [email protected]

นายสมศกด เหรยญทองนกวทยาศาสตรการแพทยช�านาญการพเศษ ส�านกวณโรค กรมควบคมโรค [email protected] ศ.เกยรตคณ พญ.สยมพร ศรนาวน ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงศาสตราจารย คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด มหาวทยาลยมหดล [email protected]

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป VII

นางสจตรา มานะกล นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษโรงพยาบาลสราษฎรธาน [email protected]

พ.อ.หญง ผศ.สดาลกษณ ธญญาหาร อาจารยวทยาลยแพทยพระมงกฎเกลา/ผชวยศาสตราจารย กองพยาธวทยา โรงพยาบาลพระมงกฎเกลา[email protected]

นางสรางค เดชศรเลศ ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกวทยาศาสตรการแพทยผทรงคณวฒดานชววทยากรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected] ดร.สวรรณา ตระกลสมบรณ อาจารยประจ�ามหาวทยาลยรงสต คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยรงสต ขาราชการบ�านาญ ต�าแหนงนกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล มหาวทยาลยมหดล [email protected]; [email protected]

นางหทยา ธญจรญ นกเทคนคการแพทยช�านาญการพเศษ โรงพยาบาลตากสน [email protected]

นายอนชาต จอมแปง นกเทคนคการแพทยปฏบตการ ส�านกโรคเอดส กรมควบคมโรค [email protected]

ดร.อนศกด เกดสน นกวทยาศาสตรการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข [email protected]

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราVIII

ค�านยม

การตรวจวเคราะหทางจลชววทยา เปนเทคนคส�าคญในการชนสตรและยนยนโรคตดเชอ ปจจบน เชอดอยา

เปนปญหาส�าคญตอการสาธารณสขไทยและของโลก การขนสง การเดนทางจากซกโลกหนงไปยง อกซกโลกหนง

สะดวกรวดเรว ไมมพรมแดนกน สถานการณโรคและภยสขภาพเปลยนแปลงตามปจจยตางๆ โดยเฉพาะ

โรคตดเชอสามารถแพรเขาสประเทศไดงายขน ซงสงผลกระทบตอสขภาพของประชากรไทย ตลอดจนการ

ด�าเนนงานดานการแพทยและสาธารณสขอยางตอเนอง ดงนน บทบาทของหองปฏบตการจงมความส�าคญมาก

ในการเตรยมความพรอมและตอบสนองการระบาดของเชอดอยา และเปนก�าลงส�าคญในการเปนเครอขายของ

ระบบเฝาระวงโรคของประเทศ

กรมวทยาศาสตรการแพทยในฐานะหองปฏบตการอางองและหองปฏบตการสาธารณสขระดบประเทศ

ก�าหนดพนธกจเนนการสรางความมนคงดานสขภาพ และลดความเหลอมล�าในการเขาถงบรการทางดาน

สาธารณสขดวยองคความรและนวตกรรมดานวทยาศาสตรการแพทย คมอปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบ

โรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป เปนเอกสารต�าราทมสวนชวยในการยกระดบคณภาพการตรวจทางหอง

ปฏบตการ จลชววทยาใหเปนมาตรฐานเดยวกนทงประเทศ และเปนคมอทไดรบความนยมอยางมาก หอง

ปฏบตการ จลชววทยาทวประเทศไดใชอางองเปนแนวปฏบต โดยสอดคลองกบแนวทางของกฎอนามยระหวาง

ประเทศ พ.ศ. ๒๕๔๘ (International Health Regulations 2005) และเกณฑการประเมน Joint External Evaluation

(JEE) ขององคการอนามยโลก เนองจากมเนอหาครอบคลมตงแตวธการเกบตวอยาง วธทดสอบ การควบคมคณภาพ

รวมทงความปลอดภยในการปฏบตงาน อกทงคณะผนพนธ ประกอบดวยคณาจารยและผทรงคณวฒจาก

มหาวทยาลยและหนวยงานตางๆทไดรบความเชอถอในระดบชาตและนานาชาต คมอฉบบนสนบสนนให

เครอขายการเฝาระวงโรคทางหองปฏบตการมความเขมแขง ผลการวเคราะหทางหองปฏบตการถกตอง เชอถอได

การจดพมพครงท ๓ น จงนบเปนเรองทนาสนบสนนและสงเสรมอยางยง ในการตอบสนอง ความตองการ

การใชงานของโรงพยาบาลทกระดบ

กรมวทยาศาสตรการแพทย หวงเปนอยางยงวา “คมอปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบโรงพยาบาลศนย

และโรงพยาบาลทวไป” ฉบบพมพครงท ๓ นจะเปนประโยชนสงสดตอหองปฏบตการของโรงพยาบาล

สมเจตนารมณของคณะผจดท�าทกประการ

(นายสขม กาญจนพมาย) อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป IX

ค�านยม

ประเทศไทยจะเขาสวาระประชาคมเศรษฐกจอาเซยนอยางเปนรปธรรม ส�าหรบภาคสาธารณสขนน

อาจเปนภาวการณทโรคตดเชอและเชอกอโรคทส�าคญแพรเขาสประเทศไดงายขน ดงนนบทบาทของหองปฏบต

การจงมความส�าคญมาก กลาวคอตองมความพรอมในการรองรบโรคระบาด และเปนก�าลงส�าคญในการเปน

เครอขายของระบบเฝาระวงโรคของประเทศ การจดท�าหนงสอคมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบ

โรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป จงนบเปนเรองทนาสนบสนนและสงเสรมอยางยง เนองจากเปนการ

ปรบปรงค มอวธปฏบตงานทางหองปฏบตการจลชววทยาใหทนตอยคสมย และสอดคลองกบแผนพฒนาระบบ

และสมรรถนะของหองปฏบตการทกระดบทงในและนอกกระทรวงสาธารณสขทจดท�าโดยกรมวทยาศาสตร

การแพทย หนงสอเลมนมความครอบคลมตงแตวธการเกบตวอยาง วธทดสอบ การควบคมคณภาพ รวมทง

ความปลอดภยในการปฏบตงาน ซงเปนไปตามแนวทางของกฎอานามยระหวางประเทศ พ.ศ. 2548 (International

Health Regulations 2005) จงนบเปนประโยชนตอบคลากรสาธารณสขเปนอยางยง

ขอชนชมความตงใจและความอตสาหะของคณะผจดท�าคมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบ

โรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป และคาดหวงวาหนงสอเลมนจะไดรบการน�าไปใชใหเกดประโยชน

สงสดตอหองปฏบตการของโรงพยาบาล สมเจตนารมณของคณะผจดท�าทกประการ

(นายอภชย มงคล)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราX

Preface

The Division of Global Health Protection at the Thai Ministry of Public Health-US CDC Collaboration

is proud to partner with the Department of Medical Sciences in the publication and distribution of this

laboratory manual for bacteriology. Microbiology laboratories at regional and general hospitals are essential

resources for detecting emerging and re-emerging infectious diseases, as well as long-standing threats to public

health. In this age of increasing antimicrobial resistance and rapid disease spread across borders, the need for

optimal procedures for specimen collection, transportation, testing and reporting are more important than ever.

The guidelines in this manual, which reflect both many years of practical experience and the most current

scientific knowledge, can help hospital laboratories throughout Thailand provide the best microbiological

services possible. Prompt and accurate identification of bacteria and fungi and determination of antimicrobial

susceptibility are essential not only for optimal clinical care, but are the cornerstone of public health

surveillance for serious invasive diseases. The US CDC is gratified to share a long partnership with the

Thailand Ministry of Public Health on laboratory-based surveillance for invasive and vaccine-preventable

bacterial infections. The guidance provided in this manual on quality assurance and biosafety techniques

will further strengthen the capacity of microbiological laboratories throughout Thailand to safely, rapidly

and confidently diagnose serious diseases. High quality laboratory diagnosis is the key to detecting, preventing

and controlling disease including outbreaks of potentially vaccine-preventable diseases. We congratulate the

editors and authors of this manual for providing a resource that will be valuable for many years in protecting the

health of the Thai people.

John R. MacArthur, MD, MPH

Director, Thailand MOPH - US CDC Collaboration

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XI

ค�าน�า

ฉบบพมพครงท 3

เนองจากคมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป ทไดจดพมพ

ครงท 1 ในป พ.ศ. 2557 และจดพมพเพมเตมในป พ.ศ. 2558 ไดรบการตอบรบเปนอยางด ซงยงมบคลากรทาง

หองปฏบตการอกจ�านวนมากทตองการคมอการปฏบตงานแบคทเรยและราฯน จงไดจดท�าฉบบป พ.ศ. 2561 ขน

โดยปรบปรงเนอหาบางสวนใหทนสมย

กรมวทยาศาสตรการแพทยหวงวา คมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและ

โรงพยาบาลทวไป 2561 น จะเปนประโยชนตอบคลากรทางหองปฏบตการ แพทย พยาบาล บคลากรดานสาธารณสข

ทมสวนเกยวของกบการปฏบตงานแบคทเรยและราในโรงพยาบาลทวประเทศ

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXII

ค�าน�า

ค มอการปฏบตงานแบคทเรยและเชอรา ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไปทจดท�านม

วตถประสงคเพอใชเปนแนวทางในการปฏบตงานยอมส เพาะ แยก และวนจฉยแบคทเรยและเชอรา จาก

สงสงตรวจผปวยและการทดสอบความไวของแบคทเรยกอโรคตอสารตานจลชพทใชในการรกษาผปวย โดย

เนนวธด�าเนนงานเปนหลกเพอใหหองปฏบตการทวประเทศมแนวทางการท�างานทมมาตรฐาน เปนไปในทศทาง

เดยวกนและคงเสนคงวา นอกจากนยงกลาวถงหลกการของการทดสอบตางๆซงจะน�าไปสความเขาใจและท�าให

ปฏบตงานไดอยางมประสทธภาพยงขน เนอหาในคมอนครอบคลมทกขนตอนของการปฏบตงานตงแตการเลอก

เกบและน�าสงสงสงตรวจซงเปนปจจยส�าคญตอผลการทดสอบทได การด�าเนนการตรวจวเคราะห และการวนจฉย

ชนดของเชอกอโรคจากสงสงตรวจตางๆ การทดสอบความไวของแบคทเรยกอโรคกบสารตานจลชพ การทวน

สอบผลทไดกอนรายงานผล การรายงานผล การควบคมคณภาพในหองปฏบตการ ความปลอดภยในการปฏบตงาน

ของบคลากรและสงแวดลอม ผเขยนทกคนมความตงใจในการจดท�าคมอน โดยรวบรวมความรจากต�าราตางๆ และ

ประสบการณจากการท�างานมาไวในแตละบท และพยายามเขยนใหกระชบเพอใหงายตอการน�าไปใช จงหวง

เปนอยางยงวาคมอนจะเปนประโยชนตอผปฏบตงานแบคทเรยและเชอราในโรงพยาบาลทวประเทศไทย

มาลย วรจตร

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XIII

สารบญ

บท หนา

บทท 1 การปองกนการตดเชอจากการปฏบตงานในหองปฏบตการ 1

บทท 2 การเกบสงสงตรวจเพอวนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยและเชอรา 11

บทท 3 การวนจฉยโรคตดเชอจากสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศน 33

บทท 4 ขนตอนการเพาะเชอจากสงสงตรวจ

4.1 การเพาะเชอจากเลอด 54

4.2 การเพาะเชอจากน�าไขสนหลงและน�าสวนตางๆของรางกาย 62

4.3 การเพาะเชอจากปสสาวะ 68

4.4 การเพาะเชอจากอจจาระ/rectal swab 73

4.5 การเพาะเชอจากระบบทางเดนหายใจ 80

4.6 การเพาะเชอจากระบบสบพนธ 88

4.7 การเพาะเชอจากหนอง แผล ฝ ตางๆ 93

บทท 5 การวนจฉยแบคทเรยกอโรคกลมตาง ๆ และเชอราทพบบอย

5.1 การวนจฉยแบคทเรยชนด Gram-Positive Cocci 102

5.2 การวนจฉยแบคทเรยชนด Gram-Positive Bacilli 113

5.3 การวนจฉยเชอแบคทเรย Gram-Negative Cocci 117

5.4 การวนจฉยเชอแบคทเรย Family Enterobacteriaceae 120

5.5 การวนจฉยเชอแบคทเรย Family Vibrionaceae 139

5.6 การวนจฉยเชอกลม Glucose Nonfermentative Gram-Negative Bacilli 144

5.7 การวนจฉยเชอกลม Higher Bacteria 173

5.8 การวนจฉยเชอกลม Miscellaneous Gram-Negative Bacteria 177

5.9 การวนจฉยเชอกลม Anaerobic Bacteria 185

5.10 การวนจฉยเชอวณโรคและเชอมยโคแบคทเรยอนๆ 196

5.11 การวนจฉยเชอราทพบบอย 207

บทท 6 การทดสอบความไวของแบคทเรยตอสารตานจลชพ 215

บทท 7 การควบคมคณภาพในหองปฏบตการแบคทเรย 265

บทท 8 การทวนสอบผล 286

บทท 9 บทบาทของหองปฎบตการจลชววทยาในดานการควบคมและปองกนโรคตดเชอในโรงพยาบาล 301

บทท 10 การตดเชอแบคทเรยในชมชน: บทบาทของหนวยงานการปฏบตการดานแบคทเรย 305

ภาคผนวก 309

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXIV

สารบญภาพ

ภาพ หนา

ภาพท 1-1 แสดงตวอยางหองปฏบตการระดบตางๆ 3

ภาพท 3-1 การยอมส acid-fast ในการตรวจหาเชอมยโคแบคทเรย 35

ภาพท 3-2 เครอง cytospin slide centrifuge 38

ภาพท 3-3 ลกษณะการตดสและการเรยงตวของเชอทใชควบคมคณภาพการยอมแกรม 41

ภาพท 4.3-1 วธการเพาะปสสาวะบน BA 68

ภาพท 5.9-1 Rubber-stoppered collection vial containing an agar indicator system 186

ภาพท 5.9.2 Anaerobic transport system ส�าหรบสงสงตรวจทเปนเนอเยอ 186

ภาพท 5.9-3 Anaerobic transport system ส�าหรบตวอยาง swab 187

ภาพท 6-1 ตวอยางการทดสอบหาคา MIC ดวยวธ broth microdilution 248

ภาพท 6-2 ลกษณะของ D-test 261

ภาพท 6-3 Epsilometer test (E-test) 262

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XV

สารบญตาราง

ตาราง หนา

ตารางท 1-1 ความสมพนธระหวาง Risk groups, ระดบชวนรภย, การปฏบต และอปกรณตางๆ 4

ตารางท 1-2 ล�าดบความทนของจลชพตอสารท�าลายจลชพแตละชนดเรยงจากมากไปหานอย 7

และระดบของการท�าลายเชอหรอน�ายาท�าลายเชอ

ตารางท 1-3 การจ�าแนกขยะและวธการก�าจดขยะ 9

ตารางท 2-1 การเกบสงสงตรวจจากระบบตางๆในรางกาย การน�าสงและการรกษา 15

ตารางท 2-2 สงสงตรวจทควรเกบ และสงสงตรวจทไมควรเกบส�าหรบการเพาะเชอ 16

ตารางท 2-3 การเกบสงสงตรวจเพอวนจฉยโรคตดเชอ Aerobic bacteria 18-28

ตารางท 2-4 การเกบสงสงตรวจเพอวนจฉยโรคตดเชอรา 29-31

ตารางท 3-1 ลกษณะของเชอทพบในสงสงตรวจตางๆ และการรายงานผล

ก. แบคทเรยแกรมบวกทพบในสงสงตรวจผปวย 42-45

ข. แบคทเรยแกรมลบทพบในสงสงตรวจผปวย 45-47

ค. จลชพอนๆ ทตรวจไดจากการท�า direct smears สงสงตรวจผปวย 47-48

ตารางท 4.1-1 แสดงแบคทเรยทแยกไดจากเลอดและโอกาสของการปนเปอน 58

(false positive) หรอโอกาสของการกอโรค (true positive)

ตารางท 4.3-1 การค�านวณจ�านวนโคโลนทนบไดเมอใช loop เทยบมาตรฐาน 0.001 ml 69

ตารางท 4.3-2 การค�านวณจ�านวนโคโลนทนบไดเมอใช Bacteruristrip 70

ตารางท 4.3-3 เกณฑพจารณาน�าเชอไปแยกวนจฉยชนดและทดสอบความไวตอสารตานจลชพ 71

ส�าหรบแบคทเรยทแยกไดจากปสสาวะ

ตารางท 4.4-1 เชอและอาหารเลยงเชอทเกยวของ 75

ตารางท 4.6-1 ตารางการวนจฉยเชอกอโรคในระบบสบพนธ 90-91

ตารางท 4.7-1 การแปลผลการยอมแกรมเชงปรมาณส�าหรบตวอยางทไมใชเสมหะ 94

ไมใชตวอยางปายชองคลอดทใชวนจฉยชองคลอดอกเสบ และไมใช

ตวอยางน�าคดหลงทผานการปน

ตารางท 4.7-2 การแปลผลการยอมแกรมเชงปรมาณส�าหรบการตรวจสงตรวจหนองโดยตรง 94

(direct examination) โดยการประเมนผลรวมของปรมาณ neutrophil และ squamous cell

เพอตรวจสอบคณภาพสงสงตรวจ

ตารางท 4.7-3 อาหารเลยงเชอ สภาวะ อณหภมและเวลาเพาะเชอจากหนองจากแผลลกและฝปด 95

ตารางท 4.7-4 อาหารเลยงเชอ สภาวะ อณหภมและเวลาเพาะเชอจากหนองจากแผลเปด ฝเปด และผน 96

ตารางท 4.7-5 อาหารเลยงเชอ สภาวะ อณหภมและเวลาเพาะเชอจาก Conjunctival swab 97

ตารางท 4.7-6 อาหารเลยงเชอ สภาวะ อณหภมและเวลาเพาะเชอจาก Ear swab 98

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXVI



ตารางท 5.1-1 การวนจฉยเชอ gram-positive cocci, catalase บวก ทมโคโลนขนาดใหญ สขาวหรอเหลอง 103

ทพบบอย

ตารางท 5.1-2 ปฏกรยาทใชในการวนจฉยเชอ Streptococcus group ตางๆ 104

ตารางท 5.1-3 การวนจฉยเชอ Streptococcus กลม pyogenic ดวยปฏกรยาทางชวเคม 105

ตารางท 5.1-4 การวนจฉยเชอ Streptococcus กลม non-pyogenic ดวยปฏกรยาทางชวเคม 106

ตารางท 5.1-5 การวนจฉยเชอในกลมของ S. bovis group ดวยปฏกรยาทางชวเคม 107

ตารางท 5.1-6 การวนจฉยเชอแบคทเรย gram-positive cocci, catalase negative, PYR positive 108

ทไมใช Streptococcus group A

ตารางท 5.1-7 การวนจฉยเชอ gram-positive cocci (excluding Streptococcus pyogenes), 110

catalase negative or weakly positive, PYR-positive

ตารางท 5.1-8 การวนจฉยเชอ gram-positive cocci, catalase negative and PYR-negative 111

ตารางท 5.2-1 การวนจฉย Aerobic non-spore forming gram positive bacilli ทส�าคญ 114

ตารางท 5.2-2 การแยกชนดของ Corynebacterium 114

ตารางท 5.2-3 การแยกเชอ Bacillus cereus group 115

ตารางท 5.3-1 Differentiation of Neisseria spp. and M. catarrhalis 119

ตารางท 5.4-1 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (+) 121

ตารางท 5.4-2 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (-), LDC (+) 123

ตารางท 5.4-3 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (-), LDC (-) 125

ตารางท 5.4-4 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-), 127

motility 25 °C (-), DNase 25 °C (-), red pigment (-), ODC (-)

ตารางท 5.4-5 การแยกพสจนเชอกลมท 2 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S+ 129

ตารางท 5.4-6 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (+) 130

ตารางท 5.4-7 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-),ODC (+) 131

ตารางท 5.4-8 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-),ODC (-) 132

ตารางท 5.4-9 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (+) 134

ตารางท 5.4-10 การแยกพสจนเชอกลมท 4 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S+ 136

ตารางท 5.5-1 การทดสอบปฏกรยาชวเคมของเชอ Vibrio และ Plesiomonas 142

ตารางท 5.5-2 การทดสอบปฏกรยาชวเคมของเชอ Aeromonas 143

ตารางท 5.6-1 รายชอเชอตามการจ�าแนกผล oxidase/motility/OF (glucose) 152

ตารางท 5.6-2 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose บวก, peritrichous flagella 153

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XVII



ตารางท 5.6-3 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose บวก, polar flagella 154-155

ตารางท 5.6-3(1) Characteristics of the B. cepacia complexa 156

ตารางท 5.6-4 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose ลบ, peritrichous flagella 157

ตารางท 5.6-5 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose ลบ, polar flagella 158

ตารางท 5.6-6 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose บวก, indole บวก 159

ตารางท 5.6-7 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose บวก, indole ลบ 160

ตารางท 5.6-8 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose ลบ, indole บวก 161

ตารางท 5.6-9 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose ลบ, indole ลบ 161-162

ตารางท 5.6-10 การจ�าแนกเชอกลม oxidase ลบ, motility บวก, OF glucose บวก 162

ตารางท 5.6-11 การจ�าแนกเชอกลม oxidase ลบ, motility ลบ , OF glucose บวก/ลบ 163

ตารางท 5.6-12 การจ�าแนกเชอกลม oxidase บวก/ลบ, motility บวก, OF glucose บวก/ลบ, 164

pink pigmented nonfermenter

ตารางท 5.6-13 Nomenclature of glucose nonfermentative gram-negative bacteria 165-171

from clinical specimens

ตารางท 5.7-1 ลกษณะของ grains หรอ granules ของเชอกอโรค actinomycotic mycetoma 174

ตารางท 5.7-2 Morphologic characteristics of aerobic actinomycetes 175

ตารางท 5.8-1 ลกษณะทางชวเคมของแบคทเรยในกลม miscellaneous gram-negative 179

และแบคทเรยอนทใกลเคยง

ตารางท 5.8-2 การแยกพสจนเชอ Campylobacter spp. 182-183

ตารางท 5.9-1 การอานผล anaerobic bacteria 193-194

ตารางท 5.10-1 แสดงวธรายงานผลการตรวจสไลดดวยกลองจลทรรศนแบบ Grading 199

วธ Ziehl – Neelsen

ตารางท 5.10-2 แสดงวธรายงานผลการตรวจสไลดดวยกลองจลทรรศนแบบ Grading 199

วธ Fluorescent acid-fast staining ดวย objective lens x20

ตารางท 5.10-3 ลกษณะตางๆทใชส�าหรบแยกเชอวณโรคออกจากเชอมยโคแบคทเรยอนๆ (NTM) 203

ตารางท 5.10-4 วธเตรยมอาหารไขทงชนด Lowenstein Jensen (LJ) และ 2% Ogawa medium 205

ตารางท 5.11-1 สโคโลนของ Candida species บน CHROMagar Candida 209

ตารางท 6-1 การเลอกสารตานจลชพททดสอบกบเชอแบคทเรยแตละชนด 218-221

ตารางท 6-2 สรปยอการทดสอบความไวของเชอชนดเจรญไวตอสารตานจลชพโดยวธ 226-227

disk diffusion test

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXVIII



ตารางท 6-3 สรปยอการทดสอบความไวของเชอ fastidious แบคทเรย ตอสารตานจลชพ 227-228

โดยวธ disk diffusion test

ตารางท 6-4 เชอททดสอบและเชออางองทใชควบคมคณภาพการทดสอบความไวของเชอ 230

ตอสารตานจลชพ โดยวธ disk diffusion test (M100-S23)

ตารางท 6-5 เชอททดสอบและเชออางองทใชควบคมคณภาพการทดสอบความไวของเชอ 231-232

ตอสารตานจลชพ (M45-A2)

ตารางท 6-6 คณลกษณะของเชอมาตรฐานส�าหรบใชในการควบคมคณภาพการทดสอบ 233-236

ความไวของเชอแบคทเรยตอสารตานจลชพ

ตารางท 6-7 รายการตรวจคดกรองการดอยาตามชนดการดอยาทแสดงออก (Phenotype) 240-241

หรอตามกลไกการดอยา

ตารางท 6-8 แสดงการหาคา MIC ของเชอโดยวธ agar dilution 245

ตารางท 6-9 ตวอยางแสดงการเตรยม working solution 247

ตารางท 6-10 แสดงเชอแบคทเรยทควรทดสอบความไวดวยวธ broth microdilution 249-251

ตารางท 6-11 ตาราง inhibition zone ของเชอในการทดสอบ ESBL 253

ตารางท 6-12 ß-lactamases และ carbapenemase activity 254

ตารางท 7-1 เชอมาตรฐานทใชในการควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ 268-277

ตารางท 7-2 อายการใชงานของอาหารเลยงเชอทเตรยมแลว 278

ตารางท 7-3 เชอมาตรฐานทใชในการทดสอบคณภาพของสและน�ายาตางๆ 279-280

ตารางท 7-4 การบ�ารงรกษาอปกรณเครองมอในหองปฏบตการ 283-284

ตารางท 8-1 Intrinsic resistance ของ Enterobacteriaceae 289

ตารางท 8-2 การดอสารตานจลชพทใชในการวนจฉยเชอ (intrinsic resistance) 292

ตารางท 8-3 การดอสารตานจลชพทเปนไปไมได 292

ตารางท 8-4 ตวอยางการดอสารตานจลชพทพบไดนอย 293

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XIX

สารบญแผนภม

แผนภม หนา

แผนภมท 4.2-1 ขนตอนการตรวจวนจฉยน�าไขสนหลงและน�าจากสวนตางๆ ของรางกาย 66

แผนภมท 4.4-1 ขนตอนการตรวจวนจฉย เชอจากอจจาระ/Rectal Swab 78

แผนภมท 4.5-1 ขนตอนการเพาะเชอจาก throat swab และ nasopharyngeal swab 81

แผนภมท 4.5-2 ขนตอนการเพาะเชอจาก sinus aspirate, tracheal suction, nasopharyngeal suction 82

แผนภมท 4.5-3 ขนตอนการเพาะเชอแบคทเรยจาก sputum และ bronchial wash 84

แผนภมท 4.5-4 ขนตอนการเพาะเชอจาก lung biopsy และ lung aspirate 86

แผนภมท 4.6-1 ขนตอนการวนจฉยเชอกอโรคในระบบสบพนธ 90

แผนภมท 4.7-1 ขนตอนการเพาะเชอจากหนองตางๆ 99

แผนภมท 5.2-1 ขนตอนการตรวจวนจฉย Bacillus 116

แผนภมท 5.3-1 ขนตอนการตรวจวนจฉยเชอ Gram-negative cocci 118

แผนภมท 5.4-1 เชอทสงสย Family Enterobcateriaceae 120

แผนภมท 5.4-2 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (+) 122

แผนภมท 5.4-3 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S-, PDA (-), LDC (+) 124

แผนภมท 5.4-4 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-) 126

แผนภมท 5.4-5 การแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-), 128

motility 25 °C (-), DNase 25 °C (-), red pigment (-), ODC (-)

แผนภมท 5.4-6 การแยกพสจนเชอกลมท 2 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S+ 129

แผนภมท 5.4-7 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (+) 130

แผนภมท 5.4-8 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-),ODC (+) 131

แผนภมท 5.4-9 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-),ODC (-) 133

แผนภมท 5.4-10 การแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (+) 135

แผนภมท 5.4-11 การแยกพสจนเชอกลมท 4 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S+ 137

แผนภมท 5.6-1 ขนตอนการวนจฉยเชอกลม Nonfermentative Gram-Negative Bacilli เบองตน 151

แผนภมท 5.9-1 วธด�าเนนการตรวจวนจฉย anaerobic bacteria เบองตน 188

แผนภมท 5.9-2 แสดงการแบงกลมของ anaerobic bacteria 190

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXX

ค�ายอ

A/A TSI ใหลกษณะ slant สเหลอง/butt สเหลอง

A/AG, H2S- TSI ใหลกษณะ slant สเหลอง/butt สเหลอง มการสรางแกส แตไมสรางไฮโดรเจนซลไฟด

A/AG, H2S+ TSI ใหลกษณะ slant สเหลอง/butt สเหลอง มการสรางแกส และสรางไฮโดรเจนซลไฟด

A/K TSI ใหลกษณะ slant สเหลอง/butt สแดง

Ana BA Anaerobic blood agar

APW Alkaline peptone water

BA Blood agar

BBE Bacteroides bile esculin agar

BG Bordet Gengou medium

BPW Buffer peptone water

BSC Biological safety cabinet

BHI Brain heart infusion

CA Chocolate agar

CAMHB Cation-adjusted Mueller Hinton broth

CAMP Cyclic adenosine monophosphate

CFU Colony forming unit

CSF Cerebrospinal fluid

CTBA Cystine tellurite blood agar

cumm cubic millimeter

DMST Department of Medical Sciences Thailand

EMB Eosin-methylene blue agar

EY Egg-yolk agar

FTM Fluid thioglycollate medium

GLC Gas Liquid Chromatography

GN broth Gram-negative broth

H.N. Hospital number

K/A TSI ใหลกษณะ slant สแดง/butt สเหลอง

K/AG, H2S- TSI ใหลกษณะ slant สแดง/butt สเหลอง มการสรางแกส แตไมสรางไฮโดรเจนซลไฟด

K/AG, H2S+ TSI ใหลกษณะ slant สแดง/butt สเหลอง มการสรางแกส และสรางไฮโดรเจนซลไฟด

K/K TSI ใหลกษณะ slant สแดง/butt สแดง

K/N TSI ใหลกษณะ slant สแดง/butt ไมเปลยนส

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป XXI

LDC Lysine decarboxylase

LDA Lysine deaminase

LPF Low power (microscopic) field

MAC MacConkey agar

MHA Mueller-Hinton agar

MR-VP Methyl red & Voges-Proskauer

MSRV Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium

MTM Modified Thayer-Martin agar

NA Nutrient agar

NF Nonfermentative gram-negative bacilli

ODC Ornithine decarboxylase

OF medium Oxidation-fermentation medium

ONPG O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside

PDA Phenylalanine deaminase

PCR Polymerase Chain Reaction

PMN Polymorphonuclear cells

PYR Pyrrolidonyl arylamidase

RPM Revolutions per minute

SDA Sabouraud dextrose agar

SEPC Squamous epithelial cells

SIM Sulfur-indole-motility medium

SS Salmonella Shigella agar

TCBS Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar

TSA Tryptic soy agar

TSB Tryptic soy broth

TSI Triple sugar iron agar

UV Ultraviolet light

VP Voges-Proskauer

XLD Xylose lysine deoxycholate agar

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราXXII

บทท1การปองกนการตดเชอ

จากการปฏบตงานในหองปฏบตการ

คมอการปฏบตงานแบคทเรยและรา2

การปองกนการตดเชอจากการปฏบตงานในหองปฏบตการ

สวรรณา ตระกลสมบรณ

บญชวย เอยมโภคลาภ

หลกการปองกนการตดเชอในหองปฏบตการ การตดเชอในหองปฏบตการอาจเกดขนไดในทกขนตอนของการปฏบตงาน ตงแตการเกบสงสงตรวจจนถงขน

ตอนการท�าลายขยะตดเชอ ผปฏบตงานจะตองมความรพนฐานเกยวกบการแพรกระจายเชอและวธปฏบตงานท

เหมาะสม ควรไดรบการฝกอบรมดานความปลอดภยในการปฏบตงาน บคลากรทกคนตองตระหนกถงความ

ปลอดภยในการปฏบตงาน และตองปฏบตตามมาตรฐานการปฏบตงานและมาตรฐานความปลอดภยอยางเครงครด

โดยเฉพาะในการปฏบตงานกบเชอหรอสงสงตรวจทมหรออาจมเชอ หนวยงานตองจดสถานทและจดหาวสด

อปกรณทเหมาะสม หองปฏบตการจะตองสะอาดและเปนระเบยบอยเสมอ ควรแยกสวนการปฏบตงานทตดเชอ

ออกจากสวนทไมตดเชอ ควรมอางลางมอและอปกรณเชดมอทเหมาะสมใหพอเพยง ขยะตดเชอตองใสถงขยะ

สแดงทมการบงชอยางชดเจนวาเปนขยะตดเชอและใสในถงขยะทมฝาปดมดชด

ควรก�าหนดมาตรฐานและวธการปฏบตงาน รวมทงฝกอบรมเจาหนาท (โดยเฉพาะเจาหนาทใหมหรอผมาฝก

ปฏบตงาน) ใหสามารถปฏบตงานไดอยางถกตอง มทกษะและความช�านาญในการปฏบตงาน สามารถปฏบตงาน

ดวยความปลอดภย มคมอเกยวกบเรองตางๆ ทส�าคญ เชน การแตงกายและการใชอปกรณทถกตองในการปฏบตงาน

เพอปองกนอนตรายประเภทตางๆ ขอปฏบตทถกตองและขอควรระวงในการท�างาน การปองกนและแกไข

เมอเกดอบตเหต การจดการกบสงสงตรวจทหกหรอกระเดนเปอนบรเวณตางๆ รวมถงการใชและบ�ารงรกษาอปกรณ

และเครองมอตางๆ เปนตน

ควรจดหาอปกรณทจ�าเปนในการปฏบตงานใหพอเพยงกบความตองการ บคลากรทกระดบควรทราบถงวธการ

ใชอปกรณปองกนตางๆ อยางถกตองเหมาะสมกบลกษณะงานทปฏบต ควรเตรยมเครองมอเครองใชตางๆ ใหพรอม

และครบถวนกอนปฏบตงาน ควรสวมเสอคลมทกครงขณะปฏบตงาน และสวมถงมอเมอปฏบตงานทตองสมผส

กบเชอหรอสงสงตรวจทอาจมเชออนตราย กรณทอาจมการกระเดนของสงสงตรวจควรสวมแวนตาและผาปดปาก-

จมกตามความเหมาะสม

ส�ำหรบโรงพยำบำลศนยและโรงพยำบำลทวไป 3

ภำพท 1-1 แสดงตวอยำงหองปฏบตกำรระดบตำงๆ

การแบงหองปฏบตการตามระดบการตดเชอองคการอนามยโลกไดก�าหนดการจดกลมเชอกอโรคตามกลมของความเสยง (risk group) ตางๆดงน

Risk Group 1 เชอทไมท�าใหเกดอนตรายหรอเกดอนตรายแตไมรนแรงตอคนและชมชน (no or low individual

and community risk) เชน แบคทเรยทไมมรายงานวาท�าใหเกดโรคในคนหรอสตว

Risk Group 2 เชอทท�าใหเกดอนตรายปานกลางตอคน แตเกดอนตรายทไมรนแรงตอชมชน (moderate

individual risk, low community risk) เชน เชอทท�าใหเกดโรคในคนและสตว แตไมเกดอนตราย

รนแรงตอบคลากรทางหองปฏบตการ, ชมชน, สตวทดลอง หรอสงแวดลอม บคลากรผทไดรบเชอ

อาจเกดการตดเชอรนแรง แตมการรกษาและการปองกนทมประสทธภาพ และความเสยง

ในการแพรกระจายเชอต�า

Risk Group 3 เชอทท�าใหเกดอนตรายสงตอคน แตเกดอนตรายทไมรนแรงตอชมชน (high individual risk,

low community risk) เชน เชอทท�าใหเกดโรคทรายแรงในคนหรอสตว แตโดยทวไปจะไม

แพรกระจายไปยงบคคลอน และมการรกษาและการปองกนทมประสทธภาพ

Risk Group 4 เชอทท�าใหเกดอนตรายสงตอคนและตอชมชน (high individual and community risk) เชน

เชอทท�าใหเกดโรคทรายแรงในคนหรอสตว และสามารถแพรกระจายไปยงบคคลอน ทงโดย

ทางตรงและทางออม ยงไมมการรกษาและการปองกนทมประสทธภาพ

เมอทราบวางานทก�าลงปฏบตนนเกยวของกบเชอในกลมเสยงกลมใด ผปฏบตงานจ�าเปนตองทราบถงแนวทาง

การแบงระดบของหองปฏบตการ และการเลอกใชอปกรณปองกนอนตรายทเหมาะสม ดงรายละเอยดในตารางท

1-1


ตำรำงท 1-1 ควำมสมพนธระหวำง Risk groups, ระดบชวนรภย, กำรปฏบต และอปกรณตำงๆ

Risk group Biosafety level Laboratory type Laboratory

practices Safety equipment

1 Basic - Biosafety Level 1 Basic teaching,

research

GMT None; open bench work

2 Basic - Biosafety Level 2 Primary health

services; diagnostic

services; research

GMT plus

protective clothing,

biohazard sign

Open bench plus BSC

for potential aerosols

3 Containment - Biosafety

Level 3

Special diagnostic

services, research

As level 2 plus

special clothing,

controlled access,

directional air flow

BSC and/or other

primary devices for

all activities

4 Maximum

Containment - Biosafety

Level 4

Dangerous pathogen

units

As level 3 plus

airlock entry,

shower exit, special

waste disposal

Class III BSC or

positive pressure suits

in conjunction with

Class II BSCs,

double-ended

autoclave (through the

wall), filtered air

BSC, biological safety cabinet; GMT, Good Microbiological Technique

จากตารางท 1-1 จะเหนวาโดยทวไปการปฏบตงานกบเชอใน risk group ใด กจะเลอกใชระดบของหองปฏบต

การ (biosafety level) ในระดบเดยวกน แตหองปฏบตการจะตองวเคราะหความเสยงของลกษณะงานทปฏบตและ

เลอกใชระดบของหองปฏบตการทเหมาะสม เชน เชอวณโรค (Mycobacterium tuberculosis) เปนเชออนตรายท

จดไวใน risk group 3 แตลกษณะการปฏบตงานยอมสโดยตรงจากเสมหะ และมเทคนคการปฏบตงานทเหมาะสม

กอาจไมเกดการฟงกระจาย จงสามารถท�างานในหองปฏบตการระดบ 2 (BSL-2) ได แตเมอเพาะเลยงเชอวณโรค

จนเพมจ�านวนมากขน การปฏบตงานเพอวเคราะหเชอหรอทดสอบความไว จะตองท�าในหองปฏบตการระดบ 3

(BSL-3) เปนตน

เครองมอส�าคญทเกยวของ 1. เครองนงฆำเชอดวยไอน�ำ (autoclave)

ตองมการตรวจสอบประสทธภาพการท�าลายเชอของ autoclave อยางสม�าเสมอ เชน ทดสอบดวย spore test

อยางนอยสปดาหละครง หากสามารถท�าไดควรวดอณหภมภายใน autoclave (เชน ใช thermometer หรอ data logger

ทผานการสอบเทยบแลว) เพอใหมนใจวาเครองสามารถใหอณหภมทเหมาะสมตามระยะเวลาทก�าหนดได


2. ตปรำศจำกเชอ (biological safety cabinet: BSC)

ในการปฏบตงานกบเชออนตรายทอาจมการฟงกระจาย ควรท�าในต BSC โดยทวไปนยมใชชนด class II ควร

ศกษาคณลกษณะ และการตรวจสอบประสทธภาพของต BSC เพอใหสามารถใชงานไดอยางปลอดภย ต BSC ดง

กลาวตองไดรบการสอบเทยบอยางนอยปละครง และควรตรวจสอบประสทธภาพการท�างานในเบองตนทกครงท

ใชงาน เชน ใชเสนดายตดไวทแผนกระจกดานหนาต เพอดทศทางการไหลของลม เสนดายควรจะถกลมดดใหเอน

เขาในต หากเสนดายถกลมเปาออกดานนอกควรหยดการใชและสงซอมโดยเรว ในตไมควรวางของจ�านวนมาก

เนองจากอาจมผลตอประสทธภาพการท�างานของเครองและอาจกระทบตอความปลอดภยของผปฏบตงาน

3. เครองหมนเหวยง (centrifuge)

ในการปฏบตงานทตองปนตกตะกอนสงสงตรวจทอาจมเชออนตราย ควรชงน�าหนกหลอดใหเทากนเพอปองกน

กรณหลอดแกวแตกขณะปน หากท�าไดควรใชหลอดพลาสตกแทนหลอดแกว หากมงบประมาณเพยงพอ ควรเลอก

ใช centrifuge ชนดทม safety cup (ใสหลอดบรรจสงสงตรวจในถวยปนทมฝาปด) ซงหากหลอดแตกขณะปน กจะ

ไมฟงกระจาย

การทดสอบประสทธภาพการฆาเชอของเครอง autoclave ดวย spore test สปอรของแบคทเรยถกท�าลายยากทสด ถาสปอรถกท�าลาย เชออนจะถกท�าลายหมด ดงนนจงน�าสปอรมาเปน

เครองทดสอบประสทธภาพของการท�าใหปราศจากเชอ spore test ซงเปนหลอดเลกๆ ภายในบรรจดวยสปอร

Geobacillus stearothermophilus และมหลอดแกวบรรจอาหารเลยงเชอ (สารละลายสมวง) ท�าการทดสอบดงน

1. ใส spore test ใน autoclave พรอมอปกรณหรอวสดทตองการฆาเชอ เมอเครองหยดท�างานแลวใหน�า

หลอด spore test ออกจากเครอง แลวใชทหนบบบใหหลอดทบรรจอาหารแตก เพอให spore สมผส

อาหารเลยงเชอทเปนสารละลายสมวง

2. น�า spore test ในขอท 1. ไปอบท 56 �C นาน 48 ชม. ดการเปลยนแปลงสของอาหารเลยงเชอ

- ถา spore ตาย อาหารเลยงเชอจะไมเปลยนส (เปนสมวงเหมอนเดม) แสดงวา autoclave มประสทธภาพ

การฆาเชอไดด

- ถาอาหารเลยงเชอเปลยนจากสมวง (เปนสเหลอง) คอสปอรยงไมตาย แสดงวาเครอง autoclave

ไมมประสทธภาพพอส�าหรบฆาเชอ spore ของ Bacillus spp. ได ตองท�าการตรวจสภาพและแกไข

โดยชางและท�า spore test เพอทดสอบประสทธภาพใหม

ขอปฏบตส�าหรบการใช biological safety cabinet 1. กอนและหลงการท�างานใน BSC ควรลางมอดวยสบหรอน�ายาลางมอทมน�ายาฆาเชอ

2. ผปฏบตงานควรสวมเสอกาวนชนดแขนยาวปลายรดและสวมถงมอ เพอปองกนการสมผสเชอ

3. ท�าความสะอาดพนทปฏบตงานใน BSC โดยเชดดวย 70% alcohol หรอน�ายาฆาเชอ

4. ไมควรวางของจ�านวนมาก เนองจากอาจมผลตอประสทธภาพการท�างานของเครอง และอาจกระทบตอ

ความปลอดภยของผปฏบตงาน โดยเฉพาะสวนหนาและสวนในทเปนชองส�าหรบถายเทอากาศและน�าออก

จาก BSC ใหหมด เมอปฏบตงานเสรจ


5. อปกรณหรอวสดทจ�าเปนตองใช ใหวางในบรเวณปฏบตงานในตกอนเรมงาน ไมควรหยบเขาออกระหวาง

ปฏบตงาน เพอไมรบกวนทศทางลมในต

6. ต�าแหนงทตง BSC ควรอยในททไมมการท�ากจกรรมอนๆ เชน อยสวนทายของหองหางไกลจากประต

ทางเขาออก และหางไกลเครองปรบอากาศหรอทดดอากาศ เพอปองกนไมใหมกระแสลมรบกวนซงอาจม

ผลกระทบตอการไหลเวยนทน�าจลชพผาน air barrier

7. การปฏบตงานใน BSC ตองไมเคลอนไหวมอและแขนแรงๆแบบรบดวน เพราะอาจมผลรบกวนทศทางลม

ในตทเปนสาเหตใหมจลชพหลดออกนอกตหรอม airborne contamination จากอากาศทไหลเขาต

8. ขณะใชเครอง centrifuge ใน BSC ไมควรปฏบตงานอนๆ ในต เนองจากลมทเกดจากเครองปนเหวยง เชน

centrifuge ทท�าในต BSC สามารถรบกวนทศทางการไหลเวยนอากาศในต อาจมผลตอการปลอยเชอออกส

อากาศในหองปฏบตการ

9. ขณะท�างานในต BSC ยงคงมความจ�าเปนตองปฏบตตามกระบวนการควบคมการปนเปอนจลชพและเทคนค

ปลอดเชอ (aseptic techniques)

10. ตองท�าลายเชอสวนผวหนา (surface decontamination) ของอปกรณทสมผสจลชพโดยตรงออกกอนน�าออก

จากต BSC ททงขยะตดเชอหรอภาชนะทใสอปกรณทเปอนเชอตองปดฝากอนน�าออก

11. เมอมอบตเหตเชอหรอสงสงตรวจหกหรอกระเดนในพนทปฏบตงานใน BSC ตองท�าลายเชอบนผวหนา

ของพนในต BSC กอนน�าเชอหรอสงสงตรวจนนออกจากต

12. ไมควรใชตะเกยงบนเสน ใน BSC เพราะเปลวไฟจะรบกวนการไหลเวยนอากาศในต และอาจท�าลาย HEPA

filter ถาจ�าเปนใหใชชนดเปด-ปดไดเฉพาะเมอตองการใชงานหรอเปนชนดทใชไฟฟา

13. ควรเปดเครองไวอยางนอย 5 นาท กอนใชงาน เพอใหอากาศในตมการไหลเวยนกอน เพอปองกนการ

ปนเปอนในอากาศในพนทปฏบตงาน

14. ควรท�าความสะอาดพนผวภายในตควรท�าซ�าอกครงหลงจากเอาของออกหมดแลว เนองจากอาจมอาหาร

เลยงเชอทเปอนในตท�าใหเกดเชอราเจรญและปลอย spore ปนเปอนบรเวณปฏบตงานได

การท�าลายเชอ การท�าลายเชออาจท�าไดโดยหลกการใหญๆ 2 วธคอ การท�าลายเชอดวยหลกการทางฟสกส เชน การใชความ

รอน ไดแก การเผา การ autoclave หรอการใช hot air oven และการใชหลกการทางเคม เชน ใชน�ายาท�าลายเชอ

ชนดตางๆ ในการใชน�ายาท�าลายเชอนน จะตองค�านงถงระดบความคงทนของเชอตอน�ายาท�าลายเชอ ความสามารถ

หรอความแรงของน�ายาในการท�าลายเชอ ระยะเวลาทใชท�าลายเชอ และปรมาณสารอนทรยทอาจมผลตอ

ประสทธภาพของน�ายา เปนตน ตวอยางเชน ความคงทนของเชอตอน�ายา ตงแตท�าลายไดยากจนถงท�าลายไดงาย

ตามล�าดบไดแก สปอรของเชอแบคทเรย, เชอวณโรค, non lipid หรอไวรสขนาดเลก, เชอรา, เชอแบคทเรยทไมม

สปอร และ lipid หรอไวรสขนาดกลาง ความสามารถหรอความแรงของน�ายา ในกรณใชเปน disinfectant เชน

glutaraldehyde จดอยในระดบ high หรอ intermediate ส�าหรบ chlorine compounds และ alcohol จดอยในระดบ

intermediate สวนสารประเภท quaternary ammonium compounds จดอยในระดบ low เปนตน ระยะเวลาทเชอ

สมผสกบน�ายาตองนานเพยงพอทเชอจะถกท�าลายได ปรมาณสารอนทรยในสงสงตรวจทจะท�าลายเชอ เชน ถาใช

น�ายาท�าลายเชอกบสงสงตรวจทมสารอนทรยมาก เชน เสมหะ อจจาระ น�ายาสวนมากจะถกท�าใหเสอมประสทธภาพ

โดยสารอนทรย ท�าใหการท�าลายเชอลดลง เปนตน


ตำรำงท 1-2 ล�ำดบควำมทนของจลชพตอสำรท�ำลำยจลชพแตละชนดเรยงจำกมำกไปหำนอย และระดบของ

กำรท�ำลำยเชอหรอน�ำยำท�ำลำยเชอ

Bacterial Spores

เชน Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes

(Sterilization)

▼

Mycobacteria

เชน Mycobacterium tuberculosis var. bovis, Non-tuberculous mycobacteria

(High level disinfection)

▼

Non lipid or Small Viruses

เชน Poliovirus, Coxsackievirus, Rhinovirus

(Intermediate level disinfection)

▼

Fungi

เชน Trichophyton spp., Cryptococcus spp., Candida spp.

▼

Vegetative Bacteria

เชน Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis, Enterococci

(Low level disinfection)

▼

Lipid or Medium-size Viruses

เชน Herpes simplex virus, CMV, Respiratory syncytial virus,

HBV, HCV, HIV, Hantavirus, Ebola virus

Modified from Russell and Favero

การด�าเนนการเมอมของตดเชอหก กรณสงสงตรวจหกเปรอะเปอนผวดานนอกของภาชนะบรรจ และจ�าเปนตองตรวจวเคราะห ใหท�าความ

สะอาดผวภาชนะดานนอกดวยน�ายาท�าลายเชอทเหมาะสมกอนทจะน�ามาตรวจตามปกต ถาสงสงตรวจตกแตก

หรอหกหลนลงพน ใหสวมถงมอยางหนา ใชกระดาษเชดสงเปรอะเปอนออกใหมากทสด หรอใชกระดาษแขงตก

สงเปรอะเปอนหรอเศษแกวออก แลวทงลงในถงขยะตดเชอ ใช 0.5% hypochlorite ราดบรเวณทเปรอะเปอนโดย

รอบ จากดานนอกสดานใน ทงไวนานประมาณ 30 นาท กอนเชดถตามปกต


ถาหลอดบรรจสงสงตรวจแตกในเครองปนตกตะกอนใหปดเครองและรอประมาณ 30 นาท สวมถงมอสวม

แวนตาและผาปดปาก-จมก แลวจงเปดฝาเครอง ใช forceps เกบเศษแกวชนใหญๆ ออกกอน ใช forceps จบเศษผา

หรอกระดาษช�าระซบของเหลวและเศษแกวทแตกอยออกใหมากทสด (เปลยนกระดาษบอยๆ) ถาสวนใดสามารถ

ถอดออกแชในน�ายาท�าลายเชอได ควรถอดออกแชดวยน�ายาทเหมาะสม และทงไวประมาณ 10 นาท สวนทไม

สามารถถอดออกไดใหคลมดวยกระดาษช�าระแลวราดดวยน�ายาท�าลายเชอใหชม ทงไวประมาณ 10 นาท จงเอาออก

ปลอยไวจนแหง แลวเชดซ�าดวยน�า เชดใหแหงอกครง แลวจงใชงานตามปกต

แนวทางการท�าความสะอาดเมอเกดอบตเหตมสงสงตรวจหรอของทมเชอหกหรอตกแตก 1. สวมใสอปกรณปองกนตว ไดแก เสอกาวนแขนยาวสวมทบดวยเอยมพลาสตก, mask, แวนตา

หมวกคลมผม, สวมถงมอบางหรอหนาสสม และสวมถงหมรองเทา (ตามความจ�าเปน)

2. น�าปายขอความ “ระวง เขตอนตราย” มาตงบรเวณทเกดอบตเหต เพอเตอนผปฏบตงานอน

3. เกบเศษแกวและของมคมดวยคมคบใสภาชนะส�าหรบใสขยะตดเชอชนดมคม

4. ใชกระดาษคลมทบบรเวณทมของหกใหทวถง จากนนเท disinfectant ทเตรยมไว (น�า 450 ml กบ 5%

hypochlorite 50 ml) ราดบรเวณทเกดอบตเหตจากดานนอกเขาสดานในปลอยทงไวนาน 30 นาท

5. รวบกระดาษช�าระดวยคมคบและไมพาย (หรออาจใชกระดาษแขงแทน) ไปทงในถงขยะตดเชอ

6. กวาดชนสวนทเหลอดวยไมกวาดหรอทตกขยะไปทงในถงขยะตดเชอ

7. ใชผากอซหรอกระดาษช�าระชบ disinfectant เชคท�าความสะอาดบรเวณทเกดอบตเหตใหสะอาดอยาง

ทวถง

8. ทงผากอซหรอกระดาษช�าระทใชแลว รวมทงเศษแกวทแตกไวในถงขยะตดเชอ

9. น�าถงขยะตดเชอใสกลองใสของมคม เพอน�าไปท�าลาย

การก�าจดขยะตดเชอ ขยะตดเชอตางๆ ตองทงในถงขยะตดเชอ (โดยทวไปนยมถงแดง) ซงบรรจในถงขยะปดมดชด ส�าหรบของมคม

ตางๆ เชน แผนกระจก slide เศษแกว ใบมด ควรทงในภาชนะชนดหนาทไมแทงทะล (เชน กระปองพลาสตกอยาง

หนา) ปดฝาใหมดชดกอนทง การท�าลายขยะตดเชอควรใชวธ autoclave หรอเผา เพอใหมนใจวาไมแพรกระจายเชอ

สสงแวดลอม ตวอยางขยะตดเชอ เชน เขมทกชนดทใชกบผปวยหรอสงสงตรวจของผปวย สารคดหลง และสงสง

ตรวจอนๆ จากผปวย อปกรณหรอภาชนะบรรจหรอสมผสสงสงตรวจหรอเชอโรค หองปฏบตการควรมแนวทาง

การปฏบตในการจ�าแนกชนดของขยะและการก�าจดขยะแตละประเภท ดงแสดงในตารางท 1-3


ตำรำงท 1-3 กำรจ�ำแนกขยะและวธกำรก�ำจดขยะ

ประเภทของขยะ ภำชนะบรรจ/สทนยม วธกำรท�ำลำย

ขยะทวไป ขยะเปยก เศษอาหาร ถงสด�า ถงสเขยว ขยะกทม. *ฝงกลบ

ขยะแหง ขยะแหงไมคนสภาพ เชน กลองโฟม

กระเบอง อฐ

ขยะแหงบางชนดสามารถน�ามา

รไซเคลได เชน กระดาษ แกว

พลาสตก โลหะ

ถงสเหลอง ถงสเหลอง ขยะกทม. *ฝงกลบ

หรอรไซเคล

ขยะอนตราย ขยะตดเชอ ชนดไมมคม เชน ขยะทสมผสสารคด

หลงผปวย สายยาง สงสงตรวจผปวย

กระบอกฉดยาหรอเจาะเลอด

ทใชกบผปวย

ถงสแดง ถงสแดง เผาดวยความรอนสง

800 ºC หรอ autoclave

ชนดมคม เชน เขม ขวดแกวหรอวตถ

มคมทสมผสสงสงตรวจ หรอ

สารคดหลงผปวย

ภาชนะพเศษของมคมไม

ทะล เชน กลอง พลาสตก

ชนดหนา กระปองโลหะ

ปดแนนกอนใสถงสแดง

ขยะไมตดเชอ สารเคมจากหองปฏบตการ ภาชนะพเศษ ก�าจดตามชนดของสาร

เคม

ท�าโดยบรษทก�าจดสาร

เคม

ยาปฏชวนะ วคซน ขยะเคมบ�าบด ถงและถงทระบชนดของ

ขยะ

เผาดวยความรอนสง

1200 ºC

ขยะอนตรายตอสงแวดลอม เชน

กระปองสเปรย แบตเตอร

หลอดฟลออเรสเซนต ถานไฟฉาย

ถงและถงทระบชนดของ

ขยะ

ขยะกทม. ฝงกลบดวยวธ

พเศษ

*ขยะกทม. หมายถงขยะทก�าจดโดยกทม. รวมทงขยะทก�าจดโดยเทศบาลของแตละทองท

วธปฏบตการทงเขมหรอของมคมในกลองทงเขมและการทงกลอง 1. ใชมอจบกระบอกเขมทใชแลวทมเขมอยมายงกลองปลดเขมโดยไมตองใสคนปลอกเขม

2. น�าเขมใสเขาในรของกลองปลดเขม เพอท�าการปลดเขมออกจากกระบอกเขม

3. ขณะใชกลองปลดเขมหรอกลองใสขยะมคม ตองตงในทปลอดภย เพอปองกนการลมหรอหลนหก

เชน วางสวนในของโตะหรอมทยดกลอง ไมควรวางรมโตะหรอใตโตะ ทางเดนหรอใตเครองมอ

4. หลงบรรจเขมหรอของมคมทตดเชอไดสองในสามสวนของภาชนะ ใหปดฝาใหแนน ภาชนะทปดไมแนน

ตองพนดวยเทปใหแนน กลองจะเปดอกไมได

5. น�ากลองไปก�าจดเปนขยะตดเชอทงกลอง โดยไมเปดกลองถายขยะออก


การหอและจดสงตวอยางตดเชอ เพอปองกนหรอลดการแพรกระจายของเชอ ควรจดใหมทเกบเสมหะเปนสดสวนอยในทโปรงโลง มแดดสอง

มอากาศถายเทด และหางไกลบรเวณทมคนเดนจ�านวนมาก มปายบงช มอางลางมอ มททงขยะตดเชอ มอปกรณ

และน�ายาลางมอชนดทฆาเชอได เชน 4% chlorhexidine มรายละเอยดวธปฏบตแสดงขนตอนการเกบเสมหะ

ไมควรมประตเพราะลกบดประตอาจเปนแหลงแพรเชอจากการจบลกบดประตได และมการท�าความสะอาดสถานท

ทกวน

การสงสงสงตรวจมาหองปฏบตการตองมการปองกนการแพรกระจายเชอ ใบขอสงตรวจตองแยกออกจากสง

สงตรวจเพอไมใหสมผสภาชนะใสสงสงตรวจ เพราะดานนอกของภาชนะอาจมการปนเปอน ไดจากกระบวนการ

เกบสงสงตรวจและใบสงตรวจเปนเอกสารคณภาพทตองเกบไว ควรใสภาชนะสงสงตรวจในถงพลาสตกทปดปาก

ถงได ภาชนะบรรจสงสงตรวจตองมความคงทนไมแตกงาย ฝาปดแนนโดยเฉพาะการสงแบบกระสวย ควรขนสง

ในถงหรอกระตกทปดแนนสามารถปองกนการหกเลอะออกสภายนอก กรณสงสงตรวจหกเลอะตองท�าการปฏเสธ

สงสงตรวจ และปฏบตตามแนวทางการท�าความสะอาดเมอเกดอบตเหตมสงสงตรวจหกหรอตกแตก

เอกสารอางอง 1. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories.

5th ed. Washington DC: U.S. Department of Health and Human Services; 2010.

2. Favero MS, Bond WW. Chemical disinfection of medical surgical material. In: Block SS, editor.

Disinfection , sterilization and preservation, 5th ed. Philadelphia, PA: Lippincott, Williams and

Wilkins; 2001. p. 881-917.

3. International Standard. ISO 15190: Medical laboratories-Requirements for safety. 2003.

4. Russell AD. Bacterial resistance to disinfectants: present knowledge and future problems. J Hosp

Infect. 1999; 43:57-68.

5. บญชวย เอยมโภคลาภ. ตชวนรภย. การใชงานและตรวจสอบประสทธภาพ. วารสารเทคนคการแพทย

2557; 42 (1) : 4778-4792.

6. โรงพยาบาลศรราช. คมอบรหารจดการขยะมลฝอยของโรงพยาบาลศรราช. กรงเทพฯ:

โรงพยาบาลศรราช; 2550.

บทท2

การเกบสงสงตรวจเพอวนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยและเชอรา


การเกบสงสงตรวจเพอวนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยและเชอรา


วรรณา เพงเรองโรจนชย

หลกการส�าคญของการเกบสงสงตรวจเพอการเพาะเชอ 1. ตองหลกเลยงการปนเปอนของเชอประจ�าถนทอยรอบๆ บรเวณทเกบสงสงตรวจ เชน ผวหนงหรอ mucous

membranes ใกลต�าแหนงทมการตดเชอ จงตองใชน�ายาท�าลายเชอท�าความสะอาดผวหนงบรเวณทจะเกบ

หรอเจาะดดสงสงตรวจ ส�าหรบต�าแหนงทปกตมเชอประจ�าถนปนเปอนมากกวาหนง species ตองใช

selective methods ในการตรวจหาเชอกอโรคทจ�าเพาะ เพอปองกนการปนเปอนจากเชอประจ�าถนทไมใช

เชอกอโรค

2. เกบสงสงตรวจเรวทสดเทาทจะท�าได ขณะเรมม onset ของโรค เพอใหไดสงสงตรวจทเปนตวแทนทดของ

การตดเชอ

3. มการปฏเสธสงสงตรวจและตองเกบสงสงตรวจใหม เมอสงสงตรวจทเกบครงแรกมคณภาพไมเหมาะสม

ส�าหรบการตรวจทางจลชววทยา หรอมปรมาณไมพอเพยง การน�าสงทไมเหมาะสมดานอณหภม การน�าสง

ลาชา ก�าหนดเกณฑรบหรอปฏเสธตวอยาง

4. เลอกวธการเกบตวอยางทเหมาะสมส�าหรบสงสงตรวจแตละชนด ดงน

Swab ตองปายหรอถแรงๆ และตองท�าใหเปยกชมกอน เพอให swab ดดซบสงสงตรวจไดมาก swab

ไมสามารถใชเพาะเชอมากกวาหนงชนด ไมเหมาะส�าหรบการเพาะเชอรา เพราะเกบ mycelium

ไมได ใชเพาะเชอ Mycobacterium ไมได ตองใชสารน�าหรอชนเนอ

Aspirates สงสงตรวจทไดจากการดด มคณภาพดกวา swab ใช 70% alcohol ท�าความสะอาดผวหนงกอน

เจาะ แลวตามดวย providone iodine หรอ 2% chlorhexidine in alcohol

Tissue ชนเนอทใชเพาะเชอ เชน ตองท�า biopsied tissue โดย aseptic technique เชน tissue จาก

draining sinus, curetting deep within interior wall, bone biopsy เปนตน

Sputum เสมหะเปนสงสงตรวจทด ส�าหรบการตรวจวนจฉยโรค pneumonia แตตองไมมน�าลายปนเปอน

จงควรตรวจคณภาพ โดยการดกลองจลทรรศน microscopy evaluations กอนการเพาะเชอ

Urine ปสสาวะควรเพาะเชอจาก midstream collection, catheterization ส�าหรบ Foley catheter tip

ไมเหมาะส�าหรบการเพาะเชอ เพราะมการปนเปอนของเชอจาก urethral micro flora ไมตองท�า

colony count

Feces/Stool อจจาระเหมาะส�าหรบเพาะเชอมากกวา rectal swabs มโอกาสไดเชอกอโรคมากกวา ส�าหรบ

rectal swabs ตองใสใน transport media เสมอ

เชอทไวตอ ambient condition ตายงาย ไดแก Shigella spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae,

S. pneumoniae, และ anaerobes จงหามเกบ CSF ในตเยน


5. น�าสงในภาชนะหรอใน transport media ทเหมาะสม เชน

Cary Blair ส�าหรบ stool หรอ rectal swab

Stuart’s/Amies w/o charcoal ส�าหรบสงสงตรวจทกชนด

Thioglycolate ส�าหรบการเพาะเชอ anaerobe bacteria

Hemoculture media ส�าหรบเลอด

ภาชนะมฝาปดแนน ไมมการรวไหล บรรจภาชนะเกบสงสงตรวจในถงพลาสตก เพอปองกนการแพร

กระจายเชอ

6. ตองระบทงชนดของสงสงตรวจและต�าแหนงของรางกายหรออวยวะทเกบสงสงตรวจชดเจน เชน ไมระบ

วาหนอง แตตองระบวาหนองจากนวชซาย เปนตน การชบงตวอยางตรงกบขอมลในใบน�าสง เกบจากผปวย

ทถกคน การเกบสงสงตรวจจากผปวยผดคนอาจท�าใหไมไดรบการรกษา หรอ ไดรบการรกษาทผดวธเปน

อนตรายกบผปวยทงสองคนได ผเกบสงสงตรวจจงตองระบตวตนของผปวยกอนเกบสงสงตรวจเสมอ ใน

ใบน�าสงควรมขอมลดงน Demographic information ของผปวย เชน Patients ID, Age (Date of birth), Sex,

Health cares facility (OPD, ICU,อายรศาสตร), Patient location (ward), Admission date, Clinical

diagnosis และ Specimen information เชน Specimen no., Specimen type, Body site, Date/time of

specimen collection

7. มคมอการเกบสงสงตรวจส�าหรบเจาหนาททเกยวของ เพอเปนแนวปฏบตในการเกบสงสงตรวจใหมคณภาพ

8. สงสงตรวจแบงออกเปนสองประเภท คอ ชนดทเกบจากต�าแหนงทปกตปราศจากเชอ และสงสงตรวจจาก

ต�าแหนงทมเชอประจ�าถน

ชนดของสงสงตรวจจำกต�ำแหนงทปกตปรำศจำกเชอ ไดแก

1. Blood 7. Joint fluid

2. Bone marrow aspirate 8. Bile

3. Cerebral spinal fluid 9. Ascitic fluid

4. Pleural fluid 10. Vitreous fluid

5. Pericardial fluid 11. น�าหลอเลยงอวยวะภายในอนๆ

6. Peritoneal fluid 12. Tissue

สงสงตรวจจำกต�ำแหนงทมเชอประจ�ำถน ไดแก

1. สงสงตรวจจากระบบทางเดนหายใจ เชน เสมหะ throat swab

2. สงสงตรวจจากระบบทางเดนปสสาวะ

3. สงสงตรวจจากระบบทางเดนอาหาร

4. สงสงตรวจจากระบบสบพนธ

5. แผล และ หนอง


เชอประจ�ำถนของพนผวสวนตำงๆ ของรำงกำย

ผวหนง S. epidermidis, streptococci, Corynebacterium, Candida

คอ Viridans streptococci, diphtheroids

ปาก Viridans streptococci, Moraxella catarrhalis, actinomyces, spirochaetes

ระบบทางเดนอาหาร Viridans streptococci, M. catarrhalis, diphtheroids, micrococci

ชองคลอด Lactobacilli, diphtheroids, streptococci, yeasts

ทางเดนอาหาร Bacteroides, anaerobic streptococci, Clostridium perfringens, Escherichia coli,

Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp.

กำรเกบสงสงตรวจจำกระบบทำงเดนหำยใจดวยวธ throat swab

ท�าโดยใชไมกดลนพรอมกบใหผปวยรอง “อา...า..า..” ยาวๆ แลวใชไมพนส�าล (swab) ทปราศจากเชอปายบรเวณ

ตอมทอนซลทงสองขางและ posterior pharynx หรอตรงบรเวณทมการอกเสบและมหนอง พยายามอยาให swab

ถกน�าลายในปาก จากนนใส swab ลงใน Stuart’s medium แลวรบน�าสงหองปฏบตการทนท ถาไมสามารถสงได

ทนทใหเกบไวทอณหภมหองไมเกน 24 ชม.

ขนตอนกำรเจำะเลอดเพอเพำะเชอ

1. เตรยมอปกรณการเจาะเลอดใหพรอมกอนเจาะเลอด ขวดเพาะเชอตงทอณหภมหอง

2. หาต�าแหนงหลอดเลอดทเหมาะสม ควรเจาะบรเวณหลอดเลอดด�าสวนปลาย (peripheral vein)

3. กอนเจาะเลอดใหท�าความสะอาดมอดวยการลางมอดวย antiseptic หรอใช alcohol hand rub และสวมถงมอ

แบบสะอาด (clean glove)

4. การท�าความสะอาดผวหนงเปนขนตอนส�าคญในการลดการปนเปอน ใหใช 2% chlorhexidine gluconate

ใน 70% alcohol รอใหแหงและออกฤทธไดสงสดใชเวลาเพยง 30 วนาท แตถาใช povidone-iodine ตองรอ

ทงใหแหงจนกวาจะออกฤทธถง 2 นาท

5. การเชดผวหนงใหเชดวนจากดานในออกดานนอกเปนวงกวาง อยางนอย 5 cm ถแรงพอควรเปนเวลา 30

วนาท และรอจนแหงไมนอยกวา 30 วนาท กรณใช 2% chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol หรอ 2

นาท กรณใช povidone-iodine หลกเลยงการสมผสบรเวณผวหนงทจะเจาะเลอดหลงท�าความสะอาดดวย

น�ายาฆาเชอ

6. ท�าความสะอาดจกยางเพาะเชอดวย 70% alcohol หรอ 2% chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol ไมควร

ใชสารทม iodine เปนองคประกอบ เนองจากอาจท�าใหจกยางมการเปลยนสภาพได ท�าใหมโอกาสปน

เปอนเชอได

7. ใสเลอด 3 ml ลงในขวดเพาะเชอ โดยไมจ�าเปนตองเปลยนเขม เนองจากไมมความแตกตางของโอกาสการ

ปนเปอนเชอของการเปลยนเขม

8. สงหองปฏบตการทนท เพอปองกนไมใหมผลกระทบตอระยะเวลาการรอผล เนองจากตองรายงานผลรบ

ดวนเปนคาวกฤต ถาไมสามารถสงไดทนทใหเกบไวทอณหภมหอง


ขอควรระวง : กรณเจาะเลอดเพอสงตรวจรายการทดสอบอนๆดวย ตองใสเลอดในขวดเพาะเชอกอนเสมอ เพอ

ปองกนการปนเปอนจากจลชพและสารเคมทอาจมในหลอดทใสเลอด

กำรเกบสงสงตรวจจำกระบบทำงเดนปสสำวะเพอตรวจหำเชอแบคทเรยกอโรค

การเกบปสสาวะเพอเพาะเชอใหเกบแบบ clean-voided midstream urine โดยท�าดงน

1. ลางท�าความสะอาดชองเปดของทอปสสาวะและอวยวะรอบขางดวยน�ายาท�าลายเชอ หรอน�าสะอาด แลว

ซบแหงดวยส�าลหรอผากอซทสะอาด โดยในเพศหญงใหใชนวแยกสวน labia ออกใหกวาง และดงสวน

ผวหนงใหรงขนบน สวนในเพศชายใหดงหนงหมอวยวะเพศใหพนออกจากสวนปลายใหมากทสด

2. ถายปสสาวะสวนแรกทงไปกอน เพอเปนการชะลางสงทอาจจะปนเปอน จากนนเกบปสสาวะลงในภาชนะ

ปากกวางปราศจากเชอทเตรยมไว ปสสาวะทเกบไดตองสงเพาะเชอโดยเรวทสด ไมควรเกน 2 ชม. เนองจาก

เชอในปสสาวะสามารถเพมจ�านวนได จ�านวนเชอทเพมขนอาจท�าใหแปลผลผดได กรณทสงตรวจไมไดทนท

ใหเกบไวท 4 °C แตไมเกน 24 ชม.

ตำรำงท 2-1 กำรเกบสงสงตรวจจำกระบบตำงๆ ในรำงกำย กำรน�ำสงและกำรเกบรกษำ

System Specimen Storage temperature/Transport media

1. Upper respiratory tract Throat swab Sterile tube or Stuart transport medium Transport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at RT

2. Lower respiratory tract Sputum Sterile containerTransport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at RT

3. Genital tract Vaginal swab Sterile tube or Stuart transport medium Transport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at RT

4. Open wound Pus, wound Sterile tube or Stuart transport medium Transport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at RT

5. Urinary tract 1. Voided midstream urine Sterile containerTransport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at 4 °C

2. Catheterized urine Sterile containerTransport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at 4 °C

3. Suprapublic aspiration Sterile containerTransport ≤ 2 h at RT, storage ≤ 24 h at 4 °C

RT = Room Temperature; h = Hour

เกณฑกำรปฏเสธสงสงตรวจส�ำหรบกำรเพำะเชอ

- Improper or no label - Prolong transportation

- Improper container (non sterile) - Leaking container

- Oropharyngeally contaminated - Obvious foreign contamination

- Duplicate specimens submitted at the same day/time - Specimen unsuitable for culture request

- Quantity not sufficient


ตำรำงท 2-2 สงสงตรวจทควรเกบและสงสงตรวจทไมควรเกบส�ำหรบกำรเพำะเชอ

สงสงตรวจ สงสงตรวจทควรเกบ (Appropriate) สงสงตรวจทไมควรเกบ (Inappropriate)

เลอด Separate 2 or 3 venipunctures,

before initiation of antibiotics

Clotted blood, 1 or > 3 specimens within

24 h, antisepsis with alcohol only

ระบบทางเดนหายใจสวนลาง Freshly expectorated mucus and

inflammatory cells (pus, sputum)

Saliva, oropharynegeal, secretions, sinus,

drainage, nasopharynx

Sinus Direct aspiration, washes, curettage

and biopsy from sinus

Nasal/nasopharyngeal swab, sputum,

saliva

ระบบทางเดนปสสาวะ Midstream urine; urine from

catheterization, suprapublic

aspiration, cystoscopy or surgical

procedure

Urine from Foley catheter collection bag

Superficial wound Aspiration of pus or irrigation fluid,

swab of purulence from beneath

dermis

Swab/specimen contaminated with surface

material, irrigation fluid with preservative

Deep wound Purulence, necrosis, or tissue from

deep subcutaneous site

Specimen contaminated with surface

material

ระบบทางเดนอาหาร Freshly pass stool Rectal swab

กำรจดกำรสงสงตรวจ

- ตรวจสอบหมายเลขขอตรวจ ชอ-นามสกล H.N. บนใบน�าสงกบบนภาชนะใหตรงกน จากนนจงตรวจสอบ

รายละเอยดดงกลาวขางตนบนใบน�าสงใหตรงกน

- สงสงตรวจทผานการตรวจสอบแลว จะถกน�ามาเพาะเชอบนอาหารเลยงเชอทเหมาะสม อบเพาะเชอท

อณหภม 35 °C เปนเวลา 18-24 ชม.

- สงสงตรวจจะถกจ�าแนกออกเปน 2 กลม คอ

1. กลมทตองรายงานผล microscopic examination เบองตน ไดแก เสมหะ หนอง น�าหลอเลยงอวยวะ

ภายใน

2. กลมทไมตองรายงานผล microscopic examination ไดแก ปสสาวะ อจจาระ

- Microscopic examination รายงานผลเบองตน preliminary report

- Final report for microscopic examination, identification and antimicrobial susceptibility test


กำรเกบสงสงตรวจตำมมำตรฐำนงำนเทคนคกำรแพทย

ขนตอนกอนกำรวเครำะห

- มคมอจดเกบตวอยางแจกใหหนวยงานทเกบตวอยางมาสงหองปฏบตการ ควรมรายละเอยดครบถวนและ

ตองทบทวนทกป

- คมอระบ วธการตรวจ เวลาทใหบรการ การจดเกบตวอยาง การปฏเสธตวอยางทไมเหมาะสม การรบตรวจ

วเคราะหเพม

- มการบงชตวอยาง/ใบน�าสง/ตวอยางทแบงมาใหสามารถสอบกลบไปยงผปวยแตละคนในแตละวน/เวลา และ

ตวอยางเรมตนได ชอ นามสกล และ H.N. หรอ Lab no.

- มการควบคมวธการน�าสงตวอยางภายในเวลาและอณหภมทเหมาะสม ปลอดภยตอผน�าสงและสงแวดลอม

- หลกฐานระบรายละเอยดสภาพตวอยางหรอใบน�าสงทไมเปนไปตามเกณฑ บนทกการรบตวอยางในสมด/

ระบบคอมพวเตอร/ระบบอนๆ (วน/เวลา/ชนดตวอยาง/ผรบ)

- กรณทยงไมท�าการวเคราะหในทนท มวธการเกบรกษาตวอยางเหมาะสม

ขนตอนกำรรำยงำนผล

- ก�าหนด “คาวกฤต” หรอ “ชวงของคาวกฤต” โดยท�าความตกลงกบแพทยผสงตรวจ กรณพบคาวกฤต มวธ

การรายงานผล บนทกคาวกฤตทพบ/วน/เวลา/ผรายงาน น�ามาทบทวนระบบคณภาพ

- กรณจ�าเปนตองวเคราะหตวอยางทไมเปนไปตามเกณฑการรบตวอยาง มการระบสภาพปญหา/ขอควรระวง

ในการแปลผลในใบรายงานผล


ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a

ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำ

แหน

งทเก

บป

รมำณ

/ภำช

นะบ

รรจ

วธเก

บเว

ลำแล

ะอณ

หภม

ของ

ขอแน

ะน�ำห

รอขอ

ควรร

ะวง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Blo

odขว

ด he

moc

ultu

re

- ผ

ใหญ

5-1

0 m

l

- เด

ก 1-

5 m

l

- ท

ารกแ

รกเก

ด 1-

2 m

l

จ�าน

วนขว

ด

1. ก

รณไม

เรงด

วนเจ

าะ

อ

ยางน

อย 2

ขวด

ภ

ายใน

24

ชม.แ

ต

ไม

ควรเ

กน 4

ขวด

2. ก

รณเร

งดวน

ตองร

บ

ให

ยาป

ฏชวน

ะให

เจาะ

2

ขวดพ

รอมก

นแต

คน

ละ

ต�าแห

นง

3. ผ

ปวย

เดกใ

หเจ

าะเล

อด

เพ

ยงคร

งเดย

ว แต

ถา

ส

งสยภ

าวะต

ดเชอ

ท

ล

นห

วใจต

องเจ

าะ

อ

ยางน

อย 2

ครง

หาง

ก

นไม

เกน

24

ชม.

1. เ

ตรยม

อปกร

ณกา

รเจา

ะเลอ

ดให

พรอ

ม

2. ล

างมอ

ใหส

ะอาด

ดวยส

บห

รอน

�ายาฆ

าเชอ

แ

ละใส

ถงมอ

3. เ

ลอกต

�าแห

นงข

องห

ลอดเ

ลอดด

�าสวน

ป

ลาย

(per

iphe

ral v

ein)

ทจะ

เจาะ

เลอด

4. เช

ดซ�าด

วย 2

% c

hlor

hexi

dine

glu

cona

te

ใน

70%

alc

ohol

แตส

�าหรบ

เดกแ

รกเก

ดให

ใช

70%

alc

ohol

เชดแ

ทน

โดยเ

ชดวน

จาก

ด

านใน

ออกด

านน

อกเป

นวง

กวาง

อยาง

นอย

5

cm ร

อไมน

อยกว

า 30

วน

าท จ

นน

�ายาท

เช

ดซ�าแ

หง

5. ใช

เขมแ

ละ sy

ringe

เจาะ

เลอด

ออกจ

าก

ห

ลอดเ

ลอดด

�า

6. ท

�าควา

มสะอ

าดจก

ยางท

ฝาขว

ด

h

emoc

ultu

re ด

วย 7

0% a

lcoh

ol

แ

ละรอ

ใหแห

ง

7. แ

ทงเ

ขมลง

ตรงก

ลางจ

กยาง

ของข

วด

he

moc

ultu

re ฉ

ดเลอ

ดลงใ

นขว

ดเบ

าๆ

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

หำม

เกบ

ใน

ตเยน

1. ข

วด he

moc

ultu

re ท

ตองเ

กบใน

ตเยน

ใหน

�า

มาต

งไวท

อณห

ภมห

องกอ

นท

จะใส

เลอด

2. ค

วรห

ลกเล

ยงกา

รเจา

ะเลอ

ดจาก

หลอ

ด

เล

อดท

ขาห

นบ

(ing

uina

l ves

sels

)3.

หลก

เลยง

การส

มผส

บรเ

วณผว

หน

งทจะ

เจ

าะเล

อดห

ลงจา

กทท

�าควา

มสะอ

าดแล

ว4.

ควร

เจาะ

เลอด

กอน

ทผป

วยจะ

ไดรบ

สาร

ตาน

จลชพ

ถาผ

ปวย

ไดรบ

สาร

ตาน

จลชพ

แลวใ

หเจ

าะเล

อด 1

5 น

าท ก

อนท

จะให

สาร

ตาน

จลชพ

ครงถ

ดไป

5. ไม

ควรเ

จาะเ

ลอดเ

พอใ

ชใน

การท

ดสอบ

อน ใ

นคร

าวเด

ยวกน

เพรา

ะอาจ

เกด

clot

หรอ

cont

amin

atio

n ได

งาย

6. ก

ารเจ

าะเล

อด 2

ครง

หาง

กน 1

5 ห

รอ 3

0

นาท

กบ

การเ

จาะเ

ลอดจ

ากต�า

แหน

งท

ตา

งกน

2 ค

รงใน

เวลา

เดยว

กน พ

บวา

คว

ามไว

ในกา

รเพ

าะเช

อไมแ

ตกตา

งกน

7.กร

ณท

สงส

ยการ

ตดเช

อจาก

สาย

สวน

ห

ลอดเ

ลอดด

�าและ

ใชเค

รองเ

พาะ

เชอแ

บบ

อ

ตโน

มต ให

ดดเล

อดจา

กสาย

สวน

1 ข

วด

และ

เจาะ

เลอด

จากห

ลอดเ

ลอดด

�าสวน

ปลา

ยอก

1 ขว

ด พ

รอมก

น ถ

าขวด

ทมา

วธปฏ

บตกา

รเกบส

งสงต

รวจเ

พอวน

จฉยโ

รคตด

เชอแบ

คทเรย

และเช

อรา


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

8. เข

ยาขว

ดเป

นวง

กลมบ

นพ

นโต

ะ

ป

ระมา

ณ 5

รอบ

และ

ซาย

ขวาข

างละ

5

ครง

9. ใช

70

% a

lcoh

ol เช

ดจกย

างดา

นบ

น

ของข

วดอก

ครง

จา

กสาย

สวน

มเชอ

ขนกอ

นขว

ดทเจ

าะมา

จ

ากห

ลอดเ

ลอดด

�า สวน

ปลา

ย เท

ากบ

หรอ

ม

ากกว

า 2 ช

ม. บ

งชถง

การต

ดเชอ

มาจา

ก

จ

ากสา

ยสวน

หลอ

ดเลอ

ด

8. ก

รณผป

วยเด

กทเจ

าะเล

อดยา

กและ

มสาย

ส

วนห

ลอดเ

ลอด

เชน

cen

tral l

ine

คาอย

อ

นโล

มให

ดดเล

อดจา

กสาย

สวน

ไดแต

หาก

ผ

ลการ

เพาะ

เชอจ

ากสา

ยสวน

มเชอ

ขนแล

ะ

ต

องกา

รยน

ยนวา

เปน

ผลบว

กปลอ

มหรอ

ไม

ให

เจาะ

เลอด

จากห

ลอดเ

ลอดด

�าสวน

ปลา

ย

เพ

อเพ

าะเช

อซ�าอ

กครง

9. ถ

าตอง

การเ

พาะ

เชอว

ณโร

คให

เลอก

ขวด

h

emoc

ultu

re ท

เหมา

ะสมแ

ละป

ฏบตต

าม

ค

�าแน

ะน�าข

องผผ

ลต

Bon

e m

arro

wขว

ด he

moc

ultu

reแพ

ทยเ

ปน

ผเจา

ะเกบ

เหมอ

นกบ

bloo

d

เหมอ

นกบ

bloo

d

CSF

1 m

l/ขวด

ปรา

ศจาก

เชอ

เจาะ

เกบ

โดยใ

ช ste

rile t

echn

ique

โดยเ

กบเป

น

3 ขว

ด แล

ะใชข

วดท

2 ส

งเพ

าะเช

อ

ภายใ

น 1

5 น

าท

หาม

แชเย

น

ไมเก

น

24 ช

ม. ท

อณห

ภมห

อง

1. ถ

าเจา

ะไดข

วดเด

ยวให

น�าส

งหอง

จ

ลชวว

ทยา

เพ

อเพ

าะเช

อกอน

ทเห

ลอ

จ

งสงไ

ปตร

วจท

างเค

ม แล

ะ ce

ll co

unt

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Mid

stre

am

urin

e

1. ผ

ปวย

หญ

ง

(f

emal

e)

2. ผ

ปวย

ชาย

(m

ale)

10-1

5 m

l/ภาช

นะ

ปรา

ศจาก

เชอ

10-1

5 m

l/ภาช

นะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�าควา

มสะอ

าดบ

รเวณ

รอบ

ๆทอป

สส

าวะ

(u

reth

ra) ด

วยส

บ

2. ล

างส

บออ

กและ

เชดใ

หแห

ง

3. ใช

นว

2 น

วแยก

labi

a ให

หาง

ออกจ

ากกน

ถ

ายป

สส

าวะช

วงแร

กทงไ

ป

4. ถ

ายป

สส

าวะช

วงกล

างลง

ในภา

ชนะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

1. ร

นห

นงห

มปลา

ย gl

and

peni

s แลว

ท�า

ค

วามส

ะอาด

ดวยส

บ

2. ล

างส

บออ

กและ

เชดใ

หแห

ง

3. ถ

ายป

สส

าวะช

วงแร

กทงไ

ป

4. ถ

ายป

สส

าวะช

วงกล

างลง

ในภา

ชนะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

ควรส

งทน

ท

ไมเก

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ควรส

งทน

ท

ไมเก

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

1. ค

วรใช

ภาชน

ะปาก

กวาง

1. ค

วรใช

ภาชน

ะปาก

กวาง

Cat

hete

rize

d

urin

e

1. st

raig

ht

c

athe

ter

ประ

มาณ

15

ml/ภ

าชน

ะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�าควา

มสะอ

าดบ

รเวณ

รอบ

ๆ ur

ethr

a

ด

วยส

บ

2. ล

างส

บออ

กและ

เชดใ

หแห

ง

3. ส

อด c

athe

ter เ

ขาไป

ในกร

ะเพ

าะป

สส

าวะ

4. ป

ลอยน

�าปส

สาว

ะทงไ

ปป

ระมา

ณ 1

5 m

l

5. เก

บป

สส

าวะใ

สภา

ชนะป

ราศจ

ากเช

อ

ควรส

งทน

ท

ไมเก

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

1. ไม

ควรใ

ชวธน

ส�าห

รบ ro

utin

e u

rine

cultu

re ย

กเวน

ผปวย

ถายป

สส

าวะเ

องไม

ได

หรอ

มการ

อดตน

ของท

อปส

สาว

ะ

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

2. in

dew

ellin

g

c

athe

ter

5-10

ml/ภ

าชน

ะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ใช

ส�าล

ชบ 7

0% a

lcoh

ol ท

�าควา

มสะอ

าด

ส

วนตอ

ระห

วาง

cath

eter

กบ

สาย

dra

in

2. ใช

เขมแ

ละกร

ะบอก

ฉดยา

แทงแ

ลวดด

ป

สส

าวะอ

อกมา

ใสภา

ชนะป

ราศจ

ากเช

อ

5

-10

ml

ควรส

งทน

ท

ไมเก

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

Flui

ds

abd

omin

al

asc

itic,

bile

,

joi

nt,

per

icar

dial

,

per

itone

al,

ple

ural

syn

ovia

l และ

am

niot

ic fl

uid

gast

ric :

was

h

หรอ

lav

age

fluid

1. ≥

1 m

l ส�าห

รบ P

DF

(P

erito

neal

Dia

lysi

s

Fl

uid)

2. ≥

50

ml/ภ

าชน

ะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

25-5

0 m

l/ภาช

นะ

ปรา

ศจาก

เชอ

แพท

ยเป

นผเ

จาะโ

ดยใช

ster

ile te

chni

que

1 เก

บตอ

นเช

าเมอ

ผปวย

ตนน

อนกอ

น

ร

บป

ระท

านอา

หาร

เชา

2 ใส

สาย

nas

ogas

tric

tube

เขาท

างป

าก

ห

รอท

างจม

กลงไ

ปใน

กระเ

พาะ

3 ลา

งกระ

เพาะ

โดยใ

ชน�าก

ลนป

ราศจ

าก

เช

อ 20

-50

ml

4 เก

บน

�าลาง

กระเ

พาะ

ใสภา

ชนะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

ภายใ

น 1

5 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 1

5 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

หรอ

neu

traliz

e

ดวย

1.5 m

l ของ

40%

Na 2H

PO4

ภายใ

น 1

ชม.

หลง

เกบ

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ยกเว

น

peric

ardi

al

fluid

เกบ

ท 4

°C

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

1. ห

ามใช

ster

ile sw

ab จ

ม flu

ids ต

างๆ

แลว

ใส

ในภา

ชนะบ

รรจ

trans

port

med

ium

2. ใน

กรณ

ทตอ

งการ

ท�า

cell

coun

t ควร

สง

ท

นท

3. ถ

าตอง

การเ

พาะ

หาเ

ชอรา

ใหเก

บท

4 °C

ได

ไมเก

น 2

4 ชม

.

1. ค

วรท

�าการ

เพาะ

เลยง

บน

อาห

ารให

เรวท

สด

เน

องจา

กเชอ

วณโร

คใน

gas

tric

was

h

ต

ายเร

ว

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

IV c

athe

ter

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�าควา

มสะอ

าดผว

หน

งรอบ

ๆ ca

thet

er

ด

วย 7

0% a

lcoh

ol

2. ใช

ster

ile te

chni

que

ดงส

าย c

athe

ter

อ

อกมา

3. ต

ดปลา

ยดาน

ทอย

ในตว

ผปวย

ประ

มาณ

5

cm

ใสลง

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

ภายใ

น 1

5 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

1. อ

ยาให

สาย

แหงก

อนท

�าการ

เพาะ

เชอ

2. ไม

ควรท

�า cu

lture

จาก

fole

y ca

thet

er

เพ

าะเช

อทขน

เปน

เชอป

ระจ�า

ถน

บ

รเวณ

ปลา

ย ur

ethr

a

Abc

ess

1. o

pen

2. c

lose

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1-2

ml/ภ

าชน

ะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�าควา

มสะอ

าดผว

บน

ของแ

ผล โด

ยใช

น

�าเกล

อปรา

ศจาก

เชอ

2. เช

ดหน

องท

อยส

วนบ

นขอ

งแผล

ทง

3. ใช

ster

ile sw

ab ป

ายห

นอง

บรเ

วณ

แ

ผลท

อยลก

ลงไป

และบ

รเวณ

ขอบ

แผล

4. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

1. ท

�าควา

มสะอ

าดผว

บน

ของแ

ผล โด

ยใช

7

0% a

lcoh

ol

2. ใช

เขมแ

ละ sy

ringe

เจาะ

ดดห

นอง

ออกม

า

3. ฉ

ดใส

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

-

1. ถ

าจะย

อมแก

รม ด

วย ค

วร sw

ab เพ

ม

อ

ก 1

อน

ปาย

ลงบ

น sl

ide

สะอ

าดป

ราศ

จ

ากไข

มน

1. ค

วรน

�าสงห

องป

ฏบตก

ารให

เรวท

สด

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Upp

er

resp

irat

ory

trac

t

1. n

asal

2. n

asop

hary

nx

3. th

roat

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1. ใช

ster

ile sw

ab จ

มน�าเ

กลอป

ราศจ

ากเช

อ

2. ส

อดเข

าไป

ในรจ

มกลก

ประ

มาณ

2 c

m

3. ห

มน sw

ab ให

สมผ

สกบ

ผนงด

านใน

ของ

ร

จมก

จม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

1. ใช

ster

ile n

asop

hary

nx sw

ab ว

ดปลา

ย

sw

ab จ

ากรจ

มกถง

ควแล

วงอล

วดให

โคง

ห

รอห

กเป

นมม

90

องศา

2. ให

ผปวย

เงยห

นาป

ระมา

ณ 4

5 อง

ศา

ห

ายใจ

เขาล

กๆ แ

ละห

ายใจ

ออกจ

นส

ด

แ

ลวกล

นห

ายใจ

3. ส

อด sw

ab เข

าไป

ทาง

รจมก

จนส

ด

แ

ลวห

มนโด

ยรอบ

ประ

มาณ

3 ว

นาท

4. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

หรอ

ป

ายลง

บน

อาห

ารเพ

าะเล

ยงโด

ยตรง

1. ใช

ไมกด

ลนผป

วยไว

2. น

�า st

erile

swab

ปาย

บรเ

วณ to

nsil

ท

งสอง

ขางห

รอบ

รเวณ

ทมก

ารอก

เสบ

3. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

1. ก

ารเพ

าะห

าเชอ

จากร

จมกส

วนให

ญใช

ใน

ก

ารคน

หาผ

ทเป

นพ

าหะข

อง

S

taph

yloc

occu

s

1. ก

รณท

น�า

swab

เพาะ

เลยง

บน

อาห

ารเล

ยง

เช

อโดย

ตรง

ตองน

�าสงห

องป

ฏบตก

าร

ภ

ายใน

15

นาท

ทอณ

หภม

หอง

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Low

er

resp

irat

ory

trac

t

1. -

bron

choa

lveo

lar

lava

ge

-

bron

chia

l was

h

-

trach

eal a

spira

te

2. sp

utum

> 1

ml /

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

1. >

1 m

l /ภา

ชนะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

2. ส

�าหรบ

acid

fast

stai

n

ใช

ภาชน

ะสะอ

าดแห

ง

ม

ฝาป

ดสน

ท

แพท

ยเป

นผเ

กบ โด

ยใช

ster

ile te

chni

que

ใหผป

วยบ

วนป

ากห

ลายค

รงดว

ยน�าส

ะอาด

แลวไ

อลกๆ

ขาก

เสมห

ะใส

ภาชน

ะ

ปรา

ศจาก

เชอ

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

-ไมเ

กน 2

4 ชม

.

ท 4

°C

- ไมเ

กน 3

วน

ท 4

°C ส

�าหรบ

aci

d fa

st st

ain

1. เ

สม

หะท

ดคว

รม s

quam

ous

epith

elia

l

cells

เทาก

บห

รอน

อยกว

า 10

ตว/lo

w p

ower

field

2. ค

วรเก

บเส

มหะต

อนเช

าหลง

ตนน

อน

Eye

1. c

onju

nctiv

a

2. c

orne

a

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

-

ใช st

erile

swab

จมน

�าเกล

อหมา

ดๆ ป

ายท

conj

unct

iva

โดยห

มนไม

swab

ไปให

ทว

น�า

swab

จมล

งใน

Stu

art’s

med

ium

1. ใช

ster

ile sw

ab จ

มน�าเ

กลอห

มาดๆ

ปาย

ท

c

orne

a

2. น

�า sw

ab ป

ายลง

บน

CA

และ

BA

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

สงท

นท

ภายใ

น

15 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

-

ควรท

�าการ

ปาย

จากต

าทงส

องขา

ง ท

งขาง

ท

ปกต

และ

เปน

โรค

เพอใ

ชผลข

องกา

รเพ

าะเช

อ

จากข

างป

กตเป

น c

ontro

l (in

dige

nous

mic

roflo

ra)

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Ear

1. in

ner

2. o

uter

1. ภ

าชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

2. ภ

าชน

ะบรร

จ St

uart’

s

m

ediu

m

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1. ล

างชอ

งหให

สะอ

าด โด

ยใชส

บแล

ะน�า

2. ใช

เขมแ

ละ sy

ringe

ดดน

�าใน

ชองห

ออกม

า

ใส

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

3. ใน

กรณ

ท e

ar d

rum

แตก

ใหเก

บ โด

ยใช

s

teril

e sw

ab ป

ายน

�าใน

ชองห

จม

swab

ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

1. ใช

ster

ile sw

ab จ

มน�าเ

กลอห

มาดๆ

เช

ดรอบ

ๆ ชอ

งห เพ

อขจด

เศษ

cel

l

ต

างๆ

ออก

2. แ

ลวใช

swab

อน

ใหมป

าย โด

ยกดใ

หแร

ง

แ

ละห

มนให

ทวช

องห

(out

er c

anal

)

3. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

Fece

s

1. ≥

2 ก

รม/ภ

าชน

ะ

ป

ราศจ

ากเช

อ

2. ภ

าชน

ะบรร

จ

C

arry

Bla

ir m

ediu

m

ถายอ

จจาร

ะใส

ในภา

ชนะป

ราศจ

ากเช

อ

1. ถ

ายอจ

จาระ

ลงใน

ภาชน

ะทแห

งและ

สะอา

ด

ไม

ปน

เปอน

ปส

สาว

ะ

2. ใช

ster

ile sw

ab ป

ายอจ

จาระ

ทถา

ยออก

มา

โด

ยเลอ

กปาย

บรเ

วณท

มมกห

รอเล

อดป

น

จ

ม sw

ab ล

งใน

Car

ry B

lair

med

ium

ภายใ

น 1

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ช

ม.

ท 4

°C

ไมเก

น 4

8 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ควรใ

ชภาช

นะป

ากกว

าง

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

Rec

tal s

wab

ภาชน

ะบรร

จ

Car

ry B

lair

med

ium

1. ใช

ster

ile sw

ab ส

อดเข

าชอง

ทวา

รหน

ก

ให

ลกป

ระมา

ณ 1

-2 น

ว

2. ห

มน sw

ab 2

-3 ร

อบ

3. ด

งออก

จม sw

ab ล

งใน

Car

y B

lair

med

ium

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 4

8 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

Gen

ital t

ract

1. fe

mal

e

1

.1 v

agin

a

1

.2 u

reth

ra

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1. ท

�าควา

มสะอ

าดบ

รเวณ

รอบ

ๆ ชอ

งคลอ

ด

ด

วยน

�าเกล

อปรา

ศจาก

เชอ

2. เช

ดให

แหงด

วยส

�าล

3.ใช

ster

ile sw

ab ส

อดเข

าไป

ในชอ

งคลอ

ด

4. ป

าย se

cret

ion

หรอ

dis

char

ge

5. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

1. ท

�าควา

มสะอ

าดบ

รเวณ

รอบ

ๆ ur

ethr

a

2. น

วดรอ

บๆ

uret

hra

หวเ

หน

าไป

จนถง

ช

องคล

อด

3. ใช

ster

ile sw

ab ป

าย d

isch

arge

ทไห

ล

อ

อกมา

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

หำม

เกบ

ใน

ตเยน

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

หำม

เกบ

ใน

ตเยน

ในกร

ณท

ไมม

disc

harg

e ให

ปฏบ

ตดงน

1. ท

�าควา

มสะอ

าดรอ

บๆ

uret

hra

ดวยส

บ

แ

ละน

�าสะอ

าด

2. ใช

ster

ile sw

ab ส

อดเข

าไป

ใน u

reth

ra

ล

กประ

มาณ

2-4

cm

3. ห

มน sw

ab ป

ระมา

ณ 2

วน

าท

4. ด

งออก

แลวจ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

m

ediu

m

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

1

.3 c

ervi

x

1

.4 in

traut

erin

e

devi

ces

2. m

ale

2

.1 p

rost

ate

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

iu

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1. ใช

spec

ulum

ในกา

รตรว

จ ce

rvix

โดย

ไม

ใชส

ารลอ

ลน

2. ใช

ster

ile sw

ab เช

ดพวก

muc

us แ

ละ

se

cret

ion

บรเ

วณ c

ervi

x แล

วทงไ

ป

3. ใช

ster

ile sw

ab อ

นให

ม ป

ายบ

รเวณ

e

ndoc

ervi

cal c

anal

4. จ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

น�าอ

ปกร

ณท

งหมด

ใสลง

ในภา

ชนะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�าควา

มสะอ

าด p

rost

ate

glan

d โด

ยใชส

บ

แ

ละน

�า

2. น

วด p

rost

ate g

land

ไลไป

จนถง

ทวา

รหน

ก

3. ใช

ster

ile sw

ab ป

ายขอ

งเห

ลวท

ไหล

อ

อกมา

แลวจ

ม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

m

ediu

m

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น24

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

หำม

เกบ

ใน

ตเยน

-

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ถาเก

บป

สส

าวะ

โดยเ

กบท

นท

กอน

และห

ลง

นวด

pro

stat

e gl

and

จะให

ผลกา

รเพ

าะเช

อ

ทดก

วา

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

2

.2 u

reth

ra

3. fe

mal

e

o

r mal

e le

sion

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

ภาชน

ะบรร

จ St

uart’

s

med

ium

1. ร

นห

นงห

ม gl

and

peni

s

2. ท

�าควา

มสะอ

าดรอ

บๆ

ดวยส

บแล

ะน�า

แ

ลวเช

ดให

แหง

3. ใช

ster

ile sw

ab ข

นาด

เลก

หรอ

ใช

st

erile

loop

สอด

เขาไ

ปใน

ทอป

สส

าวะ

ห

มนเบ

าๆ แ

ละคา

ไวป

ระมา

ณ 2

วน

าท

4. น

�า sw

ab จ

มลงใ

น S

tuar

t’s m

ediu

m

1. ท

�าควา

มสะอ

าดแผ

ลโดย

ใช st

erile

salin

e

2. ใช

ใบมด

ปรา

ศจาก

เชอข

ดทผว

บน

ของแ

ผล

ท

งไป

3. ใช

ster

ile sw

ab ก

ดซบ

เอา e

xuda

tes ท

แผล

อ

อกมา

จม sw

ab ล

งใน

Stu

art’s

med

ium

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

หำม

เกบ

ใน

ตเยน

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

กรณ

ทใช

ster

ile lo

op ใ

ห st

reak

ลงบ

นอา

หาร

เลยง

เชอโ

ดยตร

งหรอ

จะป

ายลง

บน

slid

e

เพอท

�า sm

ear ก

ได

ตำรำ

งท 2

-3 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอ

Aer

obic

bac

teri

a (ต

อ)


ตำรำ

งท 2

-4 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอร

ำ

ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

ผวห

นง

แผน

slid

e ส

ะอาด

ปรา

ศจาก

ไขมน

1. ใช

70%

alco

hol เ

ชด le

sion

บรเ

วณท

สงส

ย

2. ใช

ใบมด

ขดผว

หน

งบรเ

วณขอ

บขอ

ง les

ion

ใส

บน

slid

e

3. ใช

ใบมด

เขยผ

วหน

งทขด

ไดให

มารว

มกน

ต

รงกล

าง sl

ide

4. น

�า sl

ide

อกแผ

นป

ดทบ

แลวใ

สซ

อง

ก

ระดา

ษห

รอซ

อง p

last

icห

รอห

อดวย

ก

ระดา

ษ

ภายใ

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

สป

ดาห

ทอณ

หภม

หอง

ส�าห

รบ

Der

mat

ophy

tes

และไ

มเกน

1 ส

ปดา

ห

ทอณ

หภม

หอง

ส�าห

รบ

Can

dida

ผมแผ

น sl

ide

สะอ

าด

ปรา

ศจาก

ไขมน

หรอ

Pet

ri-di

sh

1. ด

งผมจ

ากบ

รเวณ

ศรษ

ะรอบ

ๆ le

sion

ใส

ลงบ

น sl

ide

หรอ

Pet

ri-di

sh

2. น

�า sl

ide

อกแผ

นป

ดทบ

แลวใ

สซ

อง

ก

ระดา

ษห

รอซ

อง p

last

ic ห

รอห

อดวย

ก

ระดา

ษ

ภายใ

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

สป

ดาห

ทอณ

หภม

หอง


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

เลบ

แผน

slid

e ส

ะอาด

ปรา

ศจาก

ไขมน

1. ข

ดบรเ

วณรอ

ยตอร

ะหวา

งเลบ

สวน

ทดก

บ

ส

วนท

เสย

ใส sl

ide

2. ใช

ใบมด

เขยเ

ลบท

ขดได

ใหมา

รวมก

น

ต

รงกล

าง sl

ide

3. น

�า sl

ide

อกแผ

นป

ดทบ

แลวใ

สซ

อง

กระ

ดาษ

หรอ

ซอง

pla

stic

หรอ

หอด

วย

กระ

ดาษ

ภายใ

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 1

สปด

าห

ทอณ

หภม

หอง

corn

ea-

1. ใช

ster

ile sw

ab จ

มน�าเ

กลอห

มาดๆ

ป

ายท

cor

nea

2. น

�า sw

ab ป

ายลง

บน

myc

obio

tic a

gar

สงท

นท

ภายใ

น

15 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

-ถา

ตองก

ารท

�า K

OH

pre

para

tion

ดวย

ใหท

�า sw

ab อ

กอน

และ

ปาย

swab

ลงบ

น sl

ide

CSF

1 m

l/ภาช

นะป

ราศจ

าก

เชอ

เกบ

โดยใ

ช st

erile

tech

niqu

e ส

งทน

ทภา

ยใน

15 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

-

vagi

nal

secr

etio

n

1 m

l/ภาช

นะส

ะอาด

ทม

น�าเ

กลอ

swab

จาก

vag

ina

ใสลง

ในน

�าเกล

อส

งทน

ทภา

ยใน

15 น

าท

ทอณ

หภม

หอง

-1.

ใชตร

วจห

าเชอ

รา โด

ยท�า s

alin

e wet

mou

nt

2. ก

รณท

ตองก

ารเพ

าะห

าเชอ

ราให

ท�า

swab

อก

1 ว

น ป

ายลง

บน

อาห

ารเล

ยงเช

อรา

โด

ยตรง

ตำรำ

งท 2

-4 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอร

ำ (ต

อ)


ชนดส

งสงต

รวจ/

ต�ำแห

นงท

เกบ

ปรม

ำณ/ภ

ำชน

ะบรร

จวธ

เกบ

เวลำ

และอ

ณห

ภมขอ

งขอ

แนะน

�ำหรอ

ขอคว

รระว

ง

กำรน

�ำสง

กำรเ

กบรก

ษำ

tissu

e≥

1 cu

mm

/ภาช

นะ

ปรา

ศจาก

เชอ

1. ท

�า bi

opsy

โดยต

ดชน

เนอม

าประ

มาณ

อ

ยางน

อย 1

cum

m

2. ใส

ในภา

ชนะป

ราศจ

ากเช

อ

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 8

ชม.

ท 4

°C

ควรห

ยด st

erile

salin

e ลง

ไป เพ

อปอง

กน

ชนเน

อแห

ง

urin

e10

–15

ml/ภ

าชน

ะ

ปรา

ศจาก

เชอ

เกบ

โดยใ

ชวธส

วนใส

ภาชน

ะปรา

ศจาก

เชอ

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ท 4

°C

bloo

d5-

10 m

l/ ขว

ด

hem

ocul

ture

ส�าห

รบเพ

าะเช

อรา

เหมอ

นกบ

การเ

จาะเ

กบ เพ

อเพ

าะเช

อ

แบคท

เรย

ภายใ

น 2

ชม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

bone

mar

row

ขวด

hem

ocul

ture

ส�าห

รบเพ

าะเช

อรา

แพท

ยเป

นผเ

จาะ

โดยใ

ช st

erile

tech

niqu

eภา

ยใน

2 ช

ม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ควรท

�า sm

ear ด

วยถา

ตองก

ารตร

วจห

า

hist

opla

sma

หรอ

Pen

icill

ium

mar

neff

ei

body

flui

ds

- ple

ural

, syn

ovia

l

- asc

itis ,

bile

- per

icar

dial

10-1

5 m

l/ภาช

นะ

ปรา

ศจาก

เชอ

แพท

ยเป

นผเ

จาะ

โดยใ

ช st

erile

tech

niqu

eภา

ยใน

2 ช

ม.

ทอณ

หภม

หอง

ไมเก

น 2

4 ชม

.

ทอณ

หภม

หอง

ตำรำ

งท 2

-4 ก

ำรเก

บสง

สงตร

วจเพ

อวน

จฉยโ

รคตด

เชอร

ำ (ต

อ)


เอกสารอางอง 1. Baron EJ, Thomson RB. Specimen Collection, Transport , and Processing : Bacteriology. In:

Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical

Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.228-271.

2. Linscott AJ. Specimen Collection, Transport, and Acceptability. In : Garcia LS. Clinical

Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM Press; 2010. P 2.1.1-2.1.26.

3. Miller JM, Holms HT. Specimen Collection, Transport and Storage. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,

Tenover FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 6th ed. Washington, DC: ASM Press;

1995. p. 33-63.

4. NCCLS. Quality control of Microbiological transports Systems; Approved standard. NCCLS

document M40-A. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayene, Pennsylvania 19087-1898,

USA 2003.

5. สรางค เดชศรเลศ, สวรรณา ตระกลสมบรณ, กาญจนา คชนทร. แนวปฏบตการเจาะเลอดเพอเพาะเชอ

และการเพาะเชอกอโรคจากเลอด. กรงเทพฯ: โรงพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย; 2553.หนา 1-10.

บทท3

การวนจฉยโรคตดเชอจากสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศน


การวนจฉยโรคตดเชอจากสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศน


ณฏฐวรรณ ปนวน

หลกการ การตรวจสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศนเปนวธการวนจฉยโรคตดเชออยางรวดเรว จดเปน point of care test

การตรวจทางกลองจลทรรศนอาจดสดหรอท�าการยอมสตางๆ ตามความเหมาะสม เชน ยอมแกรม เพอวนจฉยโรค

ตดเชอแบคทเรย ยอม acid fast bacilli (AFB) เพอวนจฉยการตดเชอมยโคแบคทเรย ยอม modified acid fast bacilli

เพอวนจฉยการตดเชอ Nocardia กบ Rodococcus การใช india ink เพอด yeast cells ทม capsule หนาๆ และการ

ใช KOH ชวยยอย keratin จะชวยใหเหนเสนใยเชอราไดชดขน

การยอมแกรมเมอยอมแบคทเรยดวย crystal violet สจะซมเขาภายในเซลลของแบคทเรยและเมอยอมทบดวย

gram iodine ซงจะซมเขาภายในเซลลของแบคทเรยเชนกน ส crystal violet และ iodine จะรวมกนเปน crystal

iodine complex ซงมโมเลกลทใหญขนจงไมสามารถหลดออกจากเซลลไดเมอลางน�า แตเมอลางดวย alcohol/acetone

ซงเปนสารทละลายไขมนไดจงไปลางไขมนทผนงเซลลของแบคทเรย แบคทเรยทมไขมนทผนงเซลลมากจะเกด

รขนาดใหญทผนงเซลลท�าให crystal iodine complex หลดออกจากเซลลแบคทเรยได จงยอมตดส safranin เปน

สแดงเรยกแบคทเรยแกรมลบ แบคทเรยทมไขมนทผนงเซลลนอยกวาขนาดของรทเกดขน เมอลางดวย alcohol/

acetone ในลกษณะเดยวกนจะมขนาดเลกกวา crystal iodine complex จงไมหลดออกจากเซลลและไมตดส safranin

จงยอมตดสมวงเรยกแบคทเรยแกรมบวก การตดสแกรมจะผดพลาดไดถาลางดวย alcohol/acetone มากหรอนอย

เกนไป

การยอมแกรมเปนวธการทใชแยกแบคทเรยทางหองปฏบตการจลชววทยา โดยอาศยรปราง ขนาด ลกษณะเซลล

และการตดสแกรม ใชในการวนจฉยสาเหตการตดเชอเบองตนอยางรวดเรวและชวยในการประเมนคณภาพของสง

สงตรวจ การยอมแกรมเปนวธท Christian Gram เปนผคดขนในป ค.ศ. 1884 วธทใชในปจจบนเปนวธท Hucker

ไดปรบปรงจากวธเดมใหน�ายามความคงทมากขนและแยกเชอไดดกวาเดม (ป ค.ศ. 1921) นอกจากนยงมวธทพฒนา

ใหเหมาะสมกบการยอมแบคทเรยชนดตางๆ เชน anaerobic bacteria เชอ Legionella spp., Campylobacter spp.,

Brucella spp. เปนตน การแปลผลการยอมแกรมตองค�านงถงการตดส ขนาด รปรางของเซลลและการเรยงตว ปจจย

ทมผลตอคณสมบตเหลาน ไดแก อาหารเลยงเชอ การอบเชอ วธการยอมส และสารยบยงเชอทมในการแปลผลการ

ยอมแกรมจากสงสงตรวจ นอกจากจะใชคณสมบตดงกลาวมาใชในการแปลผลยงตองน�าการตรวจพบเซลลชนด

ตางๆของรางกายมาพจารณาประกอบดวย

AFB stain เชอมยโคแบคทเรยทนตอการลางดวยสารละลายกรด + แอลกอฮอลล เมอยอมดวย carbol

fuchsin เนองจากมสวนประกอบไขมน (mycolic acid) ทผนงเซลลมาก การยอมส acid fast เปนวธการตรวจหา

มยโคแบคทเรยทเรวทสด สามารถใชในการดผลการรกษาผปวย โดยเจอจาง sediments ททดสอบความไวและยอม

หาเชอทตดส acid fast ใน culture วธ acid fast ทใชกวางขวางทสด คอวธของ Kinyoun และ fluorochrome วธ

fluorochrome เปนวธทแนะน�าใหใชตรวจในสงสงตรวจ เพราะมความไวสงและท�าไดรวดเรว เพราะสามารถตรวจ

ดดวยก�าลงขยายต�า เมอไดผลบวกจงท�าการตรวจยนยนดวยวธ Kinyoun ในการยอม AFB ตองใชสไลดใหมและ

สะอาดเสมอ


ภำพท 3-1 กำรยอมส acid-fast ในกำรตรวจหำมยโคแบคทเรย

Modified acid fast stain เปนเทคนคทใชตรวจหาเชอ partially acid fast เชน Nocardia, Rhodococcus เปนตน

โดยเปลยนสลางจากกรด HCl ในแอลกอฮอลเปน H2SO

4 ในแอลกอฮอลล

India Ink จะไมถก absorbed โดยเซลลหรอแคปซลของยสต เมอน�ายสตทมแคปซลมาผสมกบ india ink จะ

เหนแคปซลเปนสใสวาว ๆ รอบเซลลของยสต และมพนหลงสด�าของ india ink ส�าหรบยสตทมแคปซลทพบใน

สงสงตรวจสวนใหญเปน Cryptococcus neoformans จงใชวธนในการวนจฉยผปวยตดเชอ C. neoformans ในระบบ

ประสาทสวนกลาง

การตรวจทางกลองจลทรรศน โดยไมค�านงถงวาจะใชสยอมใด โดยทวไปมวตถประสงคของการท�า คอ เพอตรวจ

คณภาพของสงสงตรวจ ชวยในการวนจฉยโรคตดเชอ เปนแนวทางส�าหรบแปลผลการเพาะเชอ เพอเปนตวบงชวา

ควรท�าการทดสอบใดเพมเตม และใชเปนตวควบคมคณภาพการเพาะเชอ


การวนจฉยโรคตดเชอโดยการตรวจสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศน เปนการด�าเนนการในขนแรกเพอวนจฉยโรคตดเชอนบวาเปนสงส�าคญมาก โดยเฉพาะอยางยงโรคตดเชอรา เชอ

เจรญเตบโตชาบนอาหารเพาะเลยงเชอ ควรรายงานผลเบองตนใหแพทยทราบกอน แพทยอาจจะใชขอมลในขน

ตอนนเตรยมท�าการรกษาผปวยได การวนจฉยโรคตดเชอราจากสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศน ไดแก การตรวจ

สดในสารละลาย 10-30% potassium hydroxide (KOH) การตรวจสดในอนเดยองค (India ink preparation) การ

ยอมสแกรม การยอมส modified acid-fast และวธยอมสพเศษตางๆ

วธการทใชวนจฉยโรคตดเชอราจากสงสงตรวจดวยกลองจลทรรศนขนกบชนดของสงสงตรวจและชนดของ

โรคทสงสย สงสงตรวจสวนมากจะท�าการตรวจสดในสารละลาย potassium hydroxide สงสงตรวจทเหมาะสม

กบการตรวจวธน ไดแก ผวหนง ผม เลบ และมวคสเมมเบรนทสงสยโรคเกลอน (tinea versicolor) โรคกลาก

(dermatophytosis) และ candidiasis นอกจากนยงเหมาะสมกบการตรวจหา dematiaceous fungi ในสะเกดแผล

แหงทผวหนงทสงสยโรคตดเชอราทมสาเหตจากราด�า (chromomycosis) สารละลายผสม potassium hydroxide

และ dimethyl sulfoxide เหมาะกบการตรวจสด สงสงตรวจเลบ สงสงตรวจหนองจากแผลหรอชนเนอจากแผลท

สงสยโรค eumycotic mycetoma สารละลายผสมนจะยอย keratin ไดด ไมตองลนไฟน�าไปดใตกลองจลทรรศนได

ทนท

การวนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยโดยการยอมแกรมสงสงตรวจผปวย สงสงตรวจผปวยทเกบมาใหมๆ จะไดผลถกตองทสด

วธปฏบตงำน

1. สยอม Hucker’s modification

1.1 stock crystal violet ประกอบดวย

crystal violet 20 g

ethanol 95% 200 ml

1.2 stock oxalate solution ประกอบดวย

ammonium oxalate 8 g

น�ากลน 800 ml

ผสมสารละลาย 1.1 และ 1.2 เขาดวยกน ตงไวอยางนอย 24 ชวโมง กอนกรองและน�าไปใชเปน working solution

1.3 Gram iodine solution ประกอบดวย

iodine crystals 1 g

potassium iodide 2 ml


บด iodine และ potassium iodide ในโกรง เตมน�า 2-3 ml บดจนละลายหมดแลว เตมน�ากลนจนครบ 240 ml

แลวเตม sodium bicarbonate 5% aqueous solution 60 ml (sodium bicarbonate 3 g ในน�ากลน 60 ml) ผสมให

เขากน และเกบในขวดสน�าตาล

ขอควรระวง iodine เปนสารกดกรอน (corrosive) จงตองระวงไมหายใจเขาไป หามรบประทานหรอถก

กบผวหนง


1.4 Decolorizer ทลางไดชา คอ ethanol 95% ทลางไดปานกลาง คอสารผสมของ acetone-alcohol

(ethanol 95% : reagent grade acetone = 1:1) สารทลางไดเรวทสดคอ acetone (reagent grade)

ขอควรระวง ethanol และ acetone เปนสารไวไฟ

decolorizer ทใชในการยอมแกรมแบบรวดเรวคอ (acetone-iodine solution) ประกอบดวย

strong iodine solution :

iodine 10 g

potassium iodide 6 g


บด iodine, potassium iodide ในน�ากลนใหละลายแลวเตม 10% ethanol ใหครบ 100 ml ผสมใหเขากน

working solution:

strong iodine solution 3.5 ml

acetone 96.5 ml

1.5 counterstain ประกอบดวย

stock solution:

safranin O 2.5 ml

ethanal 95% 100 ml

working solution:

stock solution 10 ml


2. กำรเตรยมตวอยำง

การ smear ทดควรไดเปนชนเดยว (monolayer) ของเชอและเซลล มการกระจายสม�าเสมอและสามารถ

ดลกษณะการเรยงตวของเชอไดชดเจน ควรใชสไลดทสะอาด ปราศจากไข การยอมจากสงสงตรวจทตองท�าการ

เพาะเชอดวย ถาใชไปเปตหรอไมพนส�าล (swab) อนเดยวกน ตองท�าการเพาะเชอกอนเสมอ การท�า smear สงสง

ตรวจผปวยตองสวมถงมอและเครองปองกนอนทเหมาะสม ตามหลกของ universal precaution

2.1 สงสงตรวจทเปน swab ควรแยก swab ส�าหรบเพาะเชอและยอมแกรม ใหหมน swab ไปตามยาว

ของสไลด ไมตองกดแรงๆ เพราะจะท�าใหเซลลแตกและการเรยงตวของเชอเสยไป ในกรณทได

รบ swab เพยงอนเดยว ใหใส swab ในน�าเกลอปราศจากเชอเลกนอย แลวน�าไป vortex บด

swab กบฝาผนงดานในหลอด และน�าไป smear บนสไลด ปลอยใหแหงในอากาศ สวนทเหลอ

ในหลอดใชในการเพาะเชอ

2.2 สงสงตรวจทไมไดรบเปน swab เชน หนอง เสมหะ อจจาระ ถาเปนหนองทเจาะใส syringe มา

ใหถายหนองทงหมดลงในหลอดปราศจากเชอ vortex สงสงตรวจใหเชอกระจายสม�าเสมอ

ไมรบสงสงตรวจทอยใน syringe ทมเขมตดมาดวย ควรใหปลดเขมออกจาก syringe กอนสง

สงสงตรวจ ใช swab ไปเปตหรอ loop ปราศจากเชอเขยสวนของสงสงตรวจทมหนองหรอเลอด

ถาสงสงตรวจเหนยวมากอาจหยดน�าเกลอปราศจากเชอ 1 หยดบนสไลดเพอเจอจางจะท�าให

smear ไดงายขน เกลยสงสงตรวจใหกระจายเปนฟลมบางๆ ปลอยใหแหงในอากาศ


2.3 น�าไขสนหลง และสงคดหลงอนๆ การใชเครอง cytospin slide centrifuge จะชวย concentrate

สงคดหลงท smear ซงจะชวยเพมความไวของการยอมแกรมและลดเวลาทใชในการปนใหหา

บรเวณทมสงสงตรวจไดงายขน ในกรณทไมไดใชเครอง cytospin slide centrifuge ใหปนน�า

ไขสนหลง/สงคดหลงดวย centrifuge ใชไปเปตปราศจากเชอดดสวนขางบนออกใหเหลอ

ประมาณ 0.5 ml vortex เพอใหตะกอนแตกออก จากนนใชไปเปตปราศจากเชอดดมาหยดบน

สไลด สะอาดปราศจากไข 1 หยด ไมตองเกลยสงสงตรวจใหกระจาย ปลอยใหแหงในอากาศ

ภำพท 3-2 เครอง cytospin slide centrifuge

2.4 ปสสาวะทจะยอมแกรมหามปน เขยาขวดใหปสสาวะกบตระกอนเขากนด ใชไปเปตปราศจาก

เชอดดปสสาวะมาหยดลงบนสไลดสะอาดปราศจากไข ไมตองเกลยใหกระจาย ปลอยใหแหง

ในอากาศ

2.5 สงสงตรวจทแหงหรอสงสงตรวจทมขนาดเลกมาก ใหละลายสงสงตรวจในน�าเกลอปราศจาก

เชอ 0.5 ml ใชไปเปตปราศจากเชอดดมาหยดบนสไลดสะอาดปราศจากไข 1 หยด ใชปลาย

ไปเปตเกลยสงสงตรวจใหกระจายเปนฟลมบางๆ ปลอยใหแหงในอากาศ

2.6 ชนเนอ (biopsy) อาจท�าแบบ touch หรอ ground specimen preparation กได โดยใชกรรไกร

หรอใบมดทปราศจากเชอตดชนเนอใหเปนชนเลกๆ ใช forceps หยบชนเนอมากดบนสไลด

สะอาดปราศจากไข ใหท�าหลายๆ ครง โดยใหอยใกลๆ กน เพอจะไดอานสไลดไดงาย หรอบดชน

เนอใหละเอยด ใชไปเปตปราศจากเชอดดมาหยดบนสไลดสะอาดปราศจากไข 1 หยด ใชปลาย

ไปเปตเกลยสงสงตรวจใหกระจายเปนฟลมบางๆ มเสนผานศนยกลางประมาณ 1 cm ปลอยให

แหงในอากาศ


3. กำร fix smear (อาจใชความรอนหรอ methanol กได)

3.1 การใชความรอน น�าสไลดมาวางบน electric slide warmer 60 °C จนแหงหรอผานสไลดท

แหงในเปลวไฟ 2-3 ครง หรอเอาสไลดมาองไวหนาเครองเผา loop 5 วนาท อยาใชความรอนมาก

ไปหรอ fix สไลดขณะทยงไมแหง และปลอยใหสไลดเยนกอนน�าไปยอมส

3.2 การใช methanol จะชวยปองกนไมใหเมดเลอดแดงและเซลลอนๆ ของรางกายแตก และ

ท�าใหมพนหลง (background) ทดสะอาด การ fix ดวย methanol เปนวธทใชไดดกบสงสงตรวจ

ผปวย โดยเฉพาะปสสาวะเพราะจะชวยปองกนไมใหหลด วธท�าปลอยใหสไลดท smear แหงใน

อากาศ แลวหยด methanol 2-3 หยดบนสไลด ปลอยไวนาน 1 นาท เท methanol ออก โดย

ไมตองลางน�า ปลอยใหสไลดแหง ไมตองใชความรอน

4. วธกำรยอมส

4.1 หยด working crystal violet solution ลงบนสไลดทงไวประมาณ 1 นาท แลวลางน�าสะอาด

4.2 หยด Gram iodine บน slide ทงไวประมาณ 1 นาท แลวลางน�าสะอาด

4.3 Decolorize ดวย acetone iodine แลวลางน�าสะอาดทนท

4.4 ยอมทบดวย Safranin 30 วนาท ลางน�าสะอาดแลวผงใหแหง น�าไปดดวยกลองจลทรรศน โดย

ตรวจดวยก�าลงขยาย 10 x 10 เทา แลวดรายละเอยดดวยก�าลงขยาย 10 x 100 เทา

การรายงานผลและแปลผลการยอมแกรมสงสงตรวจตางๆ 1. ผลและการแปลผล ใหดคณภาพทวๆ ไปกอนดวยก�าลงขยาย 10 x 10 เทา โดยดวา decolorized ดหรอไม ถา

ยอมไดดพนหลงตองสะอาด ถามเมดเลอดขาวตองยอมตดสแกรมลบ ระวงไมอานตะกอนสเปนเชอแบคทเรย ด

ความหนาของ smear วาเซลลไมทบซอนกนและจะไมท�าใหแปลผลผด

2. การตรวจดดวยก�าลงขยาย 10 x 10 เพอดวามการอกเสบหรอไม โดยด

- จ�านวนของ PMNs, mononuclear cells

- จ�านวนของ squamous epithelial cells แบคทเรยทเปนเชอประจ�าถน

- ต�าแหนงและการเรยงตวของแบคทเรย

3. ตรวจดวยก�าลงขยาย 10 x 100 เทา โดยดหลายๆ พนท เพอดวามเชอหรอไม

- ถาไมเหนเชอใหรายงานวา “No organism seen”

- ถาพบเชอใหรายงานคราวๆ และบอกลกษณะของเชอทพบ ในกรณทแบคทเรยตดสมวง อานผลเปน

แกรมบวก ในกรณทแบคทเรยตดสแดง อานผลเปนแกรมลบ บอกรปรางลกษณะ เชน cocci, bacilli

หรอ coccobacilli และการเรยงตว เชน เปน chain หรอ clusters เปนตน

4. ดรปรางของแบคทเรยทพบเปนสวนใหญ

- รปรางโดยรวมเปน coccus, coccoid, coccobacilli, bacilli, fragment, yeast-like

- ลกษณะปลายเซลล กลม แบน ปองออก เวาเขา การบวมออกขางๆ แสดงวาอาจมสปอร แตอาจเกด

จาก vacuole กได มรปรางไมแนนอน หรอตดสไมแนนอน เปนตน

- ลกษณะดานขาง เปนลกษณะขนาน ทรงร เวา หรอไมแนนอน


- รปรางไมแนนอน pleomorphism ซงอาจใชค�าวา diphtheroid หรอ coryneform ในการบรรยายลกษณะ

ของแบคทเรยแกรมบวก รปแทงทมรปรางไมแนนอน หรอตดสไมสม�าเสมอ เรยงตวเปนซรวหรอเปน

มม (V และ L shape)

5. การรายงานผล ควรรายงานใหผทอานรายงานเกดความสนใจ หรอถาผลทไดมความส�าคญควรรายงานให

แพทยทราบทางโทรศพท

- การรายงานผลจากสงสงตรวจผปวย ปสสาวะใหตรวจอยางนอย 20 fields ใหรายงานผลวาพบเชอเมอ

เหนเชอเฉลย 1 เซลลหรอมากกวา per oil immersion field ซงแสดงวามเชอ > 105 CFU/ml

- รายงานจ�านวนเชอทพบคราวๆ โดยรายงานเปนตวเลข (numerical) หรอบรรยายวามากนอย

(descriptive) กไดโดยใชเกณฑดงน

5.1 การรายงานเปนตวเลข

1+ (<1 per oil immersion field)

2+ (1 per oil immersion field)

3+ (2 ถง 10 per oil immersion field)

4+ (predominant หรอ >10 per oil immersion field)

5.2 การบรรยายวามากหรอนอย

rare (< 1 per oil immersion field)

few (1 ถง 5 per oil immersion field)

moderate (5 ถง 10 per oil immersion field)

many (>10 per oil immersion field)

6. การตรวจสอบการยอมแกรม หลงจากรายงานผลแลวใหเกบสไลดไวนานพอทจะน�ากลบมาดใหมได โดย

เฉพาะอยางยงในกรณทผลการเพาะเชอหรอผลการทดสอบอนๆ ไมไปดวยกน การเกบสไลดใหท�าดงน

- ซบ oil ออก ในกรณทตองการเกบเปนสไลดทใชในการสอน อาจใช xylene ลาง oil ออก และปดสไลด

ดวย permount และ cover slip เพอปองกนไมใหสซด สไลดทไมใชแลว ใหทงเปนมลฝอยตดเชอและมคม

- ถาเหนวาควรจะท�าการยอมสอน เมอดผลการยอมแกรมแลวแตไมมสงสงตรวจทจะน�ามายอมได อาจ

ท�าการยอมสไลดทท�าการยอมแกรมแลวนได โดยลาง oil ออกดวย xylene ลางสไลดดวย acetone-alcohol

จนไมมส แลวด�าเนนการยอมสใหม

การควบคมคณภาพ 1. ตรวจดสทใชยอมทกวนวาไมมตะกอนส ถามควรกรองกอนใช การระเหยจะมผลตอคณภาพของสทใชจงไม

ควรเทสใสขวดครงละมากๆ

2. ท�าการยอมเชอทใชควบคมคณภาพ คอ Escherichia coli ATCC 25922 และ Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228 หรอ Staphylococcus aureus ATCC 25923 ทกวนและทกครงทเปลยนสใหม ผลทควรไดคอ

Escherichia coli เปนแกรมลบรปแทง

Staphylococcus epidermidis เปนแกรมบวกรปกลม

Staphylococcus aureus เปนแกรมบวกรปกลม


หรออาจใชสงทขดมาจากซอกฟนมายอม เพอควบคมคณภาพกได เพราะจะไดทงแบคทเรยแกรมลบและ

แกรมบวก

3. ปจจยทท�าใหผลการยอมแกรมไมด

ก. ใชสไลดทไมไดท�าความสะอาดกอน การแชสไลดใน 95% ethanol จะท�าใหสไลดสะอาดปราศจากไข

เวลาใชใหหยบสไลดมาเชดหรอลนไฟกอน

ข. smear หนาเกนไป

ค. ใชความรอนมากไปขณะท fix สไลด

ง. ลางน�ามากเกนไปขณะทยอมส

จ. เพอควบคมคณภาพของการยอมแกรมจงควรมระบบการตรวจสอบการรายงานผลการยอมแกรม โดย

หวหนาหองปฏบตการท�าการสมสไลดทรายงานแลวมาตรวจซ�า หรอเปรยบเทยบผลการเพาะเชอกบผล

การยอมแกรมทรายงานวามความขดแยงกนหรอไม และควรจดเกบตวอยางสไลดทสวยๆ ไวเพอใชใน

การสอน

Escherichia coli

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aureus

ภำพท 3-3 ลกษณะกำรตดสและกำรเรยงตวของเชอทใชควบคมคณภำพกำรยอมแกรม


ตำรำงท 3-1 ลกษณะของเชอทพบในสงสงตรวจตำงๆ และกำรรำยงำนผล

ก. แบคทเรยแกรมบวกทพบในสงสงตรวจผปวย

เชอ กำรรำยงำนผล สงสงตรวจ ขอเสนอแนะ

Actinomyces spp. Thin, beaded, branched

gram-positive filaments;

may be within sulfur

granules with peripheral

clubs

Cervicofacial ทรวงอก

ชองทอง องเชงกราน

น�าจากปอดหรอน�าลาง

ปอด

ถาม sulfur granules ลาง

และบดบนสไลดและยอม

modified AFB stain

Nocardia spp. Long, thin, branching,

beaded, gram-positive or

irregularly staining bacilli

เสมหะ น�าลางปอด ชนเนอ

หนอง เลอด น�าไขสนหลง

ยอม modified AFB stain

การเพาะเชอท 45 °C จะ

ชวยใหเชอเจรญไดเรวขน

Mycobacterium spp. Gram-positive beaded or

gram-neutral bacilli; found

inside macrophage; bacilli

may be short to long,

banded or beaded, and/or

slightly curved; some

species appear

pleomorphic and coccoid

ทางเดนหายใจ ปสสาวะ

ชนเนอ น�าไขสนหลง

ยอม AFB stain

Corynebacterium spp.

C. jeikeium

Gram-positive

pleomorphic, club-shaped,

irregularly staining bacilli

or coccobacilli with

palisading and/or angular

arrangements

Small coccobacilli

resembling streptococci

เลอด ชนเนอ แผลทผวหนง

indwelling catheters

ลนหวใจเทยม

ทางเดนหายใจสวนบนและ

สวนลาง

หากสงสยวาตดเชอ

C. diphtheriae ในการเพาะ

เชอใหเพมอาหารพเศษ

Propionibacterium spp. Gram-positive, very

pleomorphic “diphtheroid”

forms that may branch

เลอด น�าไขสนหลง แผล

จากผวหนง สงคดหลง

อนๆ

การหา propionic acid โดย

GLC มกพบเปนเชอปน

เปอนจากผวหนงในขณะ

เกบสงสงตรวจ



Listeria

monocytogenes

Gram-positive small to

medium coccobacilli that

may be pleomorphic;

occur in short chains or

palisades; อาจสบสนกบ

เชอ Corynebacterium หรอ

enterococci

น�าไขสนหลง เลอด น�าคร�า

รกหรอชนเนอจาก fetal

ด wet mount จากสงสง

ตรวจโดยตรง เพอด

tumbling motility; ถามเชอ

หลายชนดปนกน การใชวธ

cold enrichment อาจชวย

ใหแยกเชอนได

Erysipelothrix

rhusiopathiae

ในชนเนอรายงานเปน long, slender, gram-positive bacilli ในเลอดรายงานเปน small “coryneforms”

ชนเนอจากผวหนง

เลอด

เกยวของกบอาชพทสมผส

สตว

Lactobacillus spp. Medium, straight, uniform gram-positive bacilli with rounded ends; may form chains or spirals; sometimes short and coccobacillary

มกพบเปน mixed infection

ไมคอยพบจากเลอดหรอน�า

ไขสนหลง

การเพาะเชอในสภาวะไร

ออกซเจนจะชวยใหเชอ

เจรญไดดยงขน

Bacillus spp. Medium to large square-ended gram-positive bacilli with parallel sides with or without spores; some species have spores that swell sides; may stain gram variable or gram negative with age

อาจพบในสงสงตรวจหลาย

ชนด ในผปวยทมภมคมกน

บกพรอง หรอผทฉดยาเสพ

ตด และพบเปนสาเหตการ

ตดเชอทตา

มกพบปนเปอนในการเพาะ

เชอ อาจพบเปนสาเหตการ

ตดเชอทตา

Clostridium

perfringens

Gram-positive large

“boxcars” with no spore;

may stain gram-negative

เลอด แผล หนองจากชอง

ทอง

ท�าการเพาะเชอบน EY

และอบในภาวะทไร O2

การไมพบ PMNs อาจใช

เปนเครองบงชวาเปน

clostridial myonecrosis;

เปนเชอประจ�าถนในล�าไส

ก. แบคทเรยแกรมบวกทพบในสงสงตรวจผปวย (ตอ)



Clostridium spp. Gram-positive, gram-

variable, or gram-negative

bacilli, with or without

spores; bacilli may be

large, slender and short, or

long; sometimes form

coils; often small than

Bacillus spp.

เลอด แผลในชองทอง ฝ เปนเชอประจ�าถนของทาง

เดนอาหารและระบบ

สบพนธ

Streptococcus

pneumoniae

Gram-positive cocci in

pairs, lancet shapes, short

chains

ทางเดนหายใจสวนลาง

เลอด น�าไขสนหลง

สารคดหลงอนๆ

อาจใช Quelling test หรอ

การตรวจหา antigen ใน

สงสงตรวจบางชนด

Enterococcus spp. Gram-positive cocci in

pairs, short chains; อาจม

ลกษณะทคลายกบ

S. pneumoniae

ปสสาวะ แผลตดเชอ

เลอด ฝในชองทอง

เชอประจ�าถนของทางเดน

อาหาร พบเปนสาเหตการ

ตดเชอในผปวยทไดรบการ

รกษาดวย expanded-

spectrum cephalosporins

Streptococcus

viridans

Gram-positive cocci in

pairs tetrads, clusters

เลอด น�าไขสนหลง อาจแยกไดยากกบ

Corynebacterium และ

lactobacilli อาจใช antigen

detection ส�าหรบ

Streptococcus group A

และ B การพบ S. bovis ใน

เลอด มความสมพนธกบ

มะเรงของ colon (ล�าไส)

การเพาะเชอ nutritionally

variant streptococci อาจ

เพาะบน blood agar และท�า

cross streak ดวย S. aureus




Staphylococcus spp. Gram-positive cocci in

pairs, tetrads, clusters

ฝ แผลตดเชอ ทางเดน

หายใจ ชนเนอ สารคดหลง

ตางๆ indwelling catheters

เชอประจ�าถนของผวหนง

และโพรงจมก

Stomatococcus

mucilaginosus

large gram-positive cocci

in pairs, tetrad

เลอด (ผปวยภมคมกน

บกพรอง) peritoneal

dialysates

เชอประจ�าถนในชองปาก

ข. แบคทเรยแกรมลบทพบในสงสงตรวจผปวย


Enterobacteriaceae Straight thick baclli; short

to medium length with

rounded ends; antimicrobial

-agent-affected

microorganisms may be

pleomorphic, filamentous,

and/or irregular staining

ทางเดนปสสาวะ

แหลงอนๆ

เชอทเปนสาเหตของการ

ตดเชอในโรงพยาบาลมก

ดอสารตานจลชพหลาย

ชนด

Haemophilus spp.,

Pasteurella spp.,

fastidious gram-neg-

ative bacilli

Small coccoid to bacillary

forms; pleomorphic; often

with filamentous forms

อาจตดสซด

เลอด น�าไขสนหลง


ฝ แผลตดเชอ ตา

ระบบสบพนธ

อาจใชวธ direct antigen

detection เพอหา

Haemophilus type b จาก

สงสงตรวจผปวยโดยตรง

Legionella spp. pleomorphic slender

bacilli of variable lengths

that may stain pale ในสง

สงตรวจผปวยเชออาจยอม

สไมตด

ทางเดนหายใจสวนลาง ในการเพาะเชอตองใช

อาหารพเศษ การยอมจาก

สงสงตรวจทมเชอหลาย

ชนดอาจใช Gimenez stain

จะพบเชอไดดขน

Vibrio spp. Slightly curved to straight

bacilli

อจจาระ แผลตดเชอ ถามเชอหลายชนดปนกน

การใชอาหารเลยงเชอ เชน

TCBS จะแยกเชอไดดขน




Pseudomonas spp. Thin bacilli; medium

length to long with

rounded to pointy ends;

often in pairs; antimicrobial

-agent-affected

microorganisms may

appear filamentous, coiled,

and/or pleomorphic

ปสสาวะ ทางเดนหายใจ

สวนลาง แผลตดเชอ ตา

แหลงอนๆ ในผปวย

ภมคมกนบกพรอง

ถาเปน mixed infection ใช

อาหารจ�าเพาะส�าหรบเชอน

เชอทเปนสาเหตการตดเชอ

ในโรงพยาบาลมกดอสาร

ตานจลชพหลายชนด

Fusobacterium

nucleatum,

Capnocytophaga spp.

Long slender bacilli, with

tapered to pointed ends;

“needlelike”; may be in

pairs, end to end, or

filamentous

ทางเดนหายใจ แผลตดเชอ

เลอด ฝ

เปนเชอทอยในรางกาย

Fusobacterium

necrophorum,

F. mortiferum, or

F. varium

Highly pleomorphic bacilli

with rounded to tapered

ends; pale and irregularly

staining, with bizarre

forms and round bodies

แผล เลอด ฝ เปนเชอทอยในรางกาย

Bacteroides spp. Pleomorphic straight

bacilli with possible

irregular to bipolar

staining

แผล เลอด ฝ อาจใชวธ direct fluores-

cent-antibody stain เปน

เชอทอยในรางกาย

Neisseria spp.,

Moraxella catarrhalis,

Veillonella spp.

Medium to large cocci in

pairs and tetrads, coffee

bean shaped; no bacilli

seen

ระบบสบพนธ ปสสาวะ


เลอด สารคดหลง แผลตด

เชอ ฝ

การหา N. meningitides

บาง serotype อาจใชวธ

direct antigen detection ได

ใช selective medium ใน

การเพาะเชอทอยปนกน

หลายชนด

Campylobacter spp.

Helicobacter spp

Thin, curved bacilli

included S shapes, gull

wings, long spiral forms

อจจาระ เลอด ชนเนอจาก

กระเพาะ

การเพาะเชอในภาวะทม

CO2 เพมขน และการใช

42 °C จะแยกเชอไดด

ขน

ข. แบคทเรยแกรมลบทพบในสงสงตรวจผปวย (ตอ)



Acinetobacter spp. Medium to large cocci in

pairs; occasionally

coccoid, bacillary, and

filamentous forms ตดส

คอนไปทางแกรมบวก

ปสสาวะ ทางเดนหายใจ

สวนลาง เลอด สารคดหลง

แผลตดเชอ ฝ ชนเนอ

อจจาระ แหลงอนในผปวย

ภมคมกนบกพรอง

ค. จลชพอนๆ ทตรวจไดจำกกำรท�ำ direct smears สงสงตรวจผปวย


Pneumocystis carinii Gram-negative spherical

cysts (5-7 μm) often

containing rosette of eight

gram-negative intracystic

bodies; or cluster of

gram-negative cysts

surrounded by halos in

background of amorphous

gram-negative material

ปอด และ transtracheal

biopsies, bronchial

washings and lavage

sputum

ยนยนดวยการยอมส

Grocott metenamine-

silver, toluidine blue O,

Gram-Weigert, หรอการ

ยอม fluorescent stain

Candida spp. Gram-positive budding

yeast cell with or without

pseudohyphae; may appear

stippled or gram neutral

เสมหะ ปสสาวะ เลอด

ชนเนอ สงคดหลงจากชอง

คลอด ทางเดนหายใจสวน

บน

เปนเชอทอยในรางกาย

Cryptococcus

neoformans

Partially or completely

gram-positive round yeast

cell with clear or red-

orange halo; yeast cells

may appear stippled or

gram neutral

น�าไขสนหลง เลอด ชนเนอ

เสมหะ bronchial washings

แผลทผวหนง

ยนยนโดยการท�า India ink;

direct antigen detection

กบสงสงตรวจโดยตรง

ข. แบคทเรยแกรมลบทพบในสงสงตรวจผปวย (ตอ)


เชอ กำรรำยงำนผล ชนดของสงสงตรวจ ขอเสนอแนะ

Blastomyces

dermatitidis

Gram-variable, broad-

based, thick-walled yeast

cell with figure-eight

appearance

Bronchial washings,

เสมหะ หนอง แผลท

ผวหนง

Malassezia furfur Bottle-shaped yeast cells

in compact clusters,

usually with short hyphal

elements

ขดจากผวหนง เลอดทเจาะ

ผาน catheter lines

เพาะในอาหาร lipid-riched

medium

ขอจ�ากดของการยอมแกรมเพอวนจฉยโรคตดเชอ 1. ควรใชผลการตรวจรางกายและผลการตรวจอนๆ เพอชวยสนบสนนสงทไดจากการยอมแกรม

2. ผลการทดสอบจะถกตองมากนอยเพยงใดขนกบความเเมนย�าในการทดสอบ และประสบการณของผทท�าการ

ทดสอบและอานผล

3. ควรท�าการยอมวธอนรวมดวยในกรณทสงสงตรวจเหนเปนหนองแตยอมแกรมแลวไมพบเชอ

4. สงสงตรวจทยอมแกรมแลวพบเชอแตเพาะเชอไมขน อาจเนองจากมเชอปนเปอนในน�ายาทใช มสารตาน

จลชพในสงสงตรวจ หรอวธการเพาะเชอทใชไมเหมาะสม เชน อาหารเลยงเชอทใช บรรยากาศทใชในการ

เพาะเชอ เปนตน

5. สงสงตรวจนอยเกนไปอาจท�าใหผลการยอมแกรมไมถกตอง

ขอจ�ากดของการยอมแกรม 1. ผลการยอมแกรมควรใชรวมกบผลการทดสอบอน เชน การยอมพเศษ การเพาะเชอ การหา antigen

2. ท�าการทดสอบอยางถกตองและท�าตามขอก�าหนดของการแปลผลเพอใหผลทไดถกตอง

3. ท�าการยอมสอนๆ เพมเตมในกรณทไมพบเชอจากการยอมแกรม

4. การพบเชอจากการยอมแกรมแตเพาะเชอไมขนอาจเกดจากมการปนเปอนเชอของน�ายาทใช หรอเชอไม

สามารถขนบนอาหารและบรรยากาศทใชในการเพาะเชอ

5. ผลการยอมแกรมทผดพลาดอาจเกดจากการเกบสงสงตรวจมานอยเกนไป

การวนจฉยการตดเชอราโดยการตรวจสดในสารละลาย Potassium hydroxide การตรวจสดในสารละลาย Potassium hydroxide ไมเหมาะกบการตรวจหา Histoplasma yeast cells เนองจากเชอม

ขนาดเลกดไดยาก ดงนนถาแพทยสงสยโรค histoplasmosis ใหตรวจสงสงตรวจโดยการยอมสแกรม หรอยอมส

Giemsa หรอยอมส Wright ถามสยอมทง 2 ชนดนพรอมใชอยในหองปฏบตการ ในกรณทสงสย cryptococcosis ใน

สงสงตรวจน�าไขสนหลง ใหท�าการตรวจสดใน india ink การยอมสแกรมมประโยชนในการตรวจหาแกรมบวก

aerobic actinomycetes แกรมบวกยสตในสกล Candida และยงชวยใหเหนการปนเปอนของแบคทเรยในสงสงตรวจ

ไดชดเจนขน การยอมส modified kinyoun acid fast มประโยขนในการตรวจหา acid-fast aerobic actinomycetes

ค. จลชพอนๆ ทตรวจไดจำกกำรท�ำ direct smears สงสงตรวจผปวย (ตอ)



1. กำรตรวจสดในสำรละลำย potassium hydroxide

การวนจฉยราในกลม Dermatophytes ทกอโรคกลาก

สงสงตรวจ ผวหนง ผม

สำรละลำย potassium hydroxide (KOH) ใชความเขมขน 10-30 % โดยชง KOH ละลายในน�ากลน

100 ml ใชกบผวหนงและผม

กำรปฏบต หยดสารละลาย KOH 1 หยด ลงบนแผนสไลดแกว ใชเขมเขยแตะสงสงตรวจ (ส�าหรบ

เสนผมใชคมคบ) จมลงในหยดสารละลาย KOH บนแผนสไลดแกวทเตรยมไว ปดทบดวย cover

glass ลนผานเปลวไฟ 3 ครง ซบน�ายาสวนเกนออก ทงไว 5-30 นาท น�าไปดดวยกลองจลทรรศนเรม

จากก�าลงขยาย 10 X และตามดวยก�าลงขยาย 40 X

2. กำรตรวจสดในสำรละลำยผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide

สงสงตรวจ เลบ

สำรละลำย dimethyl sulfoxide 40 ml ผสมกบน�ากลน 60 ml เตม KOH 20 g คนใหเขากนจน KOH

ละลายหมด บรรจใสขวดทมจกหยด

กำรปฏบต ใชกรรไกรตดตวอยางเลบเปนชนเลกและบางเทาทจะท�าได ใชคมคบชนสวนของเลบ

จมลงในหยดสารละลายผสม potassium hydroxide และ dimethyl sulfoxide ทหยดไวกอนแลว 1

หยดบนแผนสไลดแกว ปดทบดวย cover glass ไมตองลนไฟ น�าไปดใตกลองจลทรรศนเรมจากก�าลง

ขยาย 10 X และตามดวยก�าลงขยาย 40 X

กำรอำนผลและรำยงำนผล

การตรวจสดโดยสารละลาย potassium hydroxide ส�าหรบสงสงตรวจผวหนงและเลบ จะเหน

ลกษณะของราในกลม Dermatophytes เปนแบบเสนใยใสมผนงกนแตกกงกาน (hyaline branching

septate hyphae) หรอพบลกษณะอารโธโคนเดย (arthroconidia) บนอพทเลยลเซลล

รำยงำนผล “hyaline branching septate hyphae, arthroconidia suggesting dermatophytosis”

สงสงตรวจ เสนผมจะพบลกษณะทแตกตางกน 3 แบบคอ

1. เชอสรางโคนเดย รปรางกลมเกาะอยภายนอกเสนผม (ectothrix) เปนลกษณะการกอโรคของรา

ในกลม Dermatophytes สกล Microsporum

รำยงำนผล “ectothrix infection suggesting dermatophytosis”

2. เชอสรางโคนเดย รปรางกลมเจรญอยภายในเสนผม (endothrix) เปนลกษณะการกอโรคของรา

ในกลม Dermatophytes สกล Trichophyton

รำยงำนผล “endothrix infection suggesting dermatophytosis”

3. เชอสรางเสนใยเปนทอนยาวเรยงตวอยในเสนผมเปนลกษณะเฉพาะของรากลม Dermatophytes

เชอ Trichophyton schuenleinii.

รำยงำนผล “favic infection suggesting dermatophytosis”


3. กำรตรวจสดสงสงตรวจทสงสยโรค cryptococcosis ใน India ink preparation

สงสงตรวจ น�าไขสนหลง

กำรปฏบต หยด india ink 1 หยด ลงบนแผนสไลดแกวและตามดวย 1 loop เตมของสงสงตรวจ ผสม

เขาดวยกนและปดทบดวย cover glass กดทบเบาๆใหเปนแผนบาง ไลฟองอากาศออก น�าไปดดวย

กลองจลทรรศนเรมจากก�าลงขยาย 10 X และตามดวยก�าลงขยาย 40 X

กำรอำนผลและรำยงำนผล

พบเซลลยสตรปรางกลม ผนงเซลลหนา มขนาดแตกตางกนไปตงแต 3-20μm และพบเซลลยสต

แตกหนอ (budding yeasts) รอยตอของเซลลเปนฐานแคบ พนสด�าทเหนในกลองจลทรรศนเปนสด�า

ของ india ink ซงไมสามารถซมผานเขาสวนของแคปซลได จงเหนแคปซลเปนสวนใส วาว อยรอบ

นอกของเซลล ความหนาแนนของเชอมมากขน ความแตกตางของขนาดของเซลล และความหนา

ของแคปซลกมมากขน encapsulated Cryptococci สามารถแยกความแตกตางไดชดเจนกบ

oval blastospores ของ Candida การรายงานผลการตรวจสดสงสงตรวจทสงสยโรคครปโตคอกโคซส

ในอนเดยองค และตรวจพบ encapsulated yeast cells

รำยงำนผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”

หรอ “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”


เอกสารอางอง 1. Ayers LW. Microscopic Examination of Infected Materials. In: Mahon CR, Manuselis G editors.

Textbook of Diagnostic Microbiology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 2000. p. 261-310.

2. Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, 9th ed. St. Louis:

C.V. Mosby Co.; 1994.

3. Bartholomew JW. Variables influencing results, and the precise definition of steps in gram staining as a

means of standardizing the results obtained. Stain Technol. 1962;37:139-155.

4. Clarridge JE, Mullins JM. Microscopy and staining. In: Howard BJ editor. Clinical and Pathogenic

Microbiology. St. Louis: C.V. Mosby Co.; 1987. p. 87-103.

5. Engelkirk PG, Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In: Laboratory

Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Baltimore: Wolters Kluwer

Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p. 507-540.

6. Hazen KC, Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing (Microscopic Clinical

Specimen Examination). In: Garcia LS editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed.

Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007. p.8.3.1.1-9.

7. Howell SA, Hazen KC. Candida, Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance. In:

Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of

Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.1793-1821.

8. Isenberg HI. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998.

p.39-50.

9. Mangels JI, Cox ME, Lindberg LH. Methanol fixation. An alternative to heat fixation of smears before

staining. Diagn Microbiol Infect Dis. 1984;2:129-137.

10. Murray PR, Washington JA. Microscopic and bacteriologic analysis of sputum. Mayo Clin. Proc.

1975;50:339-344.

11. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Gram stain. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical

Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 39-50.

12. Preston NW, Morrell A. Reproducible results with the Gram stain. J Path Bact. 1962;84:241-243.

13. Shanholtzer CJ, Schaper P, Peterson L. Concentrated Gram stain smears prepared with a cytospin

centrifuge. J Clin Microbiol. 1982;16:1052-1056.

14. Washington JA. Rapid diagnosis by microscopy. Clin Microbiol Newls. 1986;8:135-137.

บทท4

ขนตอนการเพาะเชอจากสงสงตรวจ


4.1 การเพาะเชอจากเลอดสวรรณา ตระกลสมบรณ

วภา ตรรตนวรพงษ

ฉนทนา อรญญะ

หลกกำร

การตดเชอแบคทเรยในกระแสเลอด (bacteremia) ถอเปนภาวะวกฤตทอาจท�าใหผปวยเกดภาวะ septic shock

และเสยชวตไดคอนขางสง การตดเชออาจมาจากการทเชอเขาสเลอดโดยตรงหรอมาจากต�าแหนงตางๆ ของรางกาย

ทมการตดเชอชนดนนๆ อยแลว เชน การตดเชอจากแผลผาตด ระบบทางเดนหายใจ ระบบปสสาวะ ระบบสบพนธ

เปนตน

เชอทเปนสาเหตกอโรคทพบบอยไดแกเชอในกลม Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

spp., Streptococcus group A และ group อนๆ Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Enterococcus spp., Neisseria meningitidis และ Vibrio spp. เปนตน เชอประจ�าถน เชน coagulase

negative staphylococci อาจเปนสาเหตทท�าใหเกดการตดเชอในผปวยทใสสายตางๆ เขาไปในรางกาย ผปวยมะเรง

เบาหวาน ผปวยทมภาวะภมคมกนบกพรอง ภาวะเมดเลอดขาวต�า เปนตน

การพจารณาวาเปนเชอกอโรคหรอปนเปอน จะพจารณารวมกบอาการทางคลนกของคนไข ระยะเวลาการเจรญ

เตบโตของเชอทใหผลบวกในแตละขวด จ�านวนขวดทใหผลบวก และแบบแผนความไวของสารตานจลชพของ

แตละขวด การเพาะเชอจากเลอดจงเปนการวนจฉยทตองค�านงถงความถกตอง การรายงานผลทรวดเรวเปนแนวทาง

ส�าหรบแพทยในการเลอกใชสารตานจลชพทเหมาะสมส�าหรบผปวย

ขอบเขต

การเจาะเลอดเพอเพาะเชอ การตรวจรบสงสงตรวจ การเพาะเชอจากเลอดดวยวธทวไป (conventional method)

หลกการเพาะเชอจากเลอดดวยระบบกงอตโนมต การอานผลการเพาะเชอ การรายงานผลเมอพบเชอจากการยอม

แกรม การรายงานผลเมอเสรจสมบรณ การแปลผลและการควบคมคณภาพการเพาะเชอจากเลอด

วธกำรปฏบตงำน

ขนตอนกำรเจำะเลอดเพอเพำะเชอ

1. กอนเจาะเลอดควรท�าความสะอาดมอ โดยการลางมอดวยน�ายาท�าลายเชอ เชน 4% Chlorhexidine gluconate

หรอใช alcohol hand rub และสวมถงมอสะอาด

2. ท�าความสะอาดผวหนงต�าแหนงทจะเจาะเลอดดวย 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol ซงม

ประสทธภาพการฆาเชอดเทยบเทา povidone-iodine แตแหงเรวกวาและมระยะเวลาในการรอคอยใหมประสทธภาพ

ฆาเชอสงสดสนกวา ใชเวลารอใหแหงและออกฤทธสงสดเพยง 30 วนาท ขณะท povidone-iodine ใชเวลานานถง

2 นาท ผปฏบตงานมกไมรอถง 2 นาท นอกจากน Chlorhexidine gluconate มฤทธคงเหลอหลงทาน�ายาดวย จงเปน

น�ายาทควรใชเพอลดการปนเปอนในการเจาะเลอดเพอเพาะเชอ

3. การเชดผวหนงใหวนจากดานในออกดานนอกอยางนอย 5 cm เชดดวยความแรงนาน 30 วนาท และรอแหง


ไมนอยกวา 30 วนาท เดกแรกเกดใช 70% alcohol หรอ povidone-iodine

4. เจาะเลอดเพอเพาะเชอเมอผปวยมขอบงชสงสยการตดเชอแบคทเรยหรอเชอราในเลอด ควรเจาะชวงทมการ

แบงตวของเชอในเลอดจ�านวนมาก ระยะเรมมไข

5. ควรเจาะเลอดกอนรบยาปฏชวนะ กรณไดรบยาปฏชวนะมากอนควรเจาะเรวทสดหลงรบยาหรอเจาะท 15

นาทกอนรบยาปฏชวนะครงตอไป กรณไมเรงดวน เจาะเลอดสองครงหางกน 15-30 นาท กรณตองรบใหยาปฏชวนะ

สามารถเจาะเลอดพรอมกนจากต�าแหนงทตางกน ถาสงสยการตดเชอลนหวใจเจาะอยางนอยสองขวดหางกน

12 ชม.

6. เจาะจากเสนเลอดด�าบรเวณทไมมแผลหรอรอยโรค ปรมาณเลอดตองใหไดตามก�าหนดของขวดเพาะเชอ กรณ

ไมสามารถเจาะเลอดไดตามก�าหนดตองบนทกในใบสงตรวจ

7. ท�าความสะอาดจกของขวดเพาะเชอดวย 70% alcohol หรอ 2% Chlorhexidine gluconate ใน 70% alcohol

8. ใสเลอดลงขวดเพาะเชอโดยไมจ�าเปนตองเปลยนเขม หมนขวดเบาๆ เพอใหเลอดผสมกบน�ายาเพาะเชอ

9. น�าสงหองปฏบตการทนท ถาไมสามารถสงไดทนทหลงเจาะเลอดควรเกบทอณหภมหอง และตองบนทก

ระยะเวลาทรอคอยกอนสงตรวจเปนขอมลเพมเตมของสงสงตรวจในใบน�าสง และควรค�านงถงผลกระทบทท�าให

เพมระยะเวลารอคอยผลและมผลตอความปลอดภยของผปวยเนองจากตองรายงานผลเปนคาวกฤต

ขนตอนกำรตรวจรบสงสงตรวจ ใหตรวจสอบสงตอไปน

1. ชอ นามสกลผปวยกบใบสงตรวจถกตองครบถวนสมบรณ

2. สภาพขวดหากพบมรอยแตกราว ตองปฏเสธตวอยาง

3. ปรมาตรของเลอดทเจาะ ถาไมเหมาะสมตองระบในใบรายงานผล

4. การเกบขวดเลอดหลงจากการเจาะ ตองมวธการเกบทถกตองเหมาะสมกอนท�าการเพาะเชอ เชน การเกบ

ในอณหภมทถกตองเหมาะสม หามน�าเขาตเยน

5. ไมมส�าลปดทบบนจกยางหรอมสของ iodine บนจกยาง ถามควรแจงผใชบรการใหแกไข

6. ระยะเวลาน�าสงหลงเจาะเลอด ถานานเกนก�าหนดควรบนทกในใบรายงานผล

กำรเพำะเชอจำกเลอดดวยวธทวไป (conventional method)

การเตรยมอาหารเลยงเชออาจใช brain heart infusion broth, tryptic soy broth ทเตมสารปองกนการแขงตวของ

เลอด 0.05% sodium polyanethol sulfonate (SPS) ปรมาณเลอดทเกบส�าหรบผปวยผใหญ 5-10 ml ตออาหาร 45

ml ส�าหรบผปวยเดกปรมาณเลอด 1- 2 ml ตออาหาร 9 ml โดยอตราสวนระหวางเลอดและปรมาณอาหารประมาณ

1:5 ถง 1:10 น�าขวด hemoculture อบท 35-37 °C นาน 7 วน ท�าการเพาะเชอหลงอบขวดขามคน และรายงานผล

เบองตน หากเชอยงไมขนใหสงเกตดการเจรญของเชอทกวน ขวดทมการเจรญของเชอจะมลกษณะตอไปนคอ

อาหารเลยงเชอมความขนบรเวณผวหนา หรอขนทงขวด มการแตกท�าลายของเมดเลอดแดง มเมดสขาวเลกๆ อย

บนผวหนา หรออยเหนอชนเมดเลอด ขวดอาหารเลยงเชอมฟองกาซ หรอกอน clot หรอมกอนคลายส�าล ในกรณ

ทพบลกษณะดงกลาว ใหเพาะเชอทนทบน CA, BA และ MAC อบ plate CA ในบรรยากาศ 5-10 % CO2 ท 35-

37 °C นาน 2-3 วน ส�าหรบ BA และ MAC อบ ท 35-37 °C นาน 2-3 วน พรอมกบปายลงสไลดท�าการยอมแกรม


กำรเพำะเชอจำกเลอดดวยระบบกงอตโนมต (continuously monitored automated blood culture system)

ปรมาณเลอดตอขวดประมาณ 5-8 ml ปรมาณทเหมาะสมจะมค�าแนะจากบรษทผผลตทบงชไวขางขวด น�า

ขวดใสเครองเพาะเชอ ทอณหภม 35-37 °C เครองจะท�าการตรวจอตโนมตอยางตอเนองตามหลกการทแตกตางกน

ไปของแตละบรษท ระยะเวลาในการอบขวดเพาะเชอภายใน 5 วน ไมมความจ�าเปนทตองอบเพาะเชอเกน 5 วน

ส�าหรบเชอทสงสยในกลม HACEK, Brucella, Capnocytophaga และ Campylobacter และไมมความจ�าเปนใน

การท�า blind subculture เมอพบการเจรญของเชอระบบจะมการแจงเตอน (alarm) ผานหนาจอ monitor น�าขวดท

ใหผลบวกออกมาท�าการ subculture และยอมแกรม พรอมทงโทรแจงผลเบองตน และออกใบรายงานผลเปนลาย

ลกษณอกษรตามไปดวยทกครง

หมำยเหต เพอลดอตราการปนเปอนควรใช 2% chlorhexidine gluconate in 70% alcohol ท�าความสะอาด

บรเวณจกยาง หรออาจใช 70% alcohol ในการเชดจกขวดเพาะเชอ ไมแนะน�าใหใชสารทม iodine

เปนสวนประกอบเชดจกยางเพราะอาจท�าใหจกยางเปลยนสภาพได

กำรอำนผล

อานผลการเพาะเชอ ท�าการแยกชนดเชอทขนบนอาหารเพาะเชอท subculture ไว พรอมทงทดสอบความไวของ

เชอตอสารตานจลชพ

กำรรำยงำนผล

กำรรำยงำนผลเบองตน

1. กรณไมมเชอเจรญ (no growth) ใหรายงานระยะเวลาทอบขวด (no growth at 24 hours, no growth at 48

hours หรอ no growth after x days) ทงนจ�านวนวน (x) ขนอยกบนโยบายของหองปฏบตการทท�าความ

ตกลงกบแพทยในแตละโรงพยาบาล

2. กรณมเชอเจรญ (positive culture) ท�าการรายงานผลแกรม การตดส รปราง และลกษณะการเรยงตว

เพอเปนประโยชนกบแพทยในการพจารณาเลอกใชสารตานจลชพทเหมาะสมตอผปวย การยอมแกรม

ถอเปนคาวกฤตทตองรบรายงานทนท การรายงานผลทางโทรศพทตองบนทกชอผรบแจง วน-เวลา

และผทท�าการแจง พรอมออกใบรายงานผลตามหลงจากการแจงทางโทรศพทดวยทกครง

กำรรำยงำนผลทเสรจสมบรณ

1. กรณไมมเชอเจรญ (no growth) ใหระบระยะเวลาทเพาะเชอดวยเชน no growth after 7 days ส�าหรบ

การเพาะเชอดวยวธ conventional method และ no growth after 5 days ส�าหรบการเพาะเชอดวยวธ

continuously monitored automated blood culture system

2. กรณมเชอเจรญ (positive culture) รายงานผลการวนจฉยเชอ และผลความไวตอสารตานจลชพ ระบ

จ�านวนขวดทใหผลบวกใน set นน

3. กรณทเพาะเชอโดยเครองตรวจอตโนมต การรายงานเวลาขวดเลอดทใหผลบวก (time to detection)

ในขวดทเจาะจากเสนเลอดด�า กบขวดทเจาะจาก catheter ถาขวดทเจาะผาน catheter ใชเวลาทใหผล

บวกนอยกวาขวดทเจาะจากเสนเลอดด�า > 2 ชม. และเชอทแยกไดจากทงสองขวดเปนเชอชนดเดยวกน

แสดงวาการตดเชอนนนาจะมความสมพนธกบการใช catheter (Catheter-related bloodstream

infections) ดความสอดคลองกบการตดเชอในต�าแหนงตางๆ และผลแกรมทรายงานเบองตน


4. ในใบรายงานผลควรระบสงทไมสอดคลองกบขอก�าหนดทอาจมผลตอการเพาะเชอดวยทกครง เชน

เจาะเลอดปรมาณนอยเกนไป การสงตวอยางลาชา เปนตน

กำรแปลผลกำรเพำะเชอจำกเลอด

เนองจากพบมอบตการณของการตดเชอในกระแสเลอด ทเกดจากเชอแบคทเรยทปรกตไมไดเปนเชอกอโรค

หรอกอโรคไมรนแรง เชน เชอประจ�าถน (normal flora bacteria) ทพบในคนปรกต การแปลผลการเพาะเชอจาก

เลอด เพอแยกความส�าคญของการพบเชอดงกลาวออกจากการปนเปอนท�าไดยากมาก เนองจากในอกดานหนง การ

พบการปนเปอนของเชอในกระแสเลอด อาจท�าใหมการใชยาตานจลชพเกนความจ�าเปน มการตรวจวเคราะหมาก

ขนหรอมการปรกษาแพทยเฉพาะทาง และเพมระยะเวลาการอยโรงพยาบาลนานขน คาใชจายทเกยวเนองจากการ

พบผลบวกปลอมของการเพาะเชอของเลอด มมากถง 40% ส�าหรบการรบสารตานจลชพและการทดสอบ เพอแยก

ชนดของเชอในหองปฏบตการ การทไมสามารถแยก contamination ออกจาก true infection จงมผลกระทบมาก

ดงนนตวชบงทสามารถชวยแยก probable pathogen ออกจาก contamination จงมความส�าคญส�าหรบการแปลผล

การเพาะเชอจากเลอด

ตวบงชทใชในกำรแปลผลของกำรเพำะเชอในเลอด

ตวบงชทใชในการแปลผล เพอพจารณาแยกการเพาะเชอทพบเชอกอโรคในกระแสเลอด ออกจากการพบ

เชอปนเปอนในเลอด ตวชวดเหลานใชแสดงใหแพทยและหองปฏบตการทราบวาตวอยางตรวจนาจะมเชอปน

เปอนระหวางการเกบตวอยางหรอในขนตอนการวเคราะห เชน

- ควำมถของกำรพบมเชอขนในขวดจำกจ�ำนวนขวดทท�ำกำรเพำะเชอ (positive bottles among collections)

เชน การเจาะเลอดสามขวดและมเชอขนทงสามขวด หรอเจาะเลอดสองขวดเพาะเชอไดทงสองขวด โอกาส

ทผปวยมการตดเชอในกระแสเลอดเพยงขวดเดยวจากการเจาะเลอดสามขวด เปนตน

- ผลกำรยอมแกรมจำกขวดเลอดเพำะเชอ พบเชอ gram-positive cocci in cluster แสดงวาเปนเชอ

staphylococci ซงอาจจะเปน เชอกอโรคคอ Staphylococcus aureus หรอ อาจจะเปนเชอประจ�าถนทผวหนง

เปน coagulase-negative Staphylococcus ซงไมกอโรค ถายอมได gram-positive rod ตวโต ชบงวาเปน

Bacillus spp. ซงเปนเชอปนเปอนในสงแวดลอม แสดงวามการปนเปอนทต�าแหนงเจาะเลอดและท�าความ

สะอาดผวหนงไมด การชบงการตดเชอดวยการยอมแกรมอยางเดยวไมเพยงพอ เนองจากเชอบางสวนทกลาว

มานอาจเปนเชอกอโรคไดดวย

- จ�ำนวนและชนดของเมดเลอดขำวในเลอด ขณะทมการตดเชอในกระแสเลอดผปวยทมภมตานทานปรกต

ถาม left shift (>10 % bands) โดยจ�านวนเมดเลอดขาวไมเพมขนมกมความสมพนธกบ positive blood culture

- จ�ำนวน species ทแยกไดจำกเลอดแตละขวด เชอทเพาะไดหลายตว (multiple organisms isolates) มกสมพนธ

กบการปนเปอน เนองจากท�าความสะอาดผวหนงไมด การตดเชอในเลอดมกพบเชอเพยงชนดเดยว

- อำกำรแสดงของผปวย เชน มไขสง หรอไขต�าๆ ผปวยทไมมไข แตม positive blood culture มกเกดค�าถามวา

ผลการเพาะเชอเชอถอไดหรอไม

- ระยะเวลำทใชในกำรเจรญเตบโตจนตรวจพบเชอ ถาเจาะเลอดไดเพยงพอเวลาทแบคทเรยแบงตวจนตรวจ

พบเชอไดมกไมเกน 48 ชม. กรณทมเชอปรมาณมาก จนตรวจพบ positive culture ไดเรวในทางกลบกนเชอ

ทโตชาชบงวามเชอปรมาณนอยมากทเขาไปในขวด ซงมกมความจ�าเพาะคอไมมเชอในเลอด แตมการปนเปอน

ในขวดเลอดจากเชอทมแหลงจากภายนอก


เชอทนำจะเปนเชอปนเปอน (probable contamination)

1. การเพาะไดเชอตอไปนจากเลอดเพยงขวดเดยว ในขณะทท�าการเพาะเชอมากกวาหรอเทากบสองขวด ไดแก

Bacillus spp., Corynebacterium spp., Propionibacterium acnes, coagulase-negative staphylococci

2. การพบเชอหลายชนดในเลอดเพยงขวดเดยวจากการเจาะเลอดอยางนอยสองขวด

3. เชอทแยกไดจากเลอดของคนไขทไมมอาการตดเชอ หรอหลกฐานทางแพทยไมสอดคลองกบผลการเพาะเชอ

4. เชอกอโรคทเปนสาเหตของการตดเชอในต�าแหนง primary site เปนคนละชนดกบทแยกไดจากเลอด

เชอทนำจะเปนเชอกอโรค (probable pathogen)

1. เชอทแยกไดเปนชนดเดยวกบทแยกไดจากเลอดทเจาะซ�าใหม ในเวลาทตางกน หรอเจาะจากต�าแหนงทตางกน

2. แยกเชอทจ�าเพาะบางตวไดจากเลอดของผปวยทมการตดเชอ endocarditis เชน Enterococcus spp. หรอเชอ

แกรมลบชนดแทง

3. เชอทจ�าเพาะ เชน เชอในกลม Enterobacteriaceae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,

Streptococcus group B และเชอแกรมลบชนดแอนเอโรบค เปนตน

4. เชอประจ�าถน (normal microbial flora) ทแยกไดจากเลอดของผปวยทสงสยมการตดเชอในกระแสเลอดและ

ม prosthetic devices หรอมภมคมกนบกพรอง หรอไดรบสารกดภมตานทาน

5. เชอทพบไดไมบอยแตแยกไดจากผปวยทมประวตพเศษ เชน เดนทางไปตางประเทศ หรอเชอทใชอาวธชวภาพ

เชน Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Brucella spp., Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei

6. เชอบางชนดทไมสามารถเจรญบนอาหารสงเคราะห วนจฉยไดโดย serological test หรอ molecular method

เชน Coxiella, Chlamydia spp., Rickettsia spp.

ตำรำงท 4.1-1 แสดงแบคทเรยทแยกไดจำกเลอดและโอกำสของกำรปนเปอน (false positive) หรอโอกำสของ

กำรกอโรค (true positive)

Organism % False positive % True positive

Bacillus spp. > 90 < 10

Coagulase-negative staphylococci > 90 < 10

Propionibacterium spp. > 90 < 10

Corynebacterium spp. 80 20

Viridans streptococci 50 50

Clostridium spp. 40 60

Staphylococcus aureus 25 75

Enterococcus spp. 15 85


กำรควบคมคณภำพกำรเพำะเชอจำกเลอดในหองปฏบตกำร

หองปฏบตการควรท�าการควบคมคณภาพในทกขนตอนของการเพาะเชอจากเลอด โดยมขนตอนการควบคม

คณภาพ ดงน

1. กำรประกนคณภำพกำรวเครำะห

ท�าการควบคมคณภาพภายใน (internal quality control; IQC) และบนทกผล ตลอดจนเขารวมโครงการทดสอบ

ความสามารถระหวางหองปฏบตการทจดขนโดยองคกรภายนอกในระดบประเทศหรอระดบสากล (external

quality assessment; EQA) หองปฏบตการท�าการประกนคณภาพการเพาะเชอจากเลอดไดดงน

- การควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอในดานการสงเสรมการเจรญเตบโตของจลชพไดครอบคลมจลชพท

เปนสาเหตการตดเชอในเลอด

- ควบคมการปนเปอนของเชอในอาหารทใชเพาะเชอ

- ควบคมคณภาพการยอมสใหครอบคลมทงเชอทเปน positive control และ negative control ท�าการ

วเคราะหและบนทกผลแบบเดยวกบการยอมเลอดของผปวย

- ควบคมคณภาพการเพาะเชอจากเลอดในขวด ท�าทง positive control โดยใสเชอมาตรฐานทเจอจางดวย

เลอดของคนปรกต ใหมปรมาณเชอแตกตางกนลงในขวดเพาะเชอ และท�า negative control ทใสน�าเกลอ

แทนเชอ ท�าการวเคราะหและบนทกผลการเพาะเชอแบบเดยวกบเลอดของผปวย

- ท�าการควบคมคณภาพทดสอบความไวของเชอมาตรฐานตอสารตานจลชพ ท�าการวเคราะหและ

บนทกผลแบบเดยวกบเชอทแยกไดจากผปวย

- ก�าหนดเกณฑการตดสนการควบคมคณภาพกรณผล IQC ไมอยในเกณฑ และท�าบนทกปฏบตการแกไข

- มการจดเกบรกษาคณภาพของเชอมาตรฐานทไดมาจากแหลงทเชอถอได และเปนสากลทอางองได เพอ

น�าผลมาใชควบคมคณภาพของการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ คณภาพอาหารทใชเพาะเชอจาก

เลอดและอาหารทใชท�า subculture หรอการวนจฉยเชอ

- มระบบการวเคราะหทสอบกลบได (traceable) ถงคามาตรฐานสากล (SI unit) มการบนทกรายละเอยด

เกยวกบวธการวเคราะห สารมาตรฐาน และเชอมาตรฐาน

- วสดอางองและเชอมาตรฐาน (standard/calibrator) มคณลกษณะเหมาะสม มใบรบรองคณลกษณะหรอ

ขอมลอางองจากผผลต (MT 5.2.4)

- กรณท�าการทดสอบเดยวกนแตใชเครองมอหลายเครองตองมการปรบเทยบผล มบนทก

- หองปฏบตการตองเขารวมโครงการ EQA กบองคกรทมคณภาพ เพอเปนดชนชวดความถกตองของผล

การทดสอบทท�า โดยปฏบตตอตวอยางทไดรบเชนเดยวกบตวอยางทดสอบจากผปวยกรณทมผลไมตรง

กบผล EQA ตองท�าการวเคราะหหาสาเหตและด�าเนนการแกไข

- มการสอบเทยบเครองมอทมผลกระทบตอคณภาพ และมการบ�ารงรกษาเชงปองกนและตรวจสอบความ

พรอมใชงานของเครองตรวจวเคราะหอตโนมตส�าหรบการเพาะเชอจากเลอด ทงสวนทเปน incubator

และระบบ detection ตลอดจนตเยนเกบแผนสารทดสอบและสารทใชทดสอบ

2. ขนตอนกอนกำรวเครำะห

- มคมอการเกบตวอยางและแนวปฏบตในการเจาะเลอดเพอเพาะเชอ ใหหนวยงานทมาสงตวอยางวเคราะห

ท�าการวเคราะหทนท เมอไดรบตวอยาง หองปฏบตการตองก�าหนดวธการเกบรกษาตวอยางและชวงเวลา

ทเกบตวอยางไว โดยผลการทดสอบไมเปลยนไปและไมท�าการทดสอบสงสงตรวจทมคณภาพไมดพอ


- มการควบคมวธการน�าสงตวอยางภายในเวลาและอณหภมทเหมาะสม

- มการก�าหนดเกณฑรบและปฏเสธตวอยาง และบนทกรายละเอยดสภาพตวอยางทไมเหมาะสมในการ

รายงานผลดวยทกครง เพอแพทยจะไดใชประโยชนในการแปลผล

- มการชบงตวอยางและใบน�าสง มบนทกการรบตวอยางในสมดหรอระบบคอมพวเตอร

3. ขนตอนกำรวเครำะห

- ใชวธวเคราะหทเปนมาตรฐานหรอวธอางองได กรณใชวธวเคราะหทก�าหนดขนเองหรอดดแปลงวธ

วเคราะห เชน ลดสวนน�ายา หรออนๆ ตองมขอมลการ validate

- แจงวธวเคราะหใหผใชบรการทราบรวมทงชนดและปรมาณของตวอยางทตองการ ถาเปลยนแปลงวธ

การตองแจงเปนลายลกษณอกษรและมบนทกการแจง

- มคมอวธปฏบตหรอระเบยบปฏบตการวเคราะห ณ จดทปฏบตงาน เปนเอกสารควบคมในระบบการ

ควบคมเอกสาร วธในคมอตรงตามทใชงานจรงและเปนปจจบน

4. ขนตอนหลงกำรวเครำะห

- การรายงานผลขนตอนสดทายประกอบดวยผลตอไปน ผลจากการยอมแกรม ผลการวนจฉยเชอ

และผลความไวตอสารตานจลชพ

- มการตรวจสอบผลการเพาะเชอ โดยผทไดรบมอบหมาย

- การยอมแกรม เปนวธการส�าคญทใชบงชวามเชอขนในขวดเลอด เมอยอมพบเชอจากขวด

เพาะเชอจากเลอดตองท�าการรายงานผลใหแพทยทราบทนท ผลการเพาะเชอจากเลอดจดเปนคาวกฤตท

ตองรายงานเรงดวน ตองใหแพทยดแลผปวยไดรบผลทรายงานโดยเรว ผทรบผลทางโทรศพทตองบนทก

ผล เพอไวยนยนความถกตอง และผโทรแจงผลตองบนทกชอผรบการแจงผล

- เมอเพาะเชอขน (positive blood culture) ตองรายงานผลทนททไดผลเปนคาวกฤต การรายงานผลตอง

รายงานทงผลจากการยอมแกรม ผลการวนจฉยเชอและผลการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ ขอมล

ทอาจจะเปนประโยชนตอการแปลผล เชน สารตานจลชพทผปวยไดกอนเจาะเลอดเพาะเชอ ปรมาตรของ

เลอดทใชเพาะเชอนอยกวามาตรฐานทก�าหนดการสงตวอยางลาชา เปนตน

การบรหารจดการระบบคณภาพของงานหองปฏบตการใหงานขบเคลอนตามล�าดบของการท�างานตองท�าให

ครอบคลมทงสามขนตอน คอ ขนตอนกอนการวเคราะห ไดแก การสงตรวจ การเกบสงสงตรวจและน�าสงหอง

ปฏบตการ และการรบ การปฏเสธสงสงตรวจ โดยตรวจสอบคณภาพของสงสงตรวจในขนตอนการวเคราะห เชน

วธการวเคราะห การทบทวนและตดตามผลการวเคราะห ส�าหรบขนตอนหลงการวเคราะห ไดแก การรายงานผล

และการรบรองผลการวเคราะห และการเกบรกษาและท�าลายสงตรวจหลงการวเคราะห

รายงานผลการเพาะเชอจากเลอด ควรมการควบคมคณภาพของการปฏบตงานทงสามขนตอนของการวเคราะห

การควบคมคณภาพทท�าอยางจรงจงและตอเนองเปนปจจยหลกทใชในการประกนคณภาพของการเพาะเชอจาก

เลอดได ท�าใหแพทยมความเชอมนตอผลการวเคราะห อนจะเปนประโยชนในการรกษาและควบคมโรค การควบคม

คณภาพของการวเคราะหเปนวธการทางหองปฏบตการทมประสทธภาพสงในการลดการปนเปอนจากการเพาะ

เชอในเลอด เนองจากสามารถใชแยกเชอทเปนสาเหตของการตดเชอในเลอดจรงออกจากเชอทปนเปอนหรอเชอท

ไมใชสาเหตของการตดเชอได จงควรใชแนวทางปฏบตการแปลผลและการควบคมคณภาพในการพฒนาคณภาพ

การเพาะเชอจากเลอด


เอกสารอางอง 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Principles and Procedures for Blood Culture: Approved

Guideline. CLSI document M47-A. Pennsylvania: Wayne; 2007.

2. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation Blood Cultures. In: Isenberg HD editor.

Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 58-62.

3. ก�าพล สวรรณพมลกล, คคนางค นาคสวสด. วธลดการปนเปอนในการเจาะเลอดเพอสงเพาะเชอ.

ใน: สรางค เดชศรเลศ, สวรรณา ตระกลสมบรณ, กาญจนา คชนทร บรรณาธการ. แนวปฏบตการเจาะ

เลอดเพอเพาะเชอและการเพาะเชอกอโรคจากเลอด. กรงเทพฯ: โรงพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย;

2553. หนา 7.

4. มาลย วรจตร. การด�าเนนการเพาะเชอและการรายงานผลการเพาะเชอจากเลอดทางหองปฏบตการหลก

การเพาะเชอจากเลอดและการวนจฉยเชอกอโรค. กรงเทพฯ: คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยมหดล;

2550. หนา 79-86.

5. มาลย วรจตร. กระบวนการทางหองปฏบตการส�าหรบการเพาะเชอจากเลอด. ใน: สรางค เดชศรเลศ,

สวรรณา ตระกลสมบรณ, กาญจนา คชนทร บรรณาธการ. แนวปฏบต การเจาะเลอด เพอเพาะเชอและการ

เพาะเชอกอโรคจากเลอด. กรงเทพฯ: โรงพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย; 2553. หนา 15-23.

6. วรรณา เพงเรองโรจนชย. การเพาะเชอจากเลอด. คมอการปฏบตงานแบคทเรยส�าหรบโรงพยาบาลศนย

และโรงพยาบาลทวไป. นนทบร: กองโรงพยาบาลภมภาค; 2540.

7. สวรรณา ตระกลสมบรณ. การแปลผลและการควบคมคณภาพการเพาะเชอจากเลอด. ใน: สรางค เดชศร

เลศ, สวรรณา ตระกลสมบรณ, กาญจนา คชนทร บรรณาธการ. แนวปฏบต การเจาะเลอดเพอเพาะเชอ

และการเพาะเชอกอโรคจากเลอด. กรงเทพฯ: โรงพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย; 2553. หนา 27-35.


4.2 การเพาะเชอจากน�าไขสนหลงและน�าสวนตางๆของรางกายฉนทนา อรญญะ

วรรณา เพงเรองโรจนชย


การเพาะเชอจากน�าไขสนหลงหลกกำร

น�าไขสนหลงเปนของเหลวในรางกายทปราศจากเชอ มหนาทหลอเลยงสมองและไขสนหลง ภาวะเยอหมสมอง

อกเสบทเกดจากการตดเชอแบคทเรยในน�าไขสนหลงถอเปนภาวะวกฤตทกอใหเกดอนตรายถงแกชวตได จงมความ

ส�าคญทตองรบท�าการทดสอบและแจงผลใหแพทยทราบโดยทนท การทดสอบทรวดเรวและถกตองสามารถชวย

รกษาชวตผปวยหรอลดความพการได การตดเชอเพยงเลกนอยกถอวามความส�าคญทางคลนกทตองวนจฉยและ

ทดสอบความไวตอสารตานจลชพในเชอทกชนด

ขอบเขต

ขนตอนการตรวจรบสงสงตรวจ การเพาะเชอจากน�าไขสนหลง การอานผล การเพาะเชอ การรายงานผล เมอ

พบเชอจากการยอมแกรม การรายงานผลเมอเสรจสมบรณ

เชอแบคทเรยทพบเปนสาเหตของการตดเชอในระบบประสาทสวนกลางมความสมพนธกบอายของผปวย คอ

เดกแรกคลอด : Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes

เดกอายต�ากวา 2 เดอน : Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli

เดกอายต�ากวา 10 ป : Hemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae

เดกทมอายมากกวา 10 ปและผใหญ : Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, gram negative

bacilli, Listeria monocytogenes


1. ตรวจดลกษณะและปรมาณของ CSF

1.1 ถามเลอดปะปนหรอมความขนใหบนทกไว

1.2 ถามปรมาณมากกวา 1 ml และใส ใหน�าไปปนแยก โดยใชความเรว 2,500 rpm นาน 15 นาท

ใช pasteur pipette ปราศจากเชอ ดดน�าใสสวนบนทง เหลอ CSF และตะกอนกนหลอดประมาณ 0.5 ml

เขยาผสมตะกอนดวย vortex mixer เพอใชยอมและเพาะเชอตอไป

1.3 ถา CSF มปรมาณนอยกวา 1 ml หรอขนไมตองปน ท�าการเพาะเชอไดเลย

2. ใช pasteur pipette ปราศจากเชอ ดด CSF หยดลงบน BA, CA, MAC plate ละ 1 หยด สวนทเหลอใสใน

fluid thioglycollate medium (FTM) และท�า smear บน slide เพอยอมแกรม โดยท�าการตรวจใหเรวทสด

3. streak plate ทง 3 ชนด น�าไปบมท 35±2 °C นาน 3 วน โดย BA และ CA บมในบรรยากาศ 5-10% CO2

ส�าหรบ FTM ใหบม ท 35±2 °C นาน 7 วน


ขอควรระวง

1. ควรท�าการเพาะเชอทนททไดรบสงสงตรวจ ถาท�าไมไดใหเกบในอณหภมหอง หามเกบในตเยน

2. กรณทได CSF ปรมาณนอย ไมสามารถแบงหลายขวด เพอสงตรวจจลชววทยา ตรวจทางชวเคม และการตรวจ

นบและแยกชนดของเซลล ใหเกบ CSF ทเจาะไดทงหมดใสขวดเดยวแลวน�าสงหองปฏบตการจลชววทยากอน

ท�าการปน เพอน�าตะกอนไปเพาะเชอ และท�า direct examination เชน ยอมแกรมท�า india ink แลวจงน�าสวนใส

ทแยกได ไปตรวจทางชววทยา


1. อานผลการยอมแกรมทนท ถาพบเชอตองรายงานผลแบบคาวกฤต

2. ตรวจ plate ดผลการเพาะเชอทกวน ถาไมมเชอขนใหอบตอจนครบ 3 วน ถามเชอขนใหยอมแกรมและรายงาน

แพทยทดแลผปวยทราบทางโทรศพทแบบคาวกฤต และท�าการวนจฉยเชอทกตวและทดสอบความไวตอสาร

ตานจลชพ

3. ตรวจด FTM ทกวน อบจนครบ 7 วน ถามลกษณะขนสงสยวานาจะมเชอขน ให subculture บน BA, CA, MAC

และยอมแกรม ถาเชอทขนเปนชนดเดยวกบทขนใน primary plate ไมจ�าเปนตองวนจฉยซ�า แตถาพบขนใน FTM

เทานน ใหวนจฉยเชอรวมทงทดสอบความไวตอสารตานจลชพโดยไมตองระบจ�านวนเชอ ถา FTM ขน เพาะ

เชอไมขนในสภาวะปกตแตยอมสแกรมพบเชอใหสงสยวาอาจจะเปน anaerobic bacteria ใหรายงานผลการยอม

แกรมพรอมรปรางและควรสงไปวเคราะหตอ


1. ถาไมพบเชอใหรายงานวา “No growth after 3 days” (ตามแผนภมท 4.2-1)

2. ถาพบเชอจากการยอมแกรมใหรายงานแพทยทท�าการรกษาผปวยทางโทรศพททนท โดยท�าการบนทกการ

รายงานและชอผรบแจงผลไว

3. ถามเชอขนรายงานจ�านวนเปน numerous, moderate, few หรอ rare กรณเชอขนใน FTM อยางเดยว ให

รายงานชนดของเชอโดยไมตองบอกจ�านวน และถาเชอขนใน FTM หลงจากวนท 3 ไปแลว ใหรายงานผล

เปน additional report ตามไป

กำรตรวจหำแอนตเจนของเชอในน�ำไขสนหลงดวย วธ latex agglutination

การตรวจหาแอนตเจนของเชอทเปน capsular antigen ในน�าไขสนหลงดวยวธ latex agglutination เปนการทดสอบ

ทางหองปฏบตการ ทใชน�าเจาะไขสนหลง เพอชวยการวนจฉยการตดเชอในระบบประสาทไดรวดเรวกวาการเพาะเชอ

สามารถไดผลภายในครงชวโมง และการทดสอบนสามารถตรวจหาเชอทจ�าเพาะชนดไดดวยชดน�ายา latex agglutina-

tion ใชตรวจหาแอนตเจนของเชอแบคทเรยไดหลายชนด ไดแก Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae

type b, Neisseria meningitidis, E. coli K-1 และ Streptococcus agalactiae (Group B streptocoocci) สามารถใชตรวจ

หาแอนตเจนของเชอแบคทเรยในน�าไขสนหลงและน�าจากสวนตางๆ ของรางกายไดดวย ขอดของวธนคอไดผลรวดเรว

มความจ�าเพาะความไวสง สามารถใหผลดกวาการเพาะเชอโดยเฉพาะในรายทไดยาปฏชวนะมากอนเกบสงสงตรวจ


รายงาน latex agglutination negative หรอ positive ตามผลทไดและตองระบชนดของเชอดวยเมอไดผลตองรายงาน

แบบคาวกฤต


กำรเพำะเชอจำกน�ำในสวนตำงๆของรำงกำย

หลกกำร

น�าจากสวนตางๆของรางกายเชน น�าจากขอ (joint/synorial fluid) น�าจากปอด (pleurl fluid) น�าจากชองทอง

(peritoneal fluid) น�าจากถงหมหวใจ (pericardio fluid) ในภาวะปกตจะปราศจากเชอ การตดเชอในต�าแหนงดง

กลาว มความส�าคญทจะท�าใหผปวยเสยชวตได ดงนนการตรวจวนจฉยทรวดเรวและถกตองมความส�าคญอยางยง

เพอใชเปนแนวทางส�าหรบดแลผปวย การเพาะเชอในต�าแหนงเหลาน อาจท�าไดยากในบางครง เชออาจจะมจ�านวน

นอยในผปวยทใสสายตางๆเขาไปในรางกาย ผปวยทไดรบยากดภมคมกน การเกบสงสงตรวจจงตองระมดระวงการ

ปนเปอน เชออนทไมไดเปนเชอกอโรคอยางแทจรง เชอทกชนดทพบในสารน�าทภาวะปกตปราศจากเชอถอวาม

ความส�าคญ และตองรายงานเชอทกชนดทพบ

ขอบเขต

ขนตอนการตรวจรบสงสงตรวจ การเพาะเชอจากน�าจากสวนตางๆของรางกาย การอานผล การเพาะเชอ การ

รายงานผล เมอพบเชอจากการยอมแกรม การรายงานผลเมอเสรจสมบรณ

แบคทเรยทพบเปนสำเหตของกำรตดเชอแบงตำมประเภทของน�ำจำกสวนตำงๆ ของรำงกำยดงน

- แบคทเรยทเปนสาเหตของการตดเชอทพบใน joint/synovial fluid ไดแก

Staphylococcus aureus, β-hemolytic streptococci group A และ B (GAS,GBS), S. pneumoniae, Enterococcus spp.

Other streptococci, Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella

osloensis, Corynebacterium spp. และ Mycobacterium spp.

- แบคทเรยทเปนสาเหตของการตดเชอทพบใน pleural fluid ไดแก

S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, Enterobacteriaceae, Non-fermentative gram-negative bacilli,

other Streptococci, M. tuberculosis และ Nocardia spp.

- แบคทเรยทเปนสาเหตของการตดเชอทพบใน pericardial fluid ไดแก

S. aureus, S. pneumoniae, Group A Streptococcus, Enterobacteriaceae, other gram-negative bacilli และ

M. tuberculosis

- แบคทเรยทเปนสาเหตของการตดเชอทพบใน peritoneal fluid ไดแก

Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., S.aureus, Group A Streptococcus, Coagulase negative Stephylococcus

(CNS) และ Streptococcus pneumoniae, Haemophilus spp., anaerobic bacteria, และ nonfermentative

gram-negative bacilli


สงสงตรวจ

1. น�าจากขอ (joint/synovial fluid)

2. น�าจากเยอหมปอด (pleural fluid)

3. น�าจากถงหมหวใจ (pericardial fluid)

4. น�าจากเยอบชองทอง (peritoneal fluid)

ขอควรระวง ควรท�าการเพาะเชอทนทเมอไดรบสงสงตรวจ แตถายงท�าไมไดใหเกบในอณหภมหอง หามเกบใสตเยน


ใชหลกการและวธการตรวจเชนเดยวกบการเพาะเชอในน�าไขสนหลง โดยมรายละเอยดเพมเตม ในกรณเกบสง

สงตรวจไมสามารถสงหองปฏบตการไดทนท สามารถฉด sterile body fluid 5 ml ใสในขวด hemoculture ได

การตรวจวนจฉย peritoneal dialysis fluid (PDF) ในผปวยไตวาย ซงลางไต โดยการท�า peritoneal dialysis ทง

ในกรณ acute dialysis และในกรณทท�า CAPD (continuous ambulatory peritoneal dialysis) ผปวยจะไดรบการใส

น�ายาลางไตเขาไปในชองทอง การตรวจ PDF ในผปวยเหลานมวตถประสงคเพอตรวจหาภาวะการตดเชอในชอง

ทอง (peritonitis) อนเปนภาวะแทรกซอนทพบไดบอย เชอทเปนสาเหตสวนใหญเกดจากแบคทเรย มสวนนอยท

เกดจากเชอรา แบคทเรยทพบเปนสาเหตไดบอย ไดแก Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,

Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Acinotobacter spp., Enterobacteriaceae

เนองจากปรมาณเชอในน�า PDF โดยทวไปจะมนอยมาก (นอยกวา 1 ตว/10 ml ของ PDF) ดงนนแมจะปนแลว

มาตรวจโดยการยอมแกรมกมกจะไมพบเชอ การเพาะหาเชอจงนยมท�าโดยน�า PDF มาไมนอยกวา 10 ml ใสขวด

hemoculture อยางนอย 5 ml และท�าตามขนตอนการวนจฉยเชนเดยวกบ hemoculture แตมขอเสยคอ เชอทตองการ

เลอดในการเจรญเตบโต อาจไมขนในขวดส�าหรบเพาะเชอจากเลอด และตองใชเวลาในการรอคอยผลทเพมขนอยาง

นอยหนงวน เนองจากตอง subculture เชอจากขวดเพาะเชอ เพอน�าโคโลนของเชอมาท�าการวนจฉยเชอและทดสอบ

ความไวตอสารตานจลชพ

เพอเพมประสทธภาพการเพาะเชอจากน�า PDF ควรเกบตวอยางน�า PDF 50 ml น�าไปปนแยก โดยใชความเรว

2,500 rpm นาน 30 นาท ดดน�าใสสวนบนทง เหลอตะกอนกนหลอดประมาณ 0.5 ml เขยาผสมตะกอนดวย vortex

mixer เพอใชยอมและเพาะเชอ


แผนภมท 4.2-1 ขนตอนกำรตรวจวนจฉย น�ำไขสนหลงและน�ำจำกสวนตำงๆ ของรำงกำย

น�ำไขสนหลงจำกสวนตำงๆ ของรำงกำย (CSF)

ปรมาณนอยหรอขน ปรมาณมากและใส

ไมปน ปน 2,500 rpm นาน 15 นาท

แยก Sediment

ยอมสแกรม เพาะบน CA, BA, MC FTM

อบ 35±2 °C นาน 3 วน อบ 35±2 °C นาน 7 วน

พบเชอ ไมพบเชอ (ดการเจรญทกวน) (ดการเจรญทกวน)

รายงานทนท ไมรายงาน พบเชอ

พบเชอ ไมพบเชอ จ�าแนกชนด และ

ทดสอบความไวของเชอ

จ�าแนกชนด และ รายงาน ตอสารตานจลชพ

ทดสอบความไวของเชอ “No growth after 3 days”

ตอสารตานจลชพ รายงานผล

รายงานผล

หมำยเหต

1. FTM ควรอบจนครบ 7 วน ดการเจรญทกวน ถามความขนในสวนลาง อาจเปน anaerobic bacteria ใหน�า

มายอมสแกรม และเพาะบน BA ในบรรยากาศ CO2 35±2 °C นาน 2 วน ถาไมมเชอขน ใหรายงานผลการ

ยอมแกรมพรอมรปรางและสงเพาะเชอ anaerobic bacteria ตอไป

2. ควรดความสอดคลองของผลเพาะเชอทไดสมพนธกบการยอมแกรมหรอไม

3. ในรายทสงสยเชอราใหเกบ plate อยางนอย 1 สปดาห

4. ควรเกบสไลดทยอมแกรม เพอใชในการทวนสอบผลและสงสงตรวจไวระยะหนงในกรณทแพทยอาจขอเพม

รายการทดสอบเกบ CSF ทอณหภม 4 °C เพอใชในกรณทแพทยสงตรวจ PCR เพม


เอกสารอางอง 1. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Sterile Body Fluids, Dialysate, and

Urine. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC:

ASM Press; 1998. p. 63-66.

2. York MK, Church DL. Cerebrospinal Fluid Culture. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for

Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 3.7.1-8.

3. มาลย วรจตร. แบคทเรยกอโรค: Pathogenic Bacteria. กรงเทพฯ: สยามศลปะการพมพ; 2545.

4. วรรณา เพงเรองโรจนชย. การเพาะเชอจากเลอด. คมอการปฏบตงานแบคทเรยส�าหรบโรงพยาบาล

ศนยและโรงพยาบาลทวไป. นนทบร: กองโรงพยาบาลภมภาค; 2540. หนา 19-22.


4.3 การเพาะเชอจากปสสาวะสวรรณา ตระกลสมบรณ

หลกกำร

ปสสาวะ เปนสงสงตรวจทสงเพาะเชอในผปวยทมอาการตดเชอของทางเดนปสสาวะและผปวยทไมมอาการ

แตมความเสยงสงวาอาจตดเชอของทางเดนปสสาวะ เชอทเปนสาเหตของการตดเชอทางเดนปสสาวะสวนใหญ

เปนเชอเจรญเรวเพยงไมกชนด เชน Escherichia coli, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp.,

Proteus spp., และ Pseudomonas spp. ซงพบในผปวยทตดเชอจากชมชนและตดเชอในโรงพยาบาล

การตรวจหาแบคทเรยกอโรคจากปสสาวะ สามารถใชวนจฉยการตดเชอแบคทเรยในระบบทางเดนปสสาวะ ซง

ตองทราบชนดและปรมาณของเชอแบคทเรยทเปนสาเหตของการตดเชอ การตรวจทางหองปฏบตการส�าหรบการ

วนจฉยโรคตดเชอในทางเดนปสสาวะจงตองท�าการเพาะเชอ เพอหาชนดของเชอแบคทเรยทเปนสาเหตของการตด

เชอ และตรวจนบจ�านวนเชอแบคทเรยทพบในสงสงตรวจนนดวย

ในภาวะปกตปสสาวะเปนน�าจากรางกายทปราศจากเชอ ถาเกบอยางถกตอง แตอาจปนเปอนเชอจากบรเวณท

ปสสาวะผานออกมาหรอทอยขางเคยง เชน perineum, prostate, urethra หรอ vagina จงควรมรายละเอยดในการ

เกบปสสาวะใหผรบบรการ (ดวธการเกบจากบทท 2) ตวอยางทใชในการเพาะเชอสวนใหญใช midstream urine


1. กำรท�ำ colony count โดยใช standard calibrated loop

1.1 น�าขวดทบรรจสงสงตรวจมาเขยาเบาๆใหปสสาวะเปนเนอเดยวกน

1.2 ใช calibrated loop ขนาด 0.001 ml หรอ 0.01 ml จมในแนวดงลงในสงสงตรวจแลวยก loop ขนตรงๆ

จะไดสงสงตรวจตดเตม loop พอด

1.3 น�าไปเพาะบนอาหารเลยงเชอ BA โดย streak เปนเสนตรงบรเวณกลางจานเพาะเชอ จากดานบน

จนถงดานลาง จากนนใหน�า loop เดมขดเปนเสนตรงใหตงฉากกบแนวเดม ขดไปมาถๆ หลายๆ ขด

คลายกางปลา ดงรป

ภำพท 4.3-1 วธกำรเพำะปสสำวะบน BA


1.4 ท�าการเพาะเชอลงบน MACโดย streak ดวย loop ปราศจากเชอใหโคโลนแยกกน

1.5 อบจานเพาะเชอท 35 °C นาน 24 ชม. แลวน�ามาตรวจดและนบจ�านวนโคโลนของแบคทเรย ใหอบจาน

เพาะทสงสยยสตหรอเชอราจนครบ 48 ชม. จงนบจ�านวนโคโลน

1.6 อบจานเพาะเชอครบ 24 ชม. แลวไมพบเชอแบคทเรย หรอครบ 48 ชม. แลวไมพบยสตหรอเชอรา รายงาน

“No growth after 1 (or 2) day”

1.7 อบจานเพาะเชอครบ 24 ชม. แลวพบเชอแบคทเรย หรอครบ 48 ชม. แลวพบยสตหรอเชอรา ท�าการนบ

ชนดและจ�านวนโคโลนของเชอทเจรญบน BA แลวรายงานผลเปนจ�านวน colony forming unit ในปสสาวะ

1 ml (CFU/ml)

การนบจ�านวนเชอแบคทเรยในปสสาวะ ท�าการนบจ�านวนแบคทเรยทเจรญบน BA โดยถาใช calibrated loop

ปรมาตร 0.001 ml ใหคณจ�านวนแบคทเรยทนบไดดวย 1,000 แตถาใช calibrated loop ปรมาตร 0.01 ml ใหคณ

จ�านวนแบคทเรยทรบไดดวย 100 จะไดจ�านวนแบคทเรยมหนวยเปน CFU/ml เชน ใช calibrated loop ขนาด

0.001 ml นบเชอได 1 โคโลน ใหรายงานเชอ = 103 CFU/ml

ตำรำงท 4.3-1 กำรค�ำนวณจ�ำนวนโคโลนทนบไดเมอใช loop เทยบมำตรฐำน 0.001 ml

จ�ำนวนโคโลนทนบได จ�ำนวนเชอทรำยงำนเปน CFU/ml

1 103

10 104

100 105

>100 >105

1.8 น�าเชอทเพาะได colony count ตามเกณฑในตารางท 4.3-1ไปตรวจวนจฉยชนดของเชอและ ทดสอบ


2. กำรเพำะเชอและท�ำ colony count โดยใช Bacteruristrip

2.1 เขยาปสสาวะเบาๆ ใหปสสาวะเปนเนอเดยวกน

2.2 ใชปากคบทปราศจากเชอคบแถบ Bacteruristrip จมลงในปสสาวะใหถงขดทก�าหนดไว รอ

ใหปสสาวะดดซบเขากระดาษกรองประมาณ 5 วนาท

2.3 แตะ Bacteruristrip ลงบน plate อาหารเลยงเชอ BA กดใหสวนทเปยกปสสาวะแนบสนทกบ

ผวหนาของอาหารเลยงเชอ ประมาณ 10 วนาท แลวยกขน น�าแถบทจมปสสาวะทงแบบขยะ

ตดเชอ (บรเวณนส�าหรบท�า colony count)

2.4 ใชแถบ Bacteruristrip อกแผนจมปสสาวะแลวน�าไปแตะบน BA plate เดยวกนบนต�าแหนง

หางจากรอยแรก และแตะบน MAC แลว streak ดวย loop ปราศจากเชอใหโคโลนแยกกน

2.5 อบ plate ท 35 °C นาน 24 ชม. แลวน�ามาตรวจดและนบจ�านวนโคโลนของแบคทเรย ถาไมพบ

เชอแบคทเรยใหอบตออก 24 ชม. แลวน�ามาอาน plate ใหม จงนบจ�านวนโคโลน


ตำรำงท 4.3-2 กำรค�ำนวณจ�ำนวนโคโลนทนบไดเมอใช Bacteruristrip

จ�ำนวน โคโลน ทนบได จ�ำนวนเชอทรำยงำนเปน CFU/ml

1-6 103

7-20 104

21-34 105

> 35 >105

2.6 น�าเชอทเพาะ colony count ไดตามเกณฑในตารางท 4.3-2 ไปตรวจวนจฉยชนดของเชอและ ทดสอบ



การนบจ�านวนเชอแบคทเรยในปสสาวะ ท�าการนบจ�านวนโคโลนทเจรญบน BA โดยถาใช calibrated loop

ปรมาตร 0.001 ml. ใหคณจ�านวนโคโลนทนบไดดวย 1,000 แตถาใช calibrated loop ปรมาตร 0.01 ml ใหคณจ�านวน

โคโลนทรบไดดวย 100 จะไดจ�านวนแบคทเรยมหนวยเปน CFU/ml

ถาใช paper strip ใหนบชนดและจ�านวนโคโลนของเชอทเจรญบนรอย streak แลวเทยบเปนจ�านวน colony

forming unit ในปสสาวะ 1 ml และรายงานผลเปน CFU/ml ถามเชอแบคทเรยมากกวา 1 ชนด ใหนบโคโลนและ

รายงานแตละชนดแยกกน ถามเชอเจรญบน BA และ MAC หากเปนเชอชนดเดยวกน ใหนบและรายงานผลจ�านวน

โคโลนจาก BA

เชอทขนนอยกวา 104 CFU/ml ไมตองแยกวนจฉยชนดของเชอและไมท�าการทดสอบความไวตอสารตาน

จลชพ ยกเวน Staphylococcus saprophyticus, Salmonella spp. และ Burkholderia pseudomallei ตองท�าการทดสอบ

ความไวตอสารตานจลชพเสมอแม colony count นอยกวา 104 หรอ 103 CFU/ml


1. การรายงานผล เมอไมพบการเจรญชองเชอบนอาหารเลยงเชอ รายงาน “No growth after 2 days”

2. การรายงานผลเมอพบเชอบนอาหารเลยงเชอ ใหรายงานจ�านวนเชอทพบเปน CFU/ml ตามดวยชอเชอ และ

ผลความไว (ถาม) เชน 105 CFU/ml of Escherichia coli

3. กรณทพบเชอหลายชนด (≥3 ชนด) ใหรายงานวา “Mixed culture, please repeat”

การแปลผลการเพาะเชอจากปสสาวะ เพาะไดเชอหนงชนดทมปรมาณมากกวาหรอเทากบ 105 CFU/ml ถอวา

มนยส�าคญบงชถงภาระการตดเชอในทางเดนปสสาวะจากเชอทเพาะได ในเดกและผปวยทมอาการทางคลนกหรอ

เพาะเชอไดชนดเดยว หรอพบเมดเลอดขาวปสสาวะรวมดวยอาจใชเกณฑพบเชอนอยกวา 104 CFU/ml เปนนย

ส�าคญบงชการตดเชอ ถาพบเชอหลายชนดปนกนในปรมาณใกลเคยงกนมกบงชการปนเปอนและไมมความส�าคญ

ทางคลนก การตดเชอหลายชนดผสมกนอาจพบไดแตไมบอย จงควรสงตวอยางตรวจซ�า ตวอยางทเกบโดยตรงจาก

สายสวนไตหรอจากการเจาะกระเพาะปสสาวะอาจใชเกณฑพบเชอปรมาณนอยกวา 102 CFU/ml เปนนยส�าคญใน


การแปลผลการตดเชอ เมอพจารณารวมกบอาการทางคลนก เนองจากการแปลผลการเพาะเชอจากปสสาวะทมวธ

การเกบทตางกนใชเกณฑทตางกนดงแสดงในตาราง 4.3-3 ทางหองปฏบตการจงตองทราบวธการเกบตวอยาง

ปสสาวะ และตองระบวธการเกบตวอยางปสสาวะในใบรายงายผลเสมอ

การเพาะเชอแบคทเรยจากปสสาวะตองท�าทนทหลงเกบปสสาวะเนองจากแบคทเรยสามารถแบงตวเพมจ�านวน

ในน�าปสสาวะถาทงไวนานเกน 1 ชม. จะท�าใหปรมาณของเชอเพมมากกวาความเปนจรงและมผลตอการแปลผล

การตรวจ

ตำรำงท 4.3-3 เกณฑพจำรณำน�ำเชอไปแยกวนจฉยชนดและทดสอบควำมไวตอสำรตำนจลชพ ส�ำหรบ

แบคทเรยทแยกไดจำกปสสำวะ

จ�ำนวน

ชนดของเชอท

เพำะไดใน


Colony count

(CFU/ml)

กำรแยกวนจฉยชนดและกำรทดสอบควำมไวตอสำรตำนจลชพ

ปสสำวะ

ชนด A Midstream urine

ปสสำวะ

ชนด B Catheter urine

1 ชนด

≥ 105 ID และ AST ID และ AST

104 Ignore ID และ AST* ID และ AST

103 Ignore ID และ AST** ID และ AST ถาเปน Pathogen

2 ชนด

เชอแตละชนด ≥ 105 ID และ AST ทงสองชนด ID และ AST

เชอชนดแรก ≥ 105 ID และ AST Ignore ID และ AST ถาเปน

Pathogen (โดยทวไปเชอกอโรคม

ตวเดยว)เชอชนดทสอง < 105 Ignore

เชอแตละชนด < 105 Ignore

3 ชนด

เชอแตละชนด ≥ 105 Mixed organisms > 3 types

โปรดสงตรวจซ�า

Mixed organisms > 3 types


เชอชนดแรก ≥ 105 ID และ AST Ignore ID และ AST ถาเปน

Pathogen (โดยทวไปเชอกอโรคม

ตวเดยว)เชอชนดทสอง < 105 Ignore

เชอชนดทสาม < 105 Ignore

เชอแตละชนด < 105 Mixed organisms > 3 types


Mixed organisms > 3 types



ชนด A คอ Midstream urine, neonatal bagged urine, indwelling catheter (Foley catheter urine, ileal conduit

urine suprapubic catheter) และ ชนด B คอ In and out catheter urines, suprapublic-tapped urine

ID = Identification, AST = Antimicrobial susceptibility test

Ignore = ไมตองแยกวนจฉยชนดของเชอและไมท�าการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ ยกเวน Staphylococcus

saprophyticus, Salmonella spp., และ Burkholderia pseudomallei ตองท�าการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ

เสมอแม colony count นอยกวา 104 หรอ 103 CFU/ml

* = เชอทแยกไดจากผปวยทไดรบสารตานจลชพ หรอผปวยชายทมอาการตดเชอในระบบปสสาวะ

** = เชอทแยกไดจากผปวยทมอาการตดเชอในระบบปสสาวะ

เอกสำรอำงอง

1. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Infection of the Urinary Tract. In: Bailey& Scott’s

Diagnostic Microbiology, 12th ed. St. Louis: Mosby Elsevier; 2007. p. 842-55.

2. Microbiology Department. Procedure Manual of Mount Sinai Hospital/ Toronto Medical

Laboratories Shared Microbiological Service: Section Urine culture manual; Toronto: Mount

Sinai Hospital; 2004.

3. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Urine Cultures. In: Isenberg

HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press;

1998. p. 95-101.


4.4 การเพาะเชอจากอจจาระ/Rectal Swabสวรรณา ตระกลสมบรณ

สจตรา มานะกล

หลกกำร

สงสงตรวจทไดจากทางเดนอาหาร เชน อจจาระ หรอ rectal swab เปนสงสงตรวจทมเชออนๆ นอกเหนอจาก

เชอกอโรคปนเปอนจ�านวนมาก เพราะเปนแหลงทมเชอ normal flora หลากหลายชนดในปรมาณมาก มทง gram-positive

bacteria และ gram-negative bacteria และเชอกอโรคทพบอาจมปรมาณเพยงเลกนอย การเพาะเชอจงตองมขนตอน

การท�า enrichment เพอเพมจ�านวนเชอกอโรค และตองมขนตอนเพาะเชอดวย selective media เพอลดปรมาณ

normal flora จงสามารถเพมประสทธภาพการตรวจหาเชอกอโรค

การตดเชอของทางเดนอาหารอาจมสาเหตจากจลชพตางๆ ในการเพาะเชอแบคทเรยทเปนสาเหตอจจาระรวง

ในงาน routine ควรค�านงถงเชอทพบไดบอยและสามารถเพาะไดงาย แมวาแบคทเรยบางชนดอาจพบไดในอจจาระ

ของผปวยทไดรบสารตานจลชพชนด broad-spectrum เชน Pseudomonas aeruginosa, Candida spp., Staphylococcus

aureus บทบาทในการท�าใหเกดอจจาระรวงยงไมชดเจน การตรวจพบเชอเหลานจ�านวนมากในอจจาระ อาจรายงาน

ใหผใชบรการ โดยระบดวยวาพบเปน predominate microorganism

ขอบเขต

การรบสงสงตรวจ คณภาพอจจาระ/rectal swab ทสงเพาะเชอ อาหารเพาะเลยงเชอทใช วธการเพาะเชอ การอาน

ผล และการรายงานผล

กำรเกบสงสงตรวจ

สงสงตรวจส�าหรบเพาะเชอจากระบบทางเดนอาหารมสองชนด คอ อจจาระและการปายอจจาระทปนเปอน

บรเวณรอบๆ รทวารหนก ทเรยกวา rectal swab

1. อจจาระ (feces, stool):

1.1 การเกบตวอยาง

1.1.1 เกบอจจาระบรเวณทผดปกต เชน เหลว เปนมกเลอด เปนตน ประมาณ 2 g

1.2 ภาชนะบรรจ

1.2.1 ขวดหรอกระปกสะอาด ปากกวาง ฝาเกลยวปดสนท สงใหถงหองปฏบตการภายใน 1 ชม.ท

อณหภมหอง

1.2.2 เกบใส Cary-Blair transport medium โดยใชไม swab ปายอจจาระ ประมาณ 2 g จมลงในอาหาร

เลยงเชอใหมด swab น�าสงทนท กรณทจ�าเปนควรสงภายใน 24 ชม. ทอณหภมหอง

2. rectal swab

2.1 การเกบตวอยาง

2.1.1 ใชไมพนส�าลสอดเขารทวารหนก ลกประมาณ 1 นว

2.1.2 หมนไมพนส�าลรอบกนแบบปาด เพอใหไดเนออจจาระ

2.1.3 ดงไมพนส�าลออก ควรเหนเนออจจาระตดบนส�าลจงจะเปนการเกบตวอยางทด


2.2 ภาชนะบรรจ

2.2.1 ไมพนส�าลทเกบอจจาระไดใสขวดสะอาด สงใหถงหองตรวจภายใน 1 ชม.

2.2.2 Rectal swab ทใสใน Cary-Blair transport medium น�าสงทนท กรณทไมสามารถสงทนทควรสง

ภายใน 24 ชม. ทอณหภมหอง

ขอควรระวง

1. การเกบอจจาระ เพอเพาะเชอกอโรค ไมแนะน�าใหท�าในผปวยทนอนในโรงพยาบาลมากกวา 3 วน หาก

ผปวยนอนในโรงพยาบาลมากกวา 3 วน และมอาการอจจาระรวงควรค�านงถงเชอ Clostridium difficile

2. อจจาระทตองเพาะเชอควรเปนทถายใหมๆ ไมควรเกบไวนาน เนองจากเชอกอโรคอจจาระรวงโดยเฉพาะ

Vibrio cholera ตายงายในอณหภม ทสงกวา 30 °C

3. การเกบ rectal swab ใหท�าเฉพาะในผปวยเดก ส�าหรบผใหญควรเกบเปนอจจาระ ยกเวนกรณทเกบอจจาระ

ไมได การเพาะเชอจากอจจาระมความไวในการตรวจหาเชอทเปนสาเหตของโรคอจจาระรวงมากกวาสงสง

ตรวจทเปน rectal swab เพราะมปรมาณเชอนอยกวาและสงสงตรวจอาจแหงเกนไปจนเชอตาย

4. อจจาระทน�าสงเพาะเชอนานเกน 2 ชม. ตองใสใน Cary-Blair transport medium เพอรกษาไมใหเชอตาย โดย

เฉพาะ Campylobacter และ Vibrio spp. และควรลดปรมาณ agar ใน Cary-Blair medium จาก 0.5% เปน

0.16% ส�าหรบเชอ Campylobacter spp. และเชอทงสองชนดทกลาวนไมสามารถเกบรกษาใน transport

medium ทม glycerol

แบคทเรยประจ�ำถนในระบบทำงเดนอำหำร ไดแก

- Escherichia coli - Klebsiella spp.

- Enterobacter - Proteus

- Citrobacter - Morganella

- Providencia - Seratia

- Pseudomonas - Alcaligenes faecalis

- Lactobacillus - Enterococci

- Anaerobic bacteria - Coagulase-negative staphylococci

แบคทเรยกอโรคในระบบทำงเดนอำหำร ไดแก

1. Infectious diarrhea

- Salmonella spp. - Shigella spp.

- Vibrio spp. - Aeromonas spp.

- Plesiomonas shigelloides - Yersinia enterocolitica

- Escherichia coli (EPEC, ETEC, EHEC, EIEC)

- Campylobacter jejuni - Campylobacter coli

- Campylobacter spp. - Clostridium difficile

- Clostridium perfringens - Bacillus cereus


2. Toxin producing

- Staphylococcus aureus

- Bacillus cereus

- Clostridium botulinum

3. กระเพาะอาหารอกเสบหรอแผลทกระเพาะอาหาร ล�าไสเลกสวนตน

(gastritis, gastric and duodenal ulcers)

- Helicobacter pylori

กำรเพำะเชอจำกระบบทำงเดนอำหำรเพอหำเชอกอโรค

อาหารเพาะเลยงเชอส�าหรบตรวจหาเชอทเปนสาเหตของโรคอจจาระรวง ตองมหลายชนด เพอใหได

ประสทธภาพจงตองเพาะเลยงทงในอาหารเหลวและอาหารวนพรอมกนทงทเปนอาหาร enrichment เพอเพมจ�านวน

เชอกอโรคทจ�าเพาะ และตองมขนตอนเพาะเชอดวย selective media เพอลดปรมาณ normal flora เมออาหารเหลว

มเชอขนตองน�ามาเพาะแยกเชอบนอาหารวน เพอน�าโคโลนของเชอมาแยกวนจฉยชนดของเชอและทดสอบความ

ไวตอสารตานจลชพ อาหารทใชเพาะเลยงมดงน

1. Enriched media: BA

2. Differential media: MAC

3. Selective media: SS, XLD และ TCBS

4. Enrichment media: GN broth และ APW

ตำรำงท 4.4-1 เชอและอำหำรเลยงเชอทเกยวของ

เชอ อำหำรเพำะเลยงเชอทเหมำะสม

Salmonella spp.

Shigella spp.

GN broth, XLD*, MAC*

MSRV และ GN broth ใชส�าหรบเลยงเชอ Salmonella spp.

Vibrio spp. APW, TCBS

Yersinia enterocolitica Yersinia selective agar base, Bile esculin agar

Campylobacter spp. BA base No.2, Campylobacter selective medium

1. ปายอจจาระหรอ rectal swab ลงบน BA, MAC, SS หรอ XLD และ TCBS ใหไดโคโลนแยกจากกน

2. ใสสงสงตรวจใน GN broth, APW และ BPW

3. น�าจานเพาะเลยงและหลอดอาหารเหลวทงหมด อบท 35-37 °C เปนเวลา 18-24 ชม. ส�าหรบ APW

อบ 6-8 ชม. และอบ BPW ท 42 °C เปนเวลา 24 ชม.

4. เพาะเชอจาก APW ลงบน TCBS, เพาะเชอจาก GN broth ลงบน SS อบท 35-37 °C เปนเวลา 18-24 ชม.

และเพาะเชอจาก BPW ลงบน MSRV อบท 42 °C เปนเวลา 18-24 ชม.


5. ตรวจเชอทขนบนอาหารแตละชนด เพอน�าโคโลนบน SS และ MSRV ทสงสย Salmonella หรอ Shigella

และโคโลนสเหลองและสเขยวบน TCBS ไปทดสอบแยกชนดของเชอโดยวธทางชวเคม

6. น�าเชอบน TSI ทสงสย Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae O1 และ Vibrio cholerae O139 ไปท�า slide

agglutination test กบ antiserum ทจ�าเพาะตอเชอ เพอรายงานผลขนตน

7. ท�าการทดสอบความไวตอสารตานจลชพเฉพาะเชอกอโรค

8. รายงานผลการเพาะเชอและผลการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ

แบคทเรยกอโรคทตรวจพบ

Shigella เปน non-hydrogen sulfide producing nonlactose fermenter Enterobacteriaceae ม 4 species 4 sero-

groups คอ S. dysenteriae group A, S. flexneri group B, S. boydii group C และ S. sonnei group D

Salmonella สวนใหญเปน nonlactose fermenter ทสราง hydrogen sulfide ยกเวน serovar Arizona ทมก ferment

lactose และ serovar Paratyphi-A ทไมสราง hydrogen sulfide Salmonella เปนสาเหตของโรคไทฟอยด อาหารเปน

พษ และโลหตเปนพษ ไดแก S. Paratyphi-A, S. Paratyphi-B, S. Paratyphi-C, S. Typhimurium, S. Enteritidis,

S. Choleraesuis, S. Typhi และ S. Arizona

Vibrio เปน gram-negative curved rod ลกษณะแทงโคงงอคลาย comma-shape ใหผล oxidase บวก

V. cholerae มหลาย serogroup แตทท�าใหเกดอหวาตกโรคทมอาการทองรวงรนแรงคอ serogroup O1 และ

O139 serogroup O1 ยงแบงเปน biotype Classical และ El tor ส�าหรบ serogroup อนมกเรยกวาเปน non

agglutination Vibrio หรอ NAG-Vibrio ท�าใหเกดทองเสยธรรมดาหรอตดเชอในระบบอนๆ ของรางกาย Vibrio

species ทกอโรคไดบอยคอ V. parahaemolyticus เปนสาเหตของอาหารทะเลเปนพษ และV. vulnificus เปน lactose

fermenter Vibrio เปนสาเหตของการตดเชอทแผล และโลหตเปนพษรนแรงถงแกชวต

Aeromonas เปนแทงตรง curve rod หรอ coccobacilli ทใหผล oxidase บวก แยกไดจากน�าจด น�ากรอยทสกปรก

และแผลของสตวน�า A. hydrophila เปนสาเหตของอาหารเปนพษและการตดเชอนอกระบบทางเดนอาหาร

A. caviae และ A. veronii biovar sobria เปนเชอกอโรคเชนเดยวกน

Plesiomonas shigelloides ท�าใหเกดโรคเชนเดยวกบ Aeromonas มลกษณะผลการทดสอบทางชวเคม และ

O antigen คลายกบ Shigella sonnei มาก แต P. shigelloides เคลอนท และใหผล arginine dihydrolase, lysine และ

ornithine decarboxylase เปนบวก

Campylobacter และ Helicobacter รปรางเปน pleomorphic spiral, half spiral คลาย S-shape, gull wing shape

หรอ comma shape อาจพบเปนแทงหรอ coccoid เปน microaerophilic เจรญในบรรยากาศทม CO2 3-5% และ

ม O2 3-15% เชอทพบกอโรคระบบทางเดนอาหารและระบบอนๆ ในคนไดบอย คอ C. jejuni, C. coli เจรญ

ท 42 °C ไดด C. fetus ตดตอจากสตวมาสคนท�าใหเกดโลหตเปนพษ

Helicobacter pylori ไมไดเปนสาเหตของโรคอจจาระรวงแตท�าใหเกดแผลทกระเพาะอาหารและล�าไสสวนตน

gram-negative half spiral bacilli หรอ gull wing shape เจรญแบบ microaerophilic ท 37 °C ในบรรยากาศทม

O2 5%, CO

2 10% และ N

2 85% สามารถเพาะเชอใน microaerophilic condition ใน anaerobe incubation jar ทไมม

catalyst แต supplement ดวย gas-generating agent การเพาะเชอตองกรองอจจาระทผสมกบน�าเกลอ 1 ml โดยหยด

ลงบนกระดาษกรองขนาด 0.65 μm ทวางบนผวของอาหารเลยงเชอ อบท 37 °C นาน 1 ชม. ในภาวะ microaerophilic

เพอกรองเอาเชออนๆ ออกไปใหมแตเชอ Campylobacter spp. อยบนผววน โดยดงแผนกระดาษกรองออกแลวบม

จานเพาะเลยงตอท 42 °C ในภาวะ microaerophilic



1. กรณพบเชอกอโรค ใหรายงานผลชอเชอ และผลการทดสอบความไวตอสารตานจลชพ (ยกเวน S. aureus

เพราะเชอนไมสราง toxin ในล�าไส)

2. กรณไมพบเชอกอโรค รายงาน

“No Salmonella, Shigella, Vibrio, Aeromonas or Plesiomonas isolated“

หากพบเชอกอโรค Salmonella spp., Shigella spp. หรอ Vibrio cholerae หลงการท�า serum grouping ใหเกบ

เชอใส NA สงตรวจยนยน และท�า strain typing ทศนยวทยาศาสตรการแพทยหรอกรมวทยาศาสตรการแพทย เพอ

เฝาระวงการระบาดในระดบประเทศและนานาชาต ส�าหรบเชอ Vibrio cholerae เมอพบตองรายงานดวนไปยงหนวย

งานทสงตวอยางและงานควบคมโรคตดเชอ เพอสอบสวนและเฝาระวงทางระบาดวทยา


แผน

ภมท

4.4

-1 ข

นตอ

นกำ

รตรว

จวน

จฉย

เชอจ

ำกอจ

จำระ

/Rec

tal S

wab

stoo

l or r

ecta

l sw

ab c

ultu

re

enric

hmen

t

GN

bro

thA

PWbu

ffer

PW

ทำเ

หมอ

น d

irect

pla

ting

iden

tifica

tion

+ su

scep

tibili

ty te

stin

g

repo

rt

repo

rt

iden

tifica

tion

+ su

scep

tibili

ty te

stin

g

slid

e ag

glut

inat

ion

dire

ct p

latin

g

MA

C (o

r EM

B)

XLD

TCB

S



1. Abbott S.L, Janda JM Farmer III J J. Vibrio and Related Organisms. In Versalovic J, Carroll KC,

Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock Dw, editor. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed.

Washington, DC: ASM Press; 2011. p.666-676.

2. Atlas RM, Synder JW. Reagents, Stains, and Media: Bacteriology. In: Versalovic J, Carroll KC,

Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology, 10th ed.


3. Baron EJ, Thomson RB. Specimen Collection, Transport, and Processing: Bacteriology.

In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor.

Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.228-271.

4. Centers for Disease Control and Prevention. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae,

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/Laboratory-Methods-for-the-Diagnosis-of-Vibriocholerae-chapter-6.pdf.

5. Garcia, L.S., 2010, Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. ASM Press.

6. Hornema, AJ, Ali A. Aeromonas. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML,

Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. Washington, DC: ASM Press;

2011. p.658-665.

7. Jones TF, Keene WE. Investigation of Enteric Disease Outbreaks. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G,

Jorgensen JH, Landry ML,Warnock DW, editor. Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. Vol 1.


8. Linscott AJ. Specimen Collection, Transport, and Acceptability. In: Garcia LS. Clinical Microbiology

Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM Press; 2010. P 2.1.1-2.1.26.

9. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Bacterial Fecal Cultures.

In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press;

1998. p. 90-94.

10. ภารด สมานชย. การวนจฉยแบคทเรยจากระบบทางเดนอาหาร ในคมอการปฏบตงานแบคทเรยส�าหรบ

โรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป. กรงเทพมหานคร: ส�านกงานปลดกระทรวงสาธารณสข; 2540.


4.5 การเพาะเชอจากระบบทางเดนหายใจสดาลกษณ ธญญาหาร

หลกกำร

การเพาะเชอจากล�าคอสวนใหญใชวนจฉย Streptococcal pharyngitis และคอตบ แบคทเรยทพบเปนสาเหต

ของ pharyngitis ทพบบอยคอ Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus ;GAS) การเพาะเชอในงาน routine

จงควรเปนวธทสามารถแยกเชอ Streptococcus pyogenes ทมจ�านวนนอยๆได คอตบเปนโรคตดเชอเฉยบพลนของ

ทางเดนหายใจสวนบน เชอทเปนสาเหตคอ Corynebacterium diptheriae ชนดทสรางสารพษ (toxin) ซงท�าใหเกด

pseudomembrane ท pharynx การยนยนอาการทางคลนกนอกจากจะแยกเชอใหไดแลวตองพสจนวาเชอสามารถ

สรางสารพษ (toxin) ไดดวย

แมการตดเชอของทางเดนหายใจสวนลางพบเปนสาเหตการตายและพการ แตการวนจฉยโรคมความยงยาก

เพราะสงสงตรวจมการปนเปอนของเชอประจ�าถนของระบบทางเดนหายใจสวนบน ซงเชอประจ�าถนเหลานบาง

ชนดอาจเปนสาเหตการตดเชอของทางเดนหายใจสวนลาง หองปฏบตการจงตองแนใจวาสงสงตรวจทน�ามาตรวจ

เปนสงสงตรวจทเหมาะสม โดยตองตรวจดวยกลองจลทรรศนเพอดคณภาพของสงสงตรวจโดยดเซลลทแสดงวา

มการอกเสบของระบบทางเดนหายใจคอ polymorphonuclear cells

ขอบเขต

การรบสงสงตรวจ คณภาพสงสงตรวจจากทางเดนหายใจสวนบนและสวนลางทสงเพาะเชอ วธการเพาะ

เชอ การอานผลและการรายงานผล

กำรเพำะเชอจำกระบบทำงเดนหำยใจสวนบน

สงสงตรวจจากทางเดนหายใจสวนบน มดงน

1. สงสงตรวจปายจากล�าคอ (throat swab) ปายจากโพรงจมก (nasopharyngeal swab) เกบใสใน Amies/Stuart’s

transport media (กรณหาเฉพาะเชอ S. pyogenes หรอ C. diphtheriae ซงทนตอความแหงไดด สามารถสงใน

ลกษณะไมพนส�าลแหงๆใสในหลอดหรอภาชนะปราศจากเชอน�าสงภายใน 1 วน

2. สงสงตรวจทเปน sinus aspirate, tracheal suction, nasopharyngeal suction ใสในภาชนะปราศจากเชอ

3. สงสงตรวจทเปน tracheal suction, nasopharyngeal suction สงมาในรป tip (ทอยาง) ใน transport media

แบคทเรยประจ�าถนในระบบทางเดนหายใจสวนบน ไดแก

- α-hemolytic streptococci - Neisseria spp. ทไมใช Neisseria gonorrhoeae

- Non-hemolytic streptococci - Moraxella catarrhalis

- Haemophilus haemolyticus - Non-group A β-hemolytic streptococci

- Staphylococcus coagulase-negative - coliform bacilli

- Yeast (รวม Candida albicans) - Diphtheroids

- Anaerobes - Spirochetes


แบคทเรยกอโรคในระบบทางเดนหายใจสวนบน ไดแก

- β-hemolytic streptococcus group A - Burkholderia pseudomallei

- Corynebacterium diphtheriae - Streptococcus pneumoniae

- Neisseria meningitidis (carrier) - Haemophilus influenzae

- Bordetella pertussis - Bordetella parapertussis

- Neisseria gonorrhoeae - Staphylococcus aureus

- Moraxella (Branhamella) catarrhalis

- Predominate gram-negative bacilli

เชอรากอโรค เชน Candida albicans

แผนภมท 4.5-1 ขนตอนกำรเพำะเชอจำก throat swab และ nasopharyngeal swab


กรณตองกำรหำแบคทเรยกอโรคบำงชนดโดยเฉพำะ อำหำรเลยงเชอทเหมำะสม

(แพทยระบเพมในใบสงตรวจเพอเลอกใชอาหารเลยงเชอเพม )

- หาเชอ C. diphtheriae กอใหเกดโรคคอตบ* CTBA*

-หาเชอ N. gonorrhoeae กอใหเกด gonococcal pharyngitis ** MTM

- หา carrier ของเชอ N. meningitidis ในล�าคอ ** MTM

- หาเชอ H. influenzae ในคอของเดกทเกบเสมหะไมได ** CA***

- หาเชอ B. pertussis กอโรคไอกรน BG

* C. diphtheriae โคโลนสด�าบน CTBA พสจนเชอแลวตองตรวจวามการสราง exotoxin หรอไม

** N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae ตองทดสอบหา enzyme β-lactamase ดวย

*** ถาไมม CA ใหใชเชอ S. aureus ขดบน BA ทปลายระนาบแรกและทระนาบสดทาย กอนน�าไป

อบในบรรยากาศ 5% CO2 หรอ candle jar

แผนภมท 4.5-2 ขนตอนกำรเพำะเชอจำก sinus aspirate, tracheal suction, nasopharyngeal suction

จนครบ 3 วน±2


วธกำรเพำะเชอจำก throat swab, nasopharyngeal swab

1. ปาย swab ลงบน BA, MAC และอาหารเลยงเชอเพมเตม (ถาม) อยางละ 1 plate โดยหมน swab ขณะปาย

เพอใหเชอลงบนอาหารใหมากทสด

2. Streak plate 4 ระนาบ เพอใหไดโคโลนทแยกจากกน น�าไปอบท 35 ± 2 °C นาน 3 วน โดย BA, CA และ

MTM บมในบรรยากาศ 5-10% CO2 หรอใสใน candle jar

วธกำรเพำะเชอจำก sinus aspirate, tracheal suction, nasopharyngeal suction

ใช Pasteur pipette ปราศจากเชอดดสงสงตรวจ หยดลงบน CA, BA , MAC plate ละ 1หยด streak plate และ

น�าไปอบท 35 ± 2 °C ส�าหรบ CA ใหเพาะในบรรยากาศ 5% CO2

(กรณสงมาในรป tip หรอทอยางใน transport media ใหคบชนสายยางใสลงใน brain heart infusion broth หรอ

trypticase soy broth ประมาณ 3 ml แลวน�าไป mix ดวย mixer เพอใหเชอหลดออกมา แลวน�าไปเพาะบนอาหาร

เลยงเชอตอไป)


1. หลงอบท 35 ± 2 °C 18-24 ชม. แลวตรวจดวามเชอเจรญหรอไม หากไมมเชอเจรญใหอบตออกจนครบ

3 วนแลวรายงาน “No growth after 3 days”

2. plate ทมเชอเจรญใหตรวจดวาเชอทเจรญมความส�าคญหรอไม โดยพจารณาชนดและปรมาณเชอทเจรญ

เปรยบเทยบกบเชออน แลวท�าการวนจฉยเชอทอาจเปนสาเหตของโรค โดยรายงานจ�านวนเชอ (numerous,

moderate, few หรอ rare) ชนดของเชอ และท�าการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพเฉพาะเชอท

นาจะเปนสาเหต สวนเชอประจ�าถนทพบไดตามปกตไมตองทดสอบความไวตอสารตานจลชพ


1. กรณไมพบการเจรญของจลชพใดๆ หลงการอบนาน 3 วน ใหรายงานวา “No growth after 3 day”

2. กรณตรวจพบแตเชอประจ�าถน ไมพบเชอกอโรคทตองการตรวจหา ใหรายงานวา “No pathogenic bacteria

isolated”

3. กรณพบเชอกอโรค ไดแก β-hemolytic Streptococcus group A, C. diphtheriae, N. meningitidis และ

B. pertussis ใหรายงานปรมาณเชอ ชอเชอ และผลทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ ยกเวนเชอ

Streptococcus group A ไมตองทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ

กำรเพำะเชอจำกระบบทำงเดนหำยใจสวนลำง

โดยปกตระบบทางเดนหายใจสวนลางจะไมมแบคทเรยประจ�าถน แตในการเพาะเชออาจพบเชอบางชนดซงเปน

จลชพประจ�าถนในล�าคอและชองปากได เชน

- α-hemolytic Streptococci (Viridans streptococci ) - Neisseria spp.

- β-hemolytic Streptococci not group A - Corynebacterium spp.

- Low number of gram-negative bacilli - Lactobacillus spp.


แบคทเรยกอโรคในระบบทำงเดนหำยใจสวนลำง ไดแก

- Staphylococcus aureus - Haemophilus influenzae

- Streptococcus pneumoniae - Burkholderia pseudomallei

- Streptococcus pyogenes - Pasteurella multocida

- Klebsiella pneumoniae - Moraxella (Brahamella) catarrhalis

- Nocardia asteroides

- เชอ gram-negative bacilli ทมจ�านวนตงแต moderate ขนไป

ชนดของสงสงตรวจจำกระบบทำงเดนหำยใจสวนลำง

ไดแก sputum, lung biopsy หรอ aspirate, tracheal suction และ bronchial wash

แผนภมท 4.5-3 ขนตอนกำรเพำะเชอแบคทเรยจำก sputum และ bronchial wash

สงใหตรวจใหม


กรณเสมหะเหนยวขน สามารถละลายเสมหะดวย N-acetyl-L-cystien (Fumacil) ในอตราสวน 4:1 และสามารถ

ท�าการเจอจางใน sterile normal saline เพอหาปรมาณของเชอได (quantitative culture)

การเพาะเชอจากเสมหะและไมพบเชอใดใหคดถงเชอทตองการอาหารเพาะเชอหรอวธการเพาะเชอพเศษ เชน

Mycobacteria, Actinomycetes, Fungus, Virus, Rickettsiae, Chlamydia และ Mycoplasma

ขนตอนกำรเพำะเชอจำก sputum และ bronchial wash

1. ตรวจดและบนทกลกษณะเสมหะ (sputum) หรอ bronchial wash วาเปนแบบใด

- mucoid (เปนมก) - purulent (เปนหนอง)

- murco-purulent (มกปนหนอง) - blood-stained (มเลอดปน)

- salivary (เหมอนน�าลาย)

แลวท�าการยอมแกรมทนท เพอตรวจสอบดความเหมาะสมของสงสงตรวจโดยยดหลกเกณฑ ดงน

เสมหะทเหมาะสม ควรม PMN จ�านวนมากแตม squamous epithelial cells (SEPC) จ�านวนนอย

PMN:SEPC ≥10:1 หรอ epithelial cells <25 cells/LPF

เสมหะทมน�าลายปนบาง ใหเลอกบรเวณทเปนเนอเสมหะ เพอยอมแกรมและเพาะเชอ

เสมหะทไมเหมาะสม เปนน�าลายไมพบ PMN หรอพบนอย ม epithelial cells มาก

PMN:SEPC ≤10:1 หรอ epithelial cells >25 cells/LPF

เสมหะทเกบมาผดวธ อาจเกบมาเปน swab ตองแจงผสงตรวจ เพอเกบมาใหมใหถกตอง

2. สงสงตรวจทเหมาะสม เพาะลง CA, BA, MAC โดยเรยงล�าดบกอนหลง, ส�าหรบ plate CA และ BA ใหอบ

ในบรรยากาศ CO2 ทอณหภม 35±2 °C 18-24 ชม.

3. หลงอบนาน 24 ชม. แลว ตรวจดวามเชอเจรญหรอไม หากไมมเชอเจรญ ใหอบตอจนครบ 3 วน ถาตรวจ

ไมพบเชอ ใหรายงาน “No growth after 3 days”

4. plate ทมเชอเจรญใหตรวจดวาเชอมความส�าคญหรอไม โดยพจารณาชนดและปรมาณเชอทขนเปรยบเทยบ

กบเชออน แลวท�าการวนจฉยเชอทอาจเปนสาเหตของโรค โดยรายงานจ�านวนเชอ (numerous, moderate,

few หรอ rare ) ชนดของเชอและ ท�าการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพเฉพาะเชอทนาจะเปน

สาเหต สวนเชอประจ�าถนทพบไดตามปกตไมตองทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ

5. กรณทพบเชอเพยงชนดเดยวใหวนจฉยและรายงานแมจะเปนเชอประจ�าถนหรอเชอรา


แผนภมท 4.5-4 ขนตอนกำรเพำะเชอจำก lung biopsy และ lung aspirate

1. ในกรณทเปน lung biopsy ใหน�าสงสงตรวจบดในโกรงปราศจากเชอ (ควรท�าใน biohazard safety cabinet)

อาจใชทรายละเอยดปราศจากเชอลงไปชวยในการบด แลวใช pasteur pipette ปราศจากเชอ ดดสงสงตรวจ

ทบดแลว หยดใส plate ละ 1 หยด ทเหลอใส thioglycollate broth และท�า smear เพอยอมแกรม ถาเปน lung

aspirate ใหท�าการเพาะเชอไดเลยโดยไมตองบด

2. การเพาะเชอ การอานผล และการรายงานผล ท�าเชนเดยวกบ sputum โดยเพมการลงสงสงตรวจทเหลอ

ใน thioglycollate broth ( FTM) เพอหา anaerobic bacteria

3. FTM ควรอบจนครบ 7 วน ด growth ทกวน ถามความขนในสวนลาง อาจเปน anaerobes ใหน�ามายอม

แกรม และเพาะบน BA, MAC นาน 2 วน : ถาพบเชอจากการยอมแกรมแตไมมเชอเจรญ ใหรายงานผล

การยอมแกรมพรอมรปรางและสงตอหองปฏบตการทเพาะ anaerobic bacteria ได ถามเชอเจรญท�าการ

จ�าแนกชนดและทดสอบความไวตอสารตานจลชพ พรอมกบรายงานผล กรณทพบเชอเพยงชนดเดยวให

วนจฉยและรายงานแมจะเปนเชอประจ�าถนหรอเชอรา

จนครบ 3 วน±2



1. Church DL. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Respiratory Tract Cultures.

In: Garcia LS editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC:

ASM Press; 2007. p.320-408.

2. Keizo M, Tsuyoshi N. Clinical Microbiology of Respiratory Infections. Nagasaki: Nagasaki

University; 1994.

3. จารภรณ กลนแกวณรงค. การเพาะเชอจากระบบทางเดนหายใจ. ใน: คมอการปฏบตงานแบคทเรย

ส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป กองโรงพยาบาลภมภาค. กรงเทพ-มหานครฯ:

ส�านกงาน ปลดกระทรวงสาธารณสข; 2540. หนา 31-37.

4. นชา เจรญศร. การเพาะเชอจากระบบทางเดนหายใจ. ใน: วภาว แมนมนตร, อรณวด ชนะวงศ,

โชตชนะ วลยลกษณคณา บรรณาธการ. การตรวจทางแบคทเรยวทยาและราวทยา. ขอนแกน:

ภาควชาจลชววทยา คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยขอนแกน; 2521. หนา 15-17.

5. มาลย วรจตร. แบคทเรยกอโรค: Pathogenic Bacteria. กรงเทพมหานครฯ: สยามศลปการพมพ; 2545.

6. ภทรชย กรตสน. ต�าราแบคทเรยทางการแพทย. กรงเทพมหานครฯ: ภาควชาจลชววทยา

คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล มหาวทยาลยมหดล; 2549. หนา 98-100, 206-9.


4.6 การเพาะเชอจากระบบสบพนธสมชย หลกภชาต

อนชาต จอมแปง

ระบบสบพนธของมนษยมจลชพหลายชนดทเปนเชอประจ�าถนเกาะอยทผวของเซลล เชอประจ�าถนพบทปลาย

เปดองคชาต (surface of penis) และในชองคลอด (vagina) การตดเชอระบบสบพนธมสาเหตจากเชอจลชพหลาย

ประเภททงเชอแบคทเรย เชอรา ไวรส ปรสต เชอกอโรคทตดตอทางเพศสมพนธ ไดแก

- Neisseria gonorrhoeae

- Chlamydia trachomatis

- Gardnerlla vaginalis

- Haemophilus ducreyi

- Treponema pallidum

- Ureaplasma urealyticum

- Mycoplasma hominis

- Trichomonas vaginalis

- Candida albicans

- Molluscum contagiosum

- Human Papilloma Virus (HPV)

- Herpes Simplex Virus (HSV)

- Human Immunodeficiency Virus (HIV)

- Anaerobic bacteria (Mobiluncus spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Prevotella spp.)

ส�าหรบเชอกอโรคทสามารถตดเชอจากแมสลก ไดแก Streptococcus group B (Streptococcus agalactiae),

Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Listeria monocytogenes ดานสรรวทยาการตด

เชอในระบบสบพนธเพศหญงจะมการตดเชอไดงายและบอยกวาในเพศชาย

บทนจะกลาวถงสงสงตรวจของระบบสบพนธทเหมาะสมตอการเพาะเชอ อาหารและวธการเพาะเชอทจ�าเพาะ

ส�าหรบแตละเชอ เพอเพมประสทธภาพของการตรวจ การอานผลและการรายงานผล โดยมงเนนการเพาะเชอกอ

โรคตดตอทางเพศสมพนธทสามารถเพาะเชอได ส�าหรบการตรวจหาเชอกอโรคทหองปฏบตการไมมวธการอยควร

สงตอหองปฏบตการอางอง


สงสงตรวจเพอเพาะเชอทางระบบสบพนธ ไดแก urethral swab, vaginal swab, cervical swab, endocervical

swab, genital ulcer swab หรออนๆ ควรใช sterile Dacron swab ใส Stuart’s หรอ Amies transport medium ทเตม

หรอไมเตม charcoal สงสงตรวจทเกบตองตดฉลากระบชอผปวย วนทเกบตวอยาง ชนดสงสงตรวจ และรบน�าสง

หองปฏบตการทนท หามเกบท 4 °C ควรเกบสงสงตรวจ 2 ชด ส�าหรบเพาะเชอและยอมแกรม กรณสงตรวจ wet

smear ใหใชไมพนส�าลปราศจากเชอเกบสงสงตรวจ ใสน�าเกลอปราศจากเชอ 1 ml



1. ตรวจสอบความถกตองเหมาะสมของสงสงตรวจ ชอผปวย ชนดสงสงตรวจ ปรมาณ และวนทเกบตวอยาง

2. น�าสงสงตรวจเพาะบนอาหารเลยงเชอ CA, BA, MTM, และ MAC ตามล�าดบ ควรเพาะเชอทนทหรอภายใน

20 นาท หลงรบสงสงตรวจ กรณทแพทยสงตรวจหาเชอ Streptococcus agalactiae ควรเพาะเชอใน LIM

broth (Todd-Hewitt broth ทม 10 μg/ml colistin และ 15 μg/ml nalidixic acid) ซงเปน selective media กอน

เพาะบนจานเพาะเชอ จะชวยใหตรวจพบเชอไดมากขน

3. ปายสงสงตรวจบนสไลดหลงจากเพาะเชอ เพอน�ามายอมแกรม ตรวจดปรมาณและชนดของเชอแบคทเรย

ปรมาณเซลลเมดเลอดขาว และ clue cell เพอชวยวนจฉยเชอกอโรคจาก normal flora ในเบองตน

4. น�าจานเพาะเชอ (และ LIM broth กรณตรวจหา Streptococus agalactiae) ไปอบ ท 35-37 °C ในบรรยากาศ

5 % CO2 หรอใน candle jar ทวางส�าลชบน�าใหความชน

5. หลงจากอบนาน 18-24 ชม. อานผลการเพาะเชอบน CA, BA และ MTM ถาไมมเชอเจรญใหอบจนครบ 72

ชม. ยกเวน ยอมแกรมพบ coccobacilli มลกษณะเรยงตวแบบฝงปลาวายตามกน (“school of fish”) ใหอบ

จนครบ 5 วน กรณ LIM broth ใหเพาะเชอ บน BA น�าไปอบ ท 35-37°C ในบรรยากาศ 5 % CO2 หรอใน

candle jar ทวางส�าลชบน�าใหความชน อบนาน 48 ชม. ถาไมมเชอเจรญใหอบจนครบ 72 ชม.

6. ตรวจแยกชนดของเชอกอโรค และทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ

7. หากตรวจพบเชอ Neisseria gonorrhoeae ไมตองทดสอบการผลตเอนไซม β-lactamase เนองจากการรกษา

ในปจจบนใชยาทออกฤทธท�าลายเอนไซม β-lactamase

การยอมแกรมจากสงสงตรวจโดยตรง มประโยชนชวยในการวนจฉยโรคหนองใน (gonorrhea) จากเชอ

N. gonorrhoeae ถาพบ gram-negative diplococci intra และ extra polymorphonuclear (PMN) cells รวมกบ PMN

ท สง โดยเฉพาะอยางยงสงสงตรวจจากระบบสบพนธ เพศหญง นอกจากนยงช วยในการวนจฉยโรค

bacterial vaginosis ได โดยจะพบ lactobacilli ซงเปนเชอประจ�าถนทมจ�านวนมากจะลดลง ท�าให pH ใน

ชองคลอดสงขน (pH > 4.5) เหมาะตอการเจรญของเชอ Gardnerella vaginalis และเชอกอโรคอนๆ ซงจะม

metabolism ไดสารประกอบพวกเอมนและกรดอนทรย ท�าใหมกลนเหมนคลายคาวปลา (fishy odor) และกลน

จะชดขนเมอหยด 10% KOH เนองจาก Gardnerella vaginalis เปน normal flora ดวย จงตองใชปรมาณ

ทพบ เพอประกอบการพจารณาวาเปนเชอกอโรครวมดวย คอ มเชอเจรญ 3 ใน 4 บนอาหารทไมใช selective media

(เชน CA)

นอกจากนกรดอนทรยยงท�าใหเซลลเยอบชองคลอดทม gram-negative bacilli และ gram variable bacilli

หลดออกมาเปนตกขาว (vaginal discharge) เมอยอมแกรมกจะพบลกษณะทเรยกวา clue cell

การตรวจสงสงตรวจโดยตรงดวยวธ wet smear มประโยชนชวยในการวนจฉยการตดเชอ Trichomonas

vaginalis, budding yeast cells และ clue cells ได


แผนภมท 4.6-1 ขนตอนกำรวนจฉยเชอกอโรคในระบบสบพนธ

ตำรำงท 4.6-1 ตำรำงกำรวนจฉยเชอกอโรคในระบบสบพนธ

เชอกอโรค กำรวนจฉยเบองตน กำรวนจฉย

เพอแยกชนดของเชอ

Neisseria gonorrhoeae 1. เจรญบน MTM และ CA ลกษณะโคโลน ขนาดเลก สเทาขอบ

เรยบเหนยว ไมเจรญบน BA และ TSA

2. ตดสแกรมลบ เปน diplococci

3. oxidase บวก

4. catalase บวก โดยใช 30% H2O

2

CTA :

glucose บวก,

lactose ลบ,

maltose ลบ

Haemophilus ducreyi 1. เชอตองการ hemin (X factor) จงเจรญบน CA เทานน

หรออาจเจรญรอบ staphylococci colony บน BA

ลกษณะโคโลน สเทานน ผวเรยบ อาจเยม

2. ตดสแกรมลบ coccobacilli ขนาดเลก

3. catalase ลบ oxidase บวกชา (15-20 วนาท)

ยอมแกรมพบลกษณะ

เรยงตวแบบฝงปลา

วายตามกน

(“school of fish”)

Streptococcus group B

(Streptococcus

agalactiae)

1. เจรญบน CA และ BA ลกษณะโคโลน เลก ใสให β-hemolysis

มโซนแคบ

2. ตดสแกรมบวก cocci เรยงตวเปนค หรอสาย

3. catalase ลบ

CAMP บวก

hippurate บวก

PYR ลบ


เชอกอโรค กำรวนจฉยเบองตน กำรวนจฉย

เพอแยกชนดของเชอ

Gardnerella vaginalis 1. ลกษณะโคโลน เลก ให β-hemolysis

2. ตดสแกรม variable coccobacilli หรอ rod ขนาดเลกมาก

3. catalase ลบ

hippurate บวก

พบ clue cell

Listeria

monocytogenes

1. เจรญบน CA และ BA ลกษณะโคโลน เลก แบน สเทาขาวให

β-hemolysis มโซนแคบ

2. ตดสแกรมบวก rods

3. catalase บวก

4. motile (tumbling) in wet mount

bile-esculin บวก

CAMP บวก

motility บวกท 25 �C

เปนรปรมกาง

แตลบท 35 �C

Yeast cells เจรญบน CA และ BA ลกษณะโคโลน สครม สขาว มกลน

ขนมปง ขอบโคโลนยนคลายเทา (“feet” extending form)

Candida albicans

ให germ tube บวก


อานผลการเพาะเชอท 18-24 ชม. ถาไมเจรญใหอบตอจนครบ 72 ชม. และอานผล CA, BA และ MTM


1. กรณไมมเชอเจรญใหรายงาน “no growth in 3 days”

2. กรณมเชอประจ�าถนเจรญใหรายงาน “normal genital flora” และประเมนจ�านวนเชอ

3. กรณมเชอกอโรคเจรญใหรายงานชนดของเชอกอโรคทกชนดทพบ และประเมนจ�านวนเชอ (rare or 1+,

few หรอ 2+, moderate หรอ 3+, many (numerous) หรอ 4+) พรอมผลการทดสอบความไวของเชอตอ

สารตานจลชพ

ตำรำงท 4.6-1 ตำรำงกำรวนจฉยเชอกอโรคในระบบสบพนธ (ตอ)



1. Baron EJ, et. al. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, 9th ed. Missouri: Mosby; 1994. p.258-73.

2. Braude AL, et. al. Infectious Diseased and Medical Microbiology, 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders

Company; 1981. p.1009-59

3. Mary K.York. Sharon L. Hillier, and deirolve L. Church. Guidelines for Performance of Cenital Cultures.

In:GS Lynne (ed). Clinical Microbiology Procedures Hardbook. 3rd edition. ASM Press, Washington DC;

2010. p.3.9.1.1-3.9.4.5

4. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical

Microbiology 7th ed. Washington, DC: ASM Press; 1999. p.64-104, 777-806.

5. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Genital Cultures. In: Isenberg HD

editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 81-89.

6. กลมโรคตดตอทางเพศสมพนธ, ส�านกโรคเอดส วณโรค และโรคตดตอทางเพศสมพนธ, กรมควบคมโรค,

กระทรวงสาธารณสข. คมอการชนสตรโรคตดตอทางเพศสมพนธ. กรงเทพมหานครฯ: โรงพมพส�านกงาน

พระพทธศาสนาแหงชาต; 2541

7. วชรนทร รงสภาณรตน, อสยา จนทรวทยานชต, พรทพย พงมวง, สมหญง งามอรเลศ, สมลรตน ชวงษวฒนะ.

การวนจฉยโรคตดเชอแบคทเรยทางการแพทย, พมพครงท 3. กรงเทพมหานครฯ: ส�านกพมพแหงจฬาลงกรณ

มหาวทยาลย; 2553. หนา 159-71.

8. วรรณา เพงเรองโรจนชย. การเพาะเชอจากเลอด. คมอการปฏบตงานแบคทเรยส�าหรบโรงพยาบาล

ศนยและโรงพยาบาลทวไป. นนทบร: กองโรงพยาบาลภมภาค; 2540. หนา 19-22

9. สวรรยา พงศปรตร. แบคทเรยวทยาทางการแพทย. ปทมธาน: ศนยเทคโนโลยทางการศกษา มหาวทยาลย

รงสต; 2556.


4.7 การเพาะเชอจากหนอง แผล ฝ ตางๆหทยา ธญจรญ

หลกกำร

จลชพทเปนสาเหตของการตดเชอของแผล ฝตางๆ อาจเปนเชอประจ�าถนของผวหนง mucous membrane และ

สงแวดลอม โดยผานเขาสบรเวณทภาวะปกตปราศจากเชอทางผวหนงหรอ mucous membrane เพราะในการกอ

โรคจลชพเหลานอาจไมตองใช virulence factor กได ในการแปลผลการเพาะเชอ จงตององเกณฑผลการยอม

แกรมและการปรกษารวมกบแพทย


1. หนองจากแผลลกหรอฝ ทไดจากการเจาะดด เปนสงสงตรวจทดรองจากชนเนอทไดจากการผาตด

เนองจากไมมการปนเปอนจากจลชพประจ�าถน

2. หนองและสงคดหลงทไดจากบรเวณตดเชอระหวางการผาตด

3. swab เปนสงสงตรวจทมคณภาพดอยทสด เนองจากมปรมาตรของสงสงตรวจนอยและมโอกาส

ปนเปอนมาก

กำรรบสงสงตรวจ

ขนตอนการรบสงสงตรวจ ประกอบดวยการตรวจสอบดงน

1. การตรวจสอบวธการน�าสง (การปองกนการแพรกระจายเชอ อณหภม ระยะเวลา การปนเปอน) และวธเกบ

รกษา

2. ตรวจสอบขอมลทส�าคญ ไดแก ชอ อาย เพศ เลขทผปวย แพทยผสงตรวจ เวลาทเกบสงสงตรวจ ชนดและ

ต�าแหนงสงสงตรวจ รายการสงตรวจ เปนตน โดยขอมลตองถกตองตรงกนทงใบสงตรวจและสงสงตรวจ

3. การตรวจสอบคณภาพสงสงตรวจทง macroscopic (ปรมาณ ชนดภาชนะน�าสงสงสงตรวจ ชนดสงตรวจ

เหมาะสมกบรายการสงตรวจ ไมใช syringe ในการน�าสงสงสงตรวจ) และ microscopic โดยการยอม

แกรมซงเปนวธการตรวจวเคราะหทชวยการวนจฉยไดอยางรวดเรวและท�าไดงาย

กำรยอมแกรม ใหขอมลทเปนประโยชน ดงน

1. การประเมนการตดเชอ จากปรมาณ PMN, squamous epithelial cells และจลชพทตรวจ พบแนวทาง

การแปลผลการยอมแกรมเชงปรมาณ แสดงในตารางท 4.7-1 และ ตารางท 4.7.2


ตำรำงท 4.7-1 กำรแปลผลกำรยอมแกรมเชงปรมำณส�ำหรบตวอยำงทไมใชเสมหะ ไมใชตวอยำงปำยชองคลอดท

ใชวนจฉยชองคลอดอกเสบ และไมใชตวอยำงน�ำคดหลงทผำนกำรปน

Epithelial or Polymorphonuclear cells ( PMN ) Microorganisms (bacteria , yeast / fungi)

Description Number / LPF Description Number / OIF

1+ , rare < 1 1+ , rare < 1

2+ , few 1-10 2+ , few 1-10

3+ , moderate 11-25 3+ , moderate 11-25

4+ , many > 25 4+ , many > 25

Low – power field ( LPF ) (x100) ; high – power oil immersion field ( OIF ) (x1000)

Numbers are based on an average of 10 fields.

(Canadian Coalition for Quality in Laboratory Medicine CCQLM, Microbiology Working Group. Guideline for

Quantitative Interpretation of Gram’s Stains : November 2004)

การแปลผล : ปรมาณ PMN และจลชพยงมาก แสดงวามโอกาสพการตดเชอมาก

2. การบรหารการใชยาตานจลชพของแพทย เนองจากสามารถบอกทงลกษณะการตดส รปราง และการ

เรยงตวของเชอจลชพ

3. ชวยตดตามการเปลยนแปลงของการตดเชอของแผลไดประหยดกวาการเพาะเชอ

4. ตรวจสอบคณภาพสงสงตรวจได ท�าใหสามารถรบหรอปฏเสธสงสงตรวจและเกบตวอยางใหมไดในวน

เดยวกน ดงแสดงในตารางท 4.7-2

ตำรำงท 4.7-2 กำรแปลผลกำรยอมแกรมเชงปรมำณส�ำหรบกำรตรวจสงสงตรวจหนองโดยตรง (direct examination)

โดยกำรประเมนผลรวมของปรมำณ neutrophil และ squamous cell เพอตรวจสอบคณภำพสงสงตรวจ

Quantity of cells per 10x (objective lens) microscopic field

No. of

neutrophils

Q-value for

neutrophils

Q-value for squamous epithelial cells present in following no.

0 1-9 10-24 > 25

0 -1 -2 -3

0 0 (1) 0 0 0

1-9 1+ 1 0 -1 -2

10-24 2+ +2 +1 0 -1

≥ 25 3+ +3 +2 +1 0

( Microbiology Procedures/Guidelines-2010 Edition Page 42 )


*** - สงสงตรวจทใหคา Q-value เปนบวก โดยบวกยงมากกจะยงท�าใหตรวจพบเชอกอโรคไดมากกวาและ

ยงลดการตรวจพบเชอปนเปอน

- สงสงตรวจทใหคา Q-value เปนลบหรอศนย ดเหมอนจะปนเปอนจลชพประจ�าถน

- สงสงตรวจทตรวจไมพบทง squamous cells และ PMN (1) จะพบไดในสงสงตรวจทไดจาก

neutropenic patient หรอสงสงตรวจทเปน necrotic หรอ serous secretions สงสงตรวจเหลานจะถก

ยอมรบในการตรวจวเคราะหตอไป

5. การตรวจพบจลชพทนาจะมความส�าคญอยางมากทางคลนก ทตองรายงานแบบคาวกฤต ไดแก

Clostidium-like gram-positive bacilli ในสงสงตรวจ soft-tissue หรอ aspirate mixed morphologies

ทอาจจะเปน anaerobic bacteria ใน brain abscess

6. เปนแนวทางส�าหรบการแปลผลและการควบคมคณภาพการเพาะเชอ

7. ชวยเปนแนวทางในการเลอกการทดสอบเพมเตม เชน การยอมส modified acid fast stain/ acid fast

stain การเพาะเชอรา/ anaerobic bacteria

หมายเหต การพบเชอจากการยอมแกรม แตเพาะเชอไมขนอาจเกดจากมการปนเปอนของน�ายาทใช หรอ

เชอไมสามารถขนบนอาหารและบรรยากาศทใชในการเพาะเชอ หรอเปนเชอทตายงายหรอผล

การยอมแกรม ผดพลาด


1. หนองจำกแผลลกและฝปด (Deep wound and abscess pus)

โดยทวไปการตดเชอในแผลลกและฝปด บอยครงทเกดจากการตดเชอรวมกนของ aerobic และ anaerobic

organism

ตำรำงท 4.7-3 อำหำรเลยงเชอ สภำวะ อณหภมและเวลำเพำะเชอจำกหนองจำกแผลลกและฝปด

อำหำรเลยงเชอ สภำวะ อณหภม เวลำเพำะเชอ

Blood agar (BA) CO2

35 �C 48 ชม.

MacConkey agar (MAC) ambient air 35 �C 48 ชม.

Chocolate agar (CA) CO2

35 �C 48 ชม.

Anaerobic agar (BRUC) AnO2

35 �C 72-96 ชม.

หมายเหต - ใหเพม FTM/chopped meat medium ถาเปนหนองจากแผลลก หรอ ฝ และตองการเพาะเชอ

anaerobe ถา plate - แต broth + ตอง subculture

- ถามค�าสงสงตรวจ Actinomyces spp. หรอ Nocardia spp. หรอตรวจพบ branching หรอ

beaded gram-positive organisms จากการยอมแกรมควรท�าการยอมส Modified acid fast stain เพม

- ถาสงสย Actinomyces spp. ไมวาจากค�าสงสงตรวจ หรอจาก direct smear anaerobic culture

ตองอบนาน 7 วน



ตรวจสอบ aerobic plates ทกวน และ anaerobic plates ภายหลง 48 ชม. และ 4 วน จ�าแนกชนดของเชอกอโรค

และทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ potential pathogens ไดแก S. aureus, β-haemolytic streptococci,

Pasteurella spp., Capnocytophaga spp. (animal bites), Eikenella spp. (human bites, Enterobacteriaceae,

P. aeruginosa, anaerobic bacteria)


- Negative report: No growth/ตรวจพบจลชพประจ�าถนทงชนด aerobic และ anaerobic

- Positive report: รายงานปรมาณการตรวจพบ potential pathogens และผลการทดสอบ

ความไวของเชอตอสารตานจลชพ

2. หนองจำกแผลเปด ฝเปดและผน (Superficial skin swabs)

ในการเกบ superficial skin swabs ถาไมระมดระวง มกปนเปอนจลชพประจ�าถนรวมดวย นอกจากน

superficial skin swabs เปนสงสงตรวจทไมเหมาะสมส�าหรบ anaerobes

ตำรำงท 4.7-4 อำหำรเลยงเชอ สภำวะ อณหภมและเวลำเพำะเชอจำกหนองจำกแผลเปด ฝเปด และผน


Blood agar (BA) CO2

35 �C 48 ชม.


Colistin nalidixic acid agar (CAN)/

phenyl-ethyl alcohol (PEA )

Azide BA (Option)

CO2

35 �C 48 ชม.

เพม Chocolate agar (CA) หากตวอยางเปน tracheal

swab หรอเกบจาก chest tube site (option)

CO2

35 �C 48 ชม.

หมายเหต CAN / PEA / Azide BA เปน selective medium ส�าหรบ gram-positive bacteria มประโยชน เมอม

การ overgrowth ของ enteric flora หรอ swarming Proteus spp.


ตรวจสอบ plates ภายหลงการเพาะเชอ 24 และ 48 ชม. potential pathogens ไดแก S. aureus,

β-hemolytic Streptococcus spp., P. aeruginosa จลชพอน ๆ ทตรวจพบเพยงชนดเดยว หรอพบเปนจ�านวนมาก

และผลเขากนไดกบการยอมแกรมถอวามนยส�าคญในการกอโรค ถาตรวจพบ PMN ≥1 รวมดวย ท�าการทดสอบ

ความไวของเชอตอสารตานจลชพ



- Negative report: No growth หรอตรวจพบจลชพประจ�าถน

- Positive report: รายงานปรมาณจลชพทมนยส�าคญ พรอมผลการทดสอบความไวของเชอตอสาร

ตานจลชพ ถาตรวจพบเชอทนาจะเปนเชอประถนใหรายงานแตปรมาณการตรวจพบ

3. Conjunctival swab

การเกบ Conjunctival swab เพอการวนจฉยโรคเยอตาขาวอกเสบ (Conjunctivitis) โดย swab ควรถกน�าสงจาก

ตาทง 2 ขางคอขางทตดเชอและขางทไมตดเชอ เพอการวเคราะหเปรยบเทยบวาเชอทถกตรวจพบเปนเชอประจ�า

ถนหรอเชอกอโรค

ตำรำงท 4.7-5 อำหำรเลยงเชอ สภำวะ อณหภมและเวลำเพำะเชอจำก Conjunctival swab


Blood agar (BA) CO2

35 �C 48 ชม.


35 �C 48 ชม.

G.C. Selective agar (neonates) CO2

35 �C 72 ชม.


ตรวจสอบ BA และ CA ภายหลงการเพาะเชอ 24 และ 48 ชม. และ G.C. ภายหลงการเพาะเชอ 48 และ

72 ชม. เปรยบเทยบผลระหวาง swab ขางทตดเชอและขางทไมตดเชอ เพอชวยการวนจฉยเชอกอโรค

potential pathogens ไดแก S .aureus, H. influenzae, M. catarrhalis, N. gonorrhoeae, S. pyogenes,

S. pneumoniae, Moraxella spp. และ P. aeruginosa ส�าหรบเชอชนดอนจะมนยส�าคญ ถาตรวจพบปรมาณปานกลาง

ถงมาก ซงเขากนไดกบผลการยอมแกรมและควรมการตรวจพบ PMN ≥1 รวมดวย แลวท�าการทดสอบความไว

ของเชอตอสารตานจลชพ


- Negative report: No growth (จลชพทพบในการยอมแกรมแตไมพบใน culture อาจจะเปน fastidious

organisms เชน N. gonorrhoeae ) หรอตรวจพบเฉพาะจลชพประจ�าถน

- Positive report: รายงานปรมาณการตรวจพบ potential pathogens และผลการทดสอบความไวของ

เชอตอสารตานจลชพ ถามเชอประจ�าถนรวมดวย รายงานชนดและปรมาณการตรวจพบ เทานน


4. Ear swab

การเกบ Ear swab เพอการวนจฉยโรค otitis externa ซงเปนโรคตดเชอแบคทเรยของ external auditory canal

ส�าหรบ Tympanocentesis fluid เปนสงสงตรวจ เพอการวนจฉย otitis media ซงจะถกปฏบตเชนเดยวกบหนอง

จากแผลลก

ตำรำงท 4.7-6 อำหำรเลยงเชอ สภำวะ อณหภมและเวลำเพำะเชอจำก Ear swab


Blood agar (BA) CO2

35 �C 48 ชม.



35 �C 48 ชม.

Fungal plate (เชน Sabouraud dextrose agar,

Fungal selective agar, Phytone)

ambient air 30 �C 48 ชม.

อาจอบตอถง 4 สปดาห


ตรวจสอบ culture plates ภายหลงการเพาะเชอ 24 และ 48 ชม. potential pathogens ไดแก S. aureus,

P. aeruginosa, Group A Streptococcus, H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis หรอ yeast เฉพาะสงสง

ตรวจจากทารกแรกเกดเชอกอโรคทตองตรวจวเคราะหและรายงานดวย คอ Group B Streptococcus ส�าหรบเชอ

ชนดอนจะมนยส�าคญ ถาตรวจพบปรมาณปานกลางถงมากซงเขากนไดกบผลการยอมแกรม และควรมการตรวจ

พบ PMN ≥1 รวมดวย แลวท�าการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ


- Negative report: No growth (จลชพทพบในการยอมแกรม แตไมพบใน culture อาจจะเปน

fastidious organisms เชน S. pneumoniae), หรอตรวจพบเฉพาะจลชพประจ�าถน

- Positive report: รายงานปรมาณการตรวจพบ potential pathogens และผลการทดสอบความไว

ของเชอตอสารตานจลชพ ถามเชอประจ�าถนรวมดวย รายงานชนดและปรมาณการตรวจ

พบเทานน


แผนภมท 4.7-1 ขนตอนกำรเพำะเชอจำกหนองตำงๆ

+ Option

(pathogen/sig)

(pathogen/sig)

+ Option

(pathogen/sig)

(pathogen/sig)



1. Baron EJ, Thomson RB. Specimen Collection, Transport , and Processing : Bacteriology. In:

Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual

of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.228-71.

2. Canadian Coalition for Quality in Laboratory Medicine CCQLM, Microbiology Working

Group. Guideline for Quantitative Interpretation of Gram Stains. 2004. p.1-4.

3. College of Physicians and Surgeons of Saskatchewan Laboratory Quality Assurance Program.

Procedures/Guidelines for the Microbiology Laboratory. 2010. p. 1-60.

4. Linscott AJ. Specimen Collection, Transport, and Acceptability. In : Garcia LS. Clinical

Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM Press; 2010. P 2.1.1-

2.1.26.

5. Pezzlo M. Aerobic Bacteriology: Processing and Interpretation of Skin and Subcutaneous-

Tissue Specimens. In: Isenberg HD editor. Essential Procedures for Clinical Microbiology.

Washington, DC: ASM Press; 1998. p. 102-10.

บทท5การวนจฉยแบคทเรย

กอโรคกลมตางๆและเชอราทพบบอย


5.1 การวนจฉยแบคทเรยชนด Gram-Positive Cocciสมศกด ราหล

อนศกด เกดสน

เชอกลม gram-positive cocci มความยากในการแยกชนดไดอยางครบถวน แตควรตองสามารถบอกชนดของ

เชอกอโรคทพบบอยได ปจจบนพบวามการเปลยนแปลงของเชอ และมการพบเชอใหมๆ เปนเชอกอโรคมากขน ซง

อาจยงยากในการวนจฉย การน�า commercial kit มาชวยวนจฉยชนดของเชอกลมน เชน viridans group streptococci,

enterococci แมวาจะท�าไดสะดวกและงาย แตมขอจ�ากดในดานความแมนย�า (accuracy)

สงส�าคญทสดในการวนจฉยชนดของเชอแบคทเรย คอ รปรางลกษณะและการตดสแกรมของเชอ ส�าหรบเชอ

กลมนกเชนเดยวกน การยอมสแกรมมความจ�าเปนอยางมาก เพอใชแยกรปรางลกษณะและชนด เพราะลกษณะ

โคโลนของเชอ gram-positive cocci มความคลายคลงกน ไมสามารถแยกชนดไดอยางชดเจน เชน โคโลนของเชอ

Streptococcus และ Aerococcus แตสามารถแยกชนดจากกนไดโดยดลกษณะการเรยงตวจากการยอมสแกรม

โคโลนของ Group B streptococci และ Listeria กเชนเดยวกน มความคลายกนมากจนอาจสบสนได หากไมยอม

แกรม เพอดรปรางดวยกลองจลทรรศน

gram-positive cocci แบงการเรยงตวเปนกลม (cluster) เชน Staphylococcus เปนส (tetrad) เชน Micrococcus

เปนสาย (chain) เชน Streptococcus เปนค เชน Streptococcus pneumoniae เปนตน

การทดสอบแรกทใชเมอพบ gram-positive cocci คอ catalase ซงจะท�าใหแยกออกเปน 2 กลมคอ catalase บวก

และ catalase ลบ กลม catalase บวกทพบกอโรคบอยคอ Staphylococcus ทพบไดนอยคอ Micrococcus กลมท

catalase ลบ ทพบกอโรคไดบอยไดแก Streptococcus และ Enterococcus

Staphylococcus และ Micrococcus เปนเชอประจ�าถนของผวหนง เยอบตางๆ และในชองปากของมนษยและ

สตว บาง species เชน S. aureus, S. lugdunensis อาจกอโรคทส�าคญและรนแรง

Staphylococcus

แบงตามความรนแรงในการกอโรคตามความสามารถในการสรางเอนไซม coagulase เปน 2 กลมใหญ คอ

1. กลมทสรางเอนไซม coagulase ได เรยก Staphylococcus coagulase positive หรอ coagulase positive

Staphylococcus ซงประกอบดวยหลาย species ไดแก aureus, schleiferi, intermedius, delphini และ

hyicus (บางสายพนธ) แตเนองจาก species อนนอกจาก aureus อาจพบกอโรคของแผลถกสตวกด

เทานน การตดเชอ Staphylococcus coagulase positive สวนใหญจงเปน S. aureus หากตองการท�าการ

วนจฉย species ใหท�าเฉพาะเชอ Staphylococcus coagulase positive ทแยกไดจากแผลถกสตวกด

2. กลมทไมสรางเอนไซม coagulase เรยก Staphylococcus coagulase negative หรอ coagulase negative

Staphylococcus (CNS) ประกอบดวยหลาย species แตจะม species ทพบบอยและหองปฏบตการ

นาจะวนจฉยได ในกรณพบเชอจากต�าแหนงทปราศจากจลชพประจ�าถน ประมาณ 4 species ไดแก

epidermidis, haemolyticus, lugdunensis, saprophyticus (เปนสาเหตของการตดเชอในทางเดน

ปสสาวะทพบบอยในสตรวยเจรญพนธ)


การวนจฉย species ของ CNS มความส�าคญ กลาวคอ

2.1 ชวยวนจฉยวาเปนชนดทกอโรคทเคยมรายงานหรอไม และเมอพจารณารวมกบขอมลของผปวยจะชวย

ยนยนวาเปนเชอกอโรคจรงหรอไมในกรณทแยกเชอไดจากเลอดหรอสงสงตรวจอน

2.2 Staphylococcus lugdunensis เปน CNS ทมความรนแรงในการกอโรค endocarditis สงเทยบเทา

S. aureus แมจะยงไมมรายงานการพบเชอกอโรคชนดนบอยกตาม อกทงการทดสอบความไวของเชอน

ตอ methicillin ใชเกณฑในการแปลผลแบบเดยวกนกบ S. aureus จงควรใหความส�าคญในการวนจฉย

ถงระดบ species อกทงการทดสอบทางชวเคม เพอชวยแยกเปนการทดสอบทไมยงยาก และมใชอยใน

หองปฏบตการจลชววทยาทวไป

Micrococcus

ประกอบดวยเชอแกรมบวกรปกลม มกเรยงตวแบบ tetrads และเปนกลมเชอทมโคโลนสเหลอง แตกตางจาก

Staphylococcus คอ Micrococcus ไวตอ bacitracin 0.04 U ไม ferment glucose และ modified oxidase บวก หอง

ปฏบตการจลชววทยาทวไปไมจ�าเปนตองวนจฉยวาเปน M. luteus หรอ M. lylae สามารถรายงานผลเชอทมลกษณะ

นเปน Micrococcus spp.

ตำรำงท 5.1-1 กำรวนจฉยเชอ gram-positive cocci, catalase บวก ทมโคโลนขนำดใหญสขำวหรอเหลองทพบบอย

Organisms คณลกษณะเฉพำะ Slide

coagulase

Tube

coagulase

Baciracin

(0.04 U)

Polymycin B

(300 U)PYR

Micrococcus groupa often yellow S S V

Staphylococcus aureus VP + V + R R -

S. intermedius (dogs) VP - V + R S +

S. delphini (dolphins) VP - - + R NA NA

S. hyicus (pigs) VP - - V R R -

S. lugdunensis OD + V - R R +

S. schleiferi OD - + -+ R S +

S. saprophyticus urine; novobiocin (5 μg) - R;

urease +; non-hemolytic

- - R S -

S. epidermidis urease + non-hemolytic - - R R -

S. haemolyticus urease -, VP +, DNase - - - R S +

S. caprae urease +, DNase + - - R S +

Other coagulase-negative

staphylococci

novobiocin (5 μg) -/V;

urease V; non-hemolytic or

delayed hemolysis

- - R S V

+ = greater than 90% of strain positive in 48h; - = greater than 90% of strain negative; V = result are between 90 and 10% positive; -+ = most strains are negative but rare positive strains exist; NA = not applicable oraviable; VP = Voges-Proskauer; OD = ornithine decarboxylase; PYR = production of pyrrolidonyl arylamidase; R = resistant; S = susceptible. Bacitracin susceptible = inhibition zone 10-25 mm, Novobiocin resistant =inhibition zone ≤16 mm, Polymycin B resistant = inhibition zone <10 mm. a Including Kytococcus and Kocuria.


Streptococcus

Streptococcus เปนแบคทเรยแกรมบวกทใหผลการทดสอบ catalase เปนลบ รปรางกลม เรยงตวเปนคหรอเปน

สาย ขนอยกบแตละ species เชอ Streptococcus สามารถใหการยอยสลายเมดเลอดแดง (hemolysis) บนอาหารเลยง

เชอทมเลอดแกะเปนสวนผสม (sheep BA) เปน 3 แบบ ไดแก alpha-hemolysis, beta-hemolysis และ gamma-hemolysis

ปจจบนไดมการแบงกลม Streptococcus เปน pyogenic และ non-pyogenic group ซง non-pyogenic group ประกอบ

ดวย angiosus group, mitis group, salivarius group, bovis group และ uncertain group เชน S. suis อยางไรกดการ

วนจฉยเชอ Streptococcus เพอประโยชนในการดแลผปวยในหองปฏบตการทางการแพทยโดยใชปฏกรยาชวเคม

เพอแบงกลมทมความส�าคญในการกอโรคแสดงดงตารางท 5.1.2

ตำรำงท 5.1-2 ปฏกรยำทใชในกำรวนจฉยเชอ Streptococcus group ตำงๆ

Organisms

Gro

up A

Gro

up B

Non

Gro

up A

, B o

r D

Gro

up D

Ent

eroc

occu

s

Gro

up D

not

Ent

eroc

occu

s

Vir

idan

s gro

up

S. p

neum

onia

e

Hemolysis β β β α,β or Υ α α αPYR (pyrrolidonyl aminopeptidase) + - - + - - -

Bacitracin susceptibility 0.04 unit

(at any zone size)+ -* -* - - -* -

CAMP reaction - + - - - -* -

Bile esculin hydrolysis - - - + + -* -

Tolerance to 6.5% NaCl - - - + - - -

Optochin susceptibility (≥14mm.) - - - - - - +

* บางครงอาจใหผลบวก

การท�า grouping กบ antisera และ PYR test สามารถใชในการวนจฉย Streptococcus group A (โดยเฉพาะ S.

pyogenes) อยางรวดเรว เชอ Enterococcus ใหผล PYR บวกเชนเดยวกบ Streptococcus group A สามารถแยกโดย

ด bile esculin hydrolysis และการขนในอาหารทม 6.5% NaCl การวนจฉยเชอในกรณทแยกไดจากสงสงตรวจท

ไมมเชอประจ�าถนมความจ�าเปนทตองแยกถงระดบ species เพอประโยชนในการท�านายโรคและการตดตามระบาด

วทยาของเชอ เชน แยกไดจากเลอดหรอน�าไขสนหลง ถาเปน Streptococcus viridans group (α-hemolysis) ตอง

วนจฉยวาเปน Streptococcus suis หรอไม โดยการสงหองปฏบตการอางอง/ใชชดการทดสอบ/ใชเครองวนจฉยเชอ

อตโนมตตามความเหมาะสม ถาพบจาก throat swab ตองท�า grouping วาเปน group C หรอ group G หรอไม เพราะ


group C และ group G สามารถท�าใหเจบคอและเกดอาการรนแรงเชนเดยวกบ group A ถาพบเชอ Streptococcus

group D not Enterococcus ตองวนจฉยใหไดวาเปน Streptococcus bovis หรอไม เพราะเชอนมความสมพนธกบ

การเกดมะเรงในล�าไสสง แพทยจะไดท�าการตรวจ ซงจะท�าใหสามารถพบเชอไดเรวจะชวยใหรกษาไดผลดกวาการ

พบเชอในระยะหลง

ตำรำงท 5.1-3 กำรวนจฉยเชอ Streptococcus กลม pyogenic ดวยปฏกรยำทำงชวเคม

OrganismsB

acitr

acin

CA

MP

PYR

VP

Tre

halo

se

Sorb

itol

Lan

cefie

ld

grou

p

Sour

ce

S. pyogenes + - + - + - A Human

S. phocae + - - - ND - C, F Animal

S. agalactiae - + - - v - B Human,

Animal

S. porcinus - + + + + + E, P, U, V,

None

Human,

Animal

S. pseudoporcinus - + v v ND + (B), None Human

S. canis - v + - - v - G Human,

Animal

S. iniae - + + - ND - None Human,

Animal

S. dysgalactiae subsp.

dysgalactiae

v + - - - + v + C, L Animal

S. dysgalactiae subsp. equisimilis v - - - + - A, C, G, L Human,

Animal

S. equi subsp. equi - - - - - - C Animal

S. equi subsp. zooepidemicus - - - - - + C Human,

Animal

S. anginosus group - - - + + - A, C, G, F,

None

Human

S. didelphis - - - - ND - None Animal

+ = positive reaction (≥95%); - = negative reaction (≤5%); v + = variable reaction, but most strains positive;

v - = variable reaction, but most strains negative; v = variable reaction


ตำรำงท 5.1-4 กำรวนจฉยเชอ Streptococcus กลม non-pyogenic ดวยปฏกรยำทำงชวเคม

OrganismsV

P

Bile

esc

ulin

Esc

ulin

Arg

inin

e

Man

nito

l

Sorb

itol

Ure

a

Opt

ochi

n

Lan

cefie

ld g

roup

Rem

ark

S. suis - v - + v + - v - - - R, S, T มประวตการรบประทาน

หมดบหรออาหารทม

สวนผสมของหมดบ หรอ

เลอดหมหรอมการสมผส

กบสกรหรอเนอหม

S. sanguinis group - - + + - v - - - None

S. mitis group - - - * - - - - - None

S. pneumoniae - - - - - - - + None ควรยนยนดวย bile solu

bility test ถาพบ zone ม

เสนผานศนยกลาง นอย

กวา 14 mm

S. mutans group + - + - + + - - None

S. salivarius group + - v - - - v - None

S. anginosus group + - + + - - - - A, C, G,

F, None

S. bovis group + +** + - - * - - - D

+ = positive reaction (≥95%); - = negative reaction (≤5%); v + = variable reaction, but most strains

positive; v - = variable reaction, but most strains negative; v = variable reaction

* บางครงอาจใหผลบวก ; ** บางสายพนธอาจใหผลลบ (S. infantarius)


ตำรำงท 5.1-5 กำรวนจฉยเชอในกลมของ S. bovis group ดวยปฏกรยำทำงชวเคม

Organisms

Bile

esc

ulin

Esc

ulin

Lac

tose

Man

nito

l

Raf

finos

e

Tre

halo

se

Inul

in

Ure

a

Lan

cefie

ld g

roup

Form

erly

syn

onym

Sour

ce

S. equinus /

S. bovis

+ + -/+ - - v -/+ - D S. bovis Animal

S. gallolyticus subsp.

gallolyticus

+ + + + + + + - D S. bovis biotype I Human,

Animal


pasteurianus

+ + + - v + - - D S. bovis biotype II.2;

S. pasteurianus

Human


macedonicus

- - + - v - - - ND S. macedonicus Dairy

product

S. infantarius subsp.

infantarius

- v + - + - - - D S. bovis biotype II.1 Human,

Animal

S. infantarius subsp.

coli

+ + + - - - - - D S. lutetiensis Human,

Animal

S. alactolyticus v + - - - - - + D S. intestinalis Animal

+ = positive reaction (≥95%); - = negative reaction (≤5%); v + = variable reaction, but most strains positive;

v - = variable reaction, but most strains negative; v = variable reaction

Enterococcus

เดมเปน Streptococcus ทม Lancefield Group D antigen แตมปฏกรยาทางชวเคมหลายประการทตางจาก genus

Streptococcus กลาวคอ เจรญไดทอณหภม 10 และ 45 °C ท pH 9.6 อาหารทมเกลอความเขมขนสง 6.5% สามารถ

ขนในอาหารทมน�าด 40% และ hydrolyse esculin ทอยในอาหารนได และใหผลการทดสอบ PYR บวก จงถกจด

เปน genus ใหม บน BA plate มการเจรญเปนโคโลนสขาวใส โปรงแสง อาจพบ hemolysis ไดทกรปแบบ คอ ไมม

hemolysis หรอ α หรอ β กได

Enterococcus เปนเชอประจ�าถนในระบบทางเดนอาหาร และ อาจพบเปนสาเหตส�าคญของการตดเชอในทาง

เดนปสสาวะ รวมทงแผลตดเชอของผปวยในโรงพยาบาลทพบบอยเปนอนดบสองรองจาก Escherichia coli และ

Pseudomonas aeruginosa ดอ aminoglycoside ระดบต�าแบบ intrinsic resistant เชอทพบในโรงพยาบาลอาจเปน

เชอดอสารตานจลชพหลายชนด เชน penicillin, cephalosporin เชอ Enterococcus ดอยาทตองเฝาระวงการแพร

กระจาย คอ vancomycin resistant Enterococcus (VRE) faecium และ E. faecalis ดงนน หากพบ Enterococcus ท


ดอ vancomycin จงตองวนจฉยระดบ species ตอวาเปนสอง species ดงกลาวหรอไมเพราะถาเปน E. faecium หรอ

E. faecalis จ�าเปนตองแยกผปวย เพอปองกนการแพรกระจายของยนสดอ vancomycin เชอ Enterococcus ทดอตอ

vancomycin โดยธรรมชาต คอ E. casseliflavus และ E. gallinarum ซงสามารถแยกจาก E. faecium และ E. faecalis

ไดโดยทดสอบ motility ของเชอ E. casseliflavus และ E. gallinarum เคลอนทได แต E. faecium และ E. faecalis

ไมเคลอนท เชอ E. casseliflavus เปน Enterococcus ทม pigment สเหลอง แบคทเรยแกรมบวกรปกลมทเคลอนท

ไดอก species หนงคอ Vagococcus fluvialis สวน Enteroccus ทมสเหลองอก species หนงคอ E. mundtii

ตำรำงท 5.1-6 กำรวนจฉยเชอแบคทเรย gram-positive cocci, catalase negative, PYR positive ทไมใช

Streptococcus group A

Organisms

Mot

ility

b

Pigm

entc

MG

P

AD

Ara

bino

se

Man

nito

l

Lac

tose

Raf

finos

e

Sorb

itol

Tel

luri

te

Pyru

vate

45 �C

Gro

wth

Van

com

ycin

E. avium - - V - + + + - + - + + S

E. raffinosus - - V - + + + + + - + + V

Vagococcus fluvialis + - + - - + - - + - - - S

E. faecium - - - + + +d + V V - - + V

E. gallinarum +d - + +d + + + + D - - + R

E. casseliflavus +d +d + +d + + + D V -d V + R

E. mundtii - + - + + + + + V - - + S

E. faecalis - - - +d - +d +d - + + + + V

Lactococcus garvieae - - - + - + + - - - - - S

E. durans - - - + - - + - - - - + S

E. hirae - - - + - - + + - - - + S

E. dispar - - + + - - + + - - + - S


Gram positive cocci catalase negative ทพบไมบอย1. Streptococcus-like organisms

1.1 Nutritionally Variant Streptococcus (NVS)

เปน Streptococcus ทตองการสารอาหารพเศษในการเจรญ เชน pyridoxal หรอ vitamin B6 ซงเปนสวน

ผสมใน CA, cysteine, NAD มกพบเปนสาเหตของ endocarditis ดงนน ถาพบเชอ gram-positive cocci in chain ท

ไมขนบน BA แตเจรญบน CA ได และ ใหลกษณะ satellite phenomenon กบ Staphylococcus บน BA ควรนกถง

เชอน ซงในขณะนถกจดเปน genus ใหม คอ Abiotrophia และ Granulicatella ซงสามารถแยกจากกนโดย Abiotrophia

จะ ferment น�าตาล lactose, trehalose, raffinose แต Granulicatella ไม ferment ซงคอนขางยงยากในการทดสอบ

เนองจากเชอเปน fastidious organism ดงนน ในเบองตน หองปฏบตการอาจรายงานผลเปน Nutritionally variant

Streptococcus

แบคทเรยแกรมบวกรปกลมอก genus หนงทอาจตองการสารอาหารพเศษในการเจรญ หรอใหผล satellite

phenomenon เปนบวกกบ Staphylococcus บน BA แตอาจมการเรยงตวเปนสายหรอเปนกลมกได คอ Ignavigranum

ซงนอกจากจะเปนเชอทมการเรยงตวทงสองแบบแลว เชอ genus น มกไมให hemolysis บน BA และเจรญไดใน

อาหารทมเกลอทมความเขมขน 6.5% ซงแตกตางจาก Abiotrophia และ Granulicatella

1.2 Aerococcus

เปนเชอแกรมบวกรปกลมเรยงตวแบบ tetrads หรอ cluster แบบ Staphylococcus ทมโคโลนเหมอน Viridans

group Streptococcus ดงนน การยอมแกรมของเชอทเลยงใน broth จะชวยแยก Aerococcus จาก Streptococcus ได

บางสายพนธของ Aerococcus viridans อาจ hydrolyse bile esculin และใหผลบวกกบ PYR แต A. urinae ใหผล

ลบกบปฏกรยาทงค

1.3 Facklamia

เปนเชอแกรมบวกรปกลมเรยงตวแบบ pairs, tetrads หรอ cluster ทมโคโลนเหมอน Viridans group

Streptococcus แตมกใหผลบวกกบ urease test และ hippurate hydrolysis

1.4 Gemella

เปนเชอทมโคโลนเหมอน Viridans group Streptococcus แมบางสายพนธอาจไมให hemolysis แตลกษณะ

เดนของเชอน คอ เปนเชอแกรมบวกทถก decolourize ไดงาย ท�าใหเหนเปน gram-negative cocci ทเรยงตวเปนค

คลาย Neisseria

2. Enterococcus-like organism (Globicatella, Lactococcus, Dolosigranulum)

เชอทมลกษณะคลาย Enterococcus ทงรปรางใตกลองจลทรรศนและลกษณะโคโลนทมองเหนดวยตาเปลา และ

hydrolyse bile esculin ได Globicatella และ Lactococcus อาจแยกจาก Enterococcus ได โดยการเจรญท 45°C

ซงทงสอง genus น ไมสามารถขนไดทอณหภม 45°C สวน Dolosigranulum เปนแกรมบวกรปกลมทใหผล PYR

เปนบวก และ เจรญไดในทความเขมขนเกลอ 6.5% แตมการเรยงตวเปนกลม และไมสามารถเจรญทอณหภม 10 °C

และ 45°C

3. Pediococcus, Leuconostoc, และ Weissella

ทงสาม genus เปนเชอแกรมบวกรปรางกลมทดอ vancomycin เชอ Pedicoccus มกเรยงตวเปนกลมหรอ tetrads

บางสายพนธอาจเจรญท 45 °C arginine เปนลบ LAP เปนบวก บางครงอาจสบสนกบ Streptococcus group D และ

Enterococcus เนองจากเปนเชอทม Lancefield group D antigen จงอาจใหผล bile esculin เปนบวก หรอ เจรญใน


ทมเกลอ 6.5% ได แต PYR ของเชอนเปนลบ เชนเดยวกบ Leuconostoc และ Weissella แตสอง genus หลงนเปน

แกรมบวกรปรางกลมทมกเรยงตวเปนสาย หรอบางครงอาจเหนเปนแกรมบวกรปแทงได Leuconostoc ไมขนท

45 °C argimine เปนลบ LAP เปนลบ สวน Weissella เจรญท 45 °C ได และ LAP เปนลบ

4. Dolosicoccus, Helcococcus

ทงสอง genus นเปนแบคทเรยรปกลมทใหผลบวกกบ PYR แตไมสามารถเจรญในทมความเขมขนเกลอ 6.5%

และทอณหภม 10 °C และ 45 °C แต Dolosicoccus เรยงตวเปนสาย โคโลนเปน α-hemolysis บน BA สวน

Helcococcus เรยงตวเปนกลม ไมม hemolysis บน BA

ตำรำงท 5.1-7 กำรวนจฉยเชอ gram-positive cocci (excluding Streptococcus pyogenes), catalase negative or

weakly positive, PYR-positive

Organisms

Gra

m st

ain

CA

T

LA

P

6.5%

NaC

l

10 ˚

C

45 ˚

C

Col

ony

on B

AP

Hem

olys

is

Bile

-esc

ulin

Enterococcus (some motile) CH - + + + + Large α,γ,β +

Lactococcus CH - + V + - Large α,γ +

Vagococcus (motile) CH - + + + - Large α,γ +

Abiotrophia/Granulicatella CH - + - - - Satellite α,γ -

Globicatella CH - - + - - Small α V

Dolosicoccus CH - - - - - Small α NA

Aerococcus viridans CL/T -,W - + - - Large α V

Helcococcus kunzii CL/T - - V - - Tiny γ -

Gemella CL/T/CH - V - - - Tiny, 48h α,γ -

Facklamia (hippurate +) CL/CH - + + - - Small γ -

Alloiococcus otitis CL/T W,+ + + - - Tiny, 72h α NA

Ignavigranum (hippurate -) CL/CH - + + - -Satellite (V)

or smallγ -

Rothia mucilaginosa CL -,W,+ + - NA NA Sticky γ V

Dolosigranulum CL/T - + + - - Small γ NA

CAT = catalase production; LAP = production of Leucine aminopeptidase; CL = clusters; T = tetrads; CH = chains; W = weak. Large colonies are approximately 1 mm; small colonies are about the size of viridans group streptococci. + = greater than 90% of strain positive in 48h; - = greater than 90% of strain negative; V = result

are between 90 and 10% positive; NA = not applicable or aviable


ตำรำงท 5.1-8 กำรวนจฉยเชอ gram-positive cocci, catalase negative and PYR-negative

Organisms Gram stain LAP 6.5% NaCl VAN Arginine 45 �C

Leuconostoc CH, rods - V R - -

Weissella confusa CH, rods - V R + +

Pediococcus CL/T + V R - V

Streptococcus CH + - S V

Aerococcus urinae CL/T + + S +

Van = vancomycin; LAP = production of leucine aminopeptidase; CL = clusters; T = tetrads; CH = chains; +

= greater than 90% of strain positive in 48h; - = greater than 90% of strain negative; V = result are between 90

and 10% positive; R = resistant; S = susceptible


เอกสารอางอง 1. Becker K, von Eiff, C. Staphylococcus, Micrococcus, and other catalase-positive cocci. In:Versalovic J,

Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microblology

10th ed. Vol 1. Washington, DC : ASM Press; 2011. p.308-330.

2. Bekal S, Gaudreau C, Laurence R A, Simoneau E, Raynal L. Streptococcus pseudoporcinus sp. nov., a

Novel Species Isolated from the Genitourinary Tract of Women. J. Clin. Microbiol. 2006;44: 2584-86.

3. Duarte RS, Barros RR, Facklam RR, Teixeira LM. Phenotypic and Genotypic Characteristics of

Streptococcus porcinus Isolated from Human Sources. J. Clin. Microbiol. 2005;43: 4592- 4601.

4. Facklam R. What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin

Microbiol Rev. 2002;15:613-30.

5. Facklam R, Elliott J. Identification, classification, and clinical relevance of catalase-negative,

gram-positive cocci, excluding the streptococci and enterococci. Clin Microbiol Rev. 1995;8:479-495.

6. Gangone R, Findlay I, Lakkireddi PR, Marsh G. A very rare spontaneous group-C

Streptococcal constellatus spondylodiscitis: A case report. J. Orthopaedics. 2009;6(3):e7.

7. Garcia LS, editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd ed. Washington, DC: ASM

Press; 2011. p.3.9.2.1-3.11.8.1.

8. Köhler W. The present state of species within the genera Streptococcus and Enterococcus. Int J Med

Microbiol. 2007;297:133-50

9. Ruoff K. Aerococcus, Abiotrophia and other aerobic catalase-negative, gram-positive cocci.

In:Versolovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of

Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC : ASM Press; 2011. p. 365-376.

10. Schlegel L, Grimont F, Ageron E, Grimont PA, Bouvet A. Reappraisal of the taxonomy of the

Streptococcus bovis /Streptococcus equinus complex and related species: description of

Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus subsp. nov., S. gallolyticus subsp. macedonicus subsp.

nov. and S. gallolyticus subsp. pasteurianus subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003;53: 631-645

11. Spellerberg B, Brandt C. Streptococcus. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry

ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Washington, DC: ASM Press;

2011. p. 331-349.

12. Teixeir LM, Carvalho MGS, Shewmaker PL, Facklam RR. Enterococcus. In:Versalovic J, Carroll KC,

Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed.

Vol 1. Washington, DC : ASM Press ; 2011. p. 350-369


5.2 การวนจฉยแบคทเรยชนด Gram-Positive Bacilliนตยา ธระวฒนสข

แบคทเรยกลมนแบงตามความสามารถในการสรางสปอรเปน 2 ชนด ไดแก

1. แบคทเรยแกรมบวกชนดแทงทไมสามารถสรางสปอร (Aerobic non-spore forming Gram-positive

bacilli) ประกอบดวย genus ทส�าคญไดแก Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix และ Rhodococcus

2. แบคทเรยแกรมบวกชนดแทงทสรางสปอร (Aerobic spore-forming Gram-positive bacilli) ประกอบดวย

Bacillus, Geobacilus และ Paenibacillus ส�ำหรบ genus ทส�าคญคอ Bacillus สวน Geobacillus (Bacillus)

stearothermophilus ใชในการควบคมประสทธภาพของ autoclave

Aerobic non-spore-forming Gram-positive bacilli

Corynebacterium and related bacteria เปนแบคทเรยแกรมบวกทมรปรางไมสม�าเสมอ ปลายดานหนงหรอสอง

ดานปองออก ลกษณะคลายกระบอง (club shape) เซลลมกเรยงตวขนานกนตามแนวยาว หรออาจมการเรยงตวท

ไมแนนอน เชน เปนค เปนรปตวว รปตววาย หรอเรยงตวคลายอกษรจน (Chinese letter appearance) species ทม

ความส�าคญ คอ C. diphtheriae ซงกอโรคคอตบ (Diphtheria) ในการแยก C. diphtheriae จากสงสงตรวจทมเชอ

ประจ�าถนปนเปอน ควรเลอกใช selective medium เชน Cystine tellurite blood agar (CTBA) เชอจะใหโคโลนส

เทาด�า และบน Tinsdale (TIN) agar เชอ C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis และ C. ulcerans จะใหโคโลนส

เทาด�าทมวงสน�าตาลเขมรอบๆ (halo)

Listeria ทท�าใหเกดโรคในคน คอ L. monocytogenes เปนแบคทเรยรปแทง พบเปนเซลลเดยว หรอเรยงตวเปน

สายสนๆ เคลอนทไดทอณหภม 22-28 °C เมอดโดยวธ hanging drop จะเหนการเคลอนไหวแบบตลงกา (tumbling)

ซงเกดจากการหมนรอบตวเองทมแกนหมนตงฉากกบแนวยาวของเซลล แตถาใช semisolid medium จะเหนการ

เคลอนไหวเปนรปรม

Erysipelothrix เปนแบคทเรยรปแทงสน ไมเคลอนไหว ไมสรางเอนไซม catalase และ oxidase มรายงานการ

กอโรคในคนเฉพาะเชอ E. rhusiopathiae เชอนแยกจากแบคทเรยแกรมบวกอนๆ คอเมอเจรญเตบโตบน TSI จะให

H2S

Rhodococcus สวนใหญพบเปนแทงสน (coccobacilli) ยอมตดส partially acid fast สามารถเจรญเตบโตไดบน

อาหารเพาะเชอทวไป เมอเกบเชอไวหลายวนโคโลนจะมสชมพออน (pale salmon pink) species ทกอโรคในคนโดย

เฉพาะผปวยทมภมตานทานต�า คอ R. equi


ตำรำงท 5.2-1 กำรวนจฉย Aerobic non-spore forming gram positive bacilli ทส�ำคญ

Test Corynebacterium L. monocytogenes E. rhusiopathiae R. equi

Gram stain Gram positive

bacilli, Chinese

letter appearance

Gram positive

bacilli

Gram positive

bacilli

Gram positive

coccobacilli

Catalase + + _ +

Motile at 25 �C_ + _ _

Esculin hydrolysis _ + _ +

H2S in TSI _ _ + _

Modified AFB _ _ _ +

ตำรำงท 5.2-2 กำรแยกชนดของ Corynebacterium

Species Catalase Urea Nitrate Glucose Maltose SucroseReverse

CAMP

C. diphtheriae bv. gravis + _ + + + _ _

C. diphtheriae bv. intermedius + _ + + + _ _

C. diphtheriae bv. mitis + _ + + + _ _

C. diphtheriae bv. belfanti + _ _ + + _ _

C. xerosis + _ V + + + _

C. jeikeium + _ _ + V _ _

C. striatum + _ + + _ V V

C. bovis + _ _ + _ _ _

C. pseudotuberculosis + + V + + V +

C. pseudodiphtheriticum + + + _ _ _ _

C. ulcerans + + _ + + _ +

C. urealyticum + + _ _ _ _ _


กำรทดสอบกำรสรำง Toxin ของ C. diphtheriae (Elek’s test)

1. เตรยม sterile Elek agar 20 ml รอใหเยนลงจนอณหภมประมาณ 50 °C เตม fresh serum 2-5 ml ผสมให

เขากนแลวเทลงใน sterile plate

2. จมกระดาษกรองปราศจากเชอขนาด 1x8 cm ลงใน diphtheria antitoxin ทมความเขมขน 100 unit/ml

3. วางกระดาษกรองทชบ antitoxin ลงบนจานอาหาร Elek agar ทจวนจะแขง กดกระดาษกรองลงบนผว

อาหารเลกนอย

4. เมอ Elek agar แขงและผวหนาแหงแลว ใหใชเชอทตองการทดสอบลากตงฉากกบแผนกระดาษกรอง

5. ใชเชอสายพนธทสรางสารพษ (positive control) และไมสรางสารพษ (negative control) ทดสอบควบคกน

6. อบเชอท 35-37 °C เปนเวลา 1-3 วน ตรวจด precipitin lines ซงจะท�ามม 45 องศากบแนวเชอทลากไว

Aerobic spore-forming Gram-positive bacilli

Bacillus เปนแบคทเรยแกรมบวกรปแทงขนาดใหญ หวทายตด บางสายพนธเรยงตวตอกนเปนสายยาว สราง

สปอรภายในเซลล เชอในกลมนทมความส�าคญไดแก B. anthracis และ B. cereus ซงจดอยในกลม Bacillus cereus

group โดยเชอกลมนจะมเซลลขนาดใหญกวากลมอนๆ

ตำรำงท 5.2-3 กำรแยกเชอ Bacillus cereus group

Species Mean diam.

of cell >1µmβ-Hemolysis Motility Lecithinase Penicillin

B. anthracis + - - + S

B. cereus + + + + R

B. thuringiensis + + +,V + R

B. mycoides + V - + R

B. megaterium + V +,V - S

Other Bacillus spp.

And related groups

- -,+ +,V - V

ถาพบแบคทเรยแกรมบวกรปแทงขนาดใหญเคลอนทได มเสนผานศนยกลางของเซลล > 1μm สลายเมดเลอด

แดงได ดอเพนนซลน lecithinase positive ใหรายงาน “B. cereus group, not B. anthracis”

ถาพบแบคทเรยแกรมบวกรปแทงขนาดใหญเคลอนทได แตไมสลายเมดเลอดแดง และ/หรอ lecithinase negative

รายงาน “Bacillus, not B. anthracis or B. cereus”


แผนภมท 5.2-1 ขนตอนกำรตรวจวนจฉย Bacillus

เอกสารอางอง 1. Funke G, Bernard KA. Coryneform Gram-Positive Rods. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G,

Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1.

Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 413-442.

2. Logan NA, Hoffmaster AR, Shadomy SV, Stauffer KE. Bacillus and Other Aerobic Endospore-Forming

Bacteria. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor.

Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 381-402.

3. Synder JW. Corynebacterium diphtheria Cultures. In: Garcia LS, editor. Clinical Microbiology

Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2007. p.3.11.7.1-3.11.7.10.

4. York MK, Ruoff KL, Clarridge III J, Bernard K. Identification of Gram –Positive Bacteria. In: Garcia

LS editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press;

2007 Update. p. 3.18.1.1- 3.18.1.17.


5.3 การวนจฉยเชอแบคทเรย Gram-Negative Cocciวนทนา ปวณกตตพร

เชอแบคทเรย Gram-negative cocci ทพบในคนม 2 กลม กลมหนงเปนแบคทเรยใน genus Neisseria ไดแก

N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica, N. cinerea, N. flavescens, N. polysaccharea, N. mucosa,

N. sicca, และ N. subflava อกกลมเปนแบคทเรยใน genus Moraxella ไดแก M. catarrhalis (Branhamella

catarrhalis) และ M. canis (ตดเชอจากการถกสนข หรอ แมวกด) แตแบคทเรย Gram-negative cocci ทมความส�าคญ

ทางการแพทย โดยพบเปนสาเหตของโรคตดเชอทมความรนแรงไดบอยคอ N. gonorrhoeae, N. meningitidis, และ

M. catarrhalis เมอยอมแกรมแบคทเรยทง 3 species จะเหนเซลลรปรางคลายเมลดถว สวนใหญอยเปนคโดยหน

สวนทเวาเขาหากน เหมอนรปไต จงเรยกวา diplococci และอาจเหนแบบ 4 cell (tetrad) ได ทง 3 species เปน

แบคทเรยชนดทไมเคลอนไหว ใหผลบวกของการทดสอบ oxidase และ catalase ซงเปนลกษณะทพบไดในเชอ

Neisseria species และ coccoid moraxellae อนดวย จงจ�าเปนตองแยกเชอกอโรคดงกลาวในระดบ species เพอชวย

ในการวนจฉยและรกษาโรคของแพทย

Neisseria gonorrhoeae

เปนแบคทเรยทจดเปนเชอกอโรคโดยมคนเปน host เทานน สวนใหญตดตอทางเพศสมพนธ ท�าใหเกดโรค

หนองใน (Gonorrhea) และการตดเชอทเยอเมอกของ pharynx (pharyngitis และ tonsillitis) และตาของเดกแรก

คลอด (gonococcal conjunctivitis) การตดเชอในกระแสเลอดพบไดนอยกวา 2 กรณขางตน N. gonorrhoeae เจรญ

ไมดบน BA การเพาะเชอควรใชทง selective (Modified Thayer martin medium, MTM) และ non-selective media

(CA) อบท 35-37 °C ในภาวะทม 5-10 % CO2 นาน 24-72 ชม. ลกษณะโคโลนบน CA กลม เรยบ มสขาวอมเทา

มนวาว มขนาดเสนผานศนยกลาง 1 mm เปนแบคทเรยทไวตอความแหง และกรดไขมนในเสนใยฝาย การเกบสง

สงตรวจโดยใช swab จงตองเปนชนด Dacron หรอ Rayon swab น�าสงใน Amies’ หรอ Stuart’s transport medium

และสงหองปฏบตการโดยไมแชเยน การท�า direct smear ควรหมน swab อยางเบาๆ บนสไลด เพอไมใหเซลลยน

หรอขาด

Neisseria meningitidis

เปนแบคทเรยทกอโรคเยอหมสมองอกเสบ (meningitis) หรอโรคไขกาฬหลงแอนและการตดเชอในเลอด

(meningococcemia) สงสงตรวจสวนใหญจงเปน CSF และเลอด หรอ body fluid สามารถเจรญไดทงบน BA และ

CA ในภาวะทม 5-10% CO2 ถาแยกเชอจาก nasopharyngeal swab เพอตรวจหาคนทเปนพาหะควรเพาะบน MTM

ควบคไปดวย โคโลนมลกษณะ กลม ขอบเรยบ สเทา มนวาว บางสายพนธใหโคโลนเยม (mucoid) ได มขนาดเสน

ผานศนยกลาง 1 mm เชอ N. meningitidis ม 12 serogroup ไดแก A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z, W135 และ 29E แบง

ตามชนดของ antigen บน capsule การหา serogroup ของเชอมประโยชนทางระบาดวทยา สามารถสงตรวจทหอง

ปฏบตการอางอง เชน ศนยวทยาศาสตรการแพทย และสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการ

แพทย กระทรวงสาธารณสข นนทบร


Moraxella catarrhalis

เปนแบคทเรยทเปนไดทง normal flora และเชอกอโรคในระบบทางเดนหายใจของคน พบในผปวย bronchitis,

bronchiectasis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), otitis media (สวนใหญพบในเดก) sinusitis และ

pneumonia นอกจากนยงพบเปนสาเหตของ endocarditis และ meningitis M. catarrhalis เจรญไดดบน NA, BA

และ CA รวมทง MTM โคโลนมสขาวขน ถงเทา ขนาดเสนผานศนยกลาง 1-3 mm เมอใช loop เขยเชอจะหลดมา

ทงโคโลน เชอไมยอยสลายน�าตาล สายพนธสวนใหญสรางเอนไซม β-lactamase สามารถแยกไดจาก Neisseria

species โดยคณสมบตการสรางเอนไซม DNase

แผนภมท 5.3-1 ขนตอนกำรตรวจวนจฉยเชอ Gram-negative cocci

primary isolation plate (MTM, CA, BA)

oxidase / catalase test

+ / + + / -

Neiserria spp., Moraxella spp., Neiserria spp. M. catarrhalis Paracoccus yeei,Oligella spp.

Gram negative diplococci, cocci Neisseria spp., M. catarrhalis

5.3.1


ตำรำงท 5.3-1 Differentiation of Neisseria spp. and M. catarrhalis

Organisms Morphology Growth on

NA, 35 °C

Acid production from DNase Nitrate

reductionGAL MAL LAC

N. bacilliformis rod ND - - - - v

N. cinerea diplococci - - - - - -

N. elongata rod + v - - - -

N. gonorrhoeae diplococci - + - - - -

N. lactamica diplococci - + + + - -

N. meningitidis diplococci - + + - - -

N. mucosa diplococci + + + - - +

N. polysaccharea diplococci + + + - - -

N. sicca diplococci + + + - - -

N. subflava diplococci + + + - - -

N. weaveri rod + - - - - -

M. catarrhalis diplococci + - - - + +

NA = nutrient agar; ND = not determined; GAL = glucose; MAL = maltose; LAC= lactose; v = variation

เอกสารอางอง 1. Elias J., Frosch M., and Vogel U. 2011. Neisseria. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen

JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington,

DC: ASM Press; 2011. p. 559-573.

2. Koneman EW, et al. Neisseria species and Moraxella catarrhalis. In: Koneman EW. Koneman’s Color

Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins;

2010. p. 566-622.

3. Vaneechoutte M, Dijkshoorn L, Nemec A, Kampeer P, Wauters G. Acinetobacter, Chryseobacterium,

Moraxella, and other Nonfermentative Gram–Negative Rods. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G,

Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1.



5.4 การวนจฉยเชอแบคทเรย Family Enterobacteriaceaeวรดา สโมสรสข

แบคทเรยใน Family Enterobacteriaceae เปนแบคทเรยทพบไดบอยๆ จากสงสงตรวจผปวย แบคทเรยกลมน

เปนเชอแกรมลบ รปรางแทง ไมสรางสปอร เชอสวนใหญเจรญไดดทอณหภม 30 °C แมวาบางชนดจะเจรญไดด

กวาทอณหภม 25-30 °C เชอมชวตอยไดในสภาวะ facultative anaerobe สามารถหมกยอยน�าตาลกลโคส และบาง

ชนดใหแกสดวย นอกจากนเกอบทงหมดใหผลลบตอการทดสอบ oxidase ยกเวน Plesiomonas shigelloides นอกจาก

น เชอในกลมนสวนใหญใหผลบวกตอการทดสอบ catalase ยกเวน Shigella dysenteriae type 1 (Karas et al., 2007)

การแยกชนดของเชอใน Family Enterobacteriaceae บนอาหารเลยงเชอ สามารถแบงไดเปน 2 กลมยอย คอ กลมท

สามารถหมกยอยน�าตาลแลคโตส (lactose fermenter) และกลมทไมหมกยอยน�าตาล (non-lactose fermenter) ซง

สามารถดไดจากการเจรญบน MAC เชอทสามารถหมกยอยน�าตาล lactose ไดจะใหลกษณะโคโลนเปนสชมพ เชอ

ทไมสามารถหมกยอยน�าตาลแลคโตสจะใหโคโลนไมมส (แผนภมท 5.4-1)

แผนภมท 5.4-1 เชอทสงสย Family Enterobcateriaceae

เชอทสงสยอยใน family Enterobacteriaceae ทมความส�าคญทางคลนก มหลายสายพนธ ท�าใหการแยกพสจน

เชอตองใชวธการทดสอบเพมขน อยางไรกตาม ในบทนไดท�าการเลอกวธทดสอบทควรมใชอยในหองปฏบตการ

เพอใหการจ�าแนกเชอไดถกตองมากขน ดงน TSI (ดการสรางแกส, การสรางไฮโดรเจนซลไฟด) PDA, LDC, ODC,

indole, motility, methyl red, VP, citrate, urea, malonate, gelatin/DNase, esculin, ONPG, yellow pigement, red

pigment, การหมกยอยน�าตาล ไดแก lactose (สามารถดไดจากโคโลนทขนบน MacConkey agar), sucrose, maltose,

mannitol, adonitol, sorbitol และ arabinose


เชอ family Enterobacteriaceae สามารถแยกกลมเบองตนออกจากกนโดยการใช Triple Sugar Iron (TSI) Agar

ไดดงน

กลมท 1 TSI = A/A หรอ A/AG, H2S-

กลมท 2 TSI = A/A หรอ A/AG, H2S+

กลมท 3 TSI = K/A หรอ K/AG, H2S-

กลมท 4 TSI = K/A หรอ K/AG, H2S+

เมอท�าการทดสอบเบองตนและแยกออกดวยผล TSI แลว จะท�าการแยกกลมเชอตอไปดวยผลของการสราง

เอนไซม deaminase ของเชอ โดยใชการทดสอบทเรยกวา phenylalanine deaminase (PDA)

เชอในกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- จะถกพสจน ดงตารางท 5.4-1 ถง 4 และ แผนภมท 5.4-2 ถง 5

เชอในกลมท 2 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S+ จะถกพสจน ดงตารางท 5.4-5 และแผนภมท 5.4-6

เชอในกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S- จะถกพสจน ดงตารางท 5.4-6 ถง 9 และแผนภมท 5.4-7- ถง 10

เชอในกลมท 4 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S+ จะถกพสจน ดงตารางท 5.4-10 และแผนภมท 5.4-11

ตำรำงท 5.4-1 กำรแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (+)

Organisms

Phen

ylal

anin

e de

amin

ase

Lys

ine

deca

rbox

ylas

e

Orn

ithin

e de

carb

oxyl

ase

Yel

low

pig

men

t

Indo

le p

rodu

ctio

n

Mot

ility

D-G

luco

se, g

asFermentation of

Lac

tose

Sucr

ose

Mal

tose

D-M

anni

tol

Cronobacter sakazakii V - + + V + + + + + +

Pantoea agglomerans V - - V V + V V V + +

Proteus penneri + - - - - + V - + + -

Proteus vulgaris + - - - + + V - + + -

Providencia spp. + - - - + V V V V - V

Rahnella aquatilis + - - - - - + + + + -

Tatumella ptyseos + - - - - - - - + - -

V, >11 - <80% positive


แผนภมท 5.4-2 กำรแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (+)


ตำรำงท 5.4-2 กำรแยกพสจนเชอกลมท 1 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S- , PDA (-), LDC (+)

Organisms

Phen

ylal

anin

e de

amin

ase

Lys

ine

deca

rbox

ylas

e

Orn

ithin

e de

carb

oxyl

ase

Yel

low

pig

men

t

Indo

le p

rodu

ctio

n

Mot

ility

Vog

es-P

rosk

auer

Citr

ate

(Sim

mon

s)

Ure

a hy

drol

ysis

Gel

atin

hyd

roly

sis (

22 °C

)

DN

ase

(25

°C)

D-G

luco

se, g

as

Ferm

enta

tion

ofL

acto

se

Sucr

ose

Edwardsiella spp. - + + - V + - - - - - V - +

Enterobacter spp. - + + - - + + + V - - + V +

Escherichia coli - + V - + + - - - - - + + V

Escherichia coli (inactive) - V V - + - - - - - - - V V

Escherichia vulneris - + - V - + - - - - - + V -

Klebsiella oxytoca - + - - + - + + + - - + + +

Klebsiella ozaenae - V - - - - - + - - - V V V

Klebsiella pneumoniae - + - - - - + + + - - + + +

Kluyvera spp. - V + - + + - + - - - V + +

Raoultella ornithinolytica - + + - + - V + + - - + + +

Raoultella terrigena - + V - - - + V - - - + + +

Serratia spp. - V V - V V V + V V + V - +

Serratia fonticola - + + - - + - + V - - V + V

V , >11 - <80% positive


แผน

ภมท

5.4

-3 ก

ำรแย

กพสจ

นเช

อกลม

ท 1

TSI

: A

/A ห

รอ A

/AG

, H2S-

, PD

A (-

), L

DC

(+)


ตำรำ

งท 5

.4-3

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

1 T

SI :

A/A

หรอ

A/A

G, H

2S- ,

PDA

(-),

LD

C (-

)

Org

anis

ms

Phenylalanine deaminase

Lysine decarboxylase

Ornithine decarboxylase

Yellow pigment

Indole production

Motility (25°C)

Motility

Voges-Proskauer

Methyl red

Urea hydrolysis

Gelatin hydrolysis (22°C)

DNase (25°C)

Esculin hydrolysis

Malonate utilization

D-Glucose, gas

Lactose

Sucrose

Ced

ecea

dav

isae

--

+-

--

-+

V+

+-

--

V+

V

Ced

ecea

sp. 3

--

--

--

-+

V+

+-

--

+-

+

Citr

obac

ter s

pp.

--

+-

-V

-V

-+

VV

--

-V

+

Cro

noba

cter

saka

zaki

iV

-+

+-

--

++

-+

--

-+

V+

Ente

roba

cter

spp.

--

V-

--

-V

VV

VV

--

VV

+

Ente

roba

cter

clo

acae

--

+-

--

-+

+-

+V

--

VV

+

Esch

eric

hia

coli

(inac

tive)

-V

V-

-+

--

-+

--

--

--

-

Klu

yver

a cr

yocr

esce

ns-

V+

--

+-

+-

++

--

-+

++

Serr

atia

spp.

-V

V-

V-

-V

VV

V-

V+

+V

V

Yer

sini

a sp

p.-

-V

--

V+

--

VV

V-

-V

-V

V ,

>11

- <80

% p

ositi

ve

Ferm

enta

tion

of


แผน

ภมท

5.4

-4 ก

ำรแย

กพสจ

นเช

อกลม

ท 1

TSI

: A

/A ห

รอ A

/AG

, H2S-

, PD

A (-

), L

DC

(-)

mot

ility

(25˚C)

(25˚C)


ตำรำ

งท 5

.4-4

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

1 T

SI :

A/A

หรอ

A/A

G, H

2S-, P

DA

(-),

LD

C (-

), m

otili

ty 2

5 °C

(-),

DN

ase

25 °C

(-),

red

pigm

ent (

-),

OD

C (-

)

Org

anis

ms




Yellow pigment

Indole production

Motility

Voges-Proskauer

Citrate (Simmons)

Urea hydrolysis

Gelatin hydrolysis (22 °C)

Esculin hydrolysis


ONPG test

D-Glucose, gas

Ferm

enta

tion

of

Lactose

Sucrose

Maltose

Adonitol

L-arabinose

Bud

vici

a aq

uatic

a-

--

--

V-

-V

--

-+

V+

--

-+

But

tiaux

ella

gav

inia

e-

--

--

+-

V-

-+

++

VV

-V

++

Ced

ecea

spp.

--

V-

-+

V+

--

+V

++

VV

+-

-

Citr

obac

ter s

pp.

--

--

VV

-V

V-

-V

VV

VV

+-

+

Pant

oea

aggl

omer

ans

V-

-V

V+

VV

V-

VV

+V

VV

+-

+

Ente

roba

cter

am

nige

nus b

iogr

.1-

-V

--

++

V-

-+

++

+V

++

-+

Esch

eric

hia

coli

inac

tive

-V

V-

+-

--

--

--

+-

VV

+-

+

Ewin

gella

am

eric

ana

--

--

-V

++

--

V-

+-

V0

V-

-

Kle

bsie

lla o

zaen

ae-

V-

--

--

V-

-+

-+

VV

V+

++

Kle

bsie

lla rh

inos

cler

omat

is-

--

--

--

--

-V

+-

--

V+

++

Lecl

erci

a ad

ecar

boxy

lata

--

--

+V

--

V-

++

++

+V

++

+

Moe

llere

lla w

isco

nsen

sis

--

--

--

-+

--

--

+-

++

V+

-

Serr

atia

mar

cesc

ens b

iogr

. 1-

VV

--

VV

V-

V+

-V

--

+V

V-

V, >

11 -

<80%

pos

itive


แผน

ภมท

5.4

-5 ก

ำรแย

กพสจ

นเช

อกลม

ท 1

TSI

: A

/A ห

รอ A

/AG

, H2S-

, PD

A (-

), L

DC

(-),

mot

ility

25

°C (-

), D

Nas

e 25

°C (-

), re

d pi

gmen

t (-)

, O

DC

(-)


ตำรำงท 5.4-5 กำรแยกพสจนเชอกลมท 2 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S+

OrganismsPh

enyl

alan

ine d

eam

inas

e

Lys

ine

deca

rbox

ylas

e

Orn

ithin

e dec

arbo

xyla

se

Indo

le p

rodu

ctio

n

Vog

es-P

rosk

auer

Citr

ate

(Sim

mon

s)

Ure

a hy

drol

ysis

D-G

luco

se, g

as

Fermentation of

Lac

tose

Sucr

ose

Budvicia aquatica - - - - - - V V + -

Citrobacter spp. - - - V - V V V V V

Proteus mirabilis + - + - V V + + - V

Proteus vulgaris + - - + - V + + - +

Proteus penneri + - - - - - + V - +

Salmonella spp. - + + - - + - + V -


แผนภมท 5.4-6 กำรแยกพสจนเชอกลมท 2 TSI : A/A หรอ A/AG, H2S+


ตำรำงท 5.4-6 กำรแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (+)

OrganismsPh

enyl

alan

ine

deam

inas

e

Lys

ine

deca

rbox

ylas

e

Orn

ithin

e de

carb

oxyl

ase

Indo

le p

rodu

ctio

n

Citr

ate

(Sim

mon

s)

Ure

a hy

drol

ysis

Mot

ility

D-G

luco

se, g

as

Fermentation of

Lac

tose

Sucr

ose

D-M

anni

tol

Ado

nito

l

Buttiauxella noackiae + - - V V - + + - - + -

Pantoea agglomerans V - - V V V + V V V + -

Morganella morganii + V V V - + V + - - - -

Providencia spp. + - - V V - V V - V - V

Providencia rettgeri + - - + + + + - - V + +

Providencia stuartii + - - + + V + - - V - -

V , >11 - <80% positive

แผนภมท 5.4-7 กำรแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (+)


ตำรำงท 5.4-7 กำรแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-), ODC (+)

Organisms

Phen

ylal

anin

e de

amin

ase

Lys

ine

deca

rbox

ylas

e

Orn

ithin

e de

carb

oxyl

ase

Indo

le p

rodu

ctio

n

Mot

ility

Vog

es-P

rosk

auer

Citr

ate

(Sim

mon

s)

Citr

ate

(25

°C)

Ure

a hy

drol

ysis

Ure

a hy

drol

ysis

(25

°C)

D-G

luco

se, g

as

Fermentation

of

lact

ose

sucr

ose

Citrobacter spp. - - + V + - + - V - + V -

Enterobacter spp. - - + - V + + - - - + V -

Escherichia albertii

biogroup 2

- - + + - - - - - - V - -

Escherichia coli

(inactive)

- V V + - - - - - - - V V

Escherichia hermanii - - + + + - - - - - + V V

Salmonella Paratyphi A - - + - + - - - - - + - -

Shigella sonnei

(serogroup D)

- - + - - - - - - - - - -

Yersinia spp. - - V V - - - V V + V - V


แผนภมท 5.4-8 กำรแยกพสจนเชอกลมท 3 TSI : K/A หรอ K/AG, H2S-, PDA (-), LDC (-) ODC (+)


ตำรำ

งท 5

.4-8

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

3 T

SI :

K/A

หรอ

K/A

G, H

2S-, P

DA

(-),

LD

C (-

), O

DC

(-)

Org

anis

ms




Yellow pigment

Indole production

Motility

Motility (25 °C)

Voges-Proskauer

Citrate (Simmons)

Urea hydrolysis


ONPG test

D-Glucose, gas

Ferm

enta

tion

of

Lactose

Sucrose

Adonitol

D-Mannitol

L-Arabinose

Sorbitol

Bud

vici

a aq

uatic

a-

--

--

+-

--

V-

+V

+-

-V

+-

But

tiaux

ella

gav

inia

e-

--

--

+-

-V

-+

+V

V-

++

+-

Ced

ecea

spp.

--

--

-+

-V

+-

V+

+V

V-

+-

-

Citr

obac

ter s

pp.

--

--

VV

--

VV

VV

VV

V-

++

+

Pant

oea

aggl

omer

ans

V-

-V

V+

-V

VV

V+

VV

V-

++

V

Esch

eric

hia

coli

(inac

tive)

-V

V-

+-

--

--

-V

-V

V-

++

V

Esch

eric

hia

vuln

eris

-+

--

-+

--

--

++

+V

--

++

-

Ewin

gella

am

eric

ana

--

--

-V

-+

+-

-+

-V

--

+-

-

Kle

bsie

lla o

zaen

ae-

V-

--

--

-V

--

+V

VV

++

+V

Kle

bsie

lla rh

inos

cler

omat

is-

--

--

--

--

-+

--

-V

++

++

Phot

orha

bdus

asy

mni

otic

a-

--

V-

+-

-V

V-

--

--

--

--

Shig

ella

dys

ente

riae

Sero

grou

p A

--

--

V-

--

--

-V

--

--

-V

V

Shig

ella

spp.

--

--

V-

--

--

--

--

--

+V

V

Yer

sini

a pe

stis

--

--

--

--

--

-V

--

--

++

V

Yer

sini

a sp

p.-

-V

--

-+

--

V-

V-

-V

-+

VV

V, >

11 -

<80%

pos

itive


แผน

ภมท

5.4

-9 ก

ำรแย

กพสจ

นเช

อกลม

ท 3

TSI

: K

/A ห

รอ K

/AG

, H2S-

, PD

A (-

), L

DC

(-),

OD

C (-

)

+


ตำรำ

งท 5

.4-9

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

3 T

SI :

K/A

หรอ

K/A

G, H

2S-, P

DA

(-),

LD

C (+

)

Org

anis

ms




Indole production

Motility

Voges-Proskauer

Citrate (Simmons)

Urea hydrolysis


DNase (25 °C)

Gas from Glucose

Ferm

enta

tion

of

Lactose

Sucrose

Adonitol

L-Arabinose

Esch

eric

hia

albe

rtii B

iogr

oup

1-

++

--

--

--

-+

--

-+

Esch

eric

hia

coli

(inac

tive)

-V

VV

--

--

--

-V

V-

V

Esch

eric

hia

ferg

uson

ii-

++

++

-V

-V

-+

--

++

Esch

eric

hia

vuln

eris

-V

--

+-

--

V-

+V

--

+

Haf

nia

alve

i-

++

-V

V-

-V

-+

--

-+

Haf

nia

alve

i bio

grou

p 1

-+

V-

-V

--

V-

--

--

-

Kle

bsie

lla o

zaen

ae-

V-

--

-V

--

-V

VV

++

Salm

onel

la e

nter

ica

(Gro

up I

)

Sero

type

Cho

lera

esui

s

-+

+-

+-

V-

--

+-

--

-

Serr

atia

odo

rifer

a bi

ogro

up 2

-+

-V

++

+-

-+

V+

-V

+

Yer

sini

a ru

cker

i-

V+

--

--

--

--

--

--

Yok

enel

la re

gens

burg

ei-

++

-+

-+

--

-+

--

-+

V, >

10 -

<89%

pos

itive


แผน

ภมท

5.4

-10

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

3 T

SI :

K/A

หรอ

K/A

G, H

2S-, P

DA

(-),

LD

C (+

)


ตำรำ

งท 5

.4-1

0 ก

ำรแย

กพสจ

นเช

อกลม

ท 4

TSI

: K

/A ห

รอ K

/AG

, H2S+

Org

anis

ms




Indole production

Motility

Citrate (Simmons)

Hydrogen sulfide (TSI)


ONPG test

Gas from Glucose

Ferm

enta

tion

of

Lactose

Sucrose

L-arabinose

D-sorbitol

Maltose

Bud

vici

a aq

uatic

a-

--

-V

-V

V+

VV

-+

+-

Citr

obac

ter s

pp.

--

-V

VV

VV

VV

VV

--

+

Edw

ards

iella

tard

a-

++

++

-+

-+

+-

--

-+

Lem

inor

ella

spp.

--

--

-V

+-

-V

--

+-

-

Mor

gane

lla m

orga

nii

+V

++

V-

--

V+

--

--

-

Prot

eus m

irabi

lis+

-+

-+

++

--

+-

V-

--

Salm

onel

la e

nter

ica

(Gro

up I)

-+

+-

+V

+-

-+

V-

++

+

Salm

onel

la T

yphi

-+

--

+-

+-

--

--

-+

+

Salm

onel

la C

hole

raes

uis

-+

+-

+V

V-

-+

--

-+

+

Salm

onel

la G

allin

arum

-+

--

--

+-

--

--

V-

+

Salm

onel

la P

ullo

rum

-+

+-

--

+-

-+

--

+-

-

Salm

onel

la G

roup

II, I

IIa,

IIIb

stra

ins

-+

+-

++

++

V+

V-

++

+

Salm

onel

la G

roup

IV st

rain

s-

++

-+

++

--

+-

-+

++

Salm

onel

la b

ongo

ri (G

roup

V)

-+

+-

++

+-

++

--

++

+

Salm

onel

la G

roup

VI s

train

s-

++

-+

++

-V

+V

-+

-+

Trab

ulsi

ella

gua

men

sis

-+

+V

++

+-

++

--

++

+

V, >

10 -

<89%

pos

itive


แผน

ภมท

5.4

-11

กำร

แยกพ

สจน

เชอก

ลมท

4 T

SI :

K/A

หรอ

K/A

G, H

2S+

S. G

allin

rum

S. P

ullo

rum

S. T

arph

i

S. C

hole

raes

uis


เอกสารอางอง 1. Abbot, S L. 2007. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and Other

Enterobacteriaceae. In: P. R. Murray editor Manual of Clinical Microbiology 9th ed., Washington,

DC : ASM Press. p. 698-715.

2. Farmer III, J. J., K. D. Boatwright, and J. M. Janda. Enterobacteriaceae: Introduction and

Identification. In: P. R. Murray (ed.), Manual of clinical microbiology, 9th ed. Washington,

DC:ASM Press; 2007. p. 649-669.

3. Nataro, J. P., C. A. Bopp, P. I. Fields, J. B. Kaper, and N. A. Strockbine. Escherichia, Shigella,

and Salmonella. In: P. R. Murray editor. Manual of Clinical Microbiology 9th ed. Washington,

DC:ASM Press; 2007. p. 670-687.

4. Walker, K. E., A. J. Horneman, C. R. Mahon, and G. Manusells. Enterobacteriaceae. In C. R.

Mahon, D. C. Lehman, and G. Manuselis editor. Textbook of Diagnositic Microbiology 4th ed.

Maryland Height. Mo:Saunder Elsevier; 2011. p. 427-461.

5. Wanger, A. Yersinia. In: P. R. Murray editor. Manual of Clinical Microbiology 9th ed. Washington,

DC:ASM Press; 2007. p. 688-697.


5.5 การวนจฉยเชอแบคทเรย Family Vibrionaceaeบญชวย เอยมโภคลาภ

เชอใน genus Vibrio เปนเชอประเภทแกรมลบรปแทงบางชนดมรปรางโคงงอ สามารถ ferment น�าตาล glucose

ได บางชนดสรางแกส เกอบทงหมด สราง oxidase enzyme บางชนดตองการเกลอในการเจรญ เชอในกลมนม

รายงานวาท�าใหเกดอจจาระรวง บางชนดเกดการตดเชอในอวยวะตางๆ ได เชอสวนใหญเจรญไดบน highly selective

medium เชน Thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS) agar ในบทนจะกลาวถงการเพาะแยกและวนจฉยเชอใน

Family Vibrionaceae รวมถงเชอในกลมใกลเคยง เชน Aeromonas และ Plesiomonas (ซงอยในตระกล Enterobac-

teriaceae ดวย)

1. การเพาะแยกและวนจฉยเชอ Vibrio จากอจจาระ 1.1 การเลยงเพมจ�านวนเชอ (enrichment)

การเลยงเพมจ�านวนเชอ Vibrio ท�าไดโดยใสสงสงตรวจ ลงในหลอดทบรรจอาหารเลยงเชอ เชน alkaline

peptone water (APW) แลวอบทอณหภม 35 °C ประมาณ 6 ชม. เชอจะเพมจ�านวนขน การเพาะเชอจาก APW ลง

บน Plate ควรใช loop ตกเฉพาะบรเวณผวดานบน เพราะจะมเชอจ�านวนมาก (ไมควรเขยาหลอด) ถาอบนานกวา

6 ชม. เชอทเปน normal flora บางชนดอาจเจรญเพมจ�านวน ท�าใหตรวจหา Vibrio ไดยากขน ส�าหรบเชอ Aeromonas

และ Plesiomonas นน ยงไมมการเลยงเพมจ�านวนเชอเปนการเฉพาะ จงเพาะหาเชอนโดยวธ direct plating จาก

อจจาระ หรอจาก transport medium ลงบนอาหารเพาะเชอโดยตรง

1.2 การเจรญบนอาหารเพาะเชอ

โดยทวไปเชอ Vibrio เจรญไดดบนอาหารเพาะเชอหลายชนดโดยเฉพาะอาหารชนด non-selective medium

เชน BA ซง Vibrio โดยทวไปจะใหลกษณะ β-hemolysis บางชนดอาจให α-hemolysis เชน Vibrio vulnificus แต

บางชนด อาจไมแสดงลกษณะ hemolysis กได

อาหารเพาะเชอชนด selective medium ทนยมใชคอ TCBS agar เชอทเจรญไดบนอาหารน สวนใหญจะเปน

เชอในกลม Vibrio ซงจะมขนาดโคโลนคอนขางใหญ (2-3 mm ขนไป) และเชออนบางชนดกอาจเจรญได แตโดย

ทวไปโคโลนจะเลกกวา เชอทเจรญบน TCBS agar ถาหมกยอยน�าตาล sucrose ได จะใหโคโลนสเหลอง ถาหมก

ยอยน�าตาล sucrose ไมได จะใหโคโลนสเขยว

ส�าหรบเชอ Aeromonas และ Plesiomonas โดยทวไปไมเจรญบน TCBS agar แตสามารถเจรญไดบนอาหาร

ชนดอนทใชอยตามปกต เชน SS agar หรอ MAC เปนตน ลกษณะโคโลนของ Plesiomonas อาจคลาย Shigella และ

ลกษณะโคโลนของ Aeromonas จะคอนขางใหญ อาจแบนหรอนนได และไม ferment น�าตาล lactose ลกษณะของ

เชอทงสองอาจไมสามารถแยกจากเชออนทเปน normal flora ไดชดเจน จงควรท�า oxidase test กอน แลวเลยงเชอ

ลงใน TSI agar และดลกษณะของ TSI ในวนรงขน

1.3 การวนจฉยเชอ

เมอไดลกษณะโคโลนบน TCBS agar แลว ในขนตนมกจะทดสอบวา เชอนนคอ Vibrio cholerae O1 หรอ

O139 หรอไม ซงท�าไดโดยเลอกโคโลนทมสเหลองใส ท�าปฏกรยา agglutination กบ antisera (โดยทวไปใช Vibrio

cholerae O1 antiserum ไดแก polyvalent, Ogawa, Inaba และ Vibrio cholerae O139 antiserum) โดยอาจทดสอบ

กบ Vibrio cholerae polyvalent anti-serum กอน ถาใหผลลบกทดสอบกบ O139 antiserum ถาใหผลบวกกบ


polyvalent antiserum กควรทดสอบกบ monovalent antiserum ทงสองชนดคอ Ogawa และ Inaba จงจะสามารถ

รายงานผลการตรวจในขนตนได เชอทขนบน TCBS agar และสงสยวาเปนเชอ Vibrio ทงโคโลนสเหลอง และโค

โลนสเขยว ใหทดสอบ biochemical test เพอวนจฉย species การทดสอบ biochemical test ของเชอ Vibrio,

Plesiomonas และ Aeromonas ดในตารางท 5.5-1 และตารางท 5.5-2

1.4 การรายงานผล

ถาเชอทน�ามาวนจฉยใหผลบวกกบ Vibrio cholerae O1 antiserum ใหรายงานผล serotype เชนรายงานวา

Vibrio cholerae O1, Ogawa serotype หรอ Vibrio cholerae O1, Inaba serotype ถาเชอใหผลบวกกบ O139 antiserum

รายงานวา Vibrio cholerae O139 เปนตน ถาใหผลลบกบ antiserum แตผลการทดสอบ biochemical test ไดเปน

Vibrio cholerae ใหรายงานวา Vibrio cholerae non-O1/ non-O139 ส�าหรบเชอ Vibrio อน หรอเชอ Aeromonas

และ Plesiomonas รายงานตามผลปฏกรยาชวเคมททดสอบได

1.5 ขอควรระวง

ในการวนจฉยเชอ Vibrio species จาก TCBS agar มขอควรระวงบางประการคอ

1. หลอด alkaline peptone water (APW) ซงเพาะเชอลงบน TCBS agar แลวยงไมควรทงในวนนน

ควรเกบไวอยางนอยอก 1 วน เพอวาในบางกรณอาจมปญหา อาจตองน�าหลอดมาตรวจสอบความถก

ตองอกครง

2. ในการทดสอบความทนเกลอ (salt tolerance) ตองระวงไมใสเชอมากเกนไปจน broth ขน เพราะ

จะท�าใหอานเปนคาบวก ซงอาจเปนผลบวกปลอม

3. antiserum ทใชทดสอบตองไมหมดอาย เพราะ antiserum ทหมดอาย อาจใหผลลบปลอม หรอ

ผลบวกปลอมได และ antiserum เมอใชงานเสรจไมควรวางไวทโตะ ควรเกบรกษาไวทอณหภม

4-8 °C

2. การเพาะแยกและวนจฉย Vibrio species จากสงสงตรวจอนทมใชอจจาระ โดยทวไปการเพาะเชอจากสงสงตรวจอนทมใชอจจาระนน จะใชอาหารเพาะเชออยางนอย 2 ชนด คอ BA และ

MAC ซงการเจรญของเชอบนอาหารเพาะเชอทงสองชนดน อาจใหลกษณะบางประการ ซงจะท�าใหนกถงวาอาจ

เปนเชอ Vibrio ลกษณะดงกลาวไดแก

2.1 การเจรญบน BA โดยทวไปเชอในกลม Vibrio นมกจะใหลกษณะ β-hemolysis ถาโคโลนบน BA ม

ลกษณะคลายเชอแกรมลบ (ใหญ, มนวาว) และม β-hemolysis กควรทดสอบ oxidase ถาใหผลบวกกอาจเปนเชอ

ในกลม Non-fermenter หรอเชอ Vibrio ได

2.2 การเจรญบน MAC เชอ Vibrio cholerae หรอเชอ Vibrio parahaemolyticus เมอเจรญบน MAC มกจะ

ไม ferment น�าตาล lactose แตจะใหโคโลนทมสคอนขางคล�ากวาสของเชอ non-lactose fermenter ทวไป ซงควร

ทดสอบ oxidase ทกครง

2.3 ในหองปฏบตการบางแหง อาจน�าเชอทเพาะไดไปทดสอบ biochemical test โดยไมไดทดสอบ oxidase

กอน ซงเชอ Vibrio และเชอในกลมทใกลเคยงบางชนด อาจใหปฏกรยาทคลายกบเชอใน Family Enterobacteriaceae

และอาจรายงานผลผดพลาดได แตมขอสงเกตประการหนงคอ ในการทดสอบ Indole production โดยเลยงเชอใน

SIM medium เมอหยด Kovac’s reagent ลงไป ถาเปนเชอกลม Vibrio มกจะใหผล Indole บวก แตสแดงทเกดขน

มกจะเกดคอนขางชา และสมกจะไมแดงจดเหมอนกบทเกดจากเชอ Enterobacteriaceae ชนดอน



1. Abbott SL, Cheung WKW and Janda JM. The genus Aeromonas : biochemical characteristics,

atypical reaction, and phenotypic schemes. J Clin Microbiol. 2003; 41:2348-57

2. Abbott SL, Janda JM, Farmer III JJ. Vibrio and Related Organisms. In: Versalovic J, Carroll

KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical

Microbiology 10th ed. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 666-676.

3. Horneman AJ, Ali A. Aeromonas. In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH,

Landry ML, Warnock DW editor. Manual of Clinical Microbiology 10th ed. Washington,

DC: ASM Press; 2011. p. 658-665.


ตำรำ

งท 5

.5-1

กำร

ทดส

อบป

ฏกร

ยำชว

เคมข

องเช

อ V

ibri

o แล

ะ Pl

esio

mon

as

Test

b%

Pos

itive

for:

a

P.

shig

ello

ides

V.

chol

erae

V.

mim

icus

V.

met

schn

ikov

iic

V.

cinc

inna

tiens

is

G.

holli

sae

P.

dam

sela

e

V.

fluvi

alis

V.

furn

issii

V.

algi

noly

ticus

V.

para

haem

olyt

icus

V.

euni

ficus

d

V.

harv

eyi

Indo

le (H

IB)

VP

100 0

99 75

98 9

20 96

8 0

97 0

0 95

13 0

11 0

85 95

98 0

97 0

100

50

Moe

ller's

A

rgin

ine

L

ysin

e

O

rnith

ine

Mot

ility

Gel

atin

hyd

roly

sis

(22

°C)

D–G

luco

se, g

as p

rodu

ctio

n

98 99 95 95 0 0

0 99 99 99 90 0

0 100

99 98 65 0

60 35 0 74 65 0

0 57 0 86 0 0

0 0 100 0 0 0

93 50 0 25 6 10

93 0 0 70 85 0

100 0 0 89 86 100

0 99 50 99 90 0

0 100

95 99 95 0

0 99 55 99 75 0

0 100 0 0 0 0

Aci

d pr

oduc

tion

from

:

L

–Ara

bino

se

C

ello

bios

e

L

acto

se

m

yo-In

osito

l

S

alic

in

S

ucro

se

ON

PG

0 0 80 95 0 0 90

0 8 7 0 1 100

94

1 0 21 0 0 0 90

0 9 50 40 9 100

50

100

100 0 100

100

100

86

97 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 5 0

93 30 3 0 0 100

40

100

11 0 0 0 100

35

1 3 0 0 4 99 0

80 5 1 0 1 1 5

0 99 85 0 95 15 75

0 50 0 0 0 50 0

Salt

tole

ranc

e (g

row

th

i

n nu

trie

nt b

roth

with

):

0

% N

aCi

6

% N

aCl

O/1

29 s

usce

ptib

ility

e

100

NA

100

100

53 99

100

49 95

0 78 90

0 100

25

0 83 40

0 95 90

0 96 31

0 100 0

0 100

19

0 99 20

0 65 98

0 100

100

A

bbre

viat

ions

: HIB

, hea

rt in

fusi

on b

roch

; VP,

Vog

es-P

rosk

auer

; ON

PG, α

–nitr

ophe

nyl–

β–D

–gal

acto

pyra

nosi

de: N

aCl,

sodi

um c

hlor

ide;

NA

, not

ava

ilabl

e.a

Perc

enta

ge o

f str

ains

pos

itive

aft

er 4

8 h

of in

cuba

tion

at 3

6 °C

unl

ess

othe

rwis

e in

dica

ted.

Mos

t pos

itive

rea

ctio

ns o

ccur

with

in 2

4 h.

b

1% N

aCl a

dded

to a

ll m

edia

exc

ept s

alt t

oler

ance

test

s.c

Thi

s or

gani

sm is

oxi

dase

neg

ativ

e an

d do

es n

ot r

educ

e ni

trat

e to

nitr

ite.

d B

iogr

oup

1 st

rain

s,

e Zo

ne o

f inh

ibiti

on p

rese

nt (d

isk

cont

ent,

150

µg).

Dat

a fo

r Pl

esio

mon

as a

re fr

om th

e M

icro

bial

Dis

ease

s La

bora

tory

.


ตำรำ

งท 5

.5-2

กำร

ทดส

อบป

ฏกร

ยำชว

เคมข

องเช

อ A

erom

onas

Test

Res

ulta

A.

hydr

ophi

laA

.be

stiar

umA

.sa

lmon

icid

aA

.ca

viae

A.

med

iaA

.cu

cren

ophi

laA

.ve

roni

ibA

. ja

ndae

iA

.Sc

hube

rtii

A.

trota

Util

izat

ion

of:

C

itrat

e

D

L–La

ctat

e

U

roca

nic

acid

Glu

cona

te o

xida

tion

Gas

from

D–g

luco

se

PZA

Indo

le

Vog

es–P

rosk

auer

Lipa

se (c

orn

oil)

Aci

d fr

om:

C

ello

bios

e

L

acto

se

L

–Rha

mno

se

D

–Sor

bito

l

G

luco

se 1

–pho

spha

te

G

luco

se 6

–pho

spha

te

L

actu

lose

D

–Man

nose

G

lyce

rol

D

–Man

nito

l

S

ucro

se

Am

pr

+ (9

2)

V (8

4)

V (1

6)

V (6

4)

+ (9

2)

V (2

4)

+ (9

6)

+ (9

2)

+ (1

00)

– (4

)

V (6

4)

V (2

4)

– (0

)

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (9

6)

+ (9

6)

+ (1

00)

+ (1

00)

V (3

8)

– (0

)

+ (9

4)

– (1

3)

V(6

9)

V (5

0)

+ (1

00)

V (6

3)

+ (8

8)

V (3

8)

– (1

3)

V (6

9)

– (0

)

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (1

00)

+(10

0)

+ (9

4)

+ (9

4)

+ (8

5)

– (0

)

+ (1

00)

– (0

)

V(7

7)

V(3

1)

+ (1

00)

V (6

2)

+ (9

2)

V (6

9)

+ (9

2)

– (0

)

+ (8

5)

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (8

5)

+ (8

8)

+ (9

6)

+ (1

00)

– (0

)

– (0

)

+ (8

8)

V (8

4)

– (0

)

V (7

6)

+ (1

00)

V (6

0)

– (0

)

– (4

)

– (4

)

– (4

)

V (6

8)

V (3

2)

V (6

8)

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

V (8

2)

V (5

6)

+ (1

00)

–(0)

– (0

)

V (1

8)

+ (1

00)

(0)

V (8

2)

+ (1

00)

V (6

4)

– (0

)

– (0

)

+ (1

00)

+ (1

00)

V(5

5)

+ (1

00)

V (5

5)

+ (1

00)

+ (1

00)

V (7

3)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

V (7

8)

+ (1

00)

+ (8

9)

(0)

+ (8

9)

V (5

6)

– (1

1)

V (2

2)

– (0

)

+ (1

00)

+ (1

00)

– (0

)

+ (1

00)

– (1

1)

+ (1

00)

V (3

3)

+ (1

00)

V (5

2)

– (0

)

– (0

)

V (6

0)

+ (9

2)

ND

+ (1

00)

+ (9

2)

+ (9

2)

V (2

0)

– (1

2)

– (0

)

– (0

)

ND

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (8

7)

–(7)

– (7

)

V(6

0)

+ (1

00)

ND

+ (1

00)

+ (8

7)

+ (1

00)

V (2

0)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (1

00)

+ (1

00)

– (0

)

+ (9

3)

V (5

8)

V (5

8)

– (0

)

–(0)

–(0)

ND

V (1

7)

V (1

7)

+ (1

00)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

ND

ND

ND

+ (9

2)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

+ (9

2)

+ (9

4)

+ (8

8)

V (7

5)

–(0)

V (6

9)

ND

+ (1

00)

– (0

)

–(0)

+ (1

00)

– (0

)

– (0

)

– (0

)

ND

ND

ND

+ (1

00)

+ (9

4)

V (6

9)

V (1

9)

– (6

)

a Dat

a co

mpi

led

from

Tab

les

2, 6

, 7

and

8 in

ref

eren

ce 2

and

rep

rint

ed w

ith p

erm

issi

on.

+, ≥

85%

of

the

stra

ins

posi

tive;

– <

15%

pos

itive

; V

, 15

to

85%

pos

itive

(r

esul

ts a

t 48

h).

Num

bers

in p

aren

thes

es in

dica

te p

erce

nt p

ositi

ve fo

r te

st a

t th

e fin

al d

ay o

f re

adin

g. G

luco

nate

, 2 d

ays;

DL

-lact

ate

and

uroc

anic

aci

d, 3

day

s: C

itrat

e,

4 da

ys: c

arbo

hydr

ates

, ind

ole,

and

lipa

se, 7

day

s: p

yraz

inam

idas

e (P

ZA),

2 da

ys; A

mpr , r

esis

tanc

e to

10

µg o

f am

pici

llin,

1 d

ay: V

oges

-Pro

skau

er, 3

day

s. N

D, n

ot d

one.

b Blo

var

sobr

ia (

DN

A h

ybri

diza

tion

gro

up 8

); th

e se

para

tion

of

A.

vero

nu b

v. v

eron

ii (D

NA

hyb

ridi

zati

on g

roup

10)

fro

m A

. ve

roni

i bv

. so

bria

is

achi

eved

wit

h A

. ur

onit

bv.

ver

onii

hav

ing

posi

tive

rea

ctio

ns

for

omit

hin

e d

ecar

boxy

lase

an

d e

scu

lin

hyd

roly

sis

and

a n

egat

ive

reac

tion

for

arg

inin

e d

ihyd

rola

se.

c For

each

of

the

thre

e A

crom

onas

spe

cies

com

plex

es,

the

disc

rim

inat

ory

reac

tion

s be

twee

n t

he

spec

ies

wit

hin

eac

h c

ompl

ex a

re p

rese

nte

d in

bol

d ty

pe.


5.6 การวนจฉยเชอแบคทเรยกลม Glucose Nonfermentative Gram-Negative Bacilli

สรางค เดชศรเลศ

เพญแข รตนพรยกล

แบคทเรยทจดอยในกลม glucose nonfermentative gram-negative bacilli (NF) มคณสมบตทเหมอนกนคอ ไม

ferment glucose ใหเกดกรด เชอในกลมนเกยวของกบการกอโรคในคน สามารถแบงได 2 กลม คอ กลมทสลาย

glucose โดยขบวนการ oxidation ในหลอดอาหาร OF (glucose) ทไมไดปดทบดวย liquid paraffin เรยกเชอในกลม

นวา oxidizer (oxidative bacteria) ไดแก Pseudomonas, Burkholderia เปนตน และกลมทไมสลาย glucose ทงใน

หลอดอาหาร OF (glucose) ทปดและไมปดทบดวย liquid paraffin เรยกกลมนวา nonoxidizer (nonoxidative

bacteria) เชอในกลมน ไดแก เชอกลม Alcaligenes, Moraxella เปนตน บาง genus อาจเปนเชอทเจรญชาหรอตองการ

สารอาหารพเศษในการเจรญ ซงอาจไมเจรญในอาหารวนทใชท�า OF test เชน เชอ Bordetella, Brucella, Eikenella

และ Francisella โดยในบทนจะกลาวถงเชอในกลม NF เฉพาะเชอทเจรญไดงายบนอาหารเพาะเชอทวไป

ลกษณะทวไปของเชอ glucose nonfermentative gram–negative bacilli 1. รปรางแทง (rod) คอนขางกลม (coccobacilli) หรอกลม (cocci: Moraxella catarrhalis)

2. เปน strictly aerobic bacteria คอเจรญเตบโตในบรรยากาศทมออกซเจน แตเชอบางชนดเจรญไดในสภาพไร

อากาศทม electron acceptor อนทไมใชออกซเจน เชน ไนเตรท ดวยขบวนการdenitrification ไดแก

P. aeruginosa, P. stutzeri, Achromobacter xylosoxidans และ A. denitrificans

3. TSI ใหผลเปน neutral หรอ alkaline slant และ neutral butt (N/N หรอ K/N) ยกเวน Burkholderia

pseudomallei ให acid slant และ neutral butt (A/N) หลงอบนานกวา 24 ชม.

4. ไมใช glucose โดยขบวนการ fermentation แตใช glucose โดยวธ oxidation หรอไมสามารถใช glucose ได

เลย (nonsaccharolytic) (ยกเวน Flavobacterium บางสายพนธสามารถ weakly ferment)

5. ไมสราง Spore

ปกตเชอกลม NF พบไดทวไปในธรรมชาต เชน ในดน น�า สงแวดลอมในโรงพยาบาล เชน อางลางมอ พนหอง

เครองมอตางๆ และอาศยบนเยอเมอกในคนและสตวโดยไมท�าใหเกดอนตราย เชอนท�าใหเกดโรคในคนตอเมอม

ภมตานทานต�า เชน ในผทรบยาลดภมตานทาน ผปวยมะเรง, เบาหวาน, น�ารอนลวก หรอ โดยผานเครองมอแพทย

ทปนเปอน เชน เครองมอผาตด เครองชวยหายใจ ฯลฯ จงถอวาเปนเชอฉวยโอกาส (opportunistic pathogen) ดง

นนเชอกลมนจงมกเกยวของกบโรคตดเชอในสถานพยาบาล (healthcare associated infections) ซงปจจบนพบวา

เชอกลมนมกดอสารตานจลชพและเปนปญหาสาธารณสข


เทคนคการแยกและวนจฉยเชอ nonfermenter 1. กำรทดสอบกำรใชน�ำตำล เชอกลม NF ใชอาหารทดสอบ OF medium ทเปน semisolid มปรมาณ peptone

0.2% และ น�าตาล 1.0% (เชอแบคทเรยทวไปใชอาหารเหลวทม peptone 1% และน�าตาล 0.5%) เนองจาก

การใชน�าตาล โดยวธ oxidation ของเชอ NF ใหผลกรดนอยกวาการใชน�าตาลโดยวธ fermentation ดงนนการ

ใช peptone ต�าส�าหรบ NF ท�าใหดางทเกดจากการใช peptone ของเชอมปรมาณไมมากพอทจะกลบเกลอน

ความเปนกรดทเกดจาก oxidation น�าตาลของเชอ NF ท�าใหเกดการเปลยนส indicator ใหเราสงเกตเหนผล

บวกจากการใชน�าตาลได ส�าหรบการใช semisolid media แทนอาหารเหลว เพอใหกรดทเกดขนไมเจอจาง

หายไปในอาหารเหลว ผลบวกทได คอเหนการเปลยนแปลงสจากเขยวเปนเหลองทบรเวณผว OF medium

2. Motility การทดสอบ motility ใน semisolid เปนวธทไมดส�าหรบเชอ NF เนองจากเชอ NF สวนใหญไมขน

ในสวนลกของหลอดอาหาร semisolid แมวาเชอบางชนดอาจเจรญในสวนใตผวไดแตอาจสงเกตเหนการ

เคลอนทไมชดเจนเสมอไป ดงนนการดการเคลอนไหวโดยวธ wet mount หรอ hanging drop เปนวธทดทสด

เมอพบวาเชอมการเคลอนท ใหท�าการยอม flagella

3. กำรยอม flagella ใชน�ายายอมโดยวธ Ryu (J" Clin" Microbiol 1982, 16: 984-952) หยดน�ากลนกลาง slide

เขยเชอแตะรอบ ๆ น�ากลน 4 จด คอ บน-ลาง, ซาย-ขวา ทงใหแหงแลวหยดน�ายายอมใหทวทงไว 2-15 นาท

เปนวธทงายกวาการยอมแกรม และมประโยชนในการแยกชนดเชอกลม NF มาก เชน Pseudomonas ม flagella

ทขวเซลล (polar flagella) Bordetella และ Alcaligenes ม flagella ลอมรอบเซลล (peritrichous flagella)

4. กำรทดสอบ oxidase ควรใชน�ายา 1% N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride ซงมความไวนอย

กวา (อานผลภายใน 30 วนาท) tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (อานผลภายใน 10 วนาท)

เนองจากเมอใช 1% N-dimethyl-p-phenylenediamine เชอ B. cepacia และ S. maltophilia สายพนธทใหผล

oxidase ลบ อาจใหผลบวกโดยใช tetramethyl-pphenylenediamine ในการทดสอบควรใชน�ายาทเตรยมใหมๆ

หรอเกบในขวดสชาในตเยน 4-10 °C ไมเกน 1 สปดาห เชอทใชทดสอบควรเปนเชอใหมทอายไมเกน 18-24 ชม.

และไมควรเปนเชอทเพาะในอาหารทม carbohydrate เชน TSI ควรทดสอบกบเชอทเพาะใน TSA หรอ NA

5. อณหภม ทเหมาะสมในการอบเพอทดสอบทางชวเคมของเชอ NF คอ 30-35 °C และอานผลหลงอบนาน 48 ชม.

6. Indole production เนองจากเชอ NF บาง species สราง indole ในปรมาณต�า การใช SIM ในการ ทดสอบ

บางครงอาจไมไดผล จงควรใชอาหารทดสอบทเตรยมจาก BHI ทเตม tryptophan และควรสกด indole ดวย

xylene และเขยา กอนเตม Ehrlich’s หรอ Kovac’s reagent ควรระวงอยาเตมxylene, Ehrlich’s หรอ Kovac’s

reagent ปรมาณมากเกนไปเพราะจะท�าให indole ทเกดขนเจอจางท�าใหไมสามารถตรวจพบการเกด indole

สวนเชอ Delftia acidovorans ใหผลสสมซงเกดจาก anthranilic acid ไมไดเกดจากการสราง indole

7. กำรทดสอบ lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase หรอ arginine dihydrolase ควรใชอาหาร

ทดสอบสตรของ Moeller (แทนสตรของ Falkow) ใสในหลอดปรมาตร 1-2 ml และลงเชอปรมาณมาก

ปดทบดวย liquid paraffin สง 4 mm และมความจ�าเปนอยางยงทจะตองมหลอดอาหารทดสอบควบคมท

ไมไดเตม lysine, ornithine หรอ arginine เพอชวยในการแปลผล

8. Nitrate reduction กลมเชอ NF ทใช nitrate (denitrification) และใหกาซไนโตรเจนประกอบดวย Burkholderia

pseudomallei, Pseudomonas aeruginosa, P. stutzeri, P. mendocina, Achromobacter xylosoxidans,

Achromobacter denitrificans, Alcaligenes faecalis, Ochrobactrum anthropi และ Rhizobium radiobacter


9. Pigmentation กลมเชอทใหลกษณะโคโลนเหลองออน-เหลองแก ประกอบดวย Chryseobacterium,

Elizabethkingia, Sphingomonas, Ralstonia, P. luteola, P. oryzihabitans, B. cepacia, S. maltophilia และ

Brevundimonas vesicularis กลมเชอทให pigment สชมพเยม-ชมพออกแดงปนอฐ เชน Roseomonas,

Methylobacterium

10. Esculin hydrolysis กลมเชอทใหผลบวกในการทดสอบ esculin ประกอบดวย Brevundimonas vesicularis,

Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobacterium, Elizabethkingia, Flavobacterium,

Pseudomonas luteola, Sphingomonas, Sphingobacterium, Rhizobium และ Ochrobactrum anthropic

11. กำรยอมแกรม Paracoccus yeeii มลกษณะเปน coccobacilli คอนขางกลมและใหญเรยงตวเปนระเบยบ

ลกษณะเดนเปน O-shape ใหญกลมเหมอนขนมโดนท กลม Moraxella spp. เปน coccobacilli หรอ

diplococci และ Neisseria spp. เปน rod ขนาดเลก

เชอแบคทเรยกลม NF 4 ชนดเปนเชอกอโรค (Pathogen) ไดแก

1. Pseudomonas aeruginosa

2. Burkholderia pseudomallei

3. Burkholderia mallei

4. Elizabethkingia meningoseptica

เชอแบคทเรยกลม NF ทเปนเชอฉวยโอกำส (Opportunistic pathogen) หรอโรคตดเชอในโรงพยำบำลทพบบอย

ดงน

1. Pseudomonas

2. Acinetobacter

3. Burkholderia

4. Stenotrophomonas

5. Flavobacterium

6. Achromobacter

7. Chryseobacterium

8. Brevundimonas

9. Comamonas

10. Ochrobactrum

11. Ralstonia

12. Shewanella

13. Rhizobium

14. Alcaligenes

15. Moraxella

16. Methylobacterium

17. Roseomonas

18. Sphingomonas


เชอแบคทเรยกลม NF ท กอโรค ไดแก

1. Pseudomonas aeruginosa

เปนไดทงเชอกอโรค (pathogen) ทกอโรคตดเชอในชมชน และฉวยโอกาส (opportunistic pathogen) ทกอ

โรคตดเชอในโรงพยาบาล (nosocomial infection) สามารถเจรญไดบน BA และ MAC ท 30-35 °C นาน 18-24 ชม.

มกม hemolysis มกลนคลายองน โคโลนมกจะแบนและแผ ขอบอาจจะหยก (serrated) และมหลายลกษณะ เชน

หยาบ (rough), เรยบ (smooth), เยม (mucoid) บางสายพนธมขนาดเลกฝอย เชอนสามารถเคลอนทโดยใช flagella

1 เสนทขวเซลล (monotrichous flagellum) สามารถสราง pigment ได เชน

- pyocyanin (สน�าเงน) pigment นสรางไดเมอเพาะเชอใน King A medium หรอ Pseudomonas agar P

- pyoverdin หรอ fluorescein (สเหลองแกมเขยวหรอเหลองแกมน�าตาลเรองแสงภายใตแสงยวคลนสน)

pigment นสรางไดดเมอเพาะเชอใน King B medium หรอ Pseudomonas agar F

- pyocyanin ผสมกบ pyoverdin จะเหนโคโลนเปนสเขยวสวาง

- pyomelanin (สน�าตาลด�า) pigment นสรางไดดเมอเพาะเชอใน King B medium หรอ Pseudomonas agar F

- pyorubrin (สแดง)

เชอนบางสายพนธไมมส (non-pigment) สายพนธเยม (mucoid) ทแยกไดจากผปวยตดเชอระบบทางเดนหายใจ

อาจจะมลกษณะทางสรรวทยาเปลยน ไดแก เจรญชา ไมเคลอนท ไมม pigment ไมสามารถเคลอนท ฝงตวบนผว

agar และเมอละลายในอาหารเหลวจะเกด autoaggregate

2. Burkholderia pseudomallei (ชอเดม Pseudomonas pseudomallei)

พบในสงแวดลอมธรรมชาต เชน ดนชน บอน�า เขาสรางกายโดยการหายใจ รบประทานหรอเขาบาดแผล

บรเวณผวหนง กอโรค melioidosis หรอเรยกวาโรค Vietnamese time bomb ในผปวยพบไดในเลอด เสมหะ หนอง

ปสสาวะ เชอนเจรญไดบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 18-24 ชม. ลกษณะโคโลนมสเทา ใส ขอบเรยบ

และมนวาว เมออายเกน 48 ชม. จะมลกษณะขาวขนและยน (wrinkle colony) กลนคลายดนหลงฝนตก (musty

odor) เมอยอมแกรมจะตดสเขมทปลายทง 2 ขาง (bipolar staining) ตรงกลางตดสจาง คลายเขมกลดซอนปลาย

(closed safety pin) TSI ให A/K ใหกาซไนโตรเจนในอาหารทใชทดสอบ nitrate reduction เชอใหผลบวกในการ

ทดสอบ oxidase, motility, arginine dihydrolase, เชอสามารถ oxidize น�าตาล glucose และเจรญไดทอณหภม 42 °C

3. Burkholderia mallei

เปนแบคทเรยทกอโรค glander ในมาแตสามารถตดตอสคน ลกษณะโคโลนบน BA มขนาดเลกและบางสาย

พนธไมเจรญบน BA ขนไดดบน BHI agar ทเตม glycerol โคโลนสขาวเทา translucent หลงจากอบนานกวา 48 ชม.

โคโลนมสเหลองขน ไมเคลอนทเนองจากไมม flagella ยอมตดสแกรมลบ coccobacilli บางครงเปนเสนยาว

(filament) และมรปรางไมแนนอน (pleomorphic) เชอใหผล oxidase บวก และสามารถ oxidize glucose ได

4. Elizabethkingia meningoseptica

(ชอเดม Chryseobacterium meningosepticum, Flavobacterium meningosepticum) เปนเชอทท�าใหเกดโรค

เยอหมสมองอกเสบหรอ septicemia ในเดกแรกเกดหรอเดกคลอดกอนก�าหนด (neonatal meningitidis) และใน

ผใหญท�าใหเกดโรคตดเชอในโรงพยาบาล เจรญไดทงบน BA และ MAC อบทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม.

เชออาย 24 ชม. มโคโลนขนาด 1-2 mm อาย 48 ชม. มโคโลนขนาด 2-3 mm ลกษณะกลม เรยบ สเหลองออน ยอม

ตดสแกรมลบ coccobacilli , TSI ใหผล K/N หรอ K/K ใหผลบวกในการทดสอบ esculin, gelatin, oxidase, indole

และ DNase ใหผลลบในการทดสอบ motility, starch hydrolysis และflexirubin เชอสามารถ oxidize น�าตาล glucose,

mannitol และ fructoseได


เชอแบคทเรยกลม NF ทเปนเชอฉวยโอกาส (opportunistic pathogen) และโรคตดเชอในโรงพยาบาล (nosocomial infections หรอ healthcare associated infections) 1. PseudomonasfluorescensและPseudomonasputida

มกพบเปนเชอฉวยโอกาส (opportunistic pathogen) สวนใหญใหส pyoverdin และไมสามารถเจรญ

ทอณหภม 42 °C ได เชอทงสองชนดสามารถแยกจากกนได โดยใชการทดสอบ gelatin โดย Pseudomonas

fluorescens ใหผลบวก แต Pseudomonas putida ใหผลลบ

2. Pseudomonas stutzeri

เปนเชอฉวยโอกาส สามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาล พบไดทงใน clinical specimens และ

สงแวดลอม เชอนเจรญไดทงบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม. ลกษณะโคโลน สเทาปน

เหลอง ผวหยาบ ยน และใหกาซไนโตรเจนในอาหารทใชทดสอบ nitrate reduction คลาย B. pseudomallei เชอ P.

stutzeri ไม oxidize lactose ท�าใหโคโลนทขนบน MAC ไมเปนสชมพออน สวน B. pseudomallei สามารถ oxidize

lactose และใหโคโลนสชมพบน MAC

3. Burkholderia cepacia complex

เชอกลมนม 17 species จากเชอทโรงพยาบาลสงทดสอบยนยนทกรมวทยาศาสตรการแพทยพบวา species

ทพบบอยทสดในผปวยคอ B. cenocepacia การทจะแยกชนดวาเปน species ใดไมสามารถใชวธแยกทางชวเคมได

ตองใชวธทางอณชวโมเลกล เชอกลมนพบในสงแวดลอม ไดแก น�ายาฆาเชอในโรงพยาบาลมกเปนสาเหตส�าคญ

ของโรคตดเชอในโรงพยาบาล สามารถเจรญไดทงบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม. ยอมตด

สแกรมลบรป แทงลกษณะโคโลนกลม สเทาปนเหลองออน บางสายพนธมส เหลองบน TSI, oxidase บวกชา (20-

30 วนาท) หรอลบ ใหผลบวกในการทดสอบ motility, glucose, lysine decarboxylase และ ornithine decarboxylase

ใหผลลบในการทดสอบ arginine dihydrolase และไมใหกาซไนโตรเจนในอาหารทใชทดสอบ nitrate reduction

4. Stenotrophomonas maltophilia (ชอเดม Xanthomonas maltophilia)

เชอนเดมจดอยใน genus Pseudomonas ตอมา พ.ศ. 2526 ถกจดอยใน genus Xanthomonas และลาสด พ.ศ.

2536 จดอยใน genus ใหม คอ Stenotrophomonas ปจจบนเชอใน genus นม 2 species คอ S. maltophilia และ S.

africana เชอนสามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาล เจรญบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม.

ลกษณะโคโลนกลม เทาปนเหลองออน หรอไมมส บางสายพนธมสเหลองบน TSI, oxidase บวกชา (20-30 วนาท)

เคลอนทโดยม flagella หลายเสนทขวเซลล (multitrichous flagella) สามารถ oxidize glucoseได และใหผลบวกใน

การทดสอบ lysine decarboxylase, gelatinase, esculin และ DNase

5. Acinetobacter spp.

เชอใน genus Acinetobater พบไดทวไปในดน น�า พช อาหาร ผวหนงคนและสตว ในบรรดาเชอกลม NF ท

แยกไดจากตวอยางผปวยในโรงพยาบาลพบ genus นมากแปนอนดบสองรองจาก P. aeruginosa เชอกลมนทมความ

ส�าคญทางการแพทยและพบในคนม 26 species จากเชอท รพ. สงทดสอบยนยนทกรมวทยาศาสตรการแพทยพบ

วา species ทพบบอยทสดในผปวยคอ Acinetobacter baumannii และ A. pittii (Acinetobacter DNA group 3) การ

ทจะแยกชนดใหแนนอนวาเปน species ใดไมสามารถใชวธแยกทางชวเคมได ตองใชวธทางอณชวโมเลกลอยางไร

กตามในหองปฏบตการของโรงพยาบาลสามารถแยกชนดเบองตนและออกผลได ดงแสดงในตารางท 5.6-11 เชอ

ทงสองน (พรอมทงเชออก 3 ชนดไดแก A. calcoaceticus, Acinetobacter DNA group TU13 และ A. nosocomialis


ซงมผลทางชวเคมคลายกนจงแนะน�าใหออกผลเปน Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex มกท�าให

เกดโรคตดเชอในโรงพยาบาลและเปนเชอดอยาหลายชนดพรอมกน (multiple drug resistant: MDR) สามารถเจรญ

ไดทงบน BA และ MAC อบทอณหภม 30-35 °C โคโลนมลกษณะกลมสเทาบน MAC โคโลนใส (translucent) ยอม

ตดสแกรมลบมรปรางคอนขางกลม (coccobacilli) ใหผล oxidase ลบ และไมเคลอนท

6. Achromobacter xylosoxidans (ชอเดม Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans)

เปนเชอฉวยโอกาส สามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาล พบใน clinical specimens โดยเฉพาะในเลอด เจรญ

ไดทงบน BA และ MAC ท 30-35°C นาน 24-48 ชม. ใหลกษณะโคโลนกลมเทาบางครงอาจเยม (mucoid) oxidase

บวก เคลอนทโดยใช flagella รอบเซลล (peritrichous flagella), oxidize glucose, xylose โดยเฉพาะ xylose ใหผล

บวกเรว ใหกาชไนโตรเจนในอาหารทใชทดสอบ nitrate reduction เจรญไดทอณหภม 42°C

7. Chryseobacterium indologenes

เปนเชอฉวยโอกาสและกอโรคตดเชอในโรงพยาบาล เจรญไดบน BA อบทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม.

หลงอบนาน 24 ชม. โคโลนมขนาด 1-2 mm และเมออบนาน 48 ชม. มขนาด 2-3 mm โคโลนลกษณะกลม เรยบ

สเหลองออน-แก ยอมตดสแกรมลบ coccobacilli TSI ใหผล K/N หรอ K/K เชอใหผลบวกในการทดสอบ esculin,

gelatin, oxidase, indole, glucose, fructose, starch, flexirubin และใหผลลบในการทดสอบ motility, mannitol, DNase

8. Alcaligenes spp.

พบไดในสงแวดลอม อาจพบอาศยแบบ colonization ในระบบทางเดนหายใจและทางเดนอาหารของผปวย

ในโรงพยาบาล เปนเชอฉวยโอกาสและกอโรคตดเชอในโรงพยาบาล พบในผปวยทมภมตานทานต�า เจรญไดทง บน

BA และ MAC ท 30-35 °C นาน 24-48 ชม. โคโลนส เทา บางสายพนธสามารถเปลยนส BA เปน สเขยวและ

โคโลนแผยอมตดสแกรมลบ coccobacilli, oxidase บวก เคลอนทโดยใช flagella รอบเซลล (peritrichous flagella)

ใหผลลบในการทดสอบ glucose, lysine, ornithine decarboxylase, arginine, dihydrolase, gelatin, DNase, indole และ esculin

9. Sphingomonas spp.

เดมอยใน genus Pseudomonas พบอาศยอยไดทวไปในสงแวดลอมและในโรงพยาบาล เปนเชอฉวยโอกาส

และสามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลได เชอ Sphingomonas spp. ทส�าคญทางคลนกและพบบอยทสดม 2

species คอ S. paucimobilis และ S. parapaucimobilis เจรญไดบน BA ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม. โคโลน

กลมเรยบเทาปนเหลอง เชอใหผลบวกในการทดสอบ oxidase, motility, glucose, lactose, maltose, xylose และ

fructose และใหผลลบในการทดสอบ mannitol

10. Brevundimonas spp.

เดมอยใน genus Pseudomonas เชอ Brevundimonas spp. ทส�าคญทางคลนกและพบบอยม 2 species คอ

B. diminuta และ B. vesicularis การกอโรคของทง 2 species พบในคนไดไมบอย แตมรายงานกอใหเกดการตด

เชอไดในกระแสเลอดโดยเฉพาะในผปวยทมระบบภมคมกนบกพรอง

11. Ochrobactrum spp.

Species ทพบกอโรคในคนไดคอ Ochrobactrum anthropi (ชอเดม Achromobacter sp. Vd-1, Vd-2) กอโรค

ไดในหลายระบบ เชน การตดเชอของบาดแผล ตดเชอในระบบทางเดนปสสาวะ และในกระแสเลอด การตดเชอ

ในโรงพยาบาลมกสมพนธกบการใสสายสวน เชน สายใหสารน�าทางเสนเลอด สวน species อน ทพบกอโรคไดคอ

Ochrobactrum intermedium โดยกอใหเกดการตดเชอในเลอด เจรญบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน

24-48 ชม. ลกษณะโคโลนกลมเทา เยม เชอใหผลบวกในการทดสอบ oxidase, motility, glucose, mannitol, xylose,

nitrate, urea และ esculin ใหผลลบในการทดสอบ lactose


12. Rhizobium radiobacter (ชอเดม Agrobacterium tumefaciens)

เปนเชอฉวยโอกาสและกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลพบใน clinical specimens และสงแวดลอมทวไป เจรญ

บน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม. ลกษณะโคโลนกลมเหลอง เยม เชอใหผลบวกในการ

ทดสอบ oxidase, motility, glucose, mannitol, xylose, nitrate, urease, esculin และ lactose

13. Methylobacterium mesophilicum (ชอเดม Pseudomonas mesophilicum)

เปนเชอฉวยโอกาสและกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลพบใน clinical specimens และสงแวดลอม สามารถพบ

ไดในสงแวดลอมของโรงพยาบาล ไมเจรญบน MAC แตเจรญบน BA ทอณหภม 30-35 °C นาน 2-3 วน และเจรญ

ไดดบน SDA ลกษณะโคโลนชมพออกแดงปนอฐแหง มเมอกเลกนอย ตดสแกรมลบ bacilli ขนาดใหญ เซลลตดส

แกรมไดไมดและม vacuole ขนาดใหญอยภายในเซลล เชอใหผลบวกในการทดสอบ motility, glucose, xylose และ

urease ใหผลลบในการทดสอบ oxidase, fructose, mannitol, esculin และ nitrate

14. Roseomonas spp.

เปนเชอฉวยโอกาส สามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลพบใน clinical specimens และสงแวดลอม สามารถ

พบไดในสงแวดลอมของโรงพยาบาลเจรญบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 2-3 วน เชอนเจรญไดด

บน SDA ลกษณะโคโลน สชมพเยม ตดสแกรมลบ, nonvacuolated, coccoid, plump rods เซลลคอนขางกลมเรยง

ตวเปนคหรอสายสนๆ เชอใหผลบวกในการทดสอบ oxidase, motility, fructose, xylose และ urease เจรญทอณหภม

42 °C ใหผลลบในการทดสอบ glucose, mannitol, esculin และ nitrate

15. Shewanella spp.

เดมจดอยใน genus Pseudomonas เปนเชอฉวยโอกาส สามารถกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลรวมกบเชออนๆ

พบใน clinical specimens และพบอาศยอยทวไปในสงแวดลอมหรอตามแหลงน�า เจรญบน BA และ MAC ทอณหภม

30-35 °C นาน 24-48 ชม. genus Shewanella ม 2 species คอ S. algae และ S. putrefaciens ทพบในคนมากคอ

S. algae เชอทงสองนใหผลบวกในการทดสอบ oxidase, motility, nitrate, gelatinase, DNase และสราง H2S เจรญ

ไดท 42 °C ใหผลลบในการทดสอบ lactose, xylose, mannitol และ esculin การทดสอบความทนเกลอ 6.5 % NaCl

เชอ S. algae สามารถทนเกลอ 6.5 % NaCl ได สวนเชอ S. putrefaciens ไมสามารถทนเกลอ 6.5 % NaCl

16. Ralstonia spp.

เชอ Ralstonia ทกอโรคม 3 species คอ R. pickettii, R. mannitolilytica และ R.insidiosa เปนเชอฉวยโอกาส

กอโรคตดเชอในโรงพยาบาลพบไดใน clinical specimens กอโรคในคนไดนอย อาจ colonize ไดชวคราว ในระบบ

ทางเดนหายใจสวนบน โดยไมกอใหเกดโรค เจรญบน BA และ MAC ทอณหภม 30-35 °C นาน 24-48 ชม. โคโลน

สเทาถงเหลอง อาจยนเลกนอย เชอใหผลบวกในการทดสอบ catalase, oxidase, urease, lactose และ motility เจรญ

ไดท 42 °C ใหผลลบในการทดสอบ lysine

17. Moraxella spp. และเชอทใกลเคยงกบ Moraxella

เชอใน genus Moraxella อาศยอยบนผวหนงและเยอเมอกของคนและสตว ไมคอยพบในสงแวดลอม ยกเวน

Psychrobacter phenylpyruvicus (ชอเดม Moraxella phenylpyruvica) พบในเนยแขงและน�า เจรญบน BA ทอณหภม

30-35 °C นาน 24-48 ชม. โคโลนขนาดเลก สเทา เซลลรปราง coccobacilli ตดสแกรมลบ อาจอยเปนคหรอเรยงตว

เปนสายสนๆ เชอบาง species บางครง decolorize ยาก ท�าใหยอมตดเปนสแกรมบวก oxidase บวก ไมเคลอนท

สวนใหญไมใชน�าตาล glucose (nonoxidizer) เชอ Moraxella และเชอทใกลเคยงกบ Moraxella ทมความส�าคญ

ทางการแพทย ไดแก M. osloensis, M. catarrhalis, M. lacunata, M. nonliquefaciens, M. atlantae, Psychrobacter

phenylpyruvicus, Paracoccus yeei, Neisseria weaveni, N. elongata


แผนภมท 5.6-1 ขนตอนกำรวนจฉยเชอกลม Nonfermentative Gram-Negative Bacilli เบองตน

เพาะเชอจาก Specimen ลงบน BA และ MAC อบท 30-35 °C นาน 18-48 ชม.

เขยเชอ 1โคโลน จาก BA

TSI TSB TSA

อบท 30-35 °C นาน 18-24 ชม.

อานผล (K/N,N/N,A/N) Oxidase test

ลงอาหารทดสอบ

OF Glucose,

OF Lactose,

OF Maltose,

OF Xylose,

OF Sucrose,

OF Fructose,

OF Arabinose,

OF Fructose,

OF Arabinose

MacConkey, SIM, Citrate, Urease, Gelatinase, Esculin, Nitrate, Acetate, Malonate

Arginine dihydrolase, Lysine decarboxylase, Ornithime decarboxylase

DNase, TSB อบเชอ 42 °C

อบท 30-35 °C นาน 18-24 ชม.

อานและแปลผลตามตารางการจ�าแนกเชอท 5.6-2 ถง 5.6-12


ตำรำ

งท 5

.6-1

รำย

ชอเช

อตำม

กำรจ

�ำแน

กผล

oxid

ase/

mot

ility

/OF

(glu

cose

)

+/+/

+

(Pri

tric

hous

flage

lla)

+/+/

+

(Pol

ar fl

agel

la)

+/+/

+

(Pol

ar fl

agel

la)

+/+/

-

(Pri

tric

hous

flage

lla)

+/+/

-

(Pol

ar fl

agel

la)

+/-/+

(Ind

ole+

)

+/-,+

(Ind

ole-

)

+/-/-

(Ind

ole+

)-/-

/+,-

+,-/+

/+,-

(pin

k pi

gmen

t)

ตารา

งท 5

.6-2

ตารา

งท 5

.6-3

ตารา

งท 5

.6-3

(1)*

ตารา

งท 5

.6-4

ตารา

งท 5

.6-5

ตารา

งท 5

.6-6

ตารา

งท 5

.6-7

ตารา

งท 5

.6-8

ตารา

งท 5

.6-9

ตารา

งท 5

.6-1

0ตา

รางท

5.6

-11

ตารา

งท 5

.6-1

2

Ach

rom

obac

ter

xyl

osox

idan

sO

chro

bact

rum

a

nthr

opi

O. g

rigno

nnen

seO

. hae

mato

philu

mO

. int

erm

ediu

mO

. pse

udin

term

ediu

mO

. pse

udog

rigno

nens

ePa

nnon

ibac

ter

phr

agm

itetu

sR

hizo

bium

ra

diob

acte

r

Aci

dovo

rax

d

elafi

eldi

i A

. fac

ilis

A. t

empe

rans

A

. wau

ters

ii B

alne

atrix

alp

ica

Bre

vund

imon

as

d

imin

uta

Bre

vund

imon

as

v

esic

ular

is

Bur

khol

deria

pse

udom

alle

i B

urkh

olde

ria

t

haila

nden

sis

Bur

khol

deria

cep

acia

com

plex

*B

urkh

olde

ria

g

ladi

oli

Inqu

ilinu

s lim

osus

Pa

ndor

aea

apis

ta

Pand

orae

a sp

. Ps

eudo

mon

as

a

erug

inos

a P.

fluo

resc

ens

P. m

endo

cina

P.

mon

teili

i P.

mos

seili

i P.

pse

udoa

lcal

igen

es

P. p

utid

a P.

stut

zeri

P. st

utze

ri–lik

e (C

DC

gro

up V

b-3)

P. v

eron

ii R

alst

onia

pic

ketti

iR

alst

onia

man

nito

lilyt

ica

Sten

otro

phom

onas

mal

toph

ilia

Sp

hing

omon

as

p

auci

mob

ilis

Sphi

ngom

onas

par

apau

cim

obili

sSh

ewan

ella

put

refa

cien

s

B. a

mbi

faria

B. a

nthi

naB

. arb

oris

B. c

enoc

epac

iaB

. cep

acia

B. c

onta

min

ans

B. d

iffus

aB

. dol

osa

B. l

ata

B. l

atee

nsB

. met

allic

aB

. mul

tivor

ans

B. p

seud

omul

tivor

ans

B. p

yrro

cini

aB

. sem

inal

isB

. sta

bilis

B. u

bone

nsis

B. v

ietn

amie

nsis

Ach

rom

obac

ter

d

enitr

ifica

ns

Ach

rom

obac

ter

p

iech

audi

i A

lcal

igen

es

f

aeca

lis

Bor

dete

lla

b

ronc

hise

ptic

a B

orde

tella

hin

zii I

C

upria

vidu

s

pau

culu

s C

upria

vidu

s

res

pira

culi

Olig

ella

u

reol

ytic

a

Bre

vund

imon

as

d

imin

uta

Bre

vund

imon

as

v

esic

ular

is

Com

amon

as sp

p.

Cup

riavi

dus

g

ilard

iiD

elfti

a

a

cido

vora

ns

Pand

orae

a ap

ista

P.

nor

imbe

rgen

sis

P. p

nom

enus

a P.

pul

mon

icol

a P.

sput

orum

Pa

ndor

aea

sp.

Pseu

dom

onas

alc

alig

enes

Ps

eudo

mon

as

p

ertu

cino

gena

Ps

eudo

mon

as

p

seud

oalca

ligen

es

Ral

ston

ia in

sidi

osa

Shew

anel

la a

lgae

Sh

ewan

ella

put

refa

cien

s St

enot

roph

omon

as

m

alto

phili

a

Chr

yseo

bact

eriu

m

a

nthr

opi

Chr

yseo

bact

eriu

m

g

leum

C

hrys

eoba

cter

ium

hom

inis

C

hrys

eoba

cter

ium

ind

olog

enes

C

hrys

eoba

cter

ium

tre

vere

nse

Eliz

abet

hkin

gia

m

enin

gose

ptic

a Em

pedo

bact

er

b

revi

s Sh

ingo

bact

eriu

m

m

izut

aii

Wau

ters

iella

fals

enii

Alis

hew

anel

la

f

etal

is

Bur

khol

deria

mal

lei

EO-3

H

aem

atob

acte

r

mis

sour

iens

is

Inqu

ilinu

s

lim

osus

Pa

raco

ccus

yee

ii Ps

ychr

obac

ter

f

aeca

lis

Psyc

hrob

acte

r

im

mob

ilis

Sphi

ngob

acter

ium

mul

tivor

um

Sphi

ngob

acter

ium

spi

ritiv

orum

Sp

hing

obac

teriu

m

t

halp

ophi

lum

Sp

hing

omon

as

s

pp.

Woh

lfahr

tiim

onas

chi

tinic

last

ica

Ber

geye

lla

z

oohe

lcum

W

eeks

ella

viro

sa

Hae

mat

obac

ter

m

assi

liens

is

Mor

axel

la

a

tlant

ae

Mor

axel

la c

anis

M

orax

ella

cat

arrh

alis

M

orax

ella

lac

unat

a M

orax

ella

lin

coln

ii M

orax

ella

non

lique

facie

ns

Mor

axel

la

oslo

ensi

s M

yroi

des

o

dora

timim

us

Myr

oide

s

odo

ratu

s O

ligel

la

u

reol

ytic

a O

ligel

la

u

reth

ralis

Ps

ychr

obac

ter

p

heny

lpyr

uvicu

s Ps

ychr

obac

ter

p

ulm

onis

Ps

ychr

obac

ter

s

angu

inis

Bur

khol

deria

cep

acia

com

plex

Bur

khol

deria

gla

diol

i B

revu

ndim

onas

ves

icul

aris

Pa

ndor

aea

apis

ta

P. n

orim

berg

ensi

s P.

pno

men

usa

P. p

ulm

onic

ola

P. sp

utor

um

Pand

orae

a sp

. Ps

eudo

mon

as

a

erug

inos

a Ps

eudo

mon

as

fl

uore

scen

s Ps

eudo

mon

as

l

uteo

la

Pseu

dom

onas

ory

ziha

bita

ns

Sten

otro

phom

onas

mal

toph

ilia

Aci

neto

bact

er

c

alco

acet

icus

-

bau

man

nii

c

ompl

ex

Aci

neto

bact

er

b

eije

rinck

ii A

cine

toba

cter

ber

ezin

iae

Aci

neto

bact

er

g

uillo

uiae

A

cine

toba

cter

gyl

lenb

ergi

i A

cine

toba

cter

hae

mol

ytic

us

Aci

neto

bact

er

j

ohns

onii

Aci

neto

bact

er

j

unii

Aci

neto

bact

er

l

wof

fii

Aci

neto

bact

er

p

arvu

s A

cine

toba

cter

rad

iore

sist

ens

Aci

neto

bact

er

s

chin

dler

i A

cine

toba

cter

urs

ingi

i

Asa

ia sp

p.

Azo

spiri

llum

spp.

M

ethy

loba

cter

ium

spp

.R

oseo

mon

as

c

ervi

calis

Ros

eom

onas

gila

rdii

s

ubsp

. gila

rdii

Ros

eom

onas

gila

rdii

s

ubsp

. ros

eaR

oseo

mon

as

m

ucos

aR

oseo

mon

as

g

enom

ospe

cies

4R

oseo

mon

as

g

enom

ospe

cies

5


ตำรำงท 5.6-2 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose บวก, peritrichous flagella

Peritrichous flagella

Flag

ella

Esc

ulin

Ure

ase

Susc

eptib

leto

Col

istin

Man

nito

l

Xyl

ose

Gro

wth

at 4

2 ๐ C

Achromobacter xylosoxidans (135) Pt, L 0 0 ND 0 100 ND

Ochrobactrum anthropi (29)

O. grignonnense (2)

O. haematophilum (3)

O. intermedium (9)

O. pseudintermedium (1)

O. pseudogrignonense (2)

Pt, L

Pt, L

Pt, L

Pt, L

Pt, L

Pt, L

0

0

0

0

0

0

100

0

100

(44)

0

(100)

100

50

100

0

0

0

59

50

33

33

0

50

100

100

100

100

100

100

0

0

100

100

100

0

Pannonibacter phragmitetus (7) Pt, L 100 100 0 28 100 ND

Rhizobium radiobacter (22) Pt, L 100 100 68 100 100 ND

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested. Values are percentages of positive,

those in parentheses represent delayed positivity.

Pt = Peritrichous flagella, L = Lateral flagella, ND = not determined.


ตำรำงท 5.6-3 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose บวก, polar flagella

Polar flagella

No.

of fl

agel

la

42 °C

Pyov

erdi

n

N2 g

as

Arg

inin

e

Lac

tose

Mal

tose

Man

nito

l

Gel

atin

(7d

ays i

ncub

atio

n)

Ure

ase

Note

Acidovorax delafeldii (2) 1-2 50 0 0 100 0 0 50 0 100 citrate + MAC +

A. facilis (2) 1-2 0 0 0 100 0 0 100 100 100 citrate -, MAC -

A. temperans (2) 1-2 100 0 100 0 0 0 50 0 50 citrate -, MAC +

A. wautersii (3) 1 - - ND - +* ND +* - + citrate +

Balneatrix alpica (2) 1-2 0 0 ND ND ND 100 100 0 0 indole +, nitrate +

Brevundimonas diminuta (68) (Glucose +21%)

1-2 38 0 0 0 0 0 0 68 13 esculin +88%, MAC +

Brevundimonas vesicularis (94)(Glucose +87%)

1-2 19 0 0 0 0 94 0 25 2 esculin +5%,MAC +43%

Burkholderia pseudomallei >=2 + - + + + + + v v TSI A/N arabinose -

Burkholderia thailandensis >=2 + - + + + + + v v arabinose +

Burkholderia cepacia complex (211) >1 60 0 0 0 99 98 100 74 45 ใหดตาราง 5.6-3(1) เพอแยก species

Burkholderia gladioli (27) >1 - - - ND - - ND v ND oxidase V

Inquilinus limosus (3) (Motility 33%) 1 100 0 0 0 ND ND 100 0 0 nonpigment, very mucoid,esculin +

Pandoraea apista (11) 1 100 0 ND 0 ND ND 0 0 100 Glucose(+)

Pandoraea sp. (1) 1 0 0 ND 0 ND ND 0 0 100 Glucose(+) Glucose(+), oxidase -, nitrate +, Mac +

Pseudomonas aeruginosa (201) 1 100 65 93 100 <1 <1 70 82 48(9)

P.fluorescens (155) >1 0 96 3 97 24 2 53 100 21(31)

P. mendocina (4) 1 100 0 100 100 0 0 0 0 50

P. monteilii (10) ND 0 100 0 100 0 0 0 0 50

P. mosseilii (12) 1 0 100 0 100 0 17 75 92 ND

P. pseudoalcaligenes (34) 1 94 0 0 78 0 0 0 0 3/(6) glucose +9%

P. putida (16) >1 0 93 0 100 25(13) 31 25 0 31(44)


Polar flagella

No.

of fl

agel

la

42 °C

Pyov

erdi

n

N2 g

as

Arg

inin

e

Lac

tose

Mal

tose

Man

nito

l

Gel

atin

Ure

ase

Note

P. stutzeri (28) 1 69 0 100 0 0 100 89(4) 0 33(22) wrinkle colony

P. stutzeri–like (CDC group Vb-3) 1 ND 0 >90 >90 <10 >90 ND ND ND

P. veronii (8) 1 0 100 100 100 ND ND ND 13 25

Ralstonia pickettii 1 V - ND ND V V - ND + xylose +, Nitrate +

Ralstonia mannitolilytica 1 + - ND ND + + + ND + xylose +,Nitrate -

Stenotrophomonas maltophilia (228) (Glucose +85%)

>2 48 0 0 0 ND 100 0 93 3 esculin 39%, lysine +93%

Sphingomonas paucimobilis (184) 1 0 0 0 0 100 100 0 0 0 yellow, esculin +, DNase +, citrate -

Sphingomonas parapaucimobilis 1 - - ND ND V V - - ND esculin +, DNase -,citrate +

Shewanella putrefaciens (2) 1 ND 0 ND ND ND ND 0 100 0 glucose 50%, H2S +,

6.5% NaCl 0%

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested.

Values are percentages of positive; those in parentheses represent delayed positivity.

+, positive for 90 to 100% of strains; -, positive for 0 to 10% of strains; V = positive for 11 to 89% of strains; ND = not

determined, * Acid production on low peptone phenol red agar.

ตำรำงท 5.6-3 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose บวก, polar flagella (ตอ)


ตำรำงท 5.6-3 (1) Characteristics of the B. cepacia complexa

Oxi

dase

b

No.

of fl

agel

la

42 °C

c

Pyov

erdi

n

N2 g

as

Arg

inin

e

Lac

tose

b

Mal

tose

c

Man

nito

l

Gel

atin

e

Ure

ase

Yel

low

pig

men

tc

Bro

wn

pigm

entc

B. ambifaria+ ND V - ND ND + + ND + ND V -

B. anthina + ND V - ND ND + + ND - ND - -

B. arboris + ND V - ND ND V + ND + ND V -

B. cenocepacia + ND V - ND - + V + V -/+ - +

B. cepacia + ND V - ND ND + V ND V ND V -

B. contaminans V ND V - ND ND + V ND + ND V -

B. diffusa + ND V - ND ND + + ND V ND - -

B. dolosa + ND + - ND ND + + ND - ND - -

B. lata V ND - - ND ND + + ND V ND V -

B. lateens + ND + - ND ND + + ND V ND - -

B. metallica + ND + - ND ND + + ND + ND V -

B. multivorans + ND + - ND - + + + - 40 - -

B. pseudomultivorans + ND + - ND ND + + ND - ND - -

B. pyrrocinia V ND V - ND ND + + ND V ND V -

B. seminalis + ND + - ND ND + + ND + ND V -

B. stabilis + ND - - ND ND V + ND + ND - -

B. ubonensis + ND V - ND ND + + ND + ND - -

B. vietnamiensis + ND + - ND ND + + ND - ND - -

aAbbreviations and symbols: +, >90% of isolates are positive; V, 10 to 90% are positive; _, <10% of isolates are positive.bNumber of strains of each species tested: B. ambifaria, 51; B. anthina, 24; B. arboris, 16; B. cenocepacia, 928; B. cepacia, 181; B. contaminans, 54; B. diffusa, 16; B. dolosa, 57; B. lata, 25; B. latens, 6; B. metallica, 7; B. multivorans, 715; B. pseudomultivorans, 11; B. pyrrocinia, 85; B. seminalis, 19; B. stabilis, 73; B. ubonensis, 2; B.vietnamiensis, 145. Data from references 112, 156, and 162 and from LiPuma (unpublished) and D. A. Henry (unpublished data).cNumber of strains of each species tested: B. ambifaria, 18; B. anthina, 16; B. arboris, 13; B. cenocepacia, 139; B. cepacia, 23; B. contaminans, 7; B. diffusa, 6; B. dolosa, 12; B. lata, 11; B. latens, 6; B. metallica, 3; B. multivorans, 109; B. pseudomultivorans, 11; B. pyrrocinia, 5; B. seminalis, 13; B. stabilis, 27; B. ubonensis, 2; B. vietnamiensis, 36. Data from references 112, 156, and 162 and from Henry (unpublished).


ตำรำงท 5.6-4 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose ลบ, peritrichous flagella


Ure

ase

Nitr

ate

N2 g

as

Ace

tate

Note

Achromobacter denitrificans (52) 31 98 98 87

Achromobacter piechaudii (13) 0 100 0 0 1-day BA: 0.1-0.5 mm; 2-day

BA: 1.5 mm

Alcaligenes faecalis (152) 0 0 0 100 1-day BA: 0.5-3 mm, smooth

sometime rough; 2-day BA:

α-haemolysis; fruity odor

Bordetella bronchiseptica (24) 100 (rapid) 100 0 100 1-day BA: 0.5 mm;

2-day BA: 1-2.5 mm

Bordetella hinzii I (7) 0 0 0 ND 2-day BA: colonies flat,

spreading

Cupriavidus pauculus (31) 100 (rapid) V ND 97

Cupriavidus respiraculi 0 V ND ND

Oligella ureolytica (19) 100 (rapid) 100 58 79 1-day BA: < 0.1mm

2-day BA: 0.3-1 mm

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested

Values are percentages of positive; +, positive for 90 to 100% of strains; -, positive for 0 to 10% of strains;

V = positive for 11 to 89% of strains; ND = not determined.


ตำรำงท 5.6-5 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility บวก, OF glucose ลบ, polar flagella

Polar flagella

No.

of fl

agel

la

Nitr

ate

Esc

ulin

Ace

tate

Fruc

tose

Mal

tose

Man

nito

l

Xyl

ose

H2S

Gro

wth

42

๐ C

Brevundimonas diminuta (68) (21% glucose +) 1-2 3 5 0 0 0 0 0 34 38

Brevundimonas vesicularis (94)

(98% oxidase+, 87% glucose +)

1-2 5 88 0 0 94 0 27 49 19

Comamonas spp. (28) >2 96 0 ND ND 0 0 0 0 68

Cupriavidus gilardii 1 - ND ND ND ND ND - 0 +

Delftia acidovorans (69) >2 99 0 100 100 0 100 0 0 ND

Pandoraea apista (11) 1 0 0 ND 0 ND 0 - - 100

P. norimbergensis (4) 1 0 0 ND 0 ND 0 - - 0

P. pnomenusa (6) 1 83 0 ND 0 ND 0 - - 100

P. pulmonicola (3) 1 0 0 ND 0 ND 0 - - 100

P. sputorum (7) 1 14 0 ND 0 ND 0 - - 57

Pandoraea sp. (1) 1 100 0 ND 0 ND 0 - - 0

Pseudomonas alcaligenes (26) 1 54 0 ND 0 0 0 92 0 ND

Pseudomonas pertucinogena (2)

(some strains glucose +weak)

1 >10 ND ND ND ND ND ND 0 ND

Pseudomonas pseudoalcaligenes (34)

(9% glucose+)

1 100 0 ND 79

(21)

0 0 18

(12)

0 ND

Ralstonia insidiosa ND + ND ND ND ND ND ND 0 ND

Shewanella algae (10) 1 100 0 ND ND ND 0 0 100 100

Shewanella putrefaciens (3) 1 100 0 ND ND ND 0 0 100 0

Stenotrophomonas maltophilia (228) >2 39 39 ND ND 100 0 0 0 ND

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested

Values are percentages of positive; those in parentheses represent delayed positivity. ND = not determined.

+, positive for 90 to 100% of strains; -, positive for 0 to 10% of strains; V = positive for 11 to 89% of strains;

Ralstonia spp. and Cupriavidus spp. may grow slowly on primary isolation media, requiring >= 72 h of incubation

before colonies are visible. Species level identification in these genus with standard biochemical testing is difficult.


ตำรำ

งท 5

.6-6

กำร

จ�ำแน

กเชอ

กลม

oxid

ase

บวก

, mot

ility

ลบ

, OF

gluc

ose

บวก

, ind

ole

บวก

Spec

ies

Beta-hemolysis(after 3 days on SBA)

Production of flexirubin pigment

Production of other pigment*

Growth on MAC

Growth at 42 ºC

Mannitol

Xylose

L-Arabinose

Maltose

Sucrose

Esculin hydrolysis

Gelatinase

Urease

Nitrate

Chr

yseo

bact

eriu

m a

nthr

opi (

9)

0 0

-/PS

0 0

0 0

0 10

0 0

0 10

0 0

0

Chr

yseo

bact

eriu

m g

leum

(11)

0

100

- 10

0 10

0 0

27

100

100

0 10

0 10

0 73

73

Chr

yseo

bact

eriu

m h

omin

is (1

1)0

0 -/P

Y

0 0

0 0

0 10

0 28

10

0 10

0 0

65

Chr

yseo

bact

eriu

m in

dolo

gene

s (15

) 10

0 74

- 67

0

0 0

0 10

0 20

10

0 10

0 0

26

Chr

yseo

bact

eriu

m tr

ever

ense

(5)

00

PY0

00

00

100

020

00

60

Eliz

abet

hkin

gia

men

ingo

sept

ica

(17)

0

0 -/P

Y/ P

S 83

47

10

0 0

0 10

0 0

100

100

0*

0

Empe

doba

cter

bre

vis (

7)

0 0

PY

100

0 0

0 0

100

0 0

100

0 0

Shin

goba

cter

ium

miz

utai

i (5)

0 0

PY

0 0

0 10

0 80

100

100

100

0 0

0

Wau

ters

iella

fals

enii

(53)

0 0

-/PY

10

0 0

0 0

0 10

0 0

5353

/ (47

)10

0 0

Num

bers

in p

aren

thes

es a

fter o

rgan

ism

nam

es a

re n

umbe

rs o

f stra

ins t

este

d.

Val

ues a

re p

erce

ntag

es o

f pos

itive

; tho

se in

par

enth

eses

repr

esen

t del

ayed

pos

itivi

ty. P

Y, p

ale

yello

w; P

S, p

ale

salm

on-p

ink.

*Eliz

abet

hkin

gia

miri

cola

is u

reas

e po

sitiv

e


ตำรำงท 5.6-7 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose บวก, indole ลบ

Species

Gro

wth

on

MA

C

Man

nito

l

Xyl

ose

Nitr

ate

Esc

ulin

Ure

ase Note

Alishewanella fetalis (1) 100 0 0 100 0 100

Burkholderia mallei (8) + - V + - V

EO-3 (5) 100 100 100 0 0 +

Haematobacter missouriensis (3) 100 66 100 0 ND 100 arginine 100%

Inquilinus limosus (3) (100) 100 100 0 100 (33) motility 33%

Paracoccus yeeii (14) 100 -50 100 100 0 100 arginine 0%

Psychrobacter faecalis (19) 100 0 100 100 ND 0 arginine 0%

Psychrobacter immobilis (13) 92 0 85 77 0 + arginine 0%

Sphingobacterium multivorum (22) 100 0 100 0 100 100

Sphingobacterium spiritivorum (4) 55 100 100 0 100 100

Sphingobacterium thalpophilum (7) 100 0 100 100 100 (100)

Sphingomonas spp. (15) 0 0 0 7 100 0 glucose 87(13%)w,

motility 66%

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica (3) 100 0 100w 0 ND 0 acetate (100%)w

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested; w=weak

Values are positive percentages; those in parentheses represent delayed positivity; ND = not determined+,

>=90% positive; -,<10% positive; v, 10% to 90% positive; ND, not determined.


ตำรำงท 5.6-8 การจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose ลบ, indole บวก

Species

Mal

tose

Ure

ase

Gel

atin

Gro

wth

on M

AC Note

Bergeyella zoohelcum (10) 0 100

(rapid)

100 100 colony: sticky, tan and yellow

Weeksella virosa (87) 0 0 100 100 1-day BA plate colonies:0.2-0.8 mm in diameter; mucoid andadherent to the agar2-3 days BA plate colonies:2-3 mm in diameter; colonies becomeyellowish, tan to brown

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested.Values are percentages of positive.

ตำรำงท 5.6-9 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose ลบ, indole ลบ

Species

Gro

wth

on

MA

C

Arg

inin

e

Ure

ase

Gel

atin

ase

Nitr

ate

redu

ctas

e

Ace

tate

Note

Haematobacter massiliensis (10) 90 100 100 0 0 100 mannitol 0%

Moraxella atlantae (7) 100 0 0 0 0 0

Moraxella canis (5) 60 0 0 0 80 100

Moraxella catarrhalis (7) 0 0 0 0 100 0 DNase +

Moraxella lacunata (5) 0 0 0 100 100 60 poor growth on OF medium

Moraxella lincolnii (2) 0 0 0 0 0 0

Moraxella nonliquefaciens (16) 0 0 0 0 100 0

Moraxella osloensis (28) 50 0 0 0 18 100

Myroides odoratimimus (20) 100 ND 100 100 0 ND produce flexirubin pigment

Myroides odoratus (4) 75 ND 100 100 0 ND produce flexirubin pigment

Oligella ureolytica (3) 0 0 100 0 100 100 motility +67% (peritrichoust)

Oligella urethralis (7) 57 0 0 0 0 100


Species

Gro

wth

on

MA

C

Arg

inin

e

Ure

ase

Gel

atin

ase

Nitr

ate

redu

ctas

e

Ace

tate

Note

Psychrobacter phenylpyruvicus (5) 0 0 100 0 20 100 growth promote by Tween 80

Psychrobacter pulmonis (8) (25) 0 0 0 100 100

Psychrobacter sanguinis (15) 0 0 100 0 33 87 growth promote by Tween 80

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested.Values are percentages of positive; those in parentheses represent delayed positivityND, not determined

ตำรำงท 5.6-10 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase ลบ, motility บวก, OF glucose บวก

Species

Oxi

dase

Glu

cose

No.

pol

ar fl

agel

la

Pyov

erdi

n

Esc

ulin

Mal

tose

**

Lac

tose

**

Man

nito

l**

Gel

atin

42 ºC

Lys

ine

Burkholderia cepacia complex* (211) V + >1 0 67 98 99 100 74 V V

Burkholderia gladioli (280)1 (27)2 V 1 + 1 0 V 2 - - + V 2 - -

Brevundimonas vesicularis (94) 98 87 1-2 0 88 94 0 0 25 19 0

Pandoraea apista (11) 64 (+) 1 - 0 ND ND 0 0 100 0

P. norimbergensis (4) 100 - 1 - 0 ND ND 0 0 0 0

P. pnomenusa (6) 33 - 1 - 0 ND ND 0 0 100 0

P. pulmonicola (3) 100 - 1 - 0 ND ND 0 0 100 0

P. sputorum (7) 57 - 1 - 0 ND ND 0 0 57 0

Pandoraea sp. (1) 0 (+) 1 - 0 ND ND 0 0 0 0

Pseudomonas aeruginosa (201) 99 97 1 65 0 >1 >1 70 82 100 0

Pseudomonas fluorescens (155) 97 100 >1 96 0 2 24 53 100 0 0

Pseudomonas luteola (34) 0 100 >1 0 100 100 3(24) 76(18) 61 94 0

Pseudomonas oryzihabitans (36) 0 100 1 0 0 97 14(22) 100 17 33 7

Stenotrophomonas maltophilia (228) 20 85 >2 0 39 100 60 0 93 48 93

Numbers in parentheses after organism names are numbers of strains tested.Values are percentages of positive; those in paren-theses represent delayed positivity. + positive for 90 to 100% of strains; - positive for 0 to 10% of strains; V, positive for 11 to 89% of strains.*Most Burkholderia cepacia complex are slow, weak-positive oxidase test, some species are oxidase negative and most clinical isolate strains are nonpigmented, but on iron-containing media ie. TSI, many strains produce a bright yellow pigment. **Acid production on low peptone phenol red agar

ตำรำงท 5.6-9 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase บวก, motility ลบ, OF glucose ลบ, indole ลบ (ตอ)


ตำรำงท 5.6-11 กำรจ�ำแนกเชอกลม oxidase ลบ, motility ลบ , OF glucose บวก/ลบ

Species

Aci

difc

atio

n of

D-G

luco

se

Gel

atin

ase

Hem

olys

is o

f she

ep b

lood

Gro

wth

at 3

7 °C

Gro

wth

at 4

1 °C

Gro

wth

at 4

4 °C

Sim

mon

s Citr

ate

Mal

onat

e

Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (70)

(DNA group 1,2, 3, TU13) + - - + V1 V2 + V

Acinetobacter beijerinckii (15) - V + + - - + +

Acinetobacter bereziniae (16) (DNA group 10) 88 - - + - - + -

Acinetobacter guillouiae (17) (DNA group 11) - - - - - - + V

Acinetobacter gyllenbergii (9) - + + + - - + V

Acinetobacter haemolyticus (21) (DNA group 4) V + + + V - V -

Acinetobacter johnsonii (20) (DNA group 7) - - - - - - + V

Acinetobacter junii (21) (DNA group 5) - - V + V - + V

Acinetobacter lwoffii (26) (DNA group 8, 9, TU15) V - - V - - V -

Acinetobacter parvus (14) - - - + - - - -

Acinetobacter radioresistens (22) (DNA group 12) - - + V - - + -

Acinetobacter schindleri (22) - - - + + - V -

Acinetobacter ursingii (29) - - - + - - + -

Numbers between parentheses are the numbers of strains tested. Values are percentages of positive

+ positive for 90 to 100% of strains; - positive for 0 to 10% of strains; V, positive for 11 to 89% of strains.1 Typically negative only for A. calcoaceticus strains2 Typically positive only for A. baumannii and most strains of genomic species 13TU.


ตำรำ

งท 5

.6-1

2 กำ

รจ�ำแ

นกเ

ชอกล

ม ox

idas

e บ

วก/ล

บ, m

otili

ty บ

วก, O

F gl

ucos

e บ

วก/ล

บ, p

ink

pigm

ente

dnon

ferm

ente

r

Spec

ies

Oxidase

No. of flagella

Growth on MAC

Glucose

Fructose

Mannitol

Xylose

Arabinose

Urease

Nitrate

Esculin

Asa

ia sp

p. (2

) 0

P1-2

/LN

D10

010

010

010

100

00

0

Azo

spiri

llum

spp.

(3)

100

P1-2

ND

0(1

00)w

010

010

010

010

010

0

Met

hylo

bact

eriu

m sp

p.*

(4)

0P1

-(2

5)0

010

010

010

00

0

Ros

eom

onas

cer

vica

lis**

(2)

100

P1-2

+0

500

(100

)10

010

00

0

Ros

eom

onas

gila

rdii

subs

p. g

ilard

ii**

Rose

omon

as g

ilard

ii su

bsp.

rose

a**

(5)

100w

P1-2

+(2

0)60

/(40)

(80)

010

010

00

0

Ros

eom

onas

muc

osa*

* (9

) 11

wP1

-2+

100

100

100

010

010

00

0

Ros

eom

onas

gen

omos

peci

es 4

** (1

) 10

0P1

-2+

(100

)10

00

00

100

100

0

Ros

eom

onas

geno

mos

peci

es 5

** (4

) 10

0wP1

-2+

0(1

00)

00

010

00

0

Num

bers

in p

aren

thes

es a

fter o

rgan

ism

nam

es a

re n

umbe

rs o

f stra

ins

test

ed. V

alue

s ar

e pe

rcen

tage

s of

pos

itive

; tho

se in

par

enth

eses

repr

esen

t del

ayed

pos

itivi

ty;

+ po

sitiv

e fo

r 90

to 1

00%

of s

train

s; -

posi

tive

for 0

to 1

0% o

f stra

ins;

W w

eak

posi

tive

P an

d nu

mbe

r=N

umbe

r of p

olar

flag

ella

; L =

Lat

eral

flag

ella

; ND

= n

ot

dete

rmin

ed G

ram

’s st

ain(

Gra

m n

egat

ive)

*B

acill

i with

vac

uole

, **C

occo

id ro

d


ตำรำงท 5.6-13 Nomenclature of glucose nonfermentative gram-negative bacteria from clinical specimens

Current namesFormer names/Synonyms

Genus species

AchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacterAchromobacter

Achromobacter

aegrifaciensdolensinsuavismarplatensismucicolenspiechaudii ruhlandiispiritinusxyloxosidans

denitrificans

-----

Alcaligenes piechaudii--

Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans, Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans,CDC group IIIa, CDC group IIIbCDC group Vc, Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans, Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans

Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax

delafieldii facilis temperans wautersii

Pseudomonas delafieldii, E. Falsen (EF) group 13Hydrogenomonas facilis, Pseudomonas facilisPseudomonas temperans, E. Falsen (EF) group 16Acidovorax avenae

Acinetobacter

Acinetobacter Acinetobacter Acinetobacter

Acinetobacter


AcinetobacterAcinetobacterAcinetobacter

Acinetobacter Acinetobacter

baumannii

beijerinckii bereziniae calcoaceticus-baumannii complex calcoaceticus

guillouiae gyllenbergii haemolyticus

johnsonii junii lwoffii

parvus pittii

Acinetobacter anitratus, Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus, Acinetobacter DNA group 2

-Acinetobacter DNA group 10Acinetobacter DNA group 1,2, 3, TU13

Acinetobacter anitraus, Acinetobacter calcoaceticus subsp. calcoaceticus, Acinetobacter DNA group 1Acinetobacter DNA group 11Acinetobacter phenon 3Acinetobacter anitratus, Acinetobacter DNA group 4Acinetobacter DNA group 4Acinetobacter DNA group 7Acinetobacter DNA group 5, Acinetobacter grimontiiAcinetobacter DNA group 8Acinetobacter DNA group 9, Moraxella lwoffiAcinetobacter calcoaceticus var. lwoffiAcinetobacter phenon 4Acinetobacter DNA group 3



Genus species


radioresistans schindleri ursingii

Acinetobacter DNA group 12Acinetobacter phenon 2Acinetobacter phenon 1

AlcaligenesAlcaligenes

ruhlandiifaecalis

-Pseudomonas odorans, Alcaligenes odorans, CDC group VI

Alishewanella fetalis -

Asaia spp. -

Azospirillum

Azospirillum

brasilense

spp.

Roseomonas genomic species 3 (Roseomonas fauriae), Roseomonas genomic species 6

-

BalneatrixBalneatrix

alpicazoohelcum

-CDC group Iij, Weeksella zoohelcum

BordetellaBordetella

BordetellaBordetellaBordetella

Bordetella

aviumbronchiseptica

hinzii I holmesiiparapertussis

trematum

-Bordetella bronchicanis, Alcaligenes bronchicanisAlcaligenes bronchisepticusBrucella bronchispetica, Alcaligenes bronchicanisHaemophilus bronchisepticaAlcaligenes faecalis type IICDC nonoxidizer group 2 ( NO-2)Bacillus parapertussis, Haemophilus parapertussisAcinetobacter parapertussis

-

BrevundimonasBrevundimonas

vesicularis diminuta

Pseudomonas vesicularis, Corynebacterium vesicularePseudomonas diminuta , CDC group 1a

BurkholderiaBurkholderia

Burkholderia

Burkholderia

arborismallei

ambifaria

anthina

-Pseudomonas mallei, Bacillus mallei, Pfeifferella mallei, Malleomyces mallei, Actinobacillus malleiLoefferella mallei, Acinetobacter malleiBurkholderia cepacia, Burkholderia cepacia complex Genomovar VIIBurkholderia cepacia, Burkholderia cepacia complex Genomovar VIII

ตำรำงท 5.6-13 Nomenclature of glucose nonfermentative gram-negative bacteria from clinical specimens (ตอ)



Genus species

Burkholderia Burkholderia

BurkholderiaBurkholderia Burkholderia BurkholderiaBurkholderiaBurkholderia

BurkholderiaBurkholderiaBurkholderia

Burkholderia BurkholderiaBurkholderia Burkholderia

Burkholderia Burkholderia

Burkholderia BurkholderiaBurkholderiaBurkholderiaBurkholderia

cenocepaciacapacia

contaminansdiffusadolosafungorumgladioli

latalatensmallei

metallicamultivoransoklahomensispseudomallei

pseudomultivoranspyrrocinia

seminalisstabilisthailandensisubonensisvietnamiensis

Burkholderia cepacia complex Genomovar IIIBurkholderia cepacia complex Genomovar IPseudomonas cepaciaPseudomonas kingii (kingae)Pseudomonas multivoransCDC group EO-1Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Genomovar VI

-Pseudomonas gladioli, Pseudomonas marginata,Burkholderia cocovenenans, Pseudomonas antimicrobica

-Burkholderia cepacia complex Pseudomonas mallei, Bacillus mallei, Pfeifferella mallei, Malleomyces mallei, Actinobacillus mallei, Loefferella mallei, Acinetobacter mallei Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Genomovar IIBurkholderia pseudomonas strain oklahomaPseudomonas pseudomalleiBacillus pseudomalleiBacterium whitmoriMalleomyces pseudomalleiLoefflerella pseudomallei

-Pseudomonas pyrrocinia, Burkholderia cepacia complex (BCC) Genomovar IXBurkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Genomovar IV

-Burkholderia cepacia complex Genomovar XBurkholderia cepacia complex Genomovar V

ChryseobacteriumChryseobacteriumChryseobacteriumChryseobacteriumChryseobacteriumChryseobacterium

anthropigleum hominisindologenesscophthalmumtreverense

CDC group IIeFlavobacterium gleumCDC group IIh, CDC group IIcFlavobacterium indologenes, Flavobacterium group IIb

--

Chryseomonas polytricha -




Genus species

Comamonas

ComamonasComamonas

Comamonas

aquatica

kerstersiiterrigena

testosteroni

Comamonas terrigena DNA group 2Aquaspirillum aquaticumComamonas terrigena DNA group 3Comamonas terrigena DNA group 1Aquaspirillum aquaticum, CDC group EF-19Pseudomonas testosteroni

CupriavidusCupriavidus

CupriavidusCupriavidus

gilardiipauculus

respiraculitaiwanensis

Ralstonia gilardii, Wautersia gilardiRalstonia paucula, Wautersia paucula, CDC group IVc-2Ralstonia respiraculi, Wautersia respiraculiRalstonia taiwanensis, Wautersia taiwanensis

Delftia acidovorans Pseudomonas acidovorans, Comamonas acidovoransPseudomonas indoloxidans, Pseudomonas desmolytica

Elizabethkingia meningoseptica Chryseobacterium meningosepticum Flavobacterium meningosepticum, CDC group IIa

Empedobacter

Empedobacter

brevis

falsenii

Flavobacterium breve, Flavobacterium brevis, Pseudobacterium brevis

-

EO-3 EO-3 -

Flavobacterium mizutaii Sphingobacterium mizutaii, Flavobacterium mizutaiiCDC group Iii

Inquilinus limosus -

KerstersiaKerstersia

gyiorumsimilis

Alcaligenes faecalis-like organism La-




Genus species

MethylobacteriumMethylobacterium

spp.mesophilicum

-Pseudomonas mesophilica, Pseudomonas extorquens,Vibrio extorguens

MoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxellaMoraxella Moraxella Moraxella Moraxella Moraxella Moraxella Moraxella

anatipestiferatlantae bovisbovoculicaniscatarrhalis equilacunatalincolniinonliquefaciensosloensis ovispluranimaliumporcisaccharolytica

-CDC group M-3

---

Branhamella catarrhalis, Neisseria catarrhalis-

Moraxella liquefaciens-------

Myroides Myroides

odoratimimusodoratus

Flavobacterium odoratumChryseobacterium odoratum, Flavobacterium odoratum, CDC group M4-f

Ochrobactrum

OchrobactrumOchrobactrumOchrobactrumOchrobactrumOchrobactrum

anthropi

grignonenseintermediumpseudogrignonensepseudointermediumhaematophilum

CDC group Vd-1 and Vd-2Achromobacter spp. biotypes 1 and 2Achromobacter group A, C and D

-----

Oligella Oligella

ureolytica urethralis

CDC group IVeMoraxella urethralis, CDC group M-4

PandoraeaPandoraeaPandoraeaPandoraeaPandoraeaPandoraea

apistanorimbergensispnomenusapulmonicolasputorumspp.

-----

CDC group WO-2




Genus species

Pannonibacter phragmitetus Achromobater group B and E

Paracoccus yeeii CDC group EO-2

PseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas PseudomonasPseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosa alcaligenes betelifluorescenshibiscicola-like group 2luteola mendocina monteilii mosseilii oryzihabitansotitidispertucinogena pseudoalcaligenes putidasimiaestutzeri stutzeri–like veronii

Pseudomonas pyocyanea, Bacterium aeruginosum----

CDC Ivd, CDC group EF-1Chryseomonas luteola, CDC group Ve-1CDC group Vb-2

--

Flavimonas oryzihabitans, CDC group Ve -2--

Pseudomonas alcaligenes biotype B--

CDC group Vb-1 CDC group Vb-3

-

PsychrobacterPsychrobacterPsychrobacter Psychrobacter

faecalisimmobilis phenylpyruvicuspulmonis

--

Moraxella phenylpyruvica, CDC group M-2-

RalstoniaRalstonia

Ralstonia Ralstonia

mannitolilytica pickettii

insidiosasolanacearum

Ralstonia pickettii biovar 3Burkholderia pickettii, Pseudomonas pickettiiCDC group Va-1 and Va-2Ralstonia pickettii-like isolatesBurkholderia solanacearum, Pseudomonas solanacearum

Rhizobium radiobacter Agrobacterium tumefaciens, CDC group Vd-3, Agrobacterium radiobacter

RoseomonasRoseomonasRoseomonasRoseomonas Roseomonas Roseomonas Roseomonas

cervicalisfauriaegilardii subsp. gilardii genomospecies 4 genomospecies 5 gilardii subsp. rosea mucosa

-------




Genus species

Shewanella

Shewanella

algae

putrefaciens

Shewanella putrefaciens biovar 2, CDC biotype 2, CDC group Ib-2Shewanella putrefaciens biovar 1 and 3, CDC biotype 1, Pseudomonas putrefaciens, Alteromonas putrefaciens Achromobacter putrefaciens, CDC group Ib-1 and Ib-2

SphingobacteriumSphingobacteriumSphingobacterium

Sphingobacterium

mizutaemultivorumspiritovorum

thalpophilum

Flavobacterium mizutaii, CDC group IIiFlavobacterium multivorum, CDC group IIk-2Flavobacterium spiritovorum, Flavobacterium yabuuchiae, Sphingobacterium versatilis, CDC group IIK-3Flavobacterium thalpophilum

SphingomonasSphingomonas

parapaucimobilispaucimobilis

-Pseudomonas paucimobilis, Flavobacterion devoransCDC group IIk-1

Stenotrophomonas maltophilia Pseudomonas maltophilia, Xanthomonas maltophiliaStenotrophomonas africana

Wautersia eutropha Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha,Cupriavidus necator

Wautersiella falsenii phenotypically resembling members of the generaChryseobacterium and Empedobacter.

Weeksella virosa CDC group IIf, Flavobacterium genitale



เอกสำรอำงอง1. Henry DA, Mahenthiralingam E, Vandamme P, Coenye T, Speert DP. 2001. Phenotypic methods for determining genomovar status of the Burkholderia cepacia complex. J Clin Microbiol 39:1073–1078.2. Vandamme P, Henry D, Coenye T, Nzula S, Vancanneyt, M, LiPuma JJ, Speert DP, Govan JR, Mahenthi ralingam E. 2002. Burkholderia anthina sp. nov. and Burkholderia pyrrocinia, two additional Burkholderia cepacia complex bacteria, may confound results of new molecular diagnostic tools. FEMS Immunol Med Microbiol 33:143–149.3. Vanlaere E, Baldwin A, Gevers D, Henry D, De Brandt E, LiPuma JJ, Mahenthiralingam E, Speert DP, Dowson C, Vandamme P. 2009. Taxon K, a complex within the Burkholderia cepacia complex, comprises at least two novel species, Burkholderia contaminans sp. nov. and Burkholderia lata sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 59:102–111.4. Vaneechoutte M, Janssens M, Avesani V, Delmee M, Deschaght P. 2013. Description of Acidovorax wautersii sp. nov. to accommodate clinical isolates and an environmental isolate, most closely related to Acidovorax avenae. Int J Syst Evol Microbiol 63:2203–2206.5. Coenye T, Falsen E, Hoste B, Ohlén M, Goris J, Govan JR, Gillis M, Vandamme P. 2000. Description of Pandoraea gen. nov. with Pandoraea apista sp. nov., Pandoraea pulmonicola sp. nov., Pandoraea pnomenusa sp. nov., Pandoraea sputorum sp. nov. and Pandoraea norimbergensis comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 50:887–899.6. Wauters G and Vaneechoutte M. 2015. Approaches to the Identification of Aerobic Gram-Negative Bacteria, p 613-634. In Jorgensen JG, Pfaller MA, Carroll KC, Landry ML, Funke G, Richter SS, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Microbiology, 11th ed, vol 1. ASM Press, Washington, DC.7. Høiby N, Ciofu O, and Bjarnsholt T. 2015. Pseudomonas, p 773-790. In Jorgensen JG, Pfaller MA, Carroll KC, Landry ML, Funke G, Richter SS, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Microbiology, 11th ed, vol 1. ASM Press, Washington, DC.8. Lipuma JJ, Currie BJ, Peacock SJ, and Vandamme P. 2015. Burkholderia, Stenotrophomonas, Ralstonia, Cupriavidus, Pandoraea, Brevundimonas, Comamonas, Delftia, and Acidovorax, p 791-812. In Jorgensen JG, Pfaller MA, Carroll KC, Landry ML, Funke G, Richter SS, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Mi crobiology, 11th ed, vol 1. ASM Press, Washington, DC.9. Vaneechoutte M, Nemec A, Kämpfer P, Cools P, and Wauters G. 2015. Acinetobacter, Chryseobacterium, Moraxella, and Other Nonfermentative Gram-Negative Rods, p 813-837. In Jorgensen JG, Pfaller MA, Carroll KC, Landry ML, Funke G, Richter SS, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Microbiology, 11th ed, vol 1. ASM Press, Washington, DC.10. König CHW, Riffelmann M, and Coenye T. 2015. Bordetella and Related Genera, p 838-850. In Jorgensen JG, Pfaller MA, Carroll KC, Landry ML, Funke G, Richter SS, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Microbiology, 11th ed, vol 1. ASM Press, Washington, DC.11. สรางค เดชศรเลศ และเพญแข รตนพรยกล. 2557. การวนจฉยเชอกลม Glucose Nonfermentative Gram-negative bacilli. หนา 164-190 ใน: มาลย วรจตร, วนทนา ปวณกตตพร, สวรรณา ตระกลสมบรณ และสรางค เดชศรเลศ (บรรณาธการ), คมอการปฏบตงานแบคทเรยและราส�าหรบโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาลทวไป. จดท�าโดย สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย ศนยความรวมมอไทย-สหรฐ ดานสาธารสข.12. Procop, GW, Church DL, Hall GS, Janda, WM, Koneman EW, Schreckenberger, PC, Woods, GL, 2016 The Nonfermentative Gram-Negative Bacilli. p. 316- In Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 7th Edition. Wolters Kluwer .13. Bruckner DA, Colonna P and Bearson BL, 1999 Nomenclature for Aerobic and Facultative Bacteria Clinical Infectious Diseases 29: 713-723.14. Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Germany, Prokaryotic Nomenclature Up-to-date (October 2017) (http://www.dsmz.de/bacterial-diversity/prokaryotic-nomencla ture-up-to-date)


5.7 การวนจฉยเชอกลม Higher Bacteriaณฎฐวรรณ ปนวน

หลกกำร

higher bacteria เปนเชอในกลม actinomycetes จดอยใน Order Actinomycetales ซงมการเจรญเปนเสนสาย

เลกๆ แตกกงกาน ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5-0.8 µm ขยายพนธโดยการสรางสปอรหรอแตกหกเปนทอนของ

เสนสาย มทงเชอทเปน aerobic actinomycetes, facultative anaerobes และ obligate anaerobes เชอกอโรคทส�าคญ

ในกลม aerobic actinomycetes ไดแก Nocardia , Actinomadura, Rhodococcus และ Streptomyces.

กำรวนจฉยทำงหองปฏบตกำร

1. สงสงตรวจ เสมหะ สงสงตรวจจากระบบหายใจ หนองจากแผล เลอด น�าไขสนหลง ชนเนอจาก ตอม

น�าเหลอง ปอด เปนตน

2. กำรตรวจโดยตรงทำงกลองจลทรรศน

2.1 กำรเตรยมตวอยำงเพอตรวจโดยตรงทำงกลองจลทรรศน

ในกรณทสงสงตรวจเปนหนองจากแผล (non sterile site) ทสงสยโรค actinomycotic mycetoma น�า

ตวอยางหนองจากแผลถายลงในจานเพาะเชอตรวจหา grains หรอ granules ซงเปนกล มของเชอกอโรค

(microcolonies) ดส รปราง ขนาด ความนมหรอความแขงของ grains หรอ granules ดวยตาเปลา จากนนใช

pasteur pipette ดดแยก grains ออกมาหยดลงบนแผนสไลดแกวและใชแผนสไลดแกวอกแผนหนงปดทบ บดให

grains แตก แลวเกลยใหเปนแผนบาง ปลอยใหแหงและลนผานเปลวไฟ 3 ครง

ชนเนอ ใชกรรไกรทปราศจากเชอตดใหเปนชนเลกๆ ใชคมคบปราศจากเชอคบชนเนอกดลงบนแผน

สไลดแกวหลายๆ ครง ปลอยใหแหงและลนผานเปลวไฟ 3 ครง

Body fluids (เลอด น�าไขสนหลง น�าจากต�าแหนงทไมมเชอประจ�าถน) น�าเขาเครองปน (centrifuge) โดย

ใชความเรว 2800 g เปนเวลา 10 นาท น�าสวนทอยกนหลอดมาสเมยรบนแผนสไลดแกวปลอยใหแหงและลนผาน

เปลวไฟ 3 ครง

2.1.1 การยอมแกรม โดยวธการยอมเหมอนกบการยอมสแกรมแบคทเรย

เชอควบคมคณภาพ Gram-positive control Streptomyces flavus DMST 15342

Gram-negative control Escherichia coli DMST 4212

2.2.2 การยอม Modified Kinyoun acid- fast

วธยอม

1. หยดสารละลาย carbon fusion ลงบนแผนสเมยรจนทว ทงไว 5 นาททอณหภม

หอง ไมตองอน

2. ลางดวยน�า

3. ลางดวย 50% ethyl alcohol ราดทบและเททงสลบกนไปหลายๆ ครงจนกวาสแดง

สวนเกนจะจางลง

4. ลางดวยน�า

5. ลางดวย 1% Sulfuric acid ในน�า เปนเวลา 3 นาท

6. ยอมทบดวย methylene blue เปนเวลา 1 นาท

7. ลางดวยน�า ปลอยใหแหง ตรวจดดวยกลองจลทรรศน


เชอควบคมคณภาพ

Modifiied AFB positive control Nocardia asteroides DMST 15332

Modifiied AFB negative control Streptomyces flavus DMST 15342

2.2 กำรเพำะเชอ

การตรวจแยกเชอ aerobic actinomycetes จากสงสงตรวจทไมมเชอประจ�าถน (sterile sites) หรอ

concentrated sterile body fluid สามารถเพาะโดยตรงบนอาหารเลยงเชอ BA, CA, BHA, Sabouraud dextrose agar

(SDA) และ Lowewstein-Jensen medium

สงสงตรวจจากต�าแหนงทมเชอประจ�าถน (nonsterile sites) เชนสงสงตรวจจากทางเดนหายใจ และ

mycetoma ให pretreat ดวย low-pH (2.2 ) HCl-KCl solution (46.8 ml. 0.2 M HCl และ 300 ml 0.2 M KCL) ใช

1 ml low pH (2.2 ) HCl-KCl solution ผสมกบตวอยาง 10 ml ตงทงไว 4 นาท เพาะลงบน selective media เชน

modified Thayer - Martin agar (MTM), Buffered charcoal yeast extract (BCYE) เพาะเชอทอณหภม 30 °C และ

35 °C นาน 1-3 สปดาห ตรวจสอบการเจรญของเชอทกวนในสปดาหทหนง และสปดาหละครงของสปดาหท 2

และ 3 เมอเชอเจรญ สงตอฝายเชอราวทยา สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย

น�าโคโลนทไดมาท�าการทดสอบคณสมบตการตดส acid-fast ดการสราง aerial mycelium ดวยกลองจลทรรศน

3. กำรอำนผล

ตำรำงท 5.7-1 ลกษณะของ grains หรอ granules ของเชอกอโรค actinomycotic mycetoma

Organisms Grains

Nocardia asteroides Rare; white, soft, irregular, 1 mm.

Nocardia brasiliensis white to yellow, soft, lobe, 1 mm.

Nocardia otitidiscaviarum white to yellow

Actinomadura madurae white, soft, oval to lobe, 5 mm.

Actinomadura pelletieri red, hard, oval to lobe, 1 mm.

Streptomyces somaliensis yellow, hard, round to oval, 2 mm.

Actinomadura spp. ตดสแกรมบวก ไมตดส modified acid-fast I รปรางลกษณะเปนเสนสายสนๆ ขนาดเสน

ผานศนยกลางนอยกวา 1 μm

Nocardia spp. ตดสแกรมบวกและตดส modified acid-fast เปนบางสวน รปรางลกษณะเปนเสนสาย เสนสาย

แตกหกเปนรปทอน จนถงรปกลม ขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 0.5-1 μm

Rhodococcus spp. ตดสแกรมบวกและตดส modified acid-fast เปนบางสวน รปรางลกษณะเปน coccobacilli

หรอมลกษณะคลาย diphtheroids

Streptomyces spp. ตดสแกรมบวก ไมตดส modified acid-fast รปรางลกษณะเปนเสนสาย ขนาดเสนผาน

ศนยกลางประมาณ 0.5-1 μm ไมมการแตกหกของเสนสายเปนทอน


ตำรำงท 5.7-2 Morphologic characteristics of aerobic actinomycetes

Genus Substrate

hyphae

Aerial

HyphaeConidia

Modified

acid-fast

Microscopic

morphologyColonial morphology

Actinomadura - V V - Thin, short

branching flament

Powdery aerial hyphae may be

blue, brown, cream, gray, green,

pink, white, violet, or yellow.

Colonies are wrinkled and may

have a leathery or cartilaginous

appearance when aerial myceliu-

mis absent.

Nocardia + + V W Thin, filamentous

branching rods,

0.5-1.0 μm in

diam; beading

generally apparent.

Chalky, matte or velvety,

powdery (usually), irregular,

wrinkled, heaped, or smooth on

surface; may be brown , tan, pink,

orange, red, purple, gray, yellow,

peach, or white on reverse;

smooth or granular; soluble brown

or yellow pigments may be

produced

Rhodococcus + - - W Coccoid to

bacillary forms

Rough, smooth, or mucoid; buff,

cream, yellow, orange, or red;

colorless variants occur; may

become increasingly pigmented

and rough with age.

Streptomyces + + + - Filamentous

branching rods,

0.5-2.0 μm in

diam; filaments

may fragment into

short rods; may

stain more solidly

gram positive than

Nocardia; may

show beading.

Colonies are discrete and

lichenoid, leathery, or butyrous;

variety of pigments; aerial hyphae

may appear floccose, granular,

powdery, or velvety; may produce

a colored soluble pigment.

ตรวจดการสราง aerial mycelium ดวยกลองจลทรรศน สวนขอบของโคโลนจะเหนลกษณะทเปนเสนสายคลายกบ

เสนซกแซก


4. กำรรำยงำนผล

กำรตรวจโดยตรงทำงกลองจลทรรศน

รำยงำนผล Nocardia “Gram-positive, modified acid fast positive (partially acid fast), branching filament,

beading filament, fragment bacilli, suggesting Nocardia.”

รำยงำนผล Rhodococcus “Gram-positive, modified acid fast positive (partially acid fast), coccoid to

bacillary forms, suggesting Rhodococcus.”

รำยงำนผล Streptomyces “Gram-positive, modified acid fast negative, branching filament, suggesting

Streptomyces.”

รำยงำนผล Actinomadura “Gram-positive, modified acid fast negative, short branching filament,

suggesting Actinomadura.”

กรณทพบ grains หรอ granules ในสงสงตรวจ ใหพจารณาส ขนาด ความนมหรอแขงและขนาดของ grains

หรอ granules ตามทแสดงไวในตารางท 5.7.1 .ลกษณะของgrains หรอ granules ของเชอกอโรค Actinomycotic

mycetoma. มาประกอบในการรายงานผลดวย

การรายงานผลเพาะเชอเบองตน สามารถรายงานผลไดในระดบ genus โดยพจารณาจากลกษณะโคโลนบน

อาหารเลยงเชอ การตดสAFB และการสราง aerial mycelium โดยพจารณาคณสมบตของเชอทท�าการทดสอบ

ประกอบกบคณสมบตของเชอแตละ genus ทแสดงไวในตารางท 5.7.2


1. Conville PS and Witebsky FG. Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinimadura,

Sterptomycetes, and Other Aerobic Actinomycetes. In: Versalovic J, editor in chief. Manual of

Clinical Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p.443-471.

2. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In:

Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p. 507-540.

3. Hazen KC and Howell SA. Aerobic Actinomycetes. In: Garcia LS.editor in chief. Clinical

Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007.

p. 6.0.1-6.2.10.


5.8 การวนจฉยเชอกลม Miscellaneous Gram-Negative Bacteriaวรดา สโมสรสข

อนศกด เกดสน

Francisella spp.

เปนแบคทเรยแกรมลบ ตดสแดงของ safranin บางๆ รปราง coccobacilli ประกอบดวย 3 species ดงน

F. tularensis, F. novicida และ F. philomiragia ส�าหรบ F. tularensis สามารถจ�าแนกออกไดอก 3 subspecies คอ

subspecies tularensis, holarctica และ mediasiatica โรคทเกดจากเชอนคอ โรคทลารเมย (tularemia) ซงเชอทกอ

โรคน คอ F. tularensis โดยเฉพาะ F. tularensis subsp. tularensis มความรนแรงในการกอโรคสงสดและถอเปน

อาวธชวภาพอกดวย เชอนมสตวปาเปนแหลงรงโรค เปนทงสตวทมและไมมกระดกสนหลง การตดตอสคนสามารถ

เกดขนโดยผานทางบาดแผลจากการสมผส หรอถกกดหรอขวน การรบประทานเนอสตวปาทปรงไมสก หรอการ

หายใจเอาละอองหรอสารคดหลงทมการปนเปอนเชอนเขาสรางกาย ในประเทศไทยยงไมมรายงานผปวยโรค

ทลารเมยจากเชอ F. tularensis แตพบรายงานการตดเชอ F. novicida ในกระแสโลหตในผปวย เมอป พ.ศ. 2551

เชอ F. tularensis สามารถเพาะไดดวยอาหารเลยงเชอ BA หรอ CA ทเสรมดวยสารประกอบจ�าพวก sulhydryl

ไดแก cysteine, cystine, thiosulfate หรอ IsoVitaleX นอกจากนอาหารเลยงเชอ buffered charcoal-yeat extract

agar (BCYE) ทใชในการเพาะเชอ Legionella spp. สามารถใชได อยางไรกตาม F. novicida และ F. philomiragia

สามารถเจรญไดในอาหารเลยงเชอ BA หรอ CA ทไมตองเสรมดวยสารประกอบจ�าพวก sulhydryl เชอนเจรญไดท

อณหภม 35-37 °C ไมตองการ CO2 ในการเจรญเตบโต ระยะเวลาในการเจรญเตบโตจนเปนโคโลน โดยเฉลยมากกวา

2 วน โดยทวไปโคโลน มขนาดประมาณ 1-2 mm สเทาถงเทาขาว บนอาหารเลยงเชอ CA การทดสอบเบองตนเพอ

จ�าแนก Francisella ออกจากเชออนๆ ทใกลเคยง เชน Brucella, Haemophilus, Acinetobacter ไดแก การทดสอบ

oxidase, X, V factor และ urease ซงใหผลลบทงหมด

Brucella spp.

เปนแบคทเรยแกรมลบ รปราง coccobacilli ขนาดเลก ตดสแดงของ safranin บางๆ ไมม capsule, flagella และ

endospore ไมสามารถหมกน�าตาลได ประกอบดวย 9 species มสตวทเปนพาหะจ�าเพาะตามแตละ species ไดแก

B. melitensis มแพะหรอแกะหรออฐ เปนสตวรงโรค B. abortus มสตวเคยวเออง เชน โค กระบอ เปนสตวรงโรค

B. suis มสกรเปนสตวรงโรค B. ovis มแกะ เปนสตวรงโรค B. canis มสนขเปนสตวรงโรค B. neotomae มหน

เปนสตวรงโรค B. delphini, B. pinnipediae, B. cetaceae มสตวเลยงลกดวยนมทอาศยอยในทะเล อาท แมวน�า

ปลาวาฬ ปลาโลมา เปนสตวรงโรค

โรคทเกดจากเชอ Brucella เรยกวา โรค Brucellosis นอกจากนยงมชอเรยกอยางอนแตกตางกนไปตามสภาพ

ภมศาสตร เชน Malta fever, Mediterranean fever, Cyprus fever, Gilbrata fever เปนตน การตดตอสคนสามารถ

เกดขนโดยผานทางบาดแผลจากการสมผส การรบประทานนมดบ เนย ชสทไมผานกระบวนการพาสเจอรไรซ หรอ

การหายใจเอาละอองหรอสารคดหลงทมการปนเปอนเชอนเขาสรางกาย เชอนยงถกจดใหเปนอาวธชวภาพอกดวย

การเพาะเชอ Brucella สามารถเพาะลงอาหารเลยงเชอ BA, CA, Thayer-Martin, Martin-Lewis เชอสามารถ

เจรญไดทอณหภม 35-37 °C ทมหรอไมม CO2 (5-10%) สามารถพบโคโลนไดหลงจากอบแลว 1-2 วน โคโลนม


ขนาดเลกประมาณ 1-2 mm ลกษณะกลมนน ผวเรยบ นอกจากน เครอง automated blood culture เชน Bactec,

BacT Alert ใหผลการเจรญของเชอดกวา วธ nonautomated blood culture อยาง biphasic Ruiz-Castañeda bottle

ซงใชเวลาประมาณ 7-35 วนในการเจรญ ขณะทเครอง automated blood culture จะใชเวลาไมเกน 10-14 วน ใน

การจ�าแนกเชอ Brucella เบองตน ไดแก การทดสอบ oxidase, catalase และ urease ซงใหผลบวกทงหมด โดยเฉพาะ

การทดสอบ urease จะใหผลบวกทคอนขางเรว ภายใน 5 นาท ส�าหรบ species ทแยกไดจากคนอยบอยๆ เชน

B. melitensis, B. abortus

Pasteurella spp.

เปนแบคทเรยแกรมลบ รปรางทรงแทงหรอ coccobacilli ปจจบนม 8 species โดย P. multocida เปน species ท

แยกไดจากผปวยบอยทสด อยางไรกตาม P. multocida สามารถจ�าแนกออกไดอก 3 subspecies ดงน multocida,

septica, gallicida เชอ Pasteurella พบไดทวไปทงในสตวปาและสตวบาน

การเพาะเชอ Pasteurella สามารถเพาะเลยงไดงาย โดยใชอาหารเลยงเชอทวไปทมอยในหองปฏบตการ อยาง BA

หรอ CA ทอณหภม 35-37 °C ไมตองการ CO2 โคโลนมขนาดประมาณ 1-2 mm nonhemolysis อยางไรกตามบาง

สายพนธอาจพบโคโลน ทมลกษณะเยมได (mucoid) การทดสอบปฏกรยาทางชวเคมเบองตน ไดแก การทดสอบ

catalase, oxidase, indole ซงใหผลการทดสอบเปนบวกทงหมด นอกจากนการใช penicillin disk ขนาด 10 U สามารถ

ชวยในการจ�าแนกได เนองจาก Pasteurella จะไวตอยา peniillin โดยมขนาดของ inhibition zone 15 ≥ mm

Bartonella spp.

เปนแบคทเรยแกรมลบ ขนาดเลก รปรางทรงแทงหรอ curve rod เลกนอย คลายกบ Helicobacter, Campylobacter

หรอ Haemophilus ตดสแกรมไมคอยด ไมวาจะใช safranin หรอ basic fuchsin เชอเปน facultative intracellular

สามารถอาศยอยในเซลลของคนและสตว มมากกวา 22 species มสตวบาน สตวปาและแมลงเปนแหลงรงโรค

Bartonella สามารถเพาะไดโดยใชอาหารเลยงเชอทมอยในหองปฏบตการ อยาง BA และ CA แตเนองจากเปน

เชอท fastidious ดงนนระยะเวลาในการเพาะอาจนานตงแต 5 วน จนถง 30 วน ณ อณหภม 35-37 °C ทม CO2

(5%)

และความชนสง (high humidity) ลกษณะโคโลนม 2 แบบ คอ (1) แบบขรขระ ผวไมเรยบ แหง ลกษณะคลายกบ

ดอกกะหล�า (cauliflower-like) (2) แบบกลม ผวเรยบ ขนาดเลก และอาจฝงอยในเนอของอาหารเลยงเชอ เนองจาก

เชอ Bartonella คอนขาง inert ตอการทดสอบทางปฏกรยาชวเคม ซงจะใหผลลบตอการทดสอบทงหมด ดงนนวธ

ในการตรวจยนยนเชอดงกลาว ควรใชวธทางอณชววทยา เชน DNA sequencing, PCR ซงเหมาะสมทสด แตอยางไร

กตาม จากลกษณะทกลาวมาขางตน อาจสนนษฐานไดวาเปนเชอดงกลาว

อาหารเลยงเชออกชนดหนงทชวยเสรมใหเชอ Bartonella เจรญเตบโตไดด คอ Bartonella Alphaproteo bacteria

growth medium (BAPGM) อยางไรกตาม ในกรณทเลยงเชอในเครอง automated blood culture system ทอาศยการ

ตรวจจบสญญาณจาก CO2 มกลมเหลวในการตรวจหาเชอน เพราะวาเชอมความ inert ในการยอยสลายอาหาร และ

ผลต CO2 ไดนอยมาก ดงนนการท�า blind subculture จากขวด hemoculture จะมประโยชนในกรณทสงสยเชอดง

กลาว


Chromobacterium spp.

เฉพาะ C. violaceum เทานน ทกอโรคในคน เชอนตดสแกรมลบ รปแทง สวนใหญมากกวารอยละ 90 มรงควตถ

violacein v ท�าใหมโคโลนสมวง แตอยางไรกตาม บางสายพนธทไมมรงควตถ กสามารถพบได

ในการเพาะเลยงเชอแบคทเรยน อาหารเลยงเชอทวไปทมอยในหองปฏบตการ เชน BA หรอ CA หรอ Tryptic

soy agar (TSA) สามารถใชเพาะไดด เชอโตงายคลายกบแบคทเรยกลม enteric อาจพบ β-hemolysis บน BA ไดใน

บางสายพนธ เชอสามารถเจรญไดทอณหภม 30-37 °C ไมตองการ CO2 โคโลนมขนาด 1-2 mm หลงจาก 24 ชม.

ลกษณะกลมนน ผวเรยบ และสวนใหญมสมวง เนองจากรงควตถ violacein ดงนนการจ�าแนกเบองตน คอนขาง

งาย ถาพบโคโลนมสมวงดงกลาว oxidase ใหผลบวก อยางไรกตาม ถาพบเชอทไมใหโคโลนสมวง อาจท�าใหสบสน

กบ Aeromonas แตสามารถจ�าแนกออกจาก Aeromonas ไดโดยการทดสอบ lysine, maltose และ mannitol ใหผล

ลบทงหมด

ตำรำงท 5.8-1 ลกษณะทำงชวเคมของแบคทเรยในกลม miscellaneous gram-negative และแบคทเรยอนทใกลเคยง

Test

Fran

cise

lla sp

p.

Bru

cella

spp.

Past

eure

lla sp

p.

Bar

tone

lla sp

p.

Hae

mop

hilu

s spp

.

Chr

omob

acte

rium

viol

aceu

m

Bor

dete

lla b

ronc

hise

ptic

a

Och

roba

ctru

m a

nthr

opi

Growth on BA v + + + - + + +

Growth on CA + + + + + + + +

Growth on MAC - - v - - + + +

Oxidase - + + - V v + +

Urease - + v - V ND + +

Motility - - - - - + + +

Indole - - +** - V v - -

X and/or V factor

requirement

- - - - + - - -

Cysteine enhancement +* - - - - - - -

* F. philomiragia และ F. novicida ไมตองการ cysteine ในการเจรญ

** P. aerogenes และ P. caballi ใหผลลบ


Campylobacter spp.

เชอ Campylobacter เปนแบคทเรยแกรมลบ จดอยใน family Campylobacteraceae รปรางเปนทอนโคง (curved)

S-shaped หรอเปนเกลยว (spiral) ขนาด 0.2 - 0.9 x 0.5 - 5.0 μm ตดสแกรมลบ ไมสรางสปอร แตอาจพบ

เปนรปรางกลมหรอร หากเพาะไวนานหลายวน เชอนสามารถเคลอนทได โดยใช polar flagellum สวนใหญเปน

microaerobic bacteria เจรญไดดในสภาวะทมปรมาณออกซเจนต�า เวลาเลยงเชอตองใชบรรยากาศทม 5% O2, 10%

CO2, and 85% N

2 บางสายพนธเจรญไดในสภาวะ aerobic หรอ anaerobic ได เดมจดอยใน genus Vibrio เนองจาก

มรปรางคลายกน เชอ Campylobacter ม 21 species (ตารางท 5.8-2) ไดแก C. jejuni, C. coli, C. fetus, C. upsaliensis,

C. lari, C. hyointestinalis, C. helveticus, C. sputorum, C. concisus, C. curvus, C. rectus, C. showae, C. gracilis,

C. mucosalis, C. lanienae, C. insulaenigrae, C. canadensis, C. hominis, C. avium, C. cuniculorum, และ

C. subantarcticus

เชอใน genus Campylobacter มทงเปนสาเหตของโรคและกลมทไมกอโรคเชอทท�าใหเกดโรคทส�าคญ C. jejuni

และ C. coli เปนสายพนธทเปนสาเหตของการตดเชอมากทสด เชอสามารถอยในอาหาร น�า หรอสงแวดลอม

อน ๆ ทนตอความรอน ความแหงแลง ดอตอสารตานจลชพในอตราทสง นอกจากน เชอ C. fetus, C. lari,

C. upsaliensis และ C. hyointestinalis เปนสายพนธทกอโรคไดทงในมนษยและสตว

กำรวนจฉยทำงหองปฏบตกำร

การตรวจการตดเชอ C. jejuni สามารถตรวจโดยใชอจจาระผสมน�าเกลอหยดบนแผนแกวตรวจดดวย

กลองจลทรรศนชนด dark field หรอ phase contrast โดยตรวจหาแบคทเรยรปรางโคงงอ ทมการเคลอนทเรว

ปจจบนใชวธการเพาะแยกเชอจากตวอยางอจจาระผปวย โดยเกบใสขวดทสะอาด หรอเกบเปน rectal swab ใสใน

Cary – Blair transport medium น�าสงหองปฏบตการภายใน 2 ชม. หรอหากไมสามารถเพาะเชอไดใหเกบท 4 °C

การเพาะเชอสามารถเลอกใชอาหารเลยงเชอหลายชนด เชน 5% BA โดยใชแผนกระดาษกรอง ขนาด 0.45 μm วาง

ลงบนอาหาร BA น�า rectal swab ของผปวย มาปายบนแผนกระดาษกรอง ตงทงไวนาน 30 นาท จากนนคบเอา

แผนกระดาษกรองทงไป แลวน�าไปอบในสภาวะ microaerobic (5% O2 10% CO

2 85% N

2) หรอใช anaerobic jar

ทใส Campy pak (BBL) 1 ซอง ทอณหภม 37 °C นาน 48 ชม.

นอกจากนอาจปายอจจาระลงอาหารเลยงเชอชนด selective medium ทมสวนผสมของสารตานจลชพ เชน

Skirrow’s medium ทมสวนผสมของ vancomycin, trimethoprim และ polymyxin B, Butzler’s medium ทมสวน

ผสมของ bacitracin, cycloheximide, colistin sulphate, cephazolin sodium และ novobiocin หรอ Campy-BAP

ทมสวนผสมของ vancomycin, polymyxin B, cephalothin sodium และ amphotericin B จากนนน�าไปอบในสภาวะ

microaerobic ดงกลาวทอณหภม 37 °C ตรวจดโคโลนของเชอหลงจากอบเพาะเชอนาน 2-3 วน โคโลนของเชอ

จะมลกษณะมนวาวคลายหยดน�าคาง ขนาด 1-2 mm สเทาขาว เมอน�าไปยอมสแกรมจะเหนเปนรปตว S หรอ ปกนก

(Gull wing) ตดสแกรมลบ แตเชอไมคอยตดส safranin ตองใช 0.05-0.1% carbol fuchsin เปน counter stain แทน


กำรทดสอบปฏกรยำทำงชวเคมเบองตน

เชอ Campylobacter ทดสอบ oxidase ใหผลบวก ท�าการถายโคโลนทพบลงใน BA 3 จาน น�าไปอบทสภาวะ

microaerobic ทอณหภมตางกน ไดแก อณหภม 25°C, 37 °C และ 42 °C เปนเวลานาน 24-48 ชม.สงเกตผลดงน

คอ ถาเปนเชอ Campylobacter เชอจะเจรญไดดในสภาวะ microaerobic อณหภม 37 °C /42 °C แตเจรญไดไมดท

สภาวะ microaerobic อณหภมหอง (25 °C) การแยกพสจนเชอใหไดแตละ species สามารถดไดจากตารางท 5.8-2

C. jejuni แยกออกจาก Campylobacter สายพนธอน ๆ ดวย hippurate hydrolysis ซง C. jejuni ใหผลบวก ขณะ

ทสายพนธอนใหผลลบ วธการทดสอบ hippurate hydrolysis ดงตอไปน

1. เขยเชอทดสอบ 2 loopful ลงใน 0.4 ml ของ 1% hippurate solution ในหลอดขนาด 13 x 100 mm

อบหลอดท 37 °C 2 ชม.

2. หยด 0.2 ml ninhydrin reagent เขยาและ อบหลอดท 37 °C 10 นาท

ผลบวก: เกดสมวง

ผลลบ: ไมเปลยนส หรอเกดสมวงออน


ตำรำ

งท 5

.8-2

กำ

รแยก

พสจ

นเช

อ C

ampy

loba

cter

spp.

Spec

ies

α-hemolysis

Oxidase

Catalase

Hippyrate hydrolysis

Urease production

Nitrate reduction

Alkaline phosphatase

H2S, TSI

Acid and H2S, TSI

Indoxyl aceate hydrolysis

Gro

wth

at/

in/o

n

Resistance to nalidixic acid

Resistance to cephalothin

Requirement for H2

γ-Glutamyl transpeptidase

Flagella

25 ˚C (microaerobic)




37 ˚C (anaerobic)

Ambient O2

Nutrient agar

CCDA

MacConkey agar

1% glycine

3.5% NaCl

C. u

psal

iens

is+

+-

--

+-

--

+-

++

(+)

--

++

-+

--

(-)

--

+

C. s

puto

rum

++

V-

-+

-+

--

-(+

)+

++

-+

(+)

V+

V(+

)-

+-

+

C. s

how

ae+

V+

--

+-

V-

V-

+V

V+

-V

++

V-

--

+N

A+

C. r

ectu

s+

+(-

)-

-+

--

-+

-V

-(-

)+

-(-

)-

-+

-(+

)-

+N

A+

C. m

ucos

alis

-+

--

--

(+)

+-

--

++

++

-+

+(+

)V

-(+

)-

+N

A+

C. l

ari

V+

+-

V+

--

--

-+

++

--

++

-+

-V

+-

-+

C. l

anie

nae

-+

+-

-+

+-

V-

-N

A+

++

-N

AN

A+

--

++

--

+

C. j

ejun

i sub

sp. j

ejun

i+

++

+-

+-

--

+-

++

+-

-+

+-

+-

-+

--

+

C. j

ejun

i sub

sp. d

oyle

i+

+V

+-

--

--

+-

++

--

-+

+-

(-)

--

--

NA

+

C. i

nsul

aeni

grae

NA

++

--

+N

A-

NA

--

NA

NA

--

-N

AN

AN

A+

-+

+N

AN

AN

A

C. h

yoin

test

inal

is

s

ubsp

. law

soni

iV

++

--

+(-

)+

--

-+

++

+-

++

vv

-+

-V

-+


ตำรำ

งท 5

.8-2

กำ

รแยก

พสจ

นเช

อ C

ampy

loba

cter

spp.

(ตอ)

Spec

ies

α-hemolysis

Oxidase

Catalase

Hippyrate hydrolysis

Urease production

Nitrate reduction

Alkaline phosphatase

H2S, TSI

Acid and H2S, TSI

Indoxyl aceate hydrolysis

Gro

wth

at/

in/o

n

Resistance to nalidixic acid

Resistance to cephalothin

Requirement for H2

γ-Glutamyl transpeptidase

Flagella





37 ˚C (anaerobic)

Ambient O2

Nutrient agar

CCDA

MacConkey agar

1% glycine

3.5% NaCl

C. h

yoin

test

inal

is s

ubsp

.

hyo

inte

stin

alis

V+

+-

-+

-+

--

(-)

++

+-

-+

+V

+-

+(-

)V

-+

C. a

vium

-+

W+

-+

--

-+

-N

A+

+-

--

--

--

-+

V-

+

C. h

omin

is-

+-

--

V-

-N

A-

--

-N

A+

-N

AN

A-

++

V-

NA

NA

-

C. h

elve

ticus

++

--

-+

--

-+

-V

++

--

(+)

+-

V-

--

--

+

C. g

raci

lis-

-V

--

(+)

--

-V

-V

-V

+-

+V

(+)

+-

V-

NA

NA

-

C. f

etus

subs

p. v

ener

ealis

V+

(+)

--

+-

--

-+

++

-V

-+

+V

--

V-

-N

A+

C. f

etus

subs

p. fe

tus

-+

+-

-+

--

--

++

+(+

)(-

)-

++

(+)

+-

+-

--

+

C. c

urvu

s(-

)+

-(-

)-

+V

(-)

-V

-+

VV

+-

+(+

)(+

)+

-+

-+

NA

+

C. c

onci

sus

(-)

V-

--

(-)

V-

--

-(+

)+

(+)

+-

(-)

(-)

-(-

)-

(-)

-+

-+

C. c

oli

(-)

++

--

+-

V-

+-

++

+-

-+

+V

+-

-+

--

+

C. c

anad

ensi

s-

+V

-V

V-

V(-

)-

--

++

+-

-+

+V

-V

--

(+)

+

C. c

umic

ulor

um+

++

--

+-

-N

A+

-N

A+

(+)

--

+(+

)-

--

V(+

)-

-+

C. s

uban

tarc

ticus

++

+-

NA

NA

NA

--

--

NA

++

+-

+N

A(-

)(+

)N

A+

--

NA

+

+, 9

0–10

0 %

of s

train

s pos

itive

; (+)

, 75–

89 %

of s

train

s pos

itive

; V, 2

6–74

% o

f stra

ins p

ositi

ve; (

–), 1

1–25

% o

f stra

ins p

ositi

ve; –

, 0–1

0 %

of s

train

s pos

itive

. w, w

eakl

y

posi

tive,

NA

, No

data

ava

ilabl

e. D

ata

for r

efer

ence

spec

ies w

ere

take

n fr

om F

oste

r et a

l. (2

004)

, Law

son

et a

l. (2

001)

, Log

an e

t al.

(200

0) a

nd O

n et

al.

(199

6). R

oss

et a

l. (2

009)

and

Ded

ryne

et a

l. ( 2

010)



1. Debruyne L, Broman T, BergstrÖm s, Olsen B, On SL, Vandamme P. Campytobacter subantarcticus

Sp. nov., isolated from birds in the sub-Antarctic region. Int J Syst Evol Microbiol. 2010; 60 : 815-9.

2. Foster G, Holmes B, Steigerwalt AG, Lawson PA, Thorne P, Bryer DE, Ross HM, Xerry J, Thompson

PM, Collins MD. Campylobacter insulaenigrae sp. nov., isolated from marine mamals. Int J Syst Evol

Microbiol. 2004; 54 : 2369-73.

3. Holmes B, Pickett J, Holis DG. Pasteurella, In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover

FC, Yolken RH editors. Manual of Clinical Microbiology 7th ed. Washington, DC: ASM

Press; 1999. p. 632-7.

4. Lawson AJ, On SL, Logan JM, Stenley J, Campylobacter hominis sp. nov., isolated from the human

gastrointertinal trat. Int J Syst Evol Mirobiol. 2001; 51 : 651-60.

5. Leelaporn A, Yongyod S, Limsrivanichakorn , Yungyuen T, Kiratisin P. Francisella novicida

bacteremia, Thailand. Emerg Infect Dis. 2008;14:1935-7.

6. Logan JM, Burnens A, Linton D, Lawson AJ, Stanley J, Campylobacter lanienae sp. nov., a new species

isolated from workers in an abattoir. Int J Syst Evol Microbiol. 2000 ; 2 : 865-72.

7. Maggi RG, Kempf VAJ, Chomel BB, Breitschwerdt EB. Bartonella. In: Versalovic J, Carroll

KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical

Microbiology 10th ed. Vol 1. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 786-98.

8. On SL. Identification method for campylobactors, helicobacters and related organisms. Clin Microbiol Rev.

1996; 9 : 405-22.

9. Petersen JM, Schriefer ME, Araj GF. 2011. Francisella and Brucella. In: Versalovic J, Carroll

KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical


10. Rossi M, Debruyne, Zanoni RG, Manfreda G, Revez J, vandamme P. Campylobacterarium sp. nov.,

a hippurate-positive species isolated from poultry. Int J Syst evol Microbiol. 2009; 59 : 2364-9

11. Zanoni RG, Debruyne L, Rossi M, Revez J, Vandamme P, Campylobacter cuniculorum sp. nov.,

from rabbits. Int J Syst Evol Microbiol. 2009; 59 : 1666-71.

12. Zbinden R, Graevenitz AV. Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, Pasteurella,

and other fastidious or rarely encountered gram-negative rods. In: Versalovic J, Carroll KC,

Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual of Clinical



5.9 การวนจฉยเชอกลม Anaerobic Bacteriaปยะดา หวงรงทรพย

หลกกำร

การตดเชอ anaerobic bacteria สวนใหญเกดจากเชอประจ�าถนของรางกาย ดงนนต�าแหนงการตดเชอจงอยใกล

กบต�าแหนงทมเชอ anaerobe เปนเชอประจ�าถน เชน การตดเชอในล�าไส ชองทอง องเชงกราน เปนตน การกอโรค

มกเกดจาก aerobic bacteria และตามดวย anaerobic bacteria จงพบวาการตดเชอ anaerobe มเชอกอโรคหลายชนด

การตดเชอ anaerobic bacteria ทเกดจากเชอนอกรางกายกพบไดเชนกน เชน บาดทะยก อาหารเปนพษจากเชอ

Clostridium botulinum แผลตดเชอ (gas gangrene) จากเชอ C. perfringens เปนตน

ขอบเขต

การเพาะแยกเชอจากตวอยางผปวย เพอตรวจหาเชอ anaerobic bacteria ทเปนสาเหตของโรคตลอดจนการตรวจ

สอบลกษณะตวเชอดวยวธการยอมแกรมและการตรวจสอบลกษณะโคโลนเพอจ�าแนกชนดของเชอ anaerobic

bacteria เบองตน

กำรเกบตวอยำงและกำรน�ำสงตวอยำงตรวจวนจฉย anaerobic bacteria

1. การเลอกและเกบสงสงตรวจ การเลอกสงสงตรวจ เพอตรวจวนจฉย anaerobic bacteria นอกจากดประวต

ผปวย ผลการตรวจของแพทยหรอขอมลทางหองปฏบตการอนๆ แลว ตองค�านงถงเวลาทเหมาะสมในการเกบวตถ

ตวอยาง เกบตวอยางในบรเวณทมการตดเชอโดยหลกเลยงการปนเปอนของเชอประจ�าถน (normal flora) บรเวณ

ใกลเคยงและจากสงแวดลอมภายนอก

2. สงสงตรวจทเหมาะสมส�าหรบการตรวจหาเชอ anaerobic bacteria

2.1 หนองจากแผลลก หนองจากอวยวะภายใน เชน สมอง ปอด ตบ ชองทอง เปนตน

2.2 สารน�าในรางกายทไดมาจากการเจาะดด (aspirate) จากต�าแหนงทอยโดยตรง เชน เลอด น�าในชอง

ทอง (peritoneal fluid) น�าในชองเยอหมปอด (pleural fluid) น�าจากขอ (synovial fluid) น�าคร�า

(amniotic fluid) น�าด (bile) เปนตน

2.3 เนอเยอจากการเกบชนเนอ (biopsy)

2.4 สงสงตรวจทเกบโดยวธพเศษ เชน การเจาะผานหลอดคอ การเจาะดดจากกระเพาะปสสาวะ

3. สงสงตรวจทไมเหมาะสมส�าหรบการตรวจหาเชอ anaerobic bacteria

3.1 เสมหะ

3.2 swab ทปายจากในคอและในจมก

3.3 อจจาระ และ rectal swab

3.4 ปสสาวะจากการขบถายหรอการสวนปสสาวะ (catheterized urine)

3.5 swab ทปายจากปากมดลกหรอบรเวณชองคลอด (cervical swab)

3.6 สงสงตรวจทปนเปอนเชอประจ�าถน (normal flora)

3.7 swab หนองจากปากแผลหรอแผลตน


4. การเกบสงสงตรวจและการน�าสงหองปฏบตการ นอกจากการเลอกสงสงตรวจทเหมาะสมสงตรวจวนจฉย

anaerobic bacteria แลว ปจจยอนทมผลตอเชอในสงสงตรวจซงควรกระท�าใหเหมาะสม ไดแก ปรมาณตวอยางท

เพยงพอ ขนาดและความสะอาดของภาชนะทใชใสตวอยางความชน ปรมาณออกซเจน (Eh) อณหภมในระหวาง

การน�าสง ระยะเวลาหลงการเกบตวอยางจนสงถงหองปฏบตการ transport medium ทใชในการน�าสง สารทมผล

ยบยงการเจรญของเชอสาร anticoagulant และการปนเปอนของยาตานจลชพในตวอยาง

สงสงตรวจทเกบมาแลวควรน�าสงหองปฏบตการทนท เพอด�าเนนการตรวจเพาะเชอโดยเรวทสดทอณหภมหอง

ไมควรใสตเยนหรอแชน�าแขง เพราะความเยนมผลตอการเจรญของ anaerobic bacteria บางชนด

4.1 การเกบสงสงตรวจทเปนของเหลว ใชเขมและกระบอกฉดยาเกบตวอยางแลวไลอากาศในกระบอกฉดยา

ออกใหหมด ฉดตวอยางลงในขวดปราศจากเชอทบรรจแกส CO2หรอแกสผสมและ indicator ทใชบงช O

2ในขวด

(ภาพท 5.9-1) กรณไมมขวดบรรจแกส CO2 เมอไลอากาศออกจากกระบอกฉดยาแลวใหปกเขมลงบนจกยางท

ปราศจากเชอและน�าใสหลอดทดลอง หรออาจใชวธเกบตวอยางบรรจลงหลอดทดลองหรอขวดขนาดเลกทปราศจาก

เชอใหเตมพอดเพอแทนทอากาศทงหมด

ภำพท 5.9-1 Rubber-stoppered collection vial containing an agar indicator system.

4.2 การเกบสงสงตรวจทเปนเนอเยอ เนอเยอเปนสงสงตรวจทเหมาะสมเพราะเชอจะสามารถอยในเนอเยอ

ไดนานหลายชวโมง เกบเนอเยอในหลอดทดลองปราศจากเชอทบรรจน�าเกลอปรมาณเลกนอย เพอรกษาความชน

และน�าสงตรวจในสภาวะไรอากาศโดยบรรจในถง anaerobic pouch ใส anaerobic GasPak (GasPak pouch) (ภาพ

ท 5.9-2)

ภำพท 5.9.2 Anaerobic transport system ส�ำหรบสงสงตรวจทเปนเนอเยอ


4.3 การเกบสงสงตรวจทเปน swab ตวอยาง swab เปนวตถตวอยางทไมเหมาะสม เนองจากสมผสอากาศ

มากไดสงสงตรวจนอย มการปนเปอนเชออนไดงาย แหงงาย อาจมเชอตกคางในใยส�าล ส�าลบางชนดมสารยบยง

การเจรญของเชอ หากมความจ�าเปนควรเกบตวอยาง swab ใน anaerobic transport system ซงม soft agar ทเตม

reducing agent (รปท 5.9-3)

ภำพท 5.9-3 Anaerobic transport system ส�ำหรบตวอยำง swab

4.4 ตวอยางเชอบรสทธ เชอแบคทเรยทสงสยเปน anaerobic bacteria ตองการสงตรวจยนยนชนดของเชอ

ใหน�าสงตวอยางเชอในสภาวะไรอากาศ โดยเพาะเลยงเชอใน enrichment media เชน BA, cooked meat medium,

enriched thioglycolate medium บรรจใน GasPak pouch น�าสงหองปฏบตการอางอง


1. เมอสงสงตรวจถงหองปฏบตการ เจาหนาทท�าการตรวจสอบสภาพของตวอยางกอนรบและด�าเนนการ

ตรวจวนจฉยทนท (แผนภมท 5.9-1) ถายงไมสามารถท�าไดในขณะนนใหน�าตวอยางเกบทอณหภมหอง

2. สงเกตลกษณะของตวอยาง (macroscopic examination) โดยสงสงตรวจจากผปวยตดเชอ anaerobic bacteria

มลกษณะเดนชด เชน มกลนเหมน มแกสเกดขนมา มสด�าคล�า มสแดงอฐ (brick-red fluorescene) เมอดภายใตแสง

ultraviolet เนองจากม Porphyromonas spp. และ/หรอ Prevotella spp. มกอนสขาวหรอเหลองในสงสงตรวจ

(sulfur granules) ถาเปนการตดเชอ Actinomyces isaraelii

3. น�าตวอยางมาเพาะเลยงเชอบนอาหารเลยงเชอตอไปน (primary plate) คอ Ana BA, BBE, EY, BA และ CA,

liquid enrichment media เชน enriched thioglycolate broth หรอ cooked meat medium และน�าไปอบท 35-37 °C

ในภาวะทเหมาะสม คอ Ana BA, BBE และ EY อบในภาวะไรอากาศ ส�าหรบ CA อบเชอในสภาวะ 5-10% CO2

อาหารทเหลออบในตอบธรรมดา ดงแผนภมท 5.9-1


แผนภมท 5.9-1 วธด�ำเนนกำรตรวจวนจฉย anaerobic bacteria เบองตน


(เลอด น�าจากชองปอด, หนอง, เนอเยอ)

ตรวจวเคราะหตวอยางโดยตรง เพาะเชอ บนอาหารแขง เพาะเชอ ใน liquid enrichment media

- ตรวจดลกษณะของตวอยาง - Ana BA, BBE, EY อบเชอในอากาศปกต

(macroscopic) อบเชอในสภาวะไรอากาศ 35 ± 2 °C 48 ชม.

- ตรวจดการยอมแกรม 35 ± 2 °C 48 ชม.

(microscopic) - BA อบเชอในสภาวะ - Ana BA primary plate positive

อากาศปกต 35 ± 2 °C 24 ชม. 1) อบ เชอ 35 ± 2 °C 48 ชม

- CA อบเชอในสภาวะ 2) ยอมสแกรม หากพบวามเชอท

5-10% CO2 35 ± 2 °C 48 ชม. ยงแยกไมไดให subculture

- Ana BA primary plate negative

ตรวจสอบผลการเจรญทงหมด 1) subculture และยอมสแกรม

เมอบมครบ7 วนหรอ อาหารขน

2) บมเพาะเชอ 14 วน ไมเจรญ

ใหสงเกตดวยตาแลวจงทง

BA และ CA - Ana BA: เลอกโคโลนลกษณะตางๆ

- BBE: เลอกโคโลนขนาด >1 mm ทดสอบ catalase

บนทกลกษณะ - EYA: บนทกผล lipase และ lecithinase เลอกโคโลนลกษณะตางๆ

และผลการยอมสแกรม

เชอแตละลกษณะโคโลน

- subculture บน Ana BA และ streak ใหไดโคโลนเดยว

- subculture บน CA ส�าหรบทดสอบ aerotolerance

- ยอมสแกรม

CA scant or no growth CA good growth

รายงานผลการทดสอบ/ลกษณะโคโลน และการยอมสแกรม aerobic bacteria


4 การเตรยมสงสงตรวจและเพาะเชอจากสงสงตรวจ (inoculate) บนอาหารเลยงเชอ หากด�าเนนการบนโตะ

ปฏบตการปกต กระบวนการทงหมดควรเสรจสนภายใน 15-20 นาท เพอใหตวอยางสมผสกบอากาศนอยทสด

4.1 สงสงตรวจทเปนของเหลว เชน หนองจากแผลลก สารน�าในรางกาย ใหผสมสงสงตรวจโดยใช

capillary pipette ดดขนดดลงเบาๆ ไมใหเกดฟองอากาศ จนแนใจวามการกระจายตวของเชอทวทง

หลอด แลวจงดดวตถตวอยางมา หยดบนอาหารเลยงเชอชนดแขง จานละ 1-2 หยด และหยดใสใน

อาหารเหลว (liquid enrichment media) ใกลกบกนหลอด 1-2 หยด หยดลงบนสไลดส�าหรบ

ยอมแกรม 1 หยด smear สไลด และ streak plate

4.2 สงสงตรวจทเปนเนอเยอ เนอเยอหรอตวอยางทคอนขางแขง ใหใชกรรไกรปราศจากเชอตด

สงสงตรวจใส liquid enrichment media ประมาณ 1 ml บดใหเขากนดดวย tissue grinder หรอผสม

ใหเขากนดกบ liquid media จะไดเปนวตถตวอยางเหลว เพาะเชอบนอาหารเลยงเชอ โดยปฏบตเชน

เดยวกบขอ 4.1

4.3 สงสงตรวจทเปน swab หากม swab 2 อน ใหใชอนแรกปายในอาหารแขง โดยหมนไปรอบๆ ใหทว

ประมาณ 1 ใน 4 ของ plate อกอนหนง ใสลงในอาหารเหลว ถาม swab เพยงอนเดยวใหใสใน

อาหาร เหลวปรมาตร 0.5 - 1 ml บดไปมาแลวใชสวนนเพาะเชอบนอาหารแขงและอาหารเหลว สง

สงตรวจทเปน swab ไมเหมาะทจะยอมแกรม

4.4 ในกรณตวอยางทตองการตรวจหาเชอ Clostridium spp. เชนตวอยางอจจาระหรอตวอยางจาก

สง แวดลอม ควรใชวธ alcohol shock โดยน�าตวอยางผสมกบ absolute ethanol ในอตราสวน 1:1 ตง

ไวทอณหภมหองนาน 30 นาท จงน�าตวอยางถายลงบนอาหารเลยงเชอ หรอวธ heat shock กใชไดด

เชนกน โดยน�าตวอยางแชในอางน�ารอนทอณหภม 70-80 °C นาน 10-15 นาท กอนถายตวอยางลง

บนอาหารเลยงเชอ

4.5 ยอมสแกรม จากสงสงตรวจ (microscopic examination) ตรวจดผลดวยกลองจลทรรศนก�าลง ขยาย

10X10 เพอดลกษณะทวไปกอนจงดดวยก�าลงขยาย 10X100 โดยสงเกตลกษณะการตดสของเชอ

ขนาดรปราง และจ�านวนของเชอแตละชนดในสงสงตรวจ รวมทงการสรางสปอรทมรปไขหรอรป

กลมและต�าแหนงของสปอร เชน กลางเซลล (central spore) ปลายเซลล (terminal spore) หรอ

ระหวางกลางกบปลายเซลล (subterminal spore) เปนตน ขอมลทไดจากการยอมสแกรมมความส�าคญ

อยางมากเปนขอมลเบองตนทแพทยสามารถน�าไปใชประกอบการรกษาผปวยได และชวยในการ

ตดสนใจเลอกใชอาหารเลยงเชอทเหมาะสม (แผนภมท 5.9-2)


แผนภมท 5.9-2 แสดงกำรแบงกลมของ anaerobic bacteria

4.6 น�าอาหารเลยงเชอ Ana BA, BBE, EY และ liquid enrichment media ทท�าการ inoculate เรยบรอย

แลว อบเชอใน anaerobic jar ทอณหภม 35 ± 2 °C นาน 48 ชม. ไมควรเปด anaerobic jar กอน 48 ชม.

เพราะจะท�าใหเชอทก�าลงเจรญและเปลยนแปลงลกษณะโคโลนสมผสโดนอากาศและตายได

เนองจาก anaerobic bacteria สวนใหญไวตอ O2 ในระหวางชวง logarithmic phase ของการเจรญ

หากอบเชอใน anaerobic chamber หรอ anaerobic pouches สามารถตรวจสอบการเจรญของเชอได

หลงอบ 24 ชม. โดยไมสมผสกบ O2 โดยเฉพาะโคโลนของ Bacteroides fragilis group บน BBE หรอ

โคโลนของ Clostridium perfringens บน EY

4.7 อาหารเลยงเชอ BA ท inoculate เรยบรอยแลว อบเชอในสภาวะอากาศปกต (ambient air) ท

อณหภม 35 ± 2 °C นาน 24 ชม.

4.8 CA ท inoculate เรยบรอยแลว อบเชอในสภาวะ 5-10% CO2 (Candle jar) หรอตอบ CO

2 ทอณหภม

35±2 °C นาน 48 ชม.

4.9 อานผลการเจรญของเชอบน BA หลงจากอบเชอในสภาวะอากาศปกตครบ 24 ชม. โดยสงเกตลกษณะ

ของโคโลน คณสมบตในการยอยสลายเมดเลอดแดง (hemolysis) และยอมสแกรม ม Clostridium

หลาย species สามารถเจรญไดในสภาวะอากาศปกต แตไมสรางสปอร เชน C. carnis,

C. haemolyticum และ C. tertium

4.10 อานผลการเจรญของเชอบน CA หลงจากบมเพาะเชอในสภาวะ 5-10 % CO2 เปนเวลา 48-72 ชม.

สงเกตลกษณะโคโลนและยอมสแกรม


4.11 ตรวจสอบผลการเจรญของเชอบน Ana BA, BBE และ EY หลงจากอบเชอในสภาวะไรอากาศ

เปนเวลา 48-72 ชม. โดยใช stereoscopic microscope หรอ hand lens (X8) ชวยในการดลกษณะ

โคโลนทมขนาดเลก อานลกษณะโคโลนของเชอทพบทงหมด ปรมาณของเชอแตละลกษณะโคโลน

โดยบนทกรายละเอยดของโคโลนคอ ขนาด รปราง (circular, irregular, molar-tooth, breadcrumb)

ขอบ (entire, rhizoid, undulate) รปดานขาง (convex, umbonate, pitting) ความทบแสง (transparent,

translucent, opaque) ส และอนๆ เชน fluorescence, hemolysis เปนตน

4.12 เลอกโคโลนเดยวของเชอทกลกษณะทพบบน Ana BA (primary plate) มา subculture ใหไดเชอ

บรสทธบน Ana BA (secondary plate) ทดสอบ aerotolerance บน Ana BA และยอมสแกรม

หากโคโลนมขนาดเลก ให inoculate บน Ana BA อยางเดยวกอน เมอเชอเจรญเพมปรมาณแลว

จงท�าการทดสอบ aerotolerance และยอมสแกรม

4.12.1 การทดสอบ aerotolerance บน Ana BA แบง plate เปน 4 ชอง ใช subculture เชอได

4 ลกษณะ โคโลน อบเชอใน 5-10% CO2 ทอณหภม 35 ± 2 °C เปนเวลา 48-72 ชม

เพอตรวจหาเชอทตองการ CO2 โดยเฉพาะเชอทเจรญชา (slow-growing aerobic

organisms) เชอเจรญยาก (fastidious), facultative หรอ microaerobic species ซงไม

เจรญเพยงล�าพงบน blood agar เชน Haemophilus spp. และควรค�านงเสมอวามเชอ

aerotolerant anaerobic bacteria แกรมบวก nonsporeforming rods หลายชนดสามารถ

เจรญในภาวะ CO2 และอาจเจรญไดนอยๆในภาวะอากาศปกต เชน Actinomyces

spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp. และ Lactobacillus spp.

4.12.2 การยอมแกรม น�า pure colony smear บนสไลดและยอมแกรม บนทกลกษณะรปราง,

การตดสของเซลล รปรางและต�าแหนงของสปอร

4.13 เลอกโคโลนทเจรญบน BBE มขนาด >1 mm สงเกตปฏกรยา esculin hydrolysis (สด�า = บวก)

น�าเชอแตละลกษณะโคโลนไปทดสอบเอนไซม catalase โดยเขยเชอลงบน glass slide หยด 15%

hydrogen dioxide (15% H2O

2) ลงบนเชอทดสอบ ถามฟองอากาศเกดขนแสดงวาใหผลบวก

ถาไมเกดฟองอากาศแสดงวาใหผลลบ และ subculture บน Ana BA ทดสอบ aerotolerance

ยอมสแกรม โดยกระท�าเชนเดยวกบเชอทแยกไดบน Ana BA (primary plate) ในขอ 4.12

4.14 อานผลการสรางเอนไซม lipase และ lecithinase ของเชอทกลกษณะโคโลน บน EY ถาเชอ

เจรญแลวมผวหนาโคโลนเปนสรงมนวาว แสดงวามการสราง enzyme lipase (ใหผล lipase บวก)

ถาเชอเจรญแลวใหโซนสขาวขนรอบโคโลน แสดงวามการสราง enzyme lecithinase (ใหผล

lecithinase เปนบวก) subculture เชอทกลกษณะทพบลงบน Ana BA อบเชอในสภาวะไรอากาศ

ท 35 ± 2 °C นาน 48 ชม. EY จะชวยแยกเชอท swarm ออกเปนโคโลนเดยว ท�าใหแยกโคโลน

ไดงายขน

4.15 เปรยบเทยบลกษณะโคโลนบน Ana BA ท subculture จาก EY (primary plate) กบเชอทแยก

ไดจาก Ana BA (primary plate) เลอกโคโลนทแตกตางกนไปทดสอบ aerotolerance และยอมแกรม

ตอไป


4.16 อบ primary plates ซ�า เพอท�าการตรวจสอบในภายหลง

4.16.1 Ana BA อบเชอในสภาวะไรอากาศ 5-7 วน โดยตรวจสอบผลทก 48 ชม. น�าลกษณะ

โคโลนใหมๆ ทพบ มาแยกเชอใหบรสทธและทดสอบ aerotolerance

4.16.2 pigmented Prevotella spp., Porphyromonas spp. และ Actinomyces spp. โดยปกตจะมอง

เหนหลงจากบมในสภาวะไรอากาศ 2-3 วน ตรวจสอบ fluorescent และ pigmented

organisms บน Ana BA ใช stereoscopic microscope ตรวจสอบลกษณะโคโลน

“molar tooth” ของ Actinomyces isaraelii

4.16.3 ทง BBE plates หลงจากอบ 2-3 วน เนองจากอาหารเลยงเชอชนดนจะสญเสยคณสมบต

ความ selective เพราะการระเหยและการเสอมของยาปฏชวนะ

4.17 Liquid enrichment media

4.17.1 กรณเชอเจรญบน Ana BA primary plate บม liquid enrichment media ท 35 ± 2 °C ใน

สภาวะไรอากาศ นาน 7 วน แลวน�ามายอมแกรม ดวามเชอทยงแยกไมได บน plates จง

น�ามา subculture แยกเชอใหบรสทธตอไป

4.17.2 กรณเชอไมเจรญบน Ana BA primary plate

4.17.2.1 ตรวจสอบการเจรญของ broth culture ทกวน

4.17.2.2 ยอมสแกรม และ subculture ลงบน Ana BA และ CA เมอ broth ขน หรอ

เมออบท 35 ± 2 °C ในสภาวะไรอากาศ ครบ 7 วน

4.17.2.3 อบ broth culture ทไมพบการเจรญของเชอจนครบ 14 วน ตรวจสอบผลการ

เจรญดวยตาเปลาแลวจงทง

คณสมบตเฉพำะทเปนประโยชนในกำรตรวจวนจฉยเชอเบองตน (presumptive identification)

1. ลกษณะเซลลของเชอทตรวจดไดจากกลองจลทรรศน ไดแก รปราง ขนาด การเรยงตว การสรางสปอร

การตดสแกรม

2. ลกษณะของเชอทเจรญบนอาหารแขง ไดแก ลกษณะโคโลน การยอยสลายเมดเลอดแดง การดดกลนแสง

fluorescence และการสรางเมดส (pigment)

3. คณสมบตในการสรางเอนไซม lecithinase, lipase และ catalase

4. ความยากงายในการเจรญเตบโตในอาหารเหลว

5. ความทนทานตอออกซเจน

6. ความสามารถในการเจรญในอาหารเลยงเชอทม 20 % bile


ตำรำงท 5.9-1 กำรอำนผล anaerobic bacteria

ชนดของแบคทเรย ลกษณะเมอยอมแกรม ลกษณะโคโลน

Anaerobic แกรมลบ rods

Prevotella melaninogenica Coccobacilli กลม ผวโคงขนเลกนอย ขอบเรยบ

ตรงกลางสน�าตาลด�า ขอบสน�าตาล

ออน สยงเขมขนเมออบไวนานขน

Bacteroides fragilis group pleomorphic rods ปลายเซลลมน ตด

สซด อยเปนเซลลเดยวหรอค มกเหน

พบ vacuoles ภายในเซลล

กลม ผวโคงขนเลกนอย ขอบเรยบ ส

ขนมวหรอขาว ดอ penicillin เจรญ

ไดดในอาหารทมน�าด 20%

Fusobacterium mortiferum สซด ตดสไมสม�าเสมอ pleomorphic

rods เซลลบวม หวทายแหลมเรยงตอ

กนเปนเสน

กลม ขอบโคโลนมเสนใย ผวโคงขน

เลกนอย หรอเปนรอยนน ตรงกลาง

โคโลนออนนม non-hemolytic

Fusobacterium necrophorum pleomorphic rods ปลายเซลลมน

หรอแบน อาจเรยงตอกนเปนเสน

กลม ขอบโคโลนหยกปลายแหลม ผว

โคงขนเลกนอย หรอเปนรอยนนตรง

กลางหรอเปนสนโคโลนใสหรอขน

Fusobacterium nucleatum ตดสซด ผอมยาว คลายกระสวยทอ

ผา ปลายแหลม อย เป นเซลลค

ลกษณะเหมอนเขมหรอผลกของ

safranin

กลม ขอบโคโลนไมสม�าเสมอ ผวโคง

ขนเลกนอย หรอโคงขนสง ขน ดาน

บนมลาย หรอเหมอนเศษขนมปงชน

เลกๆ non-hemolytic

Peptococcus niger แกรมบวก เซลลกลม อยเปนเซลล

เดยว ค สเซลล หรอไมสม�าเสมอ

กลม ขอบเรยบ ผวโคงขนเลกนอย ส

ด�า ผวเปนเงา ขนาดเลกมาก

Anaerobic Cocci

Peptostreptococcus spp. แกรมบวก เซลลกลม อยเปนคและ

เปนเสนสาย

ขอบเรยบ ผวโคงขนเลกนอย สเทา

ขาวขน

Veillonella parvula แกรมลบ เซลลกลม อยเปนคสอง

หรอเปนสายสน ๆ

กลม ขอบเรยบ สขาวเทา

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium botulinum แกรมบวก แทงกลมตรง อย เปน

เซลลเดยวหรอค สปอรอยใตสวน

ปลายเซลล (sub-terminal)

กลม โคโลน อาจไมสม�าเสมอ สขาว

เทา ผวดาน ให β-hemolytic


ชนดของแบคทเรย ลกษณะเมอยอมแกรม ลกษณะโคโลน

Clostridium difficile แกรมบวก แทงกลมตรง อาจเรยงตอ

กนเปนสายม 2–6 เซลล สปอรรปไข

อยใตสวนปลายเซลล (Oval sub-ter-

minal)

กลม ผวดานหรออาจเปนเงา แบน

หรอโคงเลกนอย สครม เหลองหรอ

เทา แตกเปนแขนงคลายราก มกลน

คลายคอกมา (horse stable odor)

Clostridium perfringens แกรมบวก แทงตรงปลายตด (box

car appearance) มกพบ แกรมลบ ปน

อยดวยอยเปนเซลลเดยวหรอค ไม

พบสปอรในอาหารเลยงเชอและสง

สงตรวจ

กลม เปนเงา สเทาหรอเทาเหลอง ให

double zone beta hemolysis บางครง

พ บ โ ค โ ล น ห ย า บ เ ป น เ ส น ฝ อ ย

lecithinase positive

Clostridium sordellii แกรมบวก แทงตรง เซลลเดยวหรอ

ค สปอรรปไขอยใตสวนปลายเซลล

พบ free สปอรจ�านวนมาก อยเปน

สาย

สเทาขาว ขนาดใหญ ขอบหยก ใหผล

indole, lecithinase และ urease บวก

Clostridium ramosum อาจตดสแกรมบวกหรอแกรมลบ

แทงกลมตรง อยเปนเซลลเดยวหรอ

ค มสปอรกลมอยสวนปลายเซลล

กลม หรอ โคโลนอาจไมสม�าเสมอ

โคงนนเลกนอย สขาวเทา บางทโค

โลนหยกปลายแหลม mannitol บวก

ไมเคลอนไหว

Anaerobic แกรมบวก spore-forming rods

Clostridium septicum แกรมบวก แตถาอายมากอาจตดส

แกรมลบ แทงกลมตรง หรอโคง อย

เปนเซลลเดยวหรอค สปอรรปไขอย

ใตสวนปลายเซลล

กลม หรอยกขนเลกนอย แผโคโลน

อาจไมสม�าเสมอบางท โคโลนแตก

แขนงคลายราก สเทา ลกษณะโคโลน

คลาย Medusa heads

Clostridium tetani แกรมบวก แตถาอายมากเกน 24

ชม.จะตดสแกรมลบอยเปนเซลล

เดยวหรอค สปอรรปกลมอยสวน

ปลาย คลายไมตกลอง หรอไมเทนนส

แผ แบนผวด าน โคโลนอาจไม

สม�าเสมอ บางทโคโลนแตกแขนง

คลายราก สเทา ให β-hemolysis zone

แคบ ๆ


กรณพบ anaerobic bacteria ใหรายงานวา

“พบแอนแอโรบคแบคทเรย มคณสมบตการตดสแกรมบวก/ลบ รปรางลกษณะของเซลล และลกษณะของโคโลน”

กรณไมพบแบคทเรยใหรายงานวา

“ไมพบเชอ anaerobic bacteria”

ตำรำงท 5.9-1 กำรอำนผล anaerobic bacteria (ตอ)



1. Dowell VR Jr, Hawkins TM. Laboratory methods in anaerobic bacteriology. In: CDC Laboratory

Manual. US Dept of HEW, PHS, Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. DHEW Publication No

(CDC) 87-8272;1990.

2. Holdeman LV, Cato EP, and Moore WEC Editors. Anaerobe laboratory manual. 4thed. Blacksburg,

Virginia : Virginia Polytechnic Institute and State University; 1977.

3. ศรพรรณ วงศวานช. การตรวจวนจฉยเชอบกเตรไรอากาศในหองปฏบตการ. กรงเทพมหานครฯ: Text and

Journal Publication; 2538. หนา 1-52.


5.10 การวนจฉยเชอวณโรคและเชอมยโคแบคทเรยอนๆสมศกด เหรยญทอง

เชอวณโรคและเชอมยโคแบคทเรยอนๆจดอยใน genus Mycobacterium ซงมคณสมบตทส�าคญรวมกนคอ acid

fastness ทท�าใหแยกความแตกตางไปจากแบคทเรยอนๆคอ เปนเชอทตดสยาก แตเมอตดสแลวกลางออกยากหรอ

ลางไมออกดวยน�ายาทเปนกรดหรอกรดผสมแอลกอฮอล จงเรยกวาเชอทนกรด (Acid Fast Bacilli หรอ AFB) เชอ

วณโรค (Mycobacterium tuberculosis) ทเปนสาเหตของวณโรคปอดในคนมลกษณะทดภายใตกลองจลทรรศน

เมอท�าการยอมเชอดวยส carbol fuchsin โดยวธ Ziehl-Neelsen จะเหนตวเชอตดสแดง รปรางเปนแทงเรยวตรงหรอ

โคงเลกนอย ปลายมน มกอยเดยวๆหรอเปนค และถาน�าสวนหนงของโคโลนบนอาหารเลยงเชอมา smear และยอม

สจะเหนเชอรวมเกาะกลมกนเปนมดเหมอนฟอนหญา เรยกลกษณะนวา cord formation ซงเปนลกษณะทพบใน

เชอวณโรคเทานน สวนเชอมยโคแบคทเรยอนๆทไมใชเชอวณโรคมชอเรยกวา Non-Tuberculous Mycobacteria

(NTM) ซงลกษณะทดภายใตกลองจลทรรศนเมอยอมส Ziehl-Neelsen จะเหนตวเชอตดสแดง แตรปรางจะมหลาย

แบบทงทเปนแทงสนๆ หรอแทงยาว หรอยาวเปนเสนสาย

สงสงตรวจทส�าคญส�าหรบการวนจฉยวณโรคปอดคอเสมหะ แตการกระจายของเชอในเสมหะไมสม�าเสมอ ดง

นนการเลอกเขยเสมหะปายบนกระจกสไลดจงส�าคญมาก จ�าเปนตองเลอกเขยสวนทนาจะมเชอมากทสดมาตรวจ

คอสวนทเปนกอนเมอกเหนยว สขนเขมคลายหนองการวนจฉยวาผปวยเปนวณโรคนนตองพบเชอจากสงสงตรวจ

ของผปวย ซงเชอมยโคแบคทเรยทพบในเสมหะประมาณ 99% จะเปนเชอวณโรค ดงนนการเกบเสมหะอยางถก

ตองจงมความส�าคญ การตรวจทางหองปฏบตการท�าไดดงน

1. การตรวจหาเชอโดยวธยอมสและตรวจดดวยกลองจลทรรศน (direct microscopy)

2. การตรวจหาเชอโดยการเพาะเลยงเชอ (culture)

กำรตรวจหำเชอโดยวธยอมสและตรวจดดวยกลองจลทรรศน (direct microscopy)

การตรวจหาเชอทนกรด (AFB) ดวยกลองจลทรรศนธรรมดา (light microscope) โดยวธ direct smear ในผทม

อาการสงสยวณโรคปอด คอการไอเรอรงเกน 2 สปดาห และ/หรอมภาพเอกซเรยปอดผดปกต ซงนอกจากเพอการ

วนจฉยโรคแลว กเพอตรวจหาผปวยทอยในระยะแพรเชอดวย การตรวจหาเชอทนกรด (AFB) ดวยกลองจลทรรศน

นยงเปนวธหลกของการควบคมวณโรค ซงสถานบรการสาธารณสขทกระดบทงโรงพยาบาลศนย โรงพยาบาลทวไป

รวมถงโรงพยาบาลชมชน สามารถใหบรการตรวจเสมหะดวยกลองจลทรรศนใหกบประชาชนผมอาการสงสย

วณโรคไดทวประเทศ

เหตผลกำรสงเสมหะตรวจ

การควบคมวณโรคตามแนวทางขององคการอนามยโลกไดก�าหนดเหตผลหรอวตถประสงคของการสงเสมหะ

ตรวจทางหองปฏบตการไว 2 ประการคอ

1. เพอการวนจฉยโรคและแบงประเภทของคนไข

2. เพอการตดตามผลการรกษา


1. เพอกำรวนจฉยโรคและแบงประเภทของคนไข

โดยก�าหนดใหใชกบผปวยใหมทยงไมขนทะเบยนสงรกษาตรวจเสมหะ 3 ตวอยางตดตอกน ซงประกอบ

ดวย spot sputum และ collection sputum น�าผลการตรวจทไดมาพจารณาดงน

1.1 ผปวยใหมเสมหะบวก หมายถง ผปวยทมผลการตรวจเสมหะพบเชออยางนอย 2 ใน 3 ตวอยาง

หรอพบเชอเพยง 1 ตวอยาง แตมภาพเอกซเรยปอดทแพทยวนจฉยวาเปนวณโรคและมอาการรนแรง

1.2 ผปวยใหมเสมหะลบ หมายถงผปวยทมผลการตรวจเสมหะไมพบเชอทง 3 ตวอยาง แตมภาพ

เอกซเรยปอดทแพทยวนจฉยวาเปนวณโรค

2. เพอกำรตดตำมผลกำรรกษำ

โดยก�าหนดใหใชกบผปวยทขนทะเบยนรกษาแลวสงเสมหะตรวจซงจะเปน spot sputum หรอ collection

sputum กไดตามระยะเวลาดงน คอ

2.1 เมอสนสดระยะ intensive phase หรอสนสดเดอนท 2 หรอเดอนท 3 เพอด conversion rate

(อตราการเปลยนแปลงของเสมหะจากพบเชอเปนไมพบเชอ)

2.2 เมอขนเดอนท 5 หรอสนสดเดอนท 5 ของการรกษา เพอดวาการรกษาลมเหลวหรอไม หาก

ตรวจพบเชอแสดงวาการรกษาลมเหลวตองเปลยนยาใหม

2.3 เมอสนสดการรกษา เพอดวาผปวยหายหรอไม โดยเสมหะจะตองตรวจไมพบเชอในครงน

ชนดของเสมหะและจ�ำนวนครงทสงตรวจ

เสมหะทเกบจากผปวยม 2 ชนดคอ spot และ collection sputum

spot sputum คอเสมหะทเกบทนท เมอผปวยมาพบแพทยทสถานพยาบาล และ collection sputum คอเสมหะท

เกบหลงตนนอนตอนเชากอนลางหนาแปรงฟน จะเปนเสมหะทดในการใชตรวจหาเชอ เนองจากมการสะสมของ

เชอในหลอดลมตลอดทงคน ผปวย 1 รายควรเกบเสมหะสงตรวจ 3 ตวอยางตางวนกน และอยางนอยตองม

collection sputum 1 ตวอยางดงนคอ

ตวอยางท 1 เปนตวอยางทใหผปวยเกบเสมหะทนท (spot sputum) เมอมาพบแพทยครงแรก

ตวอยางท 2 เปนตวอยางทผปวยเกบเสมหะตอนเชาหลงตนนอนตอนเชา (collection sputum)

ตวอยางท 3 เปนตวอยางทใหผปวยเกบเสมหะทนท (spot sputum) เมอน�าเสมหะตวอยางท 2 มาสงหนวยตรวจ

กำรปำยเสมหะบนกระจกสไลด

ใชไมเขยเสมหะสวนทเปนกอนเมอกเหนยวสขนเขมใหตดปลายไมขนมา ปายลงตรงกลางแผนกระจกสไลดท

ใหมและสะอาด ละเลงเกลยเสมหะใหเปนแผนบางๆสม�าเสมอ ไมบางหรอหนาเกนไปใหไดขนาดประมาณ 2x3 cm

แลวทงไวใหแหง จากนนน�าไปผานเปลวไฟ 3-4 ครง โดยใหดานทละเลงเสมหะอยดานบน เพอตรงใหเสมหะตด

แนนกบกระจกสไลด เพอเวลายอมสจะไดไมหลดออก น�าสไลดทตรงแลวนไปยอมสตามวธตอไปน

- วางเรยงกระจกสไลดบนคานยอม เวนระยะหางกน 0.5 - 1 cm

- ราดส 1% carbol fuchsin ใหทวมแผนกระจกสไลด

- ลนไฟใตสไลดใหสรอน จนกระทงสงเกตเหนมไอเกดขนบนแผนสไลด (ระวงอยาใหเดอด) แลว

ปลอยทงไวใหเยนประมาณ 5 นาท


- ลางดวยน�าสะอาด เทน�าทคางบนสไลดออกใหหมด

- ฟอกสดวยน�ายา 3% acid alcohol จนกระทงสแดงของ carbol fuchsin หลดออกหมด โดยการราดน�ายา

3% acid alcohol ใหทวมสไลดทงไว 2 นาท ลางดวยน�า หากสแดงยงออกไมหมดใหท�าซ�าอกครงหนง

- ลางดวยน�าสะอาด เทน�าทคางบนสไลดออกใหหมด

- ยอมทบโดยการราดดวยส 0.3% methylene blue ใหทวมสไลด แชทงไว 10 วนาท

- ลางน�าใหสะอาดทงดานหนาและดานหลงกระจกสไลด

- น�ามาตงผงลมใหแหง และตรวจดดวยกลองจลทรรศนใชหว oil immersion objective lens (x 100)

จะเหนตวเชอตดสแดงบนพนสน�าเงน

กำรตรวจสไลดทยอมสแลวดวยกลองจลทรรศน

การตรวจสไลดทยอมสแลวดวยกลองจลทรรศน มขนตอนดงตอไปน

- ใชก�าลงขยาย x10 ตรวจดบรเวณทมเซลลเมดเลอดขาว ไมใชบรเวณทม epitherial cell

- หยด oil immersion ลงบนแผนสไลด ระวงอยาใหสวนหนงสวนใดของอปกรณแตะหรอสมผส โดน

แผนสไลด

- หมนหวเลนซกก�าลงขยาย x100 เขาแทนท

- ปรบความคมชดของภาพ โดยการเลอนแผนสไลดออกหางจากเลนซวตถเสมอ

- อานโดยเรมจากตรงกลางรมสดของวงเสมยรจากซายไปขวา หรอขวาไปซาย ภาพเชอทเหนผานเลนซ

ก�าลงขยาย x100 จะตดสแดง ลกษณะเปนแทงยาวเดยวๆ หรออยเปนค หรอเปนกลม

หลกเกณฑกำรอำนและรำยงำนผลสไลดทยอมสดวยวธ Ziehl-Neelsen

- สไลดทตรวจพบเชอจ�านวนมาก (>10 AFB/วงกลอง) การรายงานผล “AFB 3+” จะตองอานสไลดใหได

อยางนอย 20 วงกลอง จงจะรายงานผลได

- สไลดทตรวจพบเชอจ�านวนปานกลาง (1-10 AFB/วงกลอง) การรายงานผล “AFB 2+” จะตองอานสไลดให

ไดอยางนอย 50 วงกลอง จงจะรายงานผลได

- สไลดทตรวจพบเชอจ�านวนนอย (10-99 AFB/100 วงกลอง) การรายงานผล “AFB 1+” จะตองอานสไลดให

ไดอยางนอย 100 วงกลอง จงจะรายงานผลได

- สไลดทตรวจพบเชอจ�านวนนอยมาก (1-9 AFB/100 วงกลอง) การรายงานผล “นบจ�านวนเชอ AFB ทพบ”

จะตองอานสไลดใหไดอยางนอย 100 วงกลอง จงจะรายงานผลได

- สไลดทตรวจไมพบเชอ การรายงานผล “Negative” จะตองอานสไลดใหไดอยางนอย 100 วงกลอง จงจะ

รายงานผลได ซงหมายถง negative เฉพาะทอานดใน 100 วงกลองนเทานน ไมไดหมายรวมถงตวอยางเสมหะ

ทน�ามาตรวจทงหมด

การพบเชอตงแต 1 ตวขนไป กสามารถรายงานวา “Positive” ไดโดยยดหลกการอานผลขางตน และรายงานผล

ตามตารางขางลางน


ตำรำงท 5.10-1 แสดงวธรำยงำนผลกำรตรวจสไลดดวยกลองจลทรรศนแบบ Grading วธ Ziehl – Neelsen

จ�ำนวนเชอ AFB กำรรำยงำนผล

0 AFB / 100 วงกลอง Negative

1 - 9 AFB / 100 วงกลอง นบจ�านวน AFB ทพบ

10 – 99 AFB / 100 วงกลอง 1+

1 - 10 AFB / วงกลอง 2+

>10 AFB / วงกลอง 3+

วธกำรยอมสเรองแสงดวย Auramine O ตำมวธ Fluorescent Acid-Fast Staining

- วางเรยงสไลดบนคานยอมส เวนระยะหางระหวางแผนสไลด 0.5–1 cm

- ราดส auramine O solution จนทวมทงแผนสไลด ทงไว 10 นาท

- ลางดวยน�าสะอาด เทน�าทคางบนแผนสไลดออกใหหมด

- ฟอกสดวย 1 % acid alcohol นาน 2 นาท จนกระทงส auramine O หลดออกหมด

- ลางออกดวยน�าสะอาด เทน�าทคางบนแผนสไลดออกใหหมด

- ยอมทบดวยน�ายา 0.5 % potassium permanganate นาน 2 นาท

- ลางดวยน�าสะอาด ผงใหแหง

- น�าไปตรวจดวยกลองจลทรรศนชนดเรองแสง (fluorescence microscope) โดยใช low power objective lens

(x20) จะเหนตวเชอตดสเรองแสงสเหลองทองบนพนสด�า

ตำรำงท 5.10-2 แสดงวธรำยงำนผลกำรตรวจสไลดดวยกลองจลทรรศนแบบ Grading วธ Fluorescent

acid- fast staining ดวย objective lens x20

จ�ำนวนเชอ AFB กำรรำยงำนผล

0 AFB / 30 วงกลอง Negative

1 - 29 AFB / 30 วงกลอง นบจ�านวน AFB ทพบ

>29 AFB / 30 วงกลอง 1+

1 - 10 AFB / วงกลอง 2+

>10 AFB / วงกลอง 3+

การรายงานผลการตรวจดวยกลองจลทรรศนจะรายงานไดเพยงวาพบเชอ AFB เทานน และหองชนสตร ควร

จดท�าสมดทะเบยนการตรวจเสมหะหาเชอวณโรค โดยเฉพาะแยกจากการตรวจสงสงตรวจอนๆ เพอเปนหลกฐาน

การตรวจ สะดวกในการตรวจสอบ และท�ารายงาน การจะรายงานวาเปนเชอวณโรค หรอเชอมยโคแบคทเรยอนๆ


ตองน�าไปเพาะเลยงเชอและท�าการทดสอบเพอพสจนยนยนชนดตอไป ในหอง ปฏบตการทไมสามารถท�าเพาะเลยง

เชอได การตรวจพบเชอทนกรด (AFB) ดวยกลองจลทรรศนเพยงอยางเดยว กสามารถชวยในการวนจฉยโรคได แต

จะตองมจ�านวนเชอมากพอถง 10,000 ตว/เสมหะ 1 ml จงจะพบไดโดยวธน ความแมนย�าของการตรวจขนอยกบ

ความช�านาญของผตรวจ การพบเชอใน smear แสดงวาผปวยเปนวณโรคและอยในระยะแพรเชอทตองใหการรกษา

ทนท เพอตดวงจรการแพรกระจายเชอ จ�านวนเชอ AFB ทพบแสดงถงความรนแรงของการตดเชอในผปวย จงเปน

ความส�าคญอยางยงทจะตองอานและรายงานสงทตรวจพบใหถกตองมากทสด

กำรวนจฉยโดยวธกำรเพำะเลยงเชอ

วตถประสงคของกำรท�ำเพำะเลยงเชอ

1. เพอการคนหาผปวยจากสงสงตรวจทไมสามารถตรวจหาดวยวธกลองจลทรรศนได

2. เพอยนยนความมชวตของเชอวณโรค

3. เพอเพมปรมาณและพสจนชนด โดยการทดสอบคณสมบตทางกายภาพ และทางชวเคม

4. เพอทดสอบความไวของเชอวณโรคตอยาเพอใชเปนแนวทางในการรกษาอยางมประสทธภาพ

5. เพอเฝาระวงการดอยาวณโรคในชมชน หรอในพนทพเศษเฉพาะ เชน ในเรอนจ�า และบรเวณชายแดน เปนตน

กำรสงสงสงตรวจเพำะเชอ ใหสงในรำยตอไปน

1. ในรายทเปนผปวยใหม

1.1 เมอตรวจเสมหะดวยกลองจลทรรศนไมพบเชออยางนอย 3 ครงขนไป

1.2 เมอสงสยเชอดอยา

1.3 เมอมประวตสมผส หรอใกลชดกบผปวยดอยาหลายขนาน หรอตดเชอ HIV

1.4 เมอมการเฝาระวงการดอยารกษาวณโรค

2. ในรายทก�าลงตดตามการรกษา

2.1 เมอสนสดระยะเขมขน (เดอนท 2) ตรวจเสมหะดวยกลองจลทรรศนพบเชอ AFB

2.2 เมอสนเดอนท 5 หรอในเดอนสดทายของการรกษา เสมหะยงตรวจพบเชอ AFB ดวยกลองจลทรรศน

2.3 เมอจะประเมนวาผปวยหายจากการเปนวณโรค

อำหำรเลยงเชอทนยมใชประกอบดวย

1. อาหารแขงทมสวนประกอบของไข

1.1 Lowenstein Jensen media

1.2 2% Ogawa media

2. อาหารแขงทมสวนประกอบของวน เชน Middlebrook 7H11

3. อาหารเหลว

3.1 Middlebrook 7H9

3.2 BBL MGIT


การเพาะเชอวณโรคจ�าเปนอยางยงทจะตองปฏบตในตปลอดเชอ BSC class II ทมระบบการดแลบ�ารงรกษา

อยางด และตองก�าจดเชอแบคทเรยอนๆทปนเปอนมากบสงสงตรวจกอนทจะน�าไปเพาะเลยงเชอ เรยกวาขบวนการ

decontamination procedure โดยมากมกจะใชกบเสมหะ หนอง และอนๆ แตถาเปนตวอยางทเกบมาดวยวธ aseptic

technique เชน CSF กสามารถเพาะลงบนอาหารเลยงเชอ Lowenstein Jensen ไดโดยตรง การเพาะเลยงเชอยงม

ประโยชนในการจ�าแนกชนดของเชอวณโรคออกจากเชอมยโคแบคทเรยอนๆได และสามารถน�าเชอทเพาะเลยงได

ไปท�าทดสอบความไวตอยาได อาหารเลยงเชอทนยมใชกนมากคอ Lowenstein-Jensen และ 2% Ogawa medium

ซงอาหารทงสองชนดนจะมไขเปนสวนประกอบทส�าคญ แตในปจจบนมการเพาะเลยงเชอในอาหารเหลว BBL

MGIT ทใชกบเครองเพาะเลยงเชออตโนมต Bactec MGIT 960 ทตรวจหาการเจรญของเชอโดยใชหลกการของ

Oxygen consuming ทสามารถตอบผลทรวดเรวกวาการเพาะเลยงเชอบนอาหารแขง แตมราคาแพงกวา

น�ำยำทใชในกำรก�ำจดเชอปนเปอน (digestion - decontamination solution)

1. 4% NaOH

2. NALC-2% NaOH (N-Acetyl-L-cysteine-2% sodium hydroxide)

วธเพำะเลยงเชอวณโรคแบบงำย (TB simple culture method)

วธนใชไดผลดเฉพาะกบสงสงตรวจทตรวจพบเชอดวยกลองจลทรรศนเทานน และไมตองใชเครองปนตกตะกอน

สามารถปฏบตไดดงน

1. ถายเสมหะจากถวยเกบเสมหะใสในขวดแกว McCartney

2. เตมน�ายา 4% NaOH ลงในขวดบรรจเสมหะ ในอตราสวน 1:1 ของปรมาณเสมหะ ถาตวอยางเสมหะม

ความหนด เหนยว และความสกปรกมาก กใหเพมสดสวนของน�ายา 4% NaOH เปน 1:2 ได

3. ปดฝาขวดใหแนน ผสมใหเขากนดดวยเครอง vortex mixer และตงทงไว 15 นาท

4. เมอครบก�าหนดใช pasteur pipette ทผานการฆาเชอแลวดดสารแขวนลอยทเตรยมไดหยดลงบนอาหาร

เลยงเชอ 2% Ogawa 2 ขวดๆละ 100 μlหรอประมาณ 4 หยด

5. น�าเขาตอบเชออณหภม 35-37 °C นาน 8 สปดาห และน�าออกมาอานผลทกสปดาหจนมการเจรญของ

เชอเกดขนมลกษณะแหง ขรขระ ขนาด 2-3 mm คลายดอกกระหล�า เรยกลกษณะแบบนวา eugonic type

แตถาโคโลนมลกษณะกลม แบน เรยบ และขนาด 1-2 mm จะเรยกวา dysgonic type ซงจะเปนลกษณะ

ของเชอมยโคแบคทเรยอนๆทไมใชเชอวณโรค


วธเพำะเลยงเชอวณโรคแบบมำตรฐำนบนอำหำรแขง (TB conventional culture method)

วธนใชไดกบเสมหะทงชนดพบเชอและไมพบเชอ รวมทงตวอยางอนๆ เชน pus, plural effusion, tissue biopsy,

gastric lavage เปนตน ส�าหรบสงสงตรวจทเปนเสมหะสามารถปฏบตไดดงน

1. ถายเสมหะจากภาชนะบรรจใสในหลอดปน (sterile centrifuge tube) ขนาด 50 ml ปรมาณของเสมหะ

ตองไมเกน 10 ml

2. เตมน�ายา NALC- 2% NaOH ลงในขวดบรรจเสมหะ ในอตราสวน 1:1 ของปรมาณ เสมหะ ปดฝาหลอด

ใหแนน น�าไปเขยาผสมใหเขากนดวยเครอง vortex mixer นานไมเกน 30 วนาท

3. ตงทงไว 15 นาท

4. เปดฝาหลอด เตมน�ายา phosphate buffer saline pH 6.8 ใหถงระดบ 50 ml

5. น�าเขาเครองปนตกตะกอนความเรวสงปรบอณหภม (high speed refrigerate centrifuge) ปนท

ความเรว 3,000 x g นาน 20 นาท เทสวนใสทงลงในภาชนะเฉพาะดวยความระมดระวง

6. เตม 1 หยดของน�ายา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกบตะกอนทได

7. ใช pasture pipette ทผานการฆาเชอแลวดดสารแขวนลอยทเตรยมไดหยดลงบนอาหารเลยงเชอ

Lowenstein-Jensen (LJ) 2 ขวดๆละ 100 μl หรอประมาณ 4 หยด

8. น�าเขาตอบเชออณหภม 35-37 °C นาน 8 สปดาห และน�าออกมาอานผลทกสปดาหจนพบการเจรญ

ของเชอ

9. บนทกระยะเวลาทตรวจพบการเจรญ จ�านวน และลกษณะของโคโลน

กำรเพำะเลยงในอำหำรเหลว BBL MGIT

1. ถายเสมหะจากถวยเกบเสมหะใสในหลอดปน (sterile centrifuge tube) ขนาด 50 ml ปรมาณของเสมหะ

ตองไมเกน 10 ml

2. เตมน�ายา NALC- 2% NaOH ลงในขวดบรรจเสมหะ ในอตราสวน 1:1 ของปรมาณเสมหะ ปดฝาหลอด

ใหแนนน�าไปเขยาผสมใหเขากนดวยเครอง vortex mixer นานไมเกน 30 วนาท


4. เปดฝาหลอด เตมน�ายา phosphate buffer saline pH 6.8 ใหถงระดบ 50 ml

5. น�าเขาเครองปนตกตะกอนความเรวสงปรบอณหภม (high speed refrigerate centrifuge) ปนทความเรว

3,000 x g นาน 20 นาท ในภาชนะปนชนด aerosol free protection

6. ระหวางทรอเวลาใหเตรยมเขยนหมายเลขขางหลอด BBL MGIT tube และเตรยมสารละลาย supplement

PANTA โดยดดสารละลาย supplement ปรมาตร 15 ml ละลายผง PANTA lyophilized เขยาใหเขากน

7. เมอครบเวลา 20 นาท น�าหลอดปนมาเทสวนใสทงลงในภาชนะเฉพาะดวยความระมดระวง

8. เตม 1 ml ของน�ายา phosphate buffer saline pH 6.8 ผสมกบตะกอนทได

9. เตม dissolved supplement PANTA ลงใน BBL MGIT ปรมาตร 0.8 ml แลวเตม 0.5 ml ของตะกอนทได

ปดฝาหลอดใหแนน คว�าหลอดไปมา 2–3 ครง เชดหลอดดวยน�ายาฆาเชอ

10. น�าเขาเครอง Bactec MGIT 960 โดยดงลนชกตออก แลวปฏบตตามวธทระบในคมอ โดยกดปม icon

บนหนาจอทเปนรปสญญาลกษณหลอดทมลกศรชลง น�าหลอดทดสอบไปผานเครองสแกน barcode


สงเกตชองในลนชกทใสหลอดทดสอบ คว�าหลอด 2–3 ครง แลวใสหลอดทดสอบในชองทมไฟกระพรบ

สเขยว ท�าแบบนจนครบจ�านวนตวอยางทเตรยมไว

11. ปดลนชกใหสนท เครอง Bactec MGIT 960 จะตรวจเชคการเจรญของเชอมยโคแบคทเรย บนทก

และจดพมพรายงาน

กำรพสจนชนดของเชอมยโคแบคทเรย

ตำรำงท 5.10-3 ลกษณะตำงๆทใชส�ำหรบแยกเชอวณโรคออกจำกเชอมยโคแบคทเรยอนๆ (NTM)

ลกษณะ M. tuberculosis NTM

1. อตราการเจรญเตบโต > 7 วน นอยกวา หรอมากกวา 7 วน

2. อณหภม 35-37 °C 25- 45 °C

3. ลกษณะโคโลนบนอาหารแขง แหง ขรขระคลายดอกกระหล�า มทงแหง ขรขระ และเรยบ

4. สของโคโลน แบบ Eugonic แบบ Dysgonic

5. Niacin test คลายสฟางหญาแหง ครม เหลอง สม หรอ ชมพ

6. Nitrate reduction test + -

7. Catalase 68 °C test + +/ -

8. Cord formation - +

9. การเจรญบนอาหาร L-J ทผสม

PNB ความเขมขน 500 µg/ml

+

-

-

+

10. Immunochromatography Assay

(SD-Bioline)

+ -

เมอแยกเชอวณโรคออกจากเชอ NTM ไดแลว ขนตอนตอไปตองพสจนชนดของเชอ NTM โดยท�าการทดสอบ

คณลกษณะตางๆ เชน growth rate, growth at different temperature (25 °C , 37 °C, 42 °C, 45 °C), pigment in the

dark, photoreactivity, nitrate reduction test, catalase 68 °C, 20 min test, semi-quantitative catalase test,

arylsulfatase 3 and 14 days test, Tween 80 hydrolysis 3 and 14 days test, tellurite reduction 3 and 14 days test,

iron uptake, growth on L-J contain 5% NaCl เปนตน ซงการทดสอบลกษณะตางๆเหลานสามารถท�าไดในหอง

ปฏบตการอางองของกลมปฏบตการอางองชนสตรวณโรคแหงชาต หองปฏบตการของสมาคมปราบวณโรคแหง

ประเทศไทยในพระบรมราชปถมภ หองปฏบตการของโรงพยาบาลมหาวทยาลยตางๆ และหองปฏบตการของ

สถาบนโรคทรวงอก เปนตน


กำรเพำะเลยงเชอวณโรคจำกสงสงตรวจทไมใชเสมหะ

gastric lavage และชนเนอ gastric lavage ตองด�าเนนการตรวจภายใน 4 ชม. นบตงแตเกบตวอยาง ชนเนอ

(biopsy tissue) กรณเปนชนเนอขนาดใหญ ใหใชกรรไกร (sterile scissor) ตดออกเปนชนเลกๆใชทบดเชอ (sterile

tissue grinder) บดเนอเยอทสงตรวจในน�าเกลอปราศจาก เชอ 2 - 5 ml แลวด�าเนนการตรวจสงสงตรวจทงสองชนด

ดงน

1. เกบสวนใสในหลอดปน (centrifuge tube) ขนาด 50 ml ในปรมาตรไมเกน 10 ml

2. ปนตกตะกอนทความเรว 3000 x g นาน 15 นาท ในภาชนะปนชนด aerosol free protection

3. หลงจากนน เทสวนใสทงและละลายตะกอนดวยน�ากลนฆาเชอปรมาตร 2-5 ml

4. เตมสารละลาย NALC - 2% NaOH ในอตราสวน 1:1 ผสมใหเขากน และเอยงหลอดไปมาเพอให

สารละลาย NALC - 2% NaOH สมผสภายในหลอดและฝาหลอดใหมากทสด


6. เตมสารละลาย phosphate buffer salime pH 6.8 ใหถงระดบ 50 ml

7. ปดฝาหลอดใหแนน น�าไปปนตกตะกอนทความเรว 3000 x g นาน 15 นาท ในภาชนะปนชนด aerosol

free protection อกครงหนง

8. เทสวนใสทงและละลายตะกอนดวยน�ากลนฆาเชอปรมาตร 1-2 ml ผสมใหเขากนดดวย pasture

pipette 1 ml แลวเจอจาง 1:10 เพอลดความเปนพษของสารละลาย NALC-2% NaOH

9. Inoculate 0.1 ml ของสารละลายทเจอจางและไมเจอจางลงบนอาหารเลยงเชอ Lowenstein -Jensen media

และ Middlebrook 7H11

10. น�าไปเกบในตอบเชอทอณหภม 35-37 °C

11. อานผลทกสปดาห จนครบ 8 สปดาหถาพบการเจรญของเชอใหท�าการ/สงตอเพอวนจฉยเชอและ

ทดสอบความไวตอไป

เลอด (blood)

1. น�าเลอด 20 ml ใสลงในอาหารเหลวชนด Middlebrook 7H9 20 ml

2. น�าไปเกบในตอบเพาะเชอทอณหภม 35-37 °C เขยาดวยมอทกวนๆละครง

3. ท�า smear ยอมสทกสปดาห

4. ถาพบเชอ AFB น�าอาหารเหลวนนมา inoculate ลงบนอาหารแขง L-J 2 ขวด

5. น�าไป อบทอณหภม 35-37 °C

6. อานผลทกสปดาห จนครบ 8 สปดาห


กำรเตรยมสยอมและอำหำรเลยงเชอ

1. วธเตรยมน�ายาสยอมแบบ Ziehl-Neelsen

ก. น�ายา 1% Carbol fuchsin

- Basic fuchsin powder 1.0 g

- Ethanol 95% 10.0 ml

(ละลายสวนผสมทงสองเขาดวยกน).....................(A)

- Phenol crystals 5.0 g

- Distilled water 95.0 ml

(ละลายผลก phenol กอนเตมน�ากลน)...................(B)

ผสม 90 ml ของสารละลาย (B) ในสารละลาย (A)

น�ายาสยอม carbol fuchsin ทไดนตองกรองหลงจากเตรยมเสรจ และเกบในทมด ซงสยอมทเตรยมแตละ

ครงควรใชใหหมดภายใน 6 เดอน

ข. น�ายาฟอกส 3% Acid alcohol

- Hydrochloric acid (conc.) 97.0 ml

- Ethanol 95% 3.0 ml

(ผสมสารทงสองสวนเขาดวยกน)

ค. สยอมทบ 0.3% Methylene blue

- Methylene blue 0.3 g

- Distilled water 100.0 ml

(ผสมสารทงสองจนละลายเขากนด)

ตำรำงท 5.10-4 วธเตรยมอำหำรไขทงชนด Lowenstein-Jensen (LJ) และ 2% Ogawa medium

สวนประกอบ Lowenstein-Jensen (LJ) 2% Ogawa medium

1. Monopotassium dihydrogen phosphate 0.4 g 2 g

2. Magnesium sulfate 0.04 g -

3. Magnesium citrate 0.1 g 0.1 g

4. Asparagine 0.6 g -

5. Sodium glutamate - 0.5 g

6. Glycerol 2 ml 4 ml

7. Distilled water 100 ml 100 ml

8. 2% Malachite green solution 3.3 ml 4 ml

9. Homogenized whole eggs 167 ml 200 ml


วธเตรยมอำหำร Lowenstein-Jensen (LJ) หรอ 2% Ogawa medium

ละลายสวนประกอบอนดบท 1 - 7 (แลวแตชนดของอาหารทจะเตรยม) น�าเขา autoclave ปลอยทงไวใหเยนแลว

น�ามาเตม 2% malachite green solution ตามสวน น�าสารละลายนมาผสมกบ homogenized whole eggs เขยาให

เขากน ตงทงไว 30 นาท แบงใสขวด McCartney ขวดละ 7 ml น�าเขาตนงอาหารระบบไอน�ารอน (inspissator) ท

อณหภม 85-90 °C ในสภาพเอยง (slant) เปนเวลา 45 นาท เพอท�าใหไขสก อาหารจะแขงตามตองการ จากนนน�า

เขาตอบ 35-37 °C นาน 48 ชม. เพอเชค sterility แลวน�าไปเกบในถงพลาสตก มดปากถงใหแนน เกบไวในตเยน

จนกวาจะใชงาน

วธเตรยม Homogenized whole eggs

น�าไขไกสดประมาณ 10 ฟอง มาลางน�าและขดผวไขใหสะอาดดวย 70% alcohol ปลอยใหแหง แลว เชดดวย

น�ายา 70% alcohol น�ามาวางเรยงบนภาชนะทสะอาด ตอกไขใสภาชนะเชน plate หรอ beaker เพอตรวจสอบ

คณภาพของไข จากนนน�าไปเทลงในเครองปน (Blender) ตไขใหเขากน เทใสกระบอกตวงโดยผานผากรองทผาน

การฆาเชอแลวใหไดปรมาณทตองการ

วธเตรยม 2% Malachite green solution

ชงผง malachite green 2 g ละลายในน�ากลน 100 ml

เอกสารอางอง 1. Kent PT and Kubica GP. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory Center for

Disease Control, Atlanta, Georgia. 1985.

2. Kudoh S and Kudoh T. Simple Technique for Culturing Tubercle Bacilli. Bull WHO. 1974; 51:7-12.

3. Smithwick RW. Laboratory Manual for Acid fast Microscopy. 2nd ed. Center for Disease Control,

Atlanta, Georgia. 1976.

4. The Public Health Service National Tuberculosis Reference Laboratory and the National Laboratory

Network. IUATLD 1998, ISBN 2-9504238-7-6

5. Vestal AL. Procedure for the Isolation and Identification of Mycobacterium. Department of health

Education and welfare, UPH , Atlanta, Georgia. 1977.

6. ชยเวช นชประยร. วณโรคปฏบตการ. สมาคมปราบวณโรคแหงประเทศไทยในพระบรมราชปถมภ กรงเทพมหานครฯ:

โรงพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย; 2529.


5.11 การวนจฉยเชอราทพบบอยณฎฐวรรณ ปนวน

โรคตดเชอราสวนใหญ มสาเหตมาจากราฉวยโอกาส ผปวยทมภมคมกนต�า ผปวยเบาหวาน ผปวยตอม

พาราไทรอยดท�างานไดนอย ผปวยทไดรบยาเปนพษตอเซลล ยากดภมคมกน สารตานจลชพ ฮอรโมน จะท�าให

ราฉวยโอกาสเพมจ�านวนมากขน และเกดโรครนแรงขน ตวอยางราฉวยโอกาสประเภทราสาย (molds) ไดแก

Aspergillus, Mucor และ Rhizopus ซงพบไดไมบอยนก ประเภทยสต ไดแก Cryptococcus neoformans และ

Candida albicans ราบางชนดมคณสมบตเปนราสองรป (dimorphic fungi) คอมรปรางแบบราสาย เมอเจรญอย

ในสภาวะแวดลอมทอณหภมไมเกน 35 ºC และเปลยนรปรางเปนยสตเมอเจรญอยในสภาวะแวดลอมทอณหภม

ไมต�ากวา 35 ºC ตวอยางรา 2 รปทพบบอยในประเทศไทยคอ Penicillium marneffei และ Histoplasma

capsulatum โรคตดเชอราทพบบอยในผปวยเอดสและผปวย immunocompromised อนๆ ไดแก candidiasis,

cryptococcosis, penicillosis marneffei, และ histoplasmosis

1. กำรวนจฉย Candida albicans กอโรค Candidiasis

หลกกำร การตรวจสดสงสงตรวจในสารละลาย potassium hydroxide (KOH )10-30% หรอการยอมแกรมจะ

ท�าใหเหนลกษณะรปรางของ Candida albicans หรอ Candida spp. อนๆ ไดชดเจน และโคโลนทเพาะไดบนอาหาร

เลยงเชอ น�ามาทดสอบการสราง germ tube และการสรางสโคโลนบน CHROMagar Candida เพอวนจฉยและ

รายงานผล Candida แบบ presumptive identification Candida species อนๆทกอโรคไดนอกจาก C. albicans ไดแก

C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei และ C. glabrata เปนตน

สงสงตรวจ เยอบจากชองปาก เยอบจากหลอดอาหารหรอล�าไส เยอบจากชองคลอด เยอบหวใจ ผวหนง เลบ

ปสสาวะ สงสงตรวจจากระบบหายใจ เลอด


1. การตรวจสงสงตรวจโดยตรงทางกลองจลทรรศน

1.1 การตรวจสดดวยสารละลาย KOH

1.2 การยอมสแกรม (วธการเชนเดยวกบการยอมสแกรมแบคทเรย)

2 . การเพาะเชอ

เพาะสงสงตรวจบน SDA หรอ BA สงสงตรวจจากต�าแหนงทมเชอประจ�าถน (non sterile site) เพาะบน

SDA ทเตม chloramphenicol อบเชอทอณหภม 25-30 °C ตรวจดการเจรญของเชอ 24-48 ชม. ตรวจดลกษณะ

รปรางของเซลลทางกลองจลทรรศนโดยท�า mounting slide ดวย lactophenol aniline blue

3. การสราง germ tube

ใช loop ตกเชอจากโคโลนเดยวทเจรญบน SDA 24 ชม. เพาะลงในซรมของคนปรกตปรมาตร 0.5 ml อบ

ทอณหภม 37 °C เวลา 2.5-3 ชม. หยดเชอในซรมลงบนแผนสไลดแกวและปดทบดวย cover glass ตรวจดวย

กลองจลทรรศน


เชอควบคมคณภาพ positive control Candida albicans DMST 15313

negative control Candida tropicalis DMST 15195

4. การสรางสโคโลนบน CHROMagar Candida

ใชลปตกเชอจากโคโลนเดยวทเจรญบน SDA 24 ชม. streak บน CHROMagar Candida plate และ streak

เชอควบคมคณภาพลงบน plate เดยวกน อบเชอในทมดทอณหภม 35-37 °C นาน 24-48 ชม.

เชอควบคมคณภาพ Candida albicans DMST 15313…… โคโลนสเขยว (bright green)

Candida tropicalis DMST15195………โคโลนสน�าเงนอมเขยว (dull greenish blue)

Candida krusei DMST 15317…… โคโลนสชมพ (rose-colored)


1. การตรวจสดดวยสารละลาย KOH พบเซลลยสตเปนสใสๆ ไมมส เซลลยสตรปไข budding yeast อยรวมกบ

pseudohyphae

2. การยอมสแกรม เซลลยสตตดสแกรมบวก ลกษณะรปรางเชนเดยวกบการตรวจสดดวสารละลาย KOH

การตรวจสดสงสงตรวจผวหนงและเลบทางกลองจลทรรศนเพอตรวจหาเชอ Candida ใชการตรวจสด

ดวยสารละลาย KOH เหมาะสมกวาการยอมสแกรม

3. การเพาะเชอลกษณะของโคโลนบนอาหารเลยงเชอ SDA คลายครมสขาว ผวหนาเรยบเปนมน ตรงกลางนน

ลกษณะทางกลองจลทรรศน พบเซลลยสตรปไขหรอรปกลม และเซลลยสตทก�าลงแตกหนอ (budding

yeast cell) อาจพบลกษณะของ short pseudohyphae

4. การสราง germ tube ลกษณะของ germ tube เปนสายรปทรงกระบอกขนาดเสนผานศนยกลางสม�าเสมอ

ไมมรอยคอดตรงจดทงอกออกจากเซลลยสต เชอท germ tube positive นอกจาก C. albicans แลวยงม

C. dubliniensis ระยะเวลาทอานผลตองอยในชวง 2.5-3 ชม. เนองจาก Candida species อนๆ เชน

C. tropicalis สามารถสราง germ tube ไดหลงจากอบเพาะเชอไว เกน 3 ชม. และ C. albicans ทก isolate

ไมได สราง germ tube ไดทงหมด ดงนนการรายงายผล germ tube positive ของ C. albicans จดเปน

presumptive identification

5. การสรางสโคโลนบน CHROMagar Candida สโคโลนของยสตแตละ species แสดงในตาราง 5.11-1

การสรางสโคโลนบน CHROMagar จดเปน presumptive identification


ตำรำงท 5.11-1 สโคโลนของ Candida species บน CHROMagar Candida

Candida species สโคโลนบน CHROMagar Candida

Candida albicans bright green/ dark green

Candida dubliniensis dark green/ bright green

Candida tropicalis dull greenish blue

Candida krusei rose -colored

Candida parapsilosis pale purplish pink

Candida glabrata pale purplish pink

Candida guilliermondii Light purple

Candida famata dull greenish blue/ bright green


การตรวจสดดวยสารละลาย KOH และการยอมสแกรม เมอไดผลการตรวจสดหรอการยอมสแกรมรายงานให

แพทยทราบทนท

รายงานผลการตรวจสด “hyaline oval yeast cells , budding yeast cells with pseudohyphae suggestive for

candidiasis”

รายงานผลการยอมสแกรม “Gram positive oval yeast cells, budding yeast cells with pseudohyphae

suggestive for candidiasis”

การเพาะเชอ รายงานผลจากการทดสอบ germ tube และ การสรางสโคโลนบน CHROMagar Candida ซงเปน

presumptive identification

เชอ C. albicans สโคโลนเปนสเขยวบน CHROMagar Candida มบาง isolate สโคโลนจะเปนสเขยวเขม เชอ

C. dubliniensis สวนใหญสโคโลนจะเปนสเขยวเขม เปนสงสงตรวจจาก sterile site เชน เลอด การพบเชอ

C. dubliniensis ในกระแสเลอดพบไดนอย (rare cases)

รายงานผล การเพาะเชอ “Candida albicans, presumptive identification base on germ tube positive and bright

green colony on CHROMagar Candida.”

2. กำรวนจฉย Cryptococcus neoformans กอโรค Cryptococcosis

หลกกำร Cryptococcus neoformans เปนยสตทสรางแคปซลลอมรอบเซลล การตรวจสดสงสงตรวจทสงสย

โรค cryptococcosis ในอนเดยองค (india ink preparation) ท�าใหเหนเซลลยสตและแคปซลทลอมรอบไดชดเจน

เชอทเพาะไดบนอาหารเลยงเชอตรวจดแคปซลดวยอนเดยองคแลวท�าการทดสอบ urease เชอมคณสมบตในการ

hydrolyse urea เปน ammonia ได และน�าผลการทดสอบมาประกอบในการวนจฉย

สงสงตรวจ น�าไขสนหลง เลอด ไขกระดก เสมหะ น�าลางปอด ผวหนง ปสสาวะ ตอมน�าเหลอง มาม ตบ ไต

ตอมหมวกไต ตอมลกหมาก และตอมไทรอยด เปนตน



1. การตรวจสดสงสงตรวจใน india ink ทางกลองจลทรรศน

2. การเพาะเชอ สงสงตรวจทเปนของเหลวใชปรมาตรประมาณ 0.5 ml หยดบน SDA plate ถาเปนชนเนอ

ใชกรรไกรปราศจากเชอตดเปนชนเลกๆและใชคมคบปราศจากเชอคบชนเนอแตะลงบนผวหนาของอาหารเลยง

เชอ ลากเปนแนวซกแซกตดกน 2 ระนาบตลอดทวผวหนาของอาหารเลยงเชอ อบเชอทอณหภม 25-30 °C ตรวจ

ดการเจรญของเชอเมอครบ 48 ชม. ถายงไมพบการเจรญของเชอ ใหเกบไว 2 สปดาหจงทง plate รายงานผล

“no fungal growth”

3. การทดสอบ urease ใชลปตกโคโลนของเชอยสตทจะทดสอบ streak ลงบนผวหนาของ Christensen’s

urea agar slant อบเชอทอณหภม 25-30 °C. และ 37 °C. เวลา 24-48 ชม.

เชอควบคมคณภาพ positive control Cryptococcus neoformans DMST 15319

negative control Candida albicans DMST 15313


การตรวจสดสงสงตรวจในอนเดยองคทางกลองจลทรรศน (ดในบทท3)

การเพาะเชอ ลกษณะโคโลนบน SDA มลกษณะเปยกเปนมก ผวหนาเรยบเปนมน โคโลนสขาวและสเขม

ขนเปนสแทนเมออายมากขน บางครงจะพบลกษณะโคโลนทแหงแสดงวาเชอไมสรางแคปซลหรอสรางไดบางมาก

ลกษณะของเชอจากการตรวจสดในอนเดยองคทางกลองจลทรรศน จะเหนรปรางยสตและแคปซลแบบเดยวกน

แตแคปซลบางกวาทตรวจพบในสงสงตรวจ

การทดสอบ urease สของ urea agar เปลยนเปนสชมพเขมทง 2 อณหภม แสดงวาเชอททดสอบสามารถ

hydrolyse urea เปน ammonia ได อานผล urease บวก สของ urea agar ไมเปลยนสอานผล urease ลบ ทงนเปรยบ

เทยบผลกบ positive และ negative control เชอยสตทสรางแคปซลและใหผล urease บวกนอกเหนอจาก

Cryptococcus neoformans ไดแก Cryptococcus spp. และ Rhodotorula spp. แตมรายงานการกอโรคในคนคอน

ขางต�า เมอเปรยบเทยบกบ Cryptococcus neoformans


การตรวจสดสงสงตรวจใน india ink ตรวจพบ encapsulated yeast cells

รายงานผล “Yeast, presumptive Cryptococcus neoformans based on capsule production.”

หรอ “presence of budding, encapsulated yeast cells presumptive diagnosis of cryptococcosis”

การเพาะเชอ รายงานผล “Cryptococcus neoformans, presumptive identification base on budding,

encapsulated yeast cells and urease positive of primary culture.”


ขอเสนอแนะเพมเตมส�ำหรบ rapid identification ของเชอ Cryptococcus neoformans

การวนจฉยเชอ Cryptococcus neoformans นนอยางนอยหองปฏบตการของโรงพยาบาลศนยและโรงพยาบาล

ทวไปตองท�าการเพาะเชอ ท�า India ink preparation และทดสอบ urease ของ primary culture แตถาเพมการทดสอบ

phenoloxidase จะท�าใหการรายงานผลมความแมนย�าถกตองสงขน หองปฏบตการแหงใดสนใจทดสอบเพมเตม

ขอใหตดตอสอบถามไดท ฝายเชอราวทยา สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย โทร.

02 5899850 ตอ 99405 โทรสาร 02 5915449

กำรทดสอบ Phenoloxidase

Phenoloxidase activity เปนคณสมบตเฉพาะของ Cryptococcus neoformans ทแตกตางจาก Cryptococcus spp.

และยสตกอโรคอนๆ คอเชอสรางเอนไซม phenoloxidase ได (Cryptococcus บาง species สรางเอนไซม

phenoloxidase ไดแตสรางไดในปรมาณทนอยกวา C. neoformans) เอนไซมชนดนเปนตวเรงในการเปลยน substrate

ทเปนสารพวก phenolic compounds เชน caffeic acid, DOPA (dihydroxyphenylalanine) ใหเปน melanin like

pigment การทดสอบ phenoloxidase สามารถท�าการเพาะเชอลงบนอาหารเลยงเชอทเตม phenolic compounds เพอ

ใชทดสอบ phenoloxidase activity ไดแก DOPA medium modified caffeic acid-cornmeal agar และ

sunflower seed agar โคโลนของเชอ C. neoformans ทเจรญบนอาหารเลยงเชอทเตม phenolic compounds จะเปน

โคโลนสน�าตาลอานผลเปน phenoloxidase บวก หรอท�าการทดสอบโดยใชแผนทดสอบ phenol oxidase ฝายเชอ

ราวทยา สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย ท�าการทดสอบ phenoloxidase โดยใช

sunflower seed agar (ระยะเวลาทอานผลภายใน 24 ชม.) และแผนทดสอบ phenoloxidase โดย phenolic compounds

ทใชคอ สารสกดจากเมลดทานตะวน (ผลการทดสอบ เหนสน�าตาลถงสน�าตาลเขมทภายใน 4 ชม.) sunflower

seed agar ราคาถกและหาไดงายในประเทศ ซงหองปฏบตการของโรงพยาบาลทวประเทศสามารถน�าไปใชทดสอบ

เพมไดโดยจะไมกระทบกบราคาคาตรวจเดมแตเพมคณคาและคณภาพของการบรการใหแกแพทยผใหการรกษา

รวมทงผปวยดวย

3. กำรวนจฉย Penicillium marneffei กอโรค Penicillosis marneffei

หลกกำร

Penicillium marneffei เปนรา 2 รป (dimorphic fungi) ซงโดยปรกตเมอเจรญอยในดนหรอในสงแวดลอมอนๆ

ทอณหภมไมเกน 30 °C จะมลกษณะรปรางเปนโมลด (mold phase) เมอถกสดดมเขาไปในปอด อณหภมเปลยน

เปน 37 °C เชอจะปรบตวเขากบสภาพแวดลอมใหมโดยเปลยนรปรางเปนยสตในภาวะทกอโรค การตรวจสงสง

ตรวจโดยตรงโดยการยอมสแกรม ยอมส Giemsa หรอยอมส Wright และตรวจดดวยกลองจลทรรศนท�าใหเหน

ยสตเซลลของ P. marneffei ไดชดเจนและแยกออกไดงายขน การทดสอบรา 2 รป เชอเปลยนจาก mold phase ท

25-30 °C เปน yeast phase ท 37 °C ได


เลอด ไขกระดก ผวหนง น�าคดหลงจากระบบทางเดนหายใจ ตบ ตอมน�าเหลอง อจจาระ น�าไขสนหลง กระเพาะ

อาหารหรอล�าไสเลก และมาม เปนตน


วธปฎบตงำน

1. การตรวจสงสงตรวจโดยตรงทางกลองจลทรรศน การยอมสแกรม การยอมส Giemsa การยอมส Wright

ตรวจดดวยกลองจลทรรศน ก�าลงขยาย 10 X และ 100 X อยางนอยทสดขอใหท�าการยอมสแกรม

2. การเพาะเชอ อาหารเลยงเชอใช SDA และ BHI agar อบเชอทอณหภม 25-30 °C ตรวจดการเจรญของ

เชอเมอครบ 48 ชม. และตรวจดการเจรญทก 2-3 วน รอจนเชอเจรญ สงตอตรวจวนจฉย/ ยนยน (definitive

identification) ท สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย


การยอมแกรมเซลลยสตตดสแกรมบวก การยอมส Giemsa และการยอมส Wright การตดสไมสม�าเสมอ

สวนของ Polar ตดสน�าเงนเขม จะเหนนวเคลยส 2 นวเคลยสชดเจนในเซลลยสต สวนของผนงตดขวางเซลล

ไมตดส

เซลลยสตของ P. marneffei ตรวจพบไดทงภายในและภายนอก histiocytes รปรางและขนาดของเซลลยสต

มความหลากหลาย ไดแก เซลลรปกลมหรอรปไขขนาดประมาณ 2-3 µm เซลลรปยาวร (elongated cells) ขนาด

ประมาณ 2-3 X 2-6.5 µm ตรวจพบภายใน histiocytes เซลลยสตภายนอก histiocytes พบเซลลรปยาวคลายไสกรอก

(sausage-shaped) ความยาว 8-13 µm อาจพบเซลลยสตทเปนทอนโคงงอคลายกลวยหอม เซลลยสตของ

P. marneffei เพมจ�านวนโดยการสรางผนงตดขวางเซลล (binary fission) ซงเปนลกษณะเฉพาะของ P. marneffei

รปรางและขนาดของเซลลยสตทอยภายใน histiocytes มความแตกตางกบเซลลยสตทอย ภายนอก

histiocytes ไซต เซลลยสตทอยภายใน histiocytes จะมรปรางทเหมอนกนทกเซลลและขนาดใกลเคยงกนซงอาจ

จะเปนรปกลม รปไข หรอรปยาวร ซงจะใกลเคยงกบเซลลยสต Histoplasma capsulatum ท�าใหเกดการสบสนได

ตองตรวจหาลกษณะเฉพาะ binary fission yeasts ของ P. marneffei และ budding yeasts ของ H. capsulatum ให

พบ ในกรณทตรวจไมพบลกษณะเฉพาะของเชอ ตองด�าเนนการเพาะเชอเพอชวยในการวนจฉย

การเพาะเชอ โคโลนมลกษณะเปนจด คลายขผงสแดง จะปรากฏใหเหนหลงจากเพาะเชอได 2 วน ตอมา

สรางเสนใยเปนปยสขาวและสรางสารสแดงละลายในเนอวน ผวหนาโคโลนจะเปลยนเปนผงละเอยดสชมพเมอ

เชอมอายการเจรญได 7 วน การสรางสารสแดงละลายในเนอวนของ Penicillium marneffei บางครงอาจสรางได

นอยมากหรอไมสรางเลยบน primary culture, SDA, Lowenstein Jensen medium หรอ CA ซงอาจท�าใหเขาใจผด

ไดวาเปน contaminated mold ได


รายงานผลการตรวจสงสงตรวจทางกลองจลทรรศน “ Binary fission yeasts, Penicillium marneffei”

กรณทไมพบลกษณะเฉพาะรายงานผล “ Round yeast cells, oval yeast cell suggesting Penicillium marneffei or

Histoplasma capsulatum”

4. กำรวนจฉย Histoplasma capsulatum กอโรคฮสโตพลำสโมสส (Histoplasmosis)

หลกกำร การยอมแกรม การยอมส Giemsa และ การยอมส Wright จะท�าใหเซลลยสตของ Histoplasma

capsulatum มการตดสทจ�าเพาะ ท�าใหตรวจพบและแยกออกจากลกษณะอนๆในสงสงตรวจไดงายขน การตรวจด

ดวยกลองจลทรรศน และการเพาะเชอเพอตรวจดลกษณะโคโลนทมองเหนไดดวยตาเปลา จะแสดงลกษณะของ


H. capsulatum ซงคลอยตามกบลกษณะรปรางของเซลลยสตทตรวจพบจากการยอมสสงสงตรวจโดยตรง

H. capsulatum เปนรา 2 รปเชนเดยวกบ P. marneffei เชอเปลยนจาก mold phase ท 25-30 °C เปน yeast phase ท

37 °C ได

สงสงตรวจ ไขกระดก เลอด น�าคดหลงจากระบบหายใจ ตอมน�าเหลอง ตบ แผลทผวหนง น�าไขสนหลง และ

สมอง

วธปฎบตงำน

1. การตรวจสงสงตรวจโดยตรงทางกลองจลทรรศน การยอมแกรม การยอมส Giemsa และ การยอมส Wright

ตรวจดดวยกลองจลทรรศน ก�าลงขยาย 10 X และ 100 X อยางนอยทสดขอใหท�าการยอมแกรม

2. การเพาะเชอ อาหารเลยงเชอใช SDA , BHA agar อบเพาะเชอทอณหภม 25-30 °C ตรวจดการเจรญของ

เชอหลงจากเพาะเชอได 3 วน และหลงจากนนตรวจดการเจรญทก 2-3 วน รอจนเชอเจรญ สงตอตรวจวนจฉย/

ยนยน (definitive identification) ท สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย


การยอมแกรม เซลลยสตตดสแกรมบวก การยอมส Giemsa และ การยอมส Wright การตดสไมสม�าเสมอ

สวนของ cytoplasm ตดสน�าเงนออน และสวนของ polar ตดสน�าเงนเขม

ตรวจพบเซลลยสตรปกลม รปไข ม budding cells ขนาดของเซลลประมาณ 3-5 µm เซลลยสตมขนาดทเทา

กนและรปรางสม�าเสมอเหมอนกนเจรญอยภายใน macrophage ขนาดใหญหรอ giant cells

การเพาะเชอ H. capsulatum มการเจรญเตบโตชา หลงจากเพาะเชอไดประมาณ 3 สปดาห จะพบลกษณะโค

โลนเปนปยนนสขาวและสเขมขนเปนสน�าตาลออนเมอเชอมอายมากขน ทางดานลางของโคโลนเปนสน�าตาล


รายงานผลการตรวจสงสงตรวจทางกลองจลทรรศน “Round or oval yeast cells, budding yeast cells

suggesting Histoplasma capsulatum.”


เอกสารอางอง 1. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Introduction to Medical Mycology. In: Laboratory Diagnosis of

Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia, PA: Lippincott Williams

& Wilkins; 2008. p.489-506.

2. Engelkirk PG and Engelkirk DJ. Laboratory Diagnosis of Selected Fungal Infections. In : Laboratory

Diagnosis of Infectious Diseases : Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia, PA: Lippincott

Williams & Wilkins;2008. p. 507-540.

3. Hazen KC and Howell SA. Mycology and Antifungal Susceptibility Testing. In: Garcia LS. editor in

chief. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2007

Update. p. 8.3.1.1- 8.6.10.

4. Howell SA, and Hazen KC. Candida , Cryptococcus, and Other Yeasts of Medical Importance.

In: Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, editor. Manual

of Clinical Microbiology 10th ed. Vol 2. Washington, DC: ASM Press; 2011. p. 1793- 821.

5. Peng CF, Lee KM, Lee SH. Characterization of Two Chromogenic Media of Candida ID2 and

CHROMagar Candida for Preliminary Identification of Yeasts. J Biomed Lab Sci 2007;19(2):

63-69.

บทท6การทดสอบความไวของ

แบคทเรยตอสารตานจลชพ


การทดสอบความไวของแบคทเรยตอสารตานจลชพสวรรณา ตระกลสมบรณ

วนทนา ปวณกตตพร

สรางค เดชศรเลศ

หลกกำร

การทดสอบความไวของแบคทเรยตอสารตานจลชพ เปนการทดสอบทางหองปฏบตการเพอบงชวาแบคทเรย

กอโรคทแยกไดจากสงสงตรวจไวหรอดอตอสารตานจลชพใด เพอเปนแนวทางส�าหรบแพทยในการเลอกใชสาร

ตานจลชพในการรกษาผปวยอยางมประสทธภาพ วธการทดสอบมหลายรปแบบทงการวเคราะหเชงคณภาพและ

การวเคราะหเชงปรมาณ นอกจากนยงมการตรวจหาเอนไซมทท�าลายสารตานจลชพซงผปฏบตงานควรพจารณา

เลอกใชการทดสอบทเหมาะสม ใหท�าการทดสอบกบเชอกอโรคทไมสามารถคาดไดวาไวหรอดอตอยา ในกรณ

ตดเชอแบคทเรยททราบแนชดวาไวตอยาทใชรกษาเสมอ กไมจ�าเปนตองท�าการทดสอบกบยาชนดนน ไดแก

Streptococcus pyogenes ไวตอ penicillin เปนตน ยกเวนทดสอบเพอตดตามเฝาระวงการดอยา หรอกรณทสงสย

วาเปนเชอดอยาทอบตใหม

วธกำรทดสอบ

การทดสอบและการแปลผลของวธในบทน ด�าเนนตามมาตรฐานของ Clinical Laboratory Standard Institute

(CLSI) ส�าหรบเชอแบคทเรยเจรญเรว (rapid growing bacteria) เชอแบคทเรยเจรญยากและชา (fastidious

bacteria) และแบคทเรยไรอากาศ (anaerobes) หาก CLSI มหลกฐานทางวชาการใหมทจะตองปรบปรงวธการหรอ

การแปลผลจะมการแจงการปรบปรงในเอกสารทพมพใหมทกป ดงนนเปนความรบผดชอบของผปฏบตงานทจะ

ตองตดตามเอกสารของ CLSI ทเปนฉบบปจจบนเสมอ วธการทดสอบทท�าในหองปฏบตการมดงน

1 Disk diffusion หรอ Kirby Bauer’s method

2 MIC determination by broth dilution

3 β-lactamase tests

4 Extended-spectrum β-lactamases (esbl) detection

5 Carbapenemases (carbapenem-resistant Enterobacteriaceae) detection

6 Screen test to detect high-level aminoglycoside resistance in enterococci

7 Agar screening to detect vancomycin resistance in enterococci

8 Agar screening to detect vancomycin resistance in staphylococci

9 D-test

10 E-test

1. วธกำรทดสอบควำมไวโดยใชแผนยำ (วธ Disk diffusion หรอ Kirby Bauer’s)

1.1. หลกกำร วธ Disk Susceptibility เปนการทดสอบเชงคณภาพ รายงานผลไว คอยขางไว หรอดอตอสารตาน

จลชพ เปนวธทดสอบความไวตอสารตานจลชพของแบคทเรยกอโรคชนดเจรญไว (rapidly-growing aerobic path-

ogens) และชนดเจรญยากบางชนด (fastidious bacteria) โดยใชวธมาตรฐานของ CLSI ฉบบ M02-A10 และ

M45-A2 ตามล�าดบ ทดสอบโดยปายเชอแบคทเรยบนผวของวนอาหารเลยงเชอ วางแผนยาทดสอบ อบเชอตาม

เวลาทก�าหนด วดเสนผานศนยกลางของบรเวณทไมมเชอเจรญรอบแผนสารตานจลชพเทยบกบตารางแปลผลตาม

มาตรฐานของ CLSI (M100-S24)


1.2. วธปฏบต

เลอกโคโลนของเชอทจะทดสอบ และเขยเชอทขนบนอาหารทไมใช selective media เพอท�าการทดสอบ


1.2.1. ชนดของแบคทเรยททดสอบไดดวยวธ Disk diffusion

แบคทเรยกอโรคชนดเจรญไว (rapidly-growing aerobic pathogens) ดงน แบคทเรยในวงศ

Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Burkholderia cepacia, Enterococcus spp.,

Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus spp., Aeromonas spp. (A. caviae complex, A. hydrophila

complex และ A. veronii complex), Plesiomonas shigelloides, Moraxella catarrhalis, Pasteurella spp. และ

Vibrio spp.

แบคทเรยกอโรคชนดเจรญชาหรอเจรญยากบางชนด (fastidious bacteria) ดงน Haemophilus

influenzae, H. parainfluenzae, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis (ยกเวนทดสอบตอยาตอไปนดวยวธ

dilution test: penicillin, ampicillin, cefotaxime หรอ ceftriaxone, meropenem และ azithromycin), Campylobacter

jejuni/coli, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp. β-hemolytic group (ยกเวนทดสอบยาตอไปนดวยวธ

dilution test: penicillin หรอ ampicillin, cefepime หรอ cefotaxime หรอ cetriaxone, doripenem, ertapenem, mer-

openem และ daptomycin), Streptococcus spp. viridans group (ยกเวนทดสอบยาตอไปนดวยวธ dilution test:

penicillin หรอ ampicillin, doripenem, ertapenem, meropenem และ daptomycin)

1.2.2 การเลอกชนดของแผนสารตานจลชพเพอใชในการทดสอบประจ�าวนและการรายงาน

การเลอกชนดของสารตานจลชพทเหมาะสม ตองเกดจากการพจารณารวมกนระหวางหองปฏบตการ

องคกรแพทย และเภสชกรรม ตารางท 6-1 เปนยาทดสอบทแนะน�าส�าหรบเชอแตละกลม

- ยำกลม Primary เปนยาทใชทดสอบในงานประจ�าวนเปนล�าดบแรก และรายงานทกยาททดสอบ

- ยำกลม Supplement 1 เปนยาททดสอบเปนล�าดบแรกและเลอกรายงานเฉพาะกรณเชอทดอยา

primary ทเปนยา class เดยวกน หรอในกรณผปวยแพยาในกลม Primary หรอรายงานเพอ

ชวยในการควบคมการระบาด

- ยำกลม Supplement 2 เปนยาทควรทดสอบเพมเตมส�าหรบเชอทไวตอยาใน primary/

supplement 1 นอยลง (reduce susceptibility) หรอ เชอทดอยาหลายชนดพรอมกน

(multidrug resistance)

- ยำกลม Urine ประกอบดวยสารตานจลชพทใชทดสอบเบองตนส�าหรบเชอกอโรคทแยก

ไดจากทางเดนปสสาวะ


ตำรำงท 6-1 กำรเลอกสำรตำนจลชพททดสอบกบเชอแบคทเรยแตละชนด

Microorganisms Primary Supplement 1 Supplement 2 Urine

Staphylococcus spp. Cefoxitin 1-1

Erythromycin 1-2

Clindamycin 1-2, 1-3

Gentamicin

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Teicoplanin

Ciprofloxacin

or Levofloxacin

Fosfomycin

Fusidic acid

MIC of

Vancomycin 1-4

Linezolid

Moxifloxacin

Norfloxacin

Nitrofurantoin

S. pneumoniae Penicillin 2-1

(Oxacillin disk)

Erythromycin

Clindamycin 1-3

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Vancomycin

Levofloxacin

MIC of Penicillin2-1, 2-2

MIC of Cefotaxime2-1 , 2-2

or Ceftriaxone 2-1, 2-2

or Meropenem 2-1, 2-2

Linezolid

Rifampin

Tigecycline

β-haemolytic

Streptococcus 3-1

Penicillin 3-2

Erythromycin 1-2

Clindamycin 1.2, 1-3

Levofloxacin

Cefotaxime

or Ceftriaxone

Streptococcus spp.

viridans group4-1

MIC of Penicillin 4-2 Cefotaxime

Ceftriaxone

Erythromycin

Clindamycin 1-2, 1-3

Vancomycin

Enterococcus spp.5-1 Penicillin 5.2

or Ampicillin

Gentamicin 5-3

(120 μg)

β-lactamase test

Vancomycin 5-4

or Teicoplanin

Streptomycin 5-3

(300 μg)

Linezolid

Tigecycline

Norfloxacin

or Ciprofloxacin

or Levofloxacin

Nitrofurantoin

Enterobacteriaceae6-1 Ampicillin

Amoxicillin-

clavulanic acid

Ampicillin-sulbactam

Cefoxitin

Gentamicin

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Ciprofloxacin

Cefuroxime

Cefotaxime 6-2

or Ceftriaxone 6-2

Cefoperazone

Cefepime

Amikacin

Ertapenem6-3

Imipenem 6-3

Meropenem 6-3

Doripenem

Norfloxacin

Ofloxacin

Nitrofurantoin



Shigella spp.7 Ampicillin

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Ciprofloxacin

or Norfloxacin

Salmonella spp. 7 Ampicillin

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Nalidixic acid 8-1

Ciprofloxacin

or Norfloxacin 8-1

Cefotaxime or

Ceftriaxone 8-2

Levofloxacin 8-1

MIC of Ciprofloxacin

Vibrio cholerae Ampicillin

Tetracycline

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Ciprofloxacin

Vibrio spp.* Cefotaxime

Ceftazidime

Tetracycline

Fluoroquinolone

Aeromonas spp.* Amoxicillin-clavulanic

acid

3rd or 4th generation

cephalosporins

Fluoroquinolones

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Campylobacter

jejuni/coli*

Erythromycin

Ciprofloxacin

Pasteurella spp.* Penicillins

β-lactam/ β-lactamase

inhibitor combinations

Cephalosporins

Tetracyclines

Macrolides

Fluoroquinolones

Trimethoprim-

Sulfamethoxazole

Piperacillin-

tazobactam

Cefoperazone-

sulbactam9

Cefepime

or Cefpirome

Imipenem

Meropenem

Doripenem

Netilmicin Norfloxacin

Ofloxacin

ตำรำงท 6-1 กำรเลอกสำรตำนจลชพททดสอบกบเชอแบคทเรยแตละชนด (ตอ)



Pseudomonas

aeruginosa

Ceftazidime

Gentamicin

Ciprofloxacin

Amikacin

Acinetobacter spp. Cefotaxime or

Ceftriaxone

Ceftazidime

Gentamicin

Ciprofloxacin

Ampicillin-

Sulbactam

Piperacillin-

tazobactam

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Cefoperazone-

sulbactam9

Cefepime or

Cefpirome

Imipenem

Meropenem

Amikacin

MIC of Colistin10

Doxycycline

Tigecycline

MIC of Netilmicin

Stenotrophomonas

maltophilia

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Levofloxacin

Burkholderia

pseudomallei

MIC of Trimethoprim-

sulfamethoxazole

MIC of Amoxicillin-

clavulanic acid

MIC of Ceftazidime

MIC of Imipenem

MIC of Tetracycline

or Doxycycline

Burkholderia

cepacia

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Ceftazidime

Meropenem

Haemophilus

influenzae 11-1

(CSF isolate)

Ampicillin

(β-lactamase test)11-2

Cefotaxime

or Cefriaxone

Meropenem




Haemophilus

influenzae11-1

(respiratory isolate)

and

H. parainfluenzae11-1

(respiratory isolate)

Ampicillin

(β-lactamase test)11-2

Amoxicillin-

clavulanic acid

or Ampicillin-

sulbactam

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Azithromycin

or Clarithromycin

Ciprofloxacin

or Levofloxacin

or Moxifloxacin

Meropenem

Neisseria meningitidis Cefotaxime

or Ceftriaxone

Meropenem

MIC of Penicillin

(Only for prophylaxis:

Azithromycin

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Rifampin

Ciprofloxacin)

Nalidixic acid 12

Moraxella catarrhalis β-lactamase test

Amoxicillin-clavulanic

acid

MIC of Cefaclor

or Cefuroxime

Trimethoprim-

sulfamethoxazole

Primary = ยาทควรทดสอบเปนล�าดบแรก และ รายงานทกยาททดสอบ

Supplement 1 = ยาทควรทดสอบเปนล�าดบแรกและเลอกรายงาน เฉพาะกรณเชอทดอยา primary ทเปนยา

class เดยวกน

Supplement 2 = ยาทควรทดสอบเพมเตมส�าหรบเชอท reduce susceptibility ตอยาใน primary/supplement 1

หรอ เชอทดอยาหลายชนดพรอมกน (multidrug resistance)

ค�ำอธบำยตำรำงท 6-1 :

1-1. การทดสอบ oxacillin หรอ methicillin resistance ของ Staphylococcus spp. ใหทดสอบดวยแผนยา

cefoxitin (หามใชแผนยา oxacillin)

1-2. การทดสอบหาการดอยา clindamycin ทเกดจากการเหนยวน�าของยา erythromycin สามารถท�าโดยการ

วางแผนยา erythromycin ใกลกบแผนยา clindamycin (ระยะหางจากขอบถงขอบ 15-20 mm ส�าหรบ

การทดสอบเชอ staphylococci และ 12 mm ส�าหรบ β-haemolytic streptococci ) เชอทให inhibition

zone ของ clindamycin ดานทตดกบ erythromycin แบนแคบลง มองเหนเปนตวอกษร D คอเชอทเกด

การดอ clindamycin แบบเหนยวน�า (inducible clindamycin resistance) ใหรายงานวาดอ clindamycin

ถงแมวาผลการทดสอบไวตอแผนยา clindamycin

1-3. ไมรายงานผลการทดสอบ clindamycin ตอเชอ staphylococci, β-haemolytic streptococci และ

Streptococcus spp. viridans group ทพบในระบบทางเดนปสสาวะ



1-4. ควรทดสอบหา MIC ของยา vancomycin ตอเชอ MRSA ทแยกไดจาก sterile site หากตองการทดสอบ

จาก specimen อน อาจพจารณาเปนรายๆ ไป

2-1. หากเชอ S. pneumoniae จาก sterile site ทให inhibition zone ตอ oxacillin (1 μg) < 19 mm ใหทดสอบ

และรายงานผล MIC ตอ penicillin และ cefotaxime หรอ ceftriaxone เสมอ

2-2. เชอ S. pneumoniae ทแยกไดจาก CSF ใหทดสอบและรายงานผล MIC ตอ penicillin และ cefotaxime

หรอ ceftriaxone หรอ meropenem รวมทงทดสอบและรายงานผล MIC หรอ disk diffusion ตอยา

vancomycin ดวย

3-1. β-haemolytic Streptococcus spp. ในทนหมายถง β-haemolytic Streptococcus group B (S. agalactiae)

และ β-haemolytic Streptococcus ทมโคโลนขนาดใหญ ใน group A (S. pyogenes), C, G

3-2. ในตางประเทศยงไมมรายงานการดอ penicillin ของเชอ β-haemolytic Streptococcus หากพบวาเชอน

มการดอ penicillin จากการทดสอบโดยวธ disk diffusion ใหท�าการทดสอบชนดเชอซ�า และทดสอบ

ความไวโดยหา MIC หรอสงเชอทดสอบยนยนไปยงกรมวทยาศาสตรการแพทย

4-1. Streptococcus spp. viridans group ในทนหมายถงเชอ Streptococcus spp.ทอยในกลม S. mutans group,

S. salivarius group, S. bovis group, S. anginosus group (ชอเดม “S. milleri” group) และ S. mitis group

รวมถง β-haemolytic Streptococcus spp. ทมโคโลนขนาดเลกไดแก group A, C, F หรอ G

4-2. ทดสอบหา MIC ของ penicillin ตอ Streptococcus spp. viridans group ทแยกไดจาก sterile site

5-1. Enterococcus spp. ไมควรทดสอบความไวตอยาในกลม cephalosporins, aminoglycosides (ยกเวน high-

level), clindamycin และ trimethoprim-sulfamethoxazole เพราะผลในหลอดทดลองไมสอดคลองกบผล

การรกษา

5-2. ผลการทดสอบความไวของเชอ Enterococcus spp. ตอ penicillin สามารถพยากรณความไวของเชอน

ตอยา ampicillin ไดดวย

5-3. การทดสอบความไวของ Enterococcus ตอยากลม aminoglycosides ใหใชยาชนดทมความเขมขนสง

(high level) ไดแก gentamicin (120 μg) และ streptomycin (300 μg) หากแปลผลดอยา หมายถงยา

ททดสอบไมเสรมฤทธกบยากลม cell wall-active ไดแก ampicillin, penicilin, vancomycin หากแปลผล

ไวตอยา หมายถงยาททดสอบเสรมฤทธกบยากลม cell wall-active และหากแปลผลเปน intermediate

ไมสามารถสรปได ตองท�าการทดสอบดวยวธ MIC

5-4. Enterococcus spp. ทใหผล vancomycin intermediate หรอ resistant ใหทดสอบยนยนดวยการท�า

vancomycin agar screen plate โดยใช BHI agar ทเตม vancomycin 6 μg/ml หรอหา MIC ตอ vancomycin

6-1. CLSI ไดปรบมาตรฐานการแปลผลของ inhibition zone และ MIC breakpoints ของ cefazolin,

ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime และ aztreonam ตามผลการรกษาดวยยาขนาด 2 g ทก 8 ชม. 1 g

ทก 24 ชม. 1 gทก 8 ชม. 1 gทก 8 ชม. 1 gทก 8 ชม.ตามล�าดบ

การอาน การแปล และรายงานผลการทดสอบความไวของยากลม cephalosporins (cefazolin, ceftriaxone,

cefotaxime, ceftazidime) และ aztreonam ตอเชอ Enterobacteriaceae กรณใชตามขอก�าหนดของ CLSI ฉบบ

M100-S21 ป 2011 รายงานผลตามทไดจรง ควรทดสอบและรายงานการสราง ESBL เพอประโยชนในการเฝาระวง

โรคตดเชอในโรงพยาบาล


6-2. Enterobacter spp., Citrobacter spp. และ Serratia spp. อาจเปลยนจากไวตอยา 3rd Generation

cephalosporins เปนดอภายใน 3 หรอ 4 วน หลงการรกษา ดงนนจงควรท�าการทดสอบความไวของเชอ

กลมนตอยาดงกลาวซ�า

6-3. ควรทดสอบความไวของเชอกลม Enterobacteriaceae ตอยา ertapenem, imipenem และ meropenem

พรอมกนเสมอเพอเฝาระวงเชอดอยากลม carbapenem resistance Enterobacteriaceae (CRE)

7. หามทดสอบความไวของเชอ Shigella spp. และ Salmonella spp. ตอยากลม 1st และ 2nd cephalosporins,

cephamycins และ aminoglycosides เนองจากผลการทดสอบไมสอดคลองกบผลการรกษา

8-1. ทดสอบ nalidixic acid เฉพาะตอเชอ Salmonella spp. ทแยกไดจากตวอยางนอกล�าไส (extraintestinal

Salmonella) เทานน หากพบวาดอยา nalidixic acid แตไวตอยากลม fluoroquinolone ตองรายงานวา

“Extraintestinal isolates of Salmonella may not be eradicated by fluoroquinolone treatment”

8-2. ทดสอบความไวและรายงานผล 3rd generation cephalosporins เฉพาะ Salmonella spp. ทพบนอกล�าไส

เทานน

9. เนองจาก CLSI มไดก�าหนด interpretation break point ส�าหรบยา cefoperazone-sulbactam ตอ

Pseudomonas aeruginosa และ Acinetobacter spp. จงใหใช break point ของยาดงกลาวส�าหรบเชอ

Enterobacteriaceae

10. การหา MIC of colistin ส�าหรบ Acinetobacter spp. ควรทดสอบดวยวธ agar หรอ broth dilution การ

ทดสอบดวยวธ E-test อาจใหผลทไมสอดคลองกบการรกษา

11-1. Haemophilus spp. ตองใช Haemophilus test medium (HTM) ในการทดสอบความไวของเชอตอยา

11-2. การทดสอบ β-lactamase เปนวธทรวดเรวและถกตองส�าหรบการตรวจหา TEM-type β-lactamase

ของเชอ Haemophilus spp. เมอพบวา β-lactamase บวกใหรายงานดอ ampicillin และ amoxicillin

(พบ H. influenzae ทไมสราง β-lactamase แตดอ ampicillin จ�านวนนอยมาก)

12. ทดสอบ nalidixic acid ตอ N. meningitidis เพอบงชวาเชอมความไวตอ fluoroquinolone ลดลงหาก

พบวา inhibition zone ≤ 25 mm

หมำยเหต เชอแกรมลบรปแทงกลม non-fermentative ตวอนๆ ทไมใช Acinetobacter spp., P. aeruginosa,

S. maltophilia และ B. cepacia ตองใชวธหา MIC เทานน เนองจากไมมคาแปลผล การทดสอบโดยวธ disk diffusion

1.2.3. แผนสารตานจลชพ

ภาชนะทบรรจหลอดแผนยาตองเปนภาชนะทมฝาปดสนทกนความชนได และมสารดดความชน ตรวจ

สอบคณสมบตสารดดความชนและควรเปลยนใหมเมอสเปลยน เกบในตเยนทอณหภม 4- 8 °C เกบแผนยาทเปน

stock ในตแชแขง –14 °C หรอต�ากวา ส�าหรบแผนยาในกลม β-lactam ใหใสในภาชนะทปดผนกและเกบไวในตแช

แขงโดยแบงจ�านวนนอยเกบในตเยนส�าหรบใชไดไมเกน 1 สปดาห ยาอนทไมคงตว (เชน imipenem, cefaclor และ

ยาทม clavulanic acid ผสมดวย) จะตองเกบในตเยนแชแขงจนกวาจะน�ามาใช และแผนยาทใชทดสอบ ตองเปน

แผนยาทยงไมหมดอายเทานน

กอนท�าการทดสอบควรน�าภาชนะทบรรจแผนยาออกจากตเยนหรอตแชแขง วางทอณหภมหองนาน 1 – 2 ชม.

กอนเปดใชงาน เพอปรบอณหภมภายในภาชนะใหเทากบอณหภมหองกอนเปด เปนการปองกนความชนทจะเกด

จากการควบแนนเมออากาศอนกระทบแผนยาเยนทอยในภาชนะ


1.2.4. อาหารเพาะเชอ

การเตรยม Mueller-Hinton agar (MHA) ดรายละเอยดทภาคผนวก ส�าหรบเชอชนด aerobic และ facultative

anaerobic ทไมสามารถเจรญเตบโตดบน MHA ไดแก Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus

pneumoniae, viridans streptococci และ β-hemolytic streptococci ตองการ supplement หรออาหารเลยงเชอชนด

อน และจะตองใชวธการทดสอบดงตาราง 6-3

1.2.5. การเตรยมเชอใหไดความขนมาตรฐาน

การเตรยมเชอทดสอบม 2 วธคอ วธเตรยมเชอจากการเพาะ (growth method) และวธเตรยมเชอจากโคโลน

โดยตรง (direct colony suspension method)

1.2.5.1. วธเตรยมเชอจากการเพาะ (growth method) วธนเปนทางเลอกอกวธหนง ส�าหรบเชอเจรญงาย

(ยกเวน staphylococci) โดยเฉพาะในกรณทเชอทตองการทดสอบมอายมากเกนไป (>24 ชม.) นอกจากนนเปนวธ

ทเหมาะส�าหรบเชอทละลายในอาหารเหลวแลวไดความขนไมสม�าเสมอ

(1) เขยสวนบนของโคโลนเดยว ทมลกษณะเหมอนกน 3-5 โคโลน ละลายในอาหารเลยงเชอเหลว เชน

TSB 4 –5 ml

(2) อบท 35 ± 2 °C 2-6 ชม. ปรบความขนใหเทากบความขนมาตรฐาน 0.5 McFarland (1-2 x 108 CFU/ml)

โดยใชน�าเกลอทปราศจากเชอ หรออาหารเลยงเชอเหลว วดความขนดวยเครองมอวดแสง หรอดดวย

ตาในททมแสงสวางเพยงพอ โดยมแผนกระดาษซงมพนเปนสขาวและมเสนสด�าวางไวดานหลง

1.2.5.2 วธเตรยมเชอจากโคโลนโดยตรง (direct colony suspension method) เปนวธทสะดวกใชไดกบ

เชอเกอบทกชนด เปนวธทแนะน�าส�าหรบเชอเจรญยาก ไดแก Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, N. meningitidis

และ streptococci รวมทง staphylococci ทดอ methicillin หรอ oxacillin

(1) เขยสวนบนของโคโลนเดยวอาย 18-24 ชม.ใสในน�าเกลอ หรออาหารเลยงเชอเหลว

(2) ปรบความขนใหเทากบความขนมาตรฐาน 0.5 McFarland (1-2 x 108 CFU/ml)โดยใชน�าเกลอท

ปราศจากเชอ หรออาหารเลยงเชอเหลว วดความขนดวยเครองมอวดแสง หรอดดวยตาในททมแสง

สวางเพยงพอ โดยมแผนกระดาษซงมพนเปนสขาวและมเสนสด�าวางไวดานหลง

1.2.6 ขนตอนการทดสอบความไวของเชอชนดเจรญไวตอยาโดยวธ Disk diffusion test

1.2.6.1. การเพาะเชอลงบนจานทดสอบ

(1) ภายใน 15 นาท ใชไมพนส�าลปราศจากเชอจมเชอทปรบความขนแลว กดดานขางของ หลอดเหนอ

ระดบน�าใหหมาดๆ

(2) ปายเชอลงบน MHA ทผวหนาแหงแลว 3 ระนาบ โดยหมนจานไป 60 องศา ขนสดทาย ใหวนไม

พนส�าลรอบขอบวน

(3) อาจเปดฝาจานไวได 3-5 นาท แตไมเกน 15 นาท เพอลดความชนทมมากเกนไป

1.2.6.2 การวางแผนยาลงบนจานทปายเชอแลว

(1) วางแผนยาลงบนอาหารหลงปายเชอไมเกน 15 นาท ควรใหจดกลางของแผนยาแตละแผนอยหางกน

อยางนอย 24 mm กดแผนยาใหแนบกบผวหนา วางแผนยาไมเกน 12 แผน บนจานขนาดเสนผา


ศนยกลาง 150 mm หรอไมเกน 5 แผนบนจานขนาด 100 mm หามยายทแผนยาหลงวางลงบนอาหาร

แลวเนองจากยากระจายลงในอาหารไดทนท ไมควรวางแผนยาใกลขอบจานอาหารจนเกนไปเพราะ

inhibition zone ของยาจะไมครบวง

(2) หลงจากวางแผนยา น�าไปใสในตอบเชออณหภม 35 ± 2 °C ภายใน 15 นาท (ทอณหภมมากกวา

35 °C จะไมสามารถตรวจหา MRSA ได) กรณเชอเจรญยากอบในบรรยากาศ CO2

1.2.6.3 การอานและการแปลผล

(1) อ านผลหลงจากอบเชอ 16-18 ชม. ส�าหรบเชอเจรญไว ยกเว น Burkholderia cepacia,

Acinetobacter spp. และ Stenotrophomonas maltophilia ตองอบ 20-24 ชม. ส�าหรบเชอเจรญยากตอง

อบใหครบ 24 ชม. ยกเวน Haemophilus spp. อบเชอ 16-18 ชม. ใหวดเสนผานศนยกลางของ zone ท

มการยบยงเชออยางสมบรณ (โดยดดวยตาเปลา)

(2) การวด zone ใหวดเปน mm โดยใช calipers หรอไมบรรทดวางบนดานหลงของจานทดสอบ โดยถอ

จานในระยะเหนอพน 2-3 นว นอกจากนมขอยกเวนดงน

- อาหารเลยงเชอทผสมเลอด ใหเปดฝาจานทดสอบไวและวด zone จากดานบนของ

อาหารโดยมแสงสองดานหนา (reflected light)

- การตรวจหา methicillin resistance ของเชอ Staphylococcus spp. ใหอบเชอไวนาน 24 ชม.

- การตรวจหา vancomycin ของเชอ Enterococcus spp. ใหอบเชอไวนาน 24 ชม.

- ถาใชแผนยา linezolid ทดสอบเชอ Staphylococcus spp. ใหอาน inhibition zone ดวย

ไฟสองหลงจาน (transmitted light)

(3) ขอบของ zone จะก�าหนดจากบรเวณทไมมเชอโดยดดวยตาเปลา ถาใชแวนขยายเหนมเชอขนเปน

โคโลนเลกทรม zone ถอวาไมมเชอ อยางไรกตาม

- ถามโคโลนเกดขนอยางชดเจนใน inhibition zone ควรท�าการทดสอบใหม ถายงมโคโลนขน

อยางชดเจนใน zone อก ใหวดความกวางของ zone ดานในตรงบรเวณทไมมเชอขน

- เชอในกลม Proteus spp. อาจจะแผปกคลมบรเวณทเชอถกยบยงรอบแผนยา ใหวด inhibition

zone ทเหนขอบชดโดยไมสนใจเชอทแผบาง ๆ (swarm) ภายใน inhibition zone

- ในการทดสอบเชอ streptococci ทให hemolysis ใหวด zone ตรงทเชอเรมไมขน ไมใช zone ทม

การแตกของเมดเลอดแดง

- ในการทดสอบ trimethoprim และ sulfonamides ใหวด inhibition zone ทเหนขอบคอนขางชด

โดยไมสนใจเชอทขนเลกนอย (≤ 20%) ภายใน inhibition zone

(4) การแปลผลความกวางของ zone ยบยงเชอให ดในตารางท 2A ถงตารางท 2I ใน CLSI M100-S24

ใหรายงานเปน S (susceptible), I (intermedite) หรอ R (resistant) ตอยาทใชทดสอบ ยาบางชนด

รายงานไดเพยง susceptible หรอ nonsusceptible เนองจากมขอมลคา break point เฉพาะsusceptible

เทานนเพราะยงไมมการดอยามากอนหรอมเชอทดอยานอยมาก ในการบนทกผลการทดสอบควร

บนทกขนาด inhibition zone ดวยเพอเปนขอมลใชวเคราะหแนวโนมการดอยา


ตำรำงท 6-2 สรปยอกำรทดสอบควำมไวของเชอชนดเจรญไวตอสำรตำนจลชพโดยวธ disk diffusion test

Organisms Medium 0.5 McFarlandInoculum

Incubation Incubation Time Comments/Modifications

Enterobacteriaceae MHA DCS ใน MHB

หรอ saline,

GM: TSB,

2-6 ชม.

35±2 °C;

ambient air

16 - 18 ชม. ESBL production

Carbapenemase production

Pseudomonas

aeruginosa

MHA DCS ใน MHB

หรอ saline,

GM: TSB,

2-6 ชม.

35± 2 °C;

ambient air

16 - 18 ชม.

Acinetobacter spp. MHA DCS ใน MHB

หรอ saline,

GM: TSB,

2-6 ชม.

35± 2 °C;

ambient air

20 - 24 ชม.

Burkholderia

cepacia

MHA DCS ใน MHB

หรอ saline,

GM: TSB,

2-6 ชม.

35± 2 °C;

ambient air

20 - 24 ชม.

Stenotrophomonas

maltophilia

MHA DCS ใน MHB

หรอ saline,

GM: TSB,

2-6 ชม.

35 ± 2 °C;

ambient air

20 - 24 ชม.

Staphylococcus spp. MHA DCS ใน MHB

หรอใน saline

35 ± 2 °C;

ambient air

(การทดสอบ

ทอณหภม >

35 °C

อาจตรวจไม

พบ MRSA)

16-18 ชม. ;

24 ชม.ส�าหรบ

S. aureus ตอยา

oxacillin;

24 ชม. ส�าหรบ

staphylococci ทก

species ตอยา

vancomycin;

24 ชม.ส�าหรบ

coagulase-negative

staphylococci

ตอยา cefoxitin

β –lactamase test

D-test (Inducible clindamycin resistance)

Examine oxacillin, vancomycin, and

linezolid zones carefully with

transmitted light for small colonies or

haze inside the zone of inhibition; any

growth = resistance. Vancomycin disk

diffusion testing is not recommended

for coagulase-negative staphylococci.


Organisms Medium 0.5 McFarlandInoculum


Aeromonas spp. &

Plesiomonas

shigelloides

MHA DCS ใน MHB

หรอ saline จาก

เ ช อ ท ข น บ น

nonse lec t ive

medium eg. BA

นาน 18-24 ชม.

35 °C 16-18 ชม.

Moraxella

catarrhalis

MHA DCS 5% CO2 20-24 ชม. β –lactamase test

Pasteurella spp. MHA DCS 16-18 ชม.

*DCS = direct colony suspension ใน MHB หรอ saline จากเชอทขนบน nonselective medium eg. BA

GM = growth method MRS = methicillin-resistant staphylococci.

ตำรำงท 6-3 สรปยอกำรทดสอบควำมไวของเชอ fastidious แบคทเรย ตอสำรตำนจลชพโดยวธ disk diffusion test

Organism Medium 0.5 McFarland Inoculum


Enterococcus spp. MHA Direct colony

suspension ใน MHB

หรอใน saline, หรอ

วธ growth method

35 ± 2 °C;

ambient air

16 – 18 ชม.

24 ชม. ส�าหรบ

vancomycin

Examine vancomycin zones

carefully with transmitted light for

small colonies or haze inside the

zone of inhibition; any growth

= resistance.

Haemophilus

influenzae,

Haemophilus

parainfluenzae

Direct colony


หรอใน saline (โดยใช

เชอทอบนาน 20-24

ชม.บน CA)

35 ± 2 °C;

5% CO2

16 – 18 ชม. β–lactamase test,

Test a maximum of 9 disks

on a 150 mm plate and 4 disks

on a 100 mm plate

Neisseria

gonorrhoeae

GC agar

base with

1% defined

supplement

Direct colony


or 0.9% phosphate

buffered saline, pH

7.0, (โดยใชเชอทอบ

ไวนาน 20-24 ชม.บน

CA อบท 5% CO2)

36 ± 1 °C

(หามเกน

37 °C);

5% CO2

20 - 24 ชม. Test a maximum of 9 disks on a 150

mm plate and 4 disks on a

100 mm plate

For some agents, eg, fluoroquinolones

or cpholosporins, only 2 to 3 disks

may be tests pre plate

ตำรำงท 6-2 สรปยอกำรทดสอบควำมไวของเชอชนดเจรญไวตอสำรตำนจลชพโดยวธ disk diffusion test (ตอ)


Organisms Medium 0.5 McFarland

Inoculum


Streptococcus

pneumoniae

MHA with

BA

Direct colony


หรอใน saline (โดยใช

เชอทอบไวนาน 18-

20 ชม. บน BA)

35 ± 2 °C;

5% CO2


mm plate and 4 disks on a 100 mm

plate.

Measure the zone of growth

inhibition, not the zone of

inhibition of hemolysis.

Streptococcus spp. MHA with

BA

Direct colony

suspension

ใน MHB หรอใน

saline

35 ± 2 °C;

5% CO2

20 - 24 ชม. D-test (β-streptococci)

Test a maximum of 9 disks

on a 150 mm plate and 4 disks

on a 100 mm plate

Measure the zone of growth

inhibition, not the zone of

inhibition of hemolysis.

Neisseria

meningitidis

MHA with

BA

Direct colony


หรอใน saline

(โดยใชเชอทอบไว

นาน 20- 24-ชม. CA

plate อบ ท 5% CO2)

35 ± 2 °C;

5% CO2


mm. plate and 2 disks on a 100 mm.

plate.

Caution: Perform all testing in a

BSC.

Campylobacter

jejuni/ coli

BMHA DCS 36-37 °C

or

42 °C

10% CO2,

5% O2,

85% N2

48 ชม.

24 ชม.

1.3 กำรควบคมคณภำพกำรทดสอบควำมไวของเชอตอสำรตำนจลชพ

จดมงหมายของการควบคมคณภาพเพอตดตามความแมนย�าถกตองของวธการ น�ายาทดสอบอาหารเลยงเชอ

แผนยาและสมรรถนะของผปฎบตการทดสอบ อาน และแปลผล ดงนนวธทดทสดในการควบคมคณภาพ คอการ

เลอกใชเชอมาตรฐานอางองเพอน�ามาทดสอบตามวธทด�าเนนการอยและตรวจสอบผลวาตรงตามทควรจะเปนหรอไม

1.3.1. การควบคมคณภาพภายในส�าหรบเชอกอโรคทเจรญเรว (rapid-growing aerobic pathogens)

หองปฎบตการทกแหงทท�าการทดสอบความไวของยาตอเชอเจรญงาย (nonfastidious bacteria) อยาง

นอยตองมเชอมาตรฐาน 6 เชอ (จากแหลงทเชอถอและสามารถสอบกลบได) ส�าหรบควบคมคณภาพ ดงน E. coli

ตำรำงท 6-3 สรปยอกำรทดสอบควำมไวของเชอ fastidious แบคทเรย ตอสำรตำนจลชพโดยวธ disk diffusion test (ตอ)


ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniac ATCC 49619,

and E. coli ATCC 35218 (ส�าหรบควบคมคณภาพการทดสอบดวยแผนยา β-lactamase inhibitor combinations

containing clavulanic acid, sulbactam, or tazobactam) และ Enterococcus faecalis ATCC 29212 (ส�าหรบควบคม

การทดสอบการใชแผนยา trimethoprim หรอ sulfonamides a high concentration of gentamicin or streptomycin

(ดรายชอเชออนๆ ททดสอบและเชออางองทใชควบคมคณภาพจากตารางท 6-4 และ 6-5 และดคณลกษณะของ

เชอมาตรฐานจากตารางท 6-6)

เชอส�าหรบควบคมคณภาพจะตองไดรบการทดสอบโดยวธมาตรฐานการทดสอบกบแผนยา โดยในอาหาร

ทดสอบและวธการเชนเดยวกบเชอทแยกไดจากผปวย

คาควบคมต�าสดและสงสดทควรจะเปนในการควบคมคณภาพ มก�าหนดอยในเอกสารอางองของ CLSI

หากผลการควบคมคณภาพของหองปฏบตการผดพลาดจากคาควบคม 1 ครง ใน 20 ครง ถอวายอมรบได แตถา

ความผดพลาดมมากกวานจะตองหาสาเหตและท�าการแกไขทนท


ตำรำ

งท 6

-4

เชอท

ทดส

อบแล

ะเชอ

อำงอ

งทใช

ควบ

คมคณ

ภำพ

กำรท

ดสอบ

ควำม

ไวขอ

งเชอ

ตอสำ

รตำน

จลชพ

โดยว

ธ di

sk d

iffus

ion

test

(M

100-

S23)

เชออ

ำงอง

ทใช

คว

บคม

คณภำ

พ

เชอท

ทดส

อบคว

ำมไว

E. co

li

ATCC

259

22

E. co

li

ATCC

352

18

K. p

neum

onia

e

ATC

C 70

0603

P. a

erug

inos

a

ATCC

278

53

S. a

ureu

s

ATCC

259

23

S. a

ureu

s

ATCC

292

13

E. fa

ecal

is

ATCC

292

12

H.infl

uenzae

ATCC

492

47

H.infl

uenzae

ATCC

497

66

N. g

onor

rhoe

ae

ATCC

492

26

S. p

neum

onia

e

ATCC

496

19

Ente

roba

cter

iace

ae✓

✓*

✓

Pseu

dom

onas

aer

ugin

osa

✓✓

*✓

Aci

neto

bact

er sp

p.✓

✓*

✓

Sten

otro

phom

onas

mal

toph

ilia

✓✓

*✓

Bur

khol

deria

cep

acia

✓✓

*✓

Oth

er n

on- E

nter

obac

teric

eae

✓✓

*✓

Stap

hylo

cocc

us sp

p.✓

*

✓ disk

di

ffusio

n

✓

dilu

tion

met

hod

Ente

roco

ccus

spp.

✓

disk

di

ffusio

n

✓

dilu

tion

met

hod

Hae

mop

hilu

s in

fluen

zae

and

Hea

mop

hilu

s par

ainfl

uenz

ae

✓

**

✓

✓

Nei

sser

ia g

onor

rhoe

ae

✓

Nei

sser

ia m

enin

gitid

is✓

✓

Stre

ptoc

occu

s pne

umon

iae

✓St

rept

ococ

cus

spp.

β-he

mol

ytic

Gro

up

✓

Stre

ptoc

occu

s spp

.

virid

ans G

roup

✓

* Fo

r β-la

ctam

/β-la

ctam

ase

inhi

bito

r com

bina

tions

** W

hen

test

ing

amox

icill

in-c

lavu

lani

c ac

id


ตำรำ

งท 6

-5

เชอท

ทดส

อบแล

ะเชอ

อำงอ

งทใช

ควบ

คมคณ

ภำพ

กำรท

ดสอบ

ควำม

ไวขอ

งเชอ

ตอสำ

รตำน

จลชพ

(M45

-A2)

เชอ

อำงอ

งทใช

คว

บคม

คณภำ

พ

เชอท

ทดส

อบคว

ำมไว

E. c

oli

AT

CC

259

22

E. c

oli

AT

CC

352

18

P. a

erug

inos

a

AT

CC

278

53

S. a

ureu

s

AT

CC

259

23

S. a

ureu

s

AT

CC

292

13

S. p

neum

onia

e

AT

CC

496

19

C.

jeju

ni

AT

CC

335

60

H. p

ylor

i

AT

CC

435

04

Abi

otro

phia

spp.

and G

ranu

licat

ella

spp.

✓

✓

dilu

tion

met

hod

Aer

omon

as s

pp.

and

Ples

iom

onas

shig

eloi

des

✓✓

**

Bac

illus

spp.

(not

B. a

nthr

acis

)

✓

Cam

pylo

bact

er je

juni

/ c

oli

✓

disk

diff

usio

n✓

m

icro

dilu

tion

met

hod

Cor

yneb

acte

rium

spp.

incl

udin

g

C

. dip

hthe

riae

✓fo

r gen

tam

icin

✓

Erys

ipel

othr

ix rh

usio

path

iae

✓

HA

CEK

Gro

up**

**

✓**

✓

Hel

icob

acte

r pyl

ori

✓

Lact

obac

illus

spp.

✓fo

r gen

tam

icin

✓

Leuc

onos

toc

spp.

✓fo

r gen

tam

icin

✓

List

eria

mon

ocyt

ogen

es

✓

Mor

axel

la c

atar

rhal

is

✓**

✓

disk

diff

usio

n✓

di

lutio

n m

ethod

Past

eure

lla sp

p.

✓**

✓

di

sk d

iffus

ion

✓

Pedi

ococ

cus s

pp.

✓fo

r gen

tam

icin

✓


เชอ

อำงอ

งทใช

คว

บคม

คณภำ

พ

เชอท

ทดส

อบคว

ำมไว

E. c

oli

AT

CC

259

22

E. c

oli

AT

CC

352

18

P. a

erug

inos

a

AT

CC

278

53

S. a

ureu

s

AT

CC

259

23

S. a

ureu

s

AT

CC

292

13

S. p

neum

onia

e

AT

CC

496

19

C.

jeju

ni

AT

CC

335

60

H. p

ylor

i

AT

CC

435

04

Vib

rio sp

p. (i

nclu

ding

V. c

hole

rae)

✓✓

**

Bur

khol

deria

pse

udom

alle

i✓

✓**

✓

Bur

khol

deria

mal

lei

✓

✓

Fran

cise

lla tu

lare

nsis

✓

✓

✓

Bac

illus

ant

hrac

is✓

✓

Bru

cella

spp.

✓

✓

Yer

sini

a pe

stis

✓

* di

sk d

iffus

ion

(am

oxic

illin

-cla

vulin

ic a

cid

and

doxy

cycl

ine)

** fo

r β-la

ctam

/β-la

ctam

ase

inhi

bito

r com

bina

tions

***

whe

n te

stin

g am

oxic

illin

-cla

vula

nic

acid

****

HA

CEK

gro

up =

Agg

rega

tibac

ter s

pp. f

orm

erly

Hae

mop

hilu

s aph

roph

ilus,

H. p

arap

hrop

hilu

s, H

. seg

nis,

Act

inob

acill

us a

ctin

omyc

etem

com

itans

,

Car

diob

acte

rium

spp

. Eik

enel

la c

orro

dens

and

Kin

gella

spp.

ตำรำ

งท 6

-5

เชอท

ทดส

อบแล

ะเชอ

อำงอ

งทใช

ควบ

คมคณ

ภำพ

กำรท

ดสอบ

ควำม

ไวขอ

งเชอ

ตอสำ

รตำน

จลชพ

(M45

-A2)

(ตอ)


ตำรำ

งท 6

-6 ค

ณลก

ษณ

ะของ

เชอม

ำตรฐ

ำนส�ำ

หรบ

ใชใน

กำรค

วบคม

คณภำ

พกำ

รทดส

อบคว

ำมไว

ของเ

ชอแบ

คทเร

ยตอส

ำรตำ

นจล

ชพ

Qua

lity

Con

trol

Str

ain

Org

anis

m C

hara

cter

istic

Dis

k D

iffus

ion

Tes

tsM

IC T

ests

Scre

enin

g T

ests

Oth

er

Bac

tero

ides

frag

ilis

ATC

C 2

5285

β-la

ctam

ase

posi

tive

A

ll an

aero

bes

Bac

tero

ides

thet

aiot

aom

icro

n

ATC

C 2

9148

β-la

ctam

ase

posi

tive

A

ll an

aero

bes

Clo

strid

ium

diffi

cile

ATC

C 7

0005

7

β-la

ctam

ase

nega

tive

G

ram

-pos

itive

ant

imic

robi

al

ag

ents

Ente

roco

ccus

faec

alis

ATC

C 2

9212

Non

fast

idio

us g

ram

-pos

itive

ba

cter

ia

Van

com

ycin

aga

r

HLA

R

Hig

h-le

vel

m

upiro

cin

resi

stan

ce

M

IC te

st

Ass

ess s

uita

bilit

y of

m

ediu

m fo

r

sulfo

nam

ide

or

trim

etho

prim

MIC

te

sts.

Ass

ess s

uita

bilit

y of

c

atio

n co

nten

t in

each

b

atch

/lot o

f Mue

ller-

H

into

n fo

r dap

tom

ycin

b

roth

mic

rodi

lutio

n.

Ente

roco

ccus

faec

alis

ATC

Ca 5

1299

Res

ista

nt to

van

com

ycin

(V

anB

) and

hig

h-le

vel

am

inog

lyco

side

s

Van

com

ycin

aga

r

HLA

R

Esch

eric

hia

coli

ATC

C 2

5922

β-la

ctam

ase

nega

tive

Non

fasti

diou

s gra

m-n

egat

ive

ba

cter

ia

Nei

sser

ia m

enin

gitid

is

Non

fast

idio

us g

ram

-neg

ativ

e

bac

teria

N. m

enin

gitid

is

Esch

eric

hia

coli

ATC

C 3

5218

Con

tain

s pla

smid

-enc

oded

TE

M-1

β-la

ctam

ase

(non

-ESB

L) a,b,

e,f

β-la

ctam

/β-la

ctam

ase

in

hibi

tor c

ombi

natio

ns

β-la

ctam

/β-la

ctam

ase

inh

ibito

r com

bina

tions

Euba

cter

ium

lent

um

ATC

C 4

3055

All

anae

robe

s


Qua

lity

Con

trol

Str

ain

Org

anis

m C

hara

cter

istic

Dis

k D

iffus

ion

Tes

tsM

IC T

ests

Scre

enin

g T

ests

Oth

er

Hae

mop

hilu

s infl

uenz

ae

ATC

C 4

9247

BLN

AR

Hae

mop

hilu

s spp

.H

aem

ophi

lus s

pp.

Hae

mop

hilu

s infl

uenz

ae

ATC

C 4

9247

Am

pici

llin

susc

eptib

leH

aem

ophi

lus s

pp.

(mor

e re

prod

ucib

le w

ith

sele

cted

β-la

ctam

s)

Hae

mop

hilu

s spp

.(mor

e

repr

oduc

ible

with

sele

cted

β-la

ctam

s)

Kle

bsie

lla p

neum

onia

e

ATC

C 7

0060

3

Con

tain

s SH

V-1

8 ES

BL

ESB

L sc

reen

and

confi

rmat

ory

test

s

ESB

L sc

reen

and

confi

rmat

ory

test

s

Nei

sser

ia g

onor

rhoe

ae

ATC

C 4

9226

CM

RN

GN

. gon

orrh

oeae

N. g

onor

rhoe

ae

Pseu

dom

onas

aer

ugin

osa

ATC

C 2

7853

Con

tain

s ind

ucib

le A

mpC

β-la

ctam

ase

Non

fasti

diou

s gra

m-n

egat

ive

bact

eria

Non

fast

idio

us g

ram

neg

ativ

e

bact

eria

Ass

ess

suita

bilit

y of

cat

ion

cont

ent i

n ea

ch b

atch

/lot

of M

uelle

r-H

into

n fo

r

gent

amic

in M

IC a

nd d

isk

diff

usio

n.

Stap

hylo

cocc

us a

ureu

s

ATC

C 2

5923

β-La

ctam

ase

nega

tive

m

ecA

neg

ativ

e

Littl

e va

lue

in M

IC te

stin

g

d

ue to

ext

rem

e

su

scep

tibili

ty to

m

ost d

rugs

Non

fasti

diou

s gra

m-n

egat

ive

bact

eria

Hig

h-le

vel m

upiro

cin

re

sist

ance

dis

k

d

iffus

ion

test

Indu

cibl

e

c

linda

myc

in

re

sist

ance

dis

k

di

ffusio

n tes

t

(D

-zon

e tes

t)

ตำรำ

งท 6

-6 ค

ณลก

ษณ

ะของ

เชอม

ำตรฐ

ำนส�ำ

หรบ

ใชใน

กำรค

วบคม

คณภำ

พกำ

รทดส

อบคว

ำมไว

ของเ

ชอแบ

คทเร

ยตอส

ำรตำ

นจล

ชพ (ต

อ)


Qua

lity

Con

trol

Str

ain

Org

anis

m C

hara

cter

istic

Dis

k D

iffus

ion

Tes

tsM

IC T

ests

Scre

enin

g T

ests

Oth

er

Stap

hylo

cocc

us a

ureu

s

ATC

C 2

9213

Wea

k β-la

ctam

ase–

prod

ucin

g st

rain

mec

A n

egat

ive

Non

fast

idio

us g

ram

-neg

ativ

e

bact

eria

Oxa

cilli

n ag

ar

Hig

h-le

vel

mup

iroci

n re

sist

ance

MIC

test

Indu

cibl

e

c

linda

myc

in

re

sist

ance

MIC

test

Ass

ess

suita

bilit

y of

cat

ion

cont

ent i

n ea

ch b

atch

/lot

of M

uelle

r-H

into

n fo

r

gent

amic

in M

IC a

nd d

isk

diff

usio

n.

Stap

hylo

cocc

us a

ureu

s

ATC

C 4

3300

Oxa

cilli

n-re

sist

ant,

mec

A p

ositi

ve

Cef

oxiti

n di

sk d

iffus

ion

test

ing

Cef

oxiti

n M

IC te

stin

gO

xaci

llin

agar

Stap

hylo

cocc

us a

ureu

s

ATC

C B

AA

-170

8

Hig

h-le

vel m

upiro

cin

resi

stan

ce m

edia

ted

by

the

mup

A g

ene

Hig

h-le

vel m

upiro

cin

re

sist

ance

test

Stre

ptoc

occu

s pne

umon

iae

ATC

C 4

9619

Peni

cilli

n in

term

edia

te b

y

alte

red

peni

cilli

n bi

ndin

g

pro

tein

S. p

neum

onia

e

Stre

ptoc

occu

s spp

.

N. m

enin

gitid

is

S. p

neum

onia

e

Stre

ptoc

occu

s spp

.

N. m

enin

gitid

is

Indu

cibl

e cl

inda

myc

in

resi

stan

ce M

IC te

st

Supp

lem

enta

l QC

Str

ains

Ente

roco

ccus

faec

alis

ATC

C 3

3186

Alte

rnat

ive

to E

. fae

calis

ATC

C 2

9212

to a

sses

s

suita

bilit

y of

med

ium

for

sulfo

nam

ide o

r trim

ethop

rim

MIC

and

dis

k di

ffus

ion

test

s.d End

poi

nts a

re th

e

sam

e as

for E

. fae

calis

ATC

C 2

9212

.

Hae

mop

hilu

s infl

uenz

ae

ATC

C 1

0211

Ass

ess

each

bat

ch/lo

t fo

r

grow

th ca

pabi

litie

s of H

TM.

ตำรำ

งท 6

-6 ค

ณลก

ษณ

ะของ

เชอม

ำตรฐ

ำนส�ำ

หรบ

ใชใน

กำรค

วบคม

คณภำ

พกำ

รทดส

อบคว

ำมไว

ของเ

ชอแบ

คทเร

ยตอส

ำรตำ

นจล

ชพ (ต

อ)


Qua

lity

Con

trol

Str

ain

Org

anis

m C

hara

cter

istic

Dis

k D

iffus

ion

Tes

tsM

IC T

ests

Scre

enin

g T

ests

Oth

er

Kle

bsie

lla p

neum

onia

e

ATC

C B

AA

-170

5

KPC

-pro

duci

ng st

rain

MH

T po

sitiv

e

Phen

otyp

ic c

onfir

mat

ory

te

st fo

r car

bape

nem

ase

p

rodu

ctio

n (M

HT)

Kle

bsie

lla p

neum

onia

e

ATC

C B

AA

-170

6

Res

ista

nt to

car

bape

nem

s

b

y mec

hani

sms o

ther

than

c

arba

pene

mas

e

MH

T ne

gativ

e

Phen

otyp

ic c

onfir

mat

ory

te

st fo

r car

bape

nem

ase

pr

oduc

tion

(MH

T)

Supp

lem

enta

l QC

Str

ains

g

Stap

hylo

ccus

aur

eus

ATC

C®

292

13

Wea

k -la

ctam

ase

prod

ucin

g

st

rain

· m

ecA

neg

ativ

e

Peni

cilli

n zo

ne-e

dge

test

Stap

hylo

ccus

aur

eus

ATC

C B

AA

-976

Con

tain

s msr

A-m

edia

ted

m

acro

lide-

only

resi

stan

ce

Ass

ess

disk

app

roxi

mat

ion

te

sts w

ith er

ythr

omyc

in an

d

c

linda

myc

in (D

-zon

e te

st

n

egat

ive)

Stap

hylo

ccus

aur

eus

ATC

C B

AA

-977

Con

tain

s ind

ucib

le e

rmA

m

edia

ted

resi

stan

ce

Ass

ess d

isk

appr

oxim

atio

n

te

sts w

ith er

ythr

omyc

in an

d

c

linda

myc

in (D

-zon

e te

st

p

ositi

ve)

ตำรำ

งท 6

-6 ค

ณลก

ษณ

ะของ

เชอม

ำตรฐ

ำนส�ำ

หรบ

ใชใน

กำรค

วบคม

คณภำ

พกำ

รทดส

อบคว

ำมไว

ของเ

ชอแบ

คทเร

ยตอส

ำรตำ

นจล

ชพ (ต

อ)


กำรเกบและกำรใชเชอส�ำหรบควบคมคณภำพ

• เชอทจะเกบไวเปนเวลานาน (stock culture) ควรเกบเชอทอณหภม –20 °C หรอต�ากวา โดยใสในอาหารเหลว

ทม stabilizer ทเหมาะสม เชน TSB ทใส 50% fetal calf serum หรอใส 10-15 % glycerol อาจใช skim milk หรอ

defibrinated blood แทน TSB ได เกบในรปแบบ freeze-dried โดยไมมความเสยงตอการเปลยนแปลงความไวตอ

สารตานจลชพ

• เชอส�าหรบควบคมคณภาพทใชงาน (working culture) ควรเกบบน TSA Slant (ส�าหรบเชอเจรญงาย) หรอ

บน enriched CA slant /BA slant (ส�าหรบเชอเจรญยาก) ทอณหภม 2-8 °C และน�ามาเพาะใหมทกสปดาหเปน

เวลาไมเกน 4 สปดาหตดตอกน แลวเตรยมเชอใหมจาก stock culture

• กอนการทดสอบใหเพาะเชอบนจานอาหารเพอใหไดโคโลนเดยว ส�าหรบ stock culture ควรน�ามาเพาะซ�า 2

ครงกอนน�าไปทดสอบ

• น�าเชอทใชในการควบคณภาพไปท�าการทดสอบตามขนตอน เชนเดยวกบเชอตวอยางทตองการทดสอบ


• ผลการทดสอบเชอควบคมคณภาพจะตองอยในเกณฑทยอมรบได หากไมอยในเกณฑ อาจเพราะวธการทไม

ถกตอง หรอเชอมาตรฐานทใชทดสอบไมไดมาตรฐาน ควรเปลยนเชอมาตรฐานส�าหรบควบคมคณภาพใหม

• เชอ E. coli ATCC 35218 และ K. pneumoniae ATCC 700603 ทใชในการควบคมมาตรฐานของการทดสอบ

มรายงานพบการสญเสย plasmid ส�าหรบการควบคม β-lactamase เมอมการ subculture หลายครง ท�าใหผลการ

ควบคมคณภาพอยนอกขอบเขตทยอมรบได

กำรใชเชอควบคมคณภำพ

1. น�าเชอทเกบรกษาในตแชแขง หรอเชอท subculture ใหมจากทเกบรกษา (stock culture) ไว

2. Subculture เชอบนอาหารเลยงเชอทเหมาะสมและอบใหเชอเจรญ (primary subculture)


3. Subculture ในหลอดอาหาร (slant) หรอจานอาหารเลยงเชอ อบ และเกบในสภาวะทเหมาะสมกบชนดเชอ

และน�ามา subculture ใชในสปดาหทหนงไดเปนเวลา 7 วน จากวนท 1 ถงวนท 7 ส�าหรบเปน working culture

4. ทกสปดาห subculture เชอจาก slant หรอจานอาหาร working culture วนท 1 (ในขอ 3) เกบในอณหภม

ทเหมาะสมส�าหรบใชในสปดาหท 2

5. ด�าเนนการซ�าไดจนถงสปดาหท 3 และ 4 หลงจากนนทงเชอน และน�าเชอจาก stock ในขอ 1 ด�าเนนการ

ตามขอ 2-5 ตอไป

คำยอมรบของ zone ยบยง

ผลการทดสอบความไวของเชอมาตรฐานทใชควบคมคณภาพตอยาแตละชนด ตองไดคาเสนผานศนยกลาง

zone ยบยงอยในชวงทยอมรบได ดงแสดงในตาราง CLSI : M100-S24

ควำมถของกำรทดสอบเพอควบคมคณภำพ

ควบคมคณภาพทงระบบโดยใชเชอมาตรฐานทเหมาะสมทดสอบกบยาแตละชนดทกวน 20-30 วนตดตอกน

ผลการทดสอบผดพลาดไดไมเกน 1 ใน 20 หรอ 3 ใน 30 ครง กรณทผลไมอยในเกณฑ ตองหาสาเหตและปฏบตการ

แกไขทนท และท�าการทดสอบใหมตอเนองกนเปนเวลา 5 วน เมอผลอยในคาทยอมรบได จงเรมท�าการทดสอบ

ประจ�าวนได

การทดสอบความไวของเชอตอยาทเปนงานบรการประจ�าวน ตองท�าการควบคมคณภาพอยางนอยสปดาห

ละ 1 ครง กรณหองปฏบตการทท�าการทดสอบไมเปนประจ�า จะตองท�าการควบคมคณภาพทกครง


กำรแกไขขอผดพลำด

ขอผดพลาดทเปนสาเหตใหผลการทดสอบอยนอกเกณฑยอมรบ ไดแก

• เชอทใชส�าหรบควบคมคณภาพ

• วสดและสารทใช

• ขบวนการทดสอบ

• เครองมอ

กำรรำยงำนผลของผปวยในกรณผลกำรควบคมคณภำพอยนอกเกณฑทยอมรบ

ไมรายงานผลการทดสอบ ตรวจสอบทบทวนรปแบบความไวของเชอตอยาของผปวยแตละคนทเคยท�ามา

กอน หรอทบทวน antibiogram ทเคยรวบรวมไว และใชวธการทดสอบอน หรอสงตอไปทดสอบทหองปฏบตการ

อางองจนกวาปญหาจะไดรบการแกไข

ขบวนกำรควบคมอนๆ

• การควบคมคณภาพความเขมขนของเชอทดสอบ

• ควบคมการอานคาส�าหรบแปลผล

ขอจ�ำกดของวธทดสอบควำมไวโดยใชแผนยำ (Disk diffusion methods)

การศกษาในขณะนการทดสอบโดยวธ Disk diffusion ยงไมเพยงพอทจะสรางมาตรฐาน ทใหผลถกตอง

แมนย�าส�าหรบการแปลผล เชอบางชนดอาจตองทดสอบโดยวธหาคา MIC (dilution method) ถามความจ�าเปน การ

ใชวธ dilution method อาจเปนวธทดสอบทเหมาะสมทสด ซงอาจตองสงเชอไปยงหองปฏบตการอางอง

ผลทท�ำใหเกดกำรเขำใจผด

ผลการทดสอบความไวของยาบางกลมตอเชอบางชนด อาจรายงานวายาไวตอเชอทงๆทเชอนนดอยา ท�าให

เขาใจผดซงกอใหเกดอนตรายตอผปวย ไดแก การทดสอบยาตอเชอดงตอไปน

• 1st และ 2nd -generation cephalosporins, cephamycins และ aminoglycosides ตอเชอ Samonella และ

Shigella spp.

• Penicillins, β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations, cephems (ยกเวน cephalosporins with

anti-MRSA activity), และ carbapenems ตอเชอ oxacillin-resistant Staphylococcus spp. (MRSA)

• Aminoglycosides (ยกเวน high concentrations), cephalosporins, clindamycin และ

trimethoprim-sulfamethoxazole ตอเชอ Enterococcus spp.

ปรำกฏกำรณดอยำระหวำงกำรรกษำและกำรทดสอบซ�ำ

เชอจลชพบางชนดอาจกลายจากไวเปนดอหรอดอปานกลาง เมอผปวยไดรบการรกษาดวยยาเดมภายใน 3 – 4 วน

เชน เชอ Enterobacter spp., Citrobacter spp. และ Serratia spp. กบยากลม 3rd -generation cepholosporins เชอ

P. aeruginosa กบสารตานจลชพทกชนด และเชอ staphylococci กบ quinolones ส�าหรบ S. aureus ทไว


vancomycin อาจกลายเปนดอหลงใชรกษาผปวยเปนระยะเวลานาน จงตองท�าการทดสอบความไวของเชอชนด

เดยวกนซ�าทกครง ทแยกไดในระหวางการรกษา

กำรตรวจคดกรองกำรดอยำ

ผลทไดจากการทดสอบคดกรองบางวธนอาจมความไวและความจ�าเพาะเพยงพอ สามารถออกผลและ

พจารณารกษาผปวยไดโดยไมตองทดสอบดวยวธอนอก บางวธจะตองทดสอบดวยวธอนเพมเพอยนยน

ตำรำงท 6-7 รำยกำรตรวจคดกรองกำรดอยำตำมชนดกำรดอยำทแสดงออก (Phenotype) หรอตำมกลไกกำรดอยำ

เชอ

Resistance

Phenotype หรอ

กลไกกำรดอยำ

วธตรวจคดกรอง กำรทดสอบยนยนเพม

Enterobacteriaceae ESBL production Broth microdilution และ

disk diffusion ตอยากลม

cephalosporins และ aztreonam

ท�าการทดสอบเพมหากใหผลบวก

Carbapenemase

production

Broth microdilution และ disk

diffusion ตอยากลม

carbapenems


Staphylococcus

aureus

β-lactamase

production

Penicillin disk diffusion

zone-edge test หรอวธอน

Yes, if screen test negative, repeat penicillin MIC

และ β-lactamase test(s) (eg, penicillin disk

diffusion zone-edge test or induced β-lactamase

test) on subsequent isolates from same patient

(if penicillin MIC ≤ 0.12 μg/ml or zone ≥ 29

mm); PCR for blaZ may be considered.

Oxacillin resistance Agar dilution; MHA ทม 4%

NaCl และ 6 mg/ml oxacillin

ไมตองท�าการทดสอบเพม

mecA-mediated

oxacillin resistance


diffusion ตอยา cefoxitin


Vancomycin MIC

≥ 8 mg/ml

Agar dilution; BHI

ทม 6 mg/ml

vancomycin


Inducible

clindamycin

resistance


diffusion ตอยา clindamycin

และ erythromycin


High-level

mupirocin resistance


diffusion ตอยา mupirocin



เชอ

Resistance

Phenotype

หรอ กลไกกำรดอยำ

วธตรวจคดกรอง กำรทดสอบยนยนเพม

Coagulase-negative

staphylococci

β –lactamase

production

Chromogenic cephalosporin

หรอวธอน

Yes, if screen test negative, repeat penicillin MIC

and induced β-lactamase test on subsequent

isolates from same patient (if penicillin MIC ≤

0.12 µg/ml or zone ≥ 29 mm); PCR for blaZ

may be considered

mecA-Mediated

oxacillin resistance

Disk diffusion ตอยา cefoxitin ไมตองท�าการทดสอบเพม

Inducible

clindamycin

resistance





Enterococci Vancomycin

resistance

Agar dilution; BHI with

6 μg/ml vancomycin

ตอยา vancomycin


HLAR Broth microdilution,

agar dilution และ

disk diffusion ตอยา

gentamicin และ streptomycin

หากหา MIC ไมตองท�าการทดสอบเพม

หากท�า disk ถาสรปผลไมได ใหท�าเพม

Streptococcus

pneumoniae

Penicillin

resistance

Disk diffusion ตอยา oxacillin ท�าการทดสอบเพมหากเชอใหผล nonsusceptible

Inducible

clindamycin

resistance





Streptococcus spp.

β -hemolytic Group

Inducible

clindamycin

resistance





ค�ายอ: ESBL, extended-spectrum β-lactamase; FDA, US Food and Drug Administration; HLAR, high-level

aminoglycoside resistance; MIC, minimal inhibitory concentration; PCR, polymerase chain reaction.

* If the current cephalosporin, aztreonam, and carbapenem breakpoints are used, ESBL and/or modified Hodge

testing is not required, but may be used to determine the presence of a resistance mechanism that may be of

epidemiological significance. However, if the ESBL and/or carbapenemase screen is performed and positive,

the confirmatory test must be performed to establish the presence of an ESBL or a carbapenemase.

ตำรำงท 6-7 รำยกำรตรวจคดกรองกำรดอยำตำมชนดกำรดอยำทแสดงออก (Phenotype) หรอตำมกลไกกำรดอยำ (ตอ)


สำเหตของควำมผดพลำดทพบบอยในกำรทดสอบควำมไวของเชอตอสำรตำนจลชพ ไดแก

- การบนทกผลผดพลาดหรอใชยาไมถกตอง

- การวนจฉยเชอตวอยางผดพลาด

- วธการทดสอบไมถกตองตามเกณฑมาตรฐาน

การเตรยม inoculum ขนมากหรอนอยเกนไป

ความขนมาตรฐานหมดอายหรอเปลยนสภาพ

อณหภมในการอบเชอไมถกตอง

คาความเปนกรด-ดาง (pH) ของอาหารเลยงเชอ สงหรอต�าเกนไป

- ยาทใชทดสอบเสอมคณภาพหรอหมดอาย

- เชอทใชทดสอบมการปนเปอน

- การอานผลผดพลาด

- inhibition zone เลกเกนไปหรอมเชอเจรญอยภายใน zone (โดยเฉพาะยา sulfonamide, trimethoprim

และ co-trimoxazole) กรณนอาจเกดจากสารยบยงในอาหารเลยงเชอจงควรทดสอบดวย E. faecalis

ดงกลาวแลวขางตน

กำรตรวจสอบผลกำรทดสอบ

ตรวจสอบวาแบบแผนความไวของเชอตอยาสอดคลองกนหรอไม หรอตรวจสอบจากผลการทดสอบความไว

ของเชอชนดเดยวกนทแยกไดจากผปวยกอนหนาน และใหหาสาเหตของความผดพลาดทกลาวแลวขางตน

นอกจากน เชอบางสปชสจะใหแบบแผนการดอยาทแนนอนอยแลว เชน

- Proteus spp. โดยทวไปจะดอตอยา nitrofurantoin และ tetracyclines

- Streptococcus pyogenes จะไวตอยา penicillin เสมอ

- Serratia spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp. และ Klebsiella pneumoniae จะดอยา ampicillin

- staphylococci และ streptococci จะไวตอ vancomycin (หากพบเชอทงสองดอตอยา vancomycin ใหตรวจ

สอบยนยนการแยกชนดเชออกครงเนองจากเชอ Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. และ Pediococcus

spp. ดอ vancomycin)

- Shigella spp. จะไวตอยา norfloxacin

หากพบเชอทใหผล antibiogram ตางไปจากปกตและมความส�าคญทางระบาดวทยา เชน พบ norfloxacin-

resistant Shigella, vancomycin-resistant Staphylococcus ควรสงเชอดงกลาวตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตร

สาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย เจาหนาทหองปฏบตการควรมขอมลและตดตามขาวสารเกยวกบ typical,

atypical, unusual หรอ impossible antibiogram อยางสม�าเสมอ

เชอทควรท�ำกำรแยกชนดและทดสอบควำมไวตอยำซ�ำใหม

ผลการทดสอบความไวของจลชพตอยาตานจลชพทมขอชบงตอไปน ตองท�าการทดสอบซ�าใหมทงการแยก

และพสจนชนดของเชอและการทดสอบความไวดวยวธเดมอกครง เมอท�าซ�าแลวไดผลดอเหมอเดมใหท�าการยนยน

ดวยวธอนและหรอสงใหหองปฏบตการอางองตรวจยนยนการดอยา


ขอบงชเชอทควรท�ำกำรแยกชนดและทดสอบควำมไวตอสำรตำนจลชพซ�ำใหม

1) เชอทไมเคยมการรายงานมากอน

2) เชอทพบไมบอยในพนททแยกเชอไดแตเคยมรายงานในพนทอนหรอพนทใกลเคยง

3) เชอทใหผลการทดสอบทสามารถเกดความผดพลาดดานเทคนคไดงาย และการดอยานมผลกระทบทางคลนก

ทส�าคญ

กำรควบคมคณภำพภำยนอก

หองปฏบตการควรไดรบการทดสอบจากหนวยงานภายนอก

2. กำรทดสอบควำมไวของเชอตอสำรตำนจลชพโดยกำรหำคำ MIC

2.1 หลกกำร เปนการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพแบบปรมาณวเคราะห โดยการผสมสารตาน

จลชพทมความเขมขนจากสงไปหาต�ากบอาหารเลยงเชอแลวใสเชอลงไป น�าไปอบเพาะเชอขามคนในตอบ 35 °C

ท�าการตรวจหาความเขมขนต�าสดของสารตานจลชพทสามารถยบยงการเจรญของเชอททดสอบ เรยกวา minimum

inhibitory concentration หรอ MIC การหาคา MIC ท�าได 3 วธ คอ วธทใชอาหารเลยงเชอชนดวนผสมกบยาตาน

จลชพ เรยกวา agar dilution method วธทผสมยาตานจลชพดวยอาหารเหลว เรยกวา broth dilution method และวธ

E-test ส�าหรบวธ broth dilution สามารถกระท�าได 2 วธ ไดแก macrodilution และ microdilution broth method

ซงวธหลงเปนวธทนยมมากกวาเพราะสนเปลองสารนอยกวา จงขอน�ามากลาวไวในทนโดยจะกลาวถงวธทเหมาะ

ส�าหรบเชอเจรญงายใน Mueller-Hinton Broth (MHB) ส�าหรบเชอทเจรญยากหรอพบนอย (Bacillus spp.,

Brucella spp., Burkholderia pseudomallei, Corynebacterium diphtheriae,Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria

monocytogenes, Yersinia pestis เปนตน) สามารถอานเพมเตมใน CLSI M45-A2 และส�าหรบเชอกลม anaerobe

อานเพมเตมใน CLSI M11-A7 ซงใช broth แตกตางกนตามชนดของเชอแบคทเรย

2.2 วธปฏบต

2.2.1 วธการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพโดยการหาคา MIC ดวยวธ Agar dilution

กำรเตรยมสำรตำนจลชพ

1. เตรยมสารตานจลชพใหเปน 10 เทาของปรมาณยาทตองการใหมในอาหารจานเพาะเชอแตละ plateโดย

เจอจางยาตานจลชพใหเปน 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 … เชนเตรยมยา 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10 และ

5 μg/ml

2. ใสยาทเตรยมไวแตละความเขมขน plate ละ 1 ml แลว ผสมกบ MHA ทมความรอนประมาณ 56 °C

ปรมาณ 9 ml จะไดความเขมขนของยาตานจลชพใน agar dilution plate เรยงจากมากไปหานอย ดงน

128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, และ 0.5 μg/ml

3. รอให agar dilution plate เยนและแขงทอณหภมหอง อาหารเลยงเชอทมยาตานจลชพผสมอยสามารถ

เกบท 4 °C ไดไมเกน 5 วน ยกเวนยากลม β-lactamases ตองใชภายใน 48 ชวโมง เนองจากยาสลายตวงาย

4. ท�าหนา plate ใหแหงกอนน�าไปใชโดยใสในตอบเพาะเชอหรอวางแบบเปดฝาใน laminar flow

หรอ BSC ประมาณ 15 นาท


กำรเตรยมเชอแบคทเรย

เตรยมเชอโดยวธ direct colony หรอ growth method เชนเดยวกบทกลาวไวในวธทดสอบความไวของเชอ

ตอยาดวยวธ disk diffusion ใหไดเชอทความขนเทากบ 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน TSB แลวเจอจาง

เชอลงอก 1: 10 เทาจะไดความเขมขนของเชอ 5x107 CFU/ml ปรมาณเชอสดทายทอยบน agar dilution plate เทากบ

104 CFU ตอหยด เมอใช replicators ทมเขมขนาด 1 mm ซงสามารถปลอยเชอได 0.1-0.2 μl ไมควรเตรยมเชอนาน

เกน 15 นาท กอนใสเชอบน plate

กำรใสเชอบน Agar dilution plates

1. จดเรยงเชอทเตรยมไวใหเปนล�าดบ โดยสามารถท�าเชอได 30-32 สายพนธ

2. ท�าเครองหมายท plate เพอใหรต�าแหนงและทศทางการเรยงหมายเลขเชอแตละตวบน agar plate

3. ดดเชอทเตรยมไวแตละตว ประมาณ 0.5 ml ใสในแตละหลมของ inoculator ตามล�าดบ

4. น�า inoculator-replicator ไปวางในหลมของ inoculator แลวน�าไปวางบน agar plate เพอปลอยใหเชอหยด

บนผว plate ควรหยดเชอบนผว agar ทเปน control plate ซงไมมยาตานจลชพกอน plate ทมยาโดยเรยง

จากยานอยไปหามาก

5. รอจนหยดเชอแหงสนทจงน�า plate อบท 35+ 2 °C เปนเวลา 18-24 ชวโมง

กำรอำนคำ MIC

อานคา MIC ของเชอแตละตวโดยเรยงจาก plate ทมยานอยทสดไปหายามากเพอหาวาเชอม completely

inhibit growth (ไมมการเจรญของเชอหรอมเพยงรอยเชอทจางๆ) บน plate ทมยาตานจลชพปรมาณเทาใดคาของ

MIC ของเชอแตละตวคอปรมาณยานอยทสดทสามารถยบยงการเจรญของเชอได

ขอควรระวง กรณมเชอขน ≥ 2 โคโลน กอนจดทเปน end point ของเชอ หรอกรณเชอไมขนบน plate ทมยานอย

แตมเชอเจรญบน plate ทมยามากกวา ใหตรวจสอบการปนเปอนของเชออน และตองท�าการทดสอบใหม

กำรควบคมคณภำพ

Control plate: ใชอาหารเพาะเลยงเชอทไมเตมยาตานจลชพ เพอควบคมการเจรญเตบโตของเชอททดสอบ

Drug control: ใชเชอมาตรฐานททราบคา MIC ทดสอบควบคกบเชอทดสอบใน agar dilution plate เดยวกน


ตำรำงท 6-8 แสดงกำรหำคำ MIC ของเชอโดยวธ agar dilution

Strain No.Antimicrobial concentration in agar dilution plate (µg/ml)

MIC (µg/ml)0.5 1 2 4 8

1 +++ +++ +++ +++ NG 8

2 +++ +++ +++ NG NG 4

3 +++ +++ NG NG NG 2

4 +++ +++ NG NG NG 2

5 +++ NG NG NG NG 1

6 +++ NG NG NG NG 1

7 +++ NG NG NG NG 1

8 +++ NG NG NG NG 1

9 +++ NG NG NG NG 1

10 +++ NG NG NG NG 1

Control strain +++ NG NG NG NG 1

Negative control NG NG NG NG NG NG

+++ คอมการเจรญของเชอ; NG คอไมมเชอเจรญ

2.2.2 วธการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพโดยการหาคา MIC ดวยวธ Broth dilution

1. เตรยม Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth (CAMHB มชนดส�าเรจรปขาย) เปนอาหารเลยงเชอ

ส�าหรบผสมยา (กรณทตองทดสอบหาความไวของเชอกลม staphylococci ตอยา oxacillin, methicillin หรอ

nafcillin ใหเตม 2 % NaCl ลงกอนน�าไปนง)

2. ทดสอบคา pH ซงควรอยในชวง 7.2-7.4

กำรเตรยมสำรละลำยสำรตำนจลชพ

1. ค�านวณหา potency ของยาจากคาทก�าหนดมาในใบ certifcate ทแนบมากบยา ดงตวอยาง

Assay purity (by HPLC): 99.8%, water content: 12.1% (w/w), Active fraction: 100%

Potency = (assay purity) x (active fraction) x (1- water content)

= 998 x 1 x (1- 0.121)

= 877 μg/mg or 87.7%

ยาบางชนดแสดงคา potency เปน IU/mg เขยนอยบนฉลากปดขวด ใหค�านวณเปน μg/mg

ดงตวอยาง amphotericin 100 mg potency = 5,000 IU/mg = 5,000 IU/1,000 μg


ใชสตร 1 IU =

1,000 μg

5,000 IU = 0.2 μg

Amphotericin ม potency = 5,000 IU x 0.2 μg = 1,000 μg /mg

2. ค�านวณหาน�าหนกยาทตองชงซงควรมากกวา 100 mg เพอเตรยม stock solution

ตวอยาง ตองการเตรยม stock solution 100 ml ทมความเขมขนของยา 1280 g/ml

ยาม potency 750 g/mg

ใชสตร weight = volume (ml) x concentration (μg /ml)

potency (μg /mg)

= 100 ml x 1,280 μg/ml = 170.67 mg

750 μg/mg

เพอความถกตองควรชงยามากกวาคาทค�านวณได หากเลอกชงยา 182.6 mg จะใชตวท�าละลาย

ปรมาตรเทาใด

ใชสตร volume = weight (mg) x potency (μg/mg)

stock concentration (μg/ml)

= 182.6 mg x 750 μg/mg = 107.0 ml

1,280 μg/ml

นนคอ ชงยา 182.6 mg ละลายในน�ากลนปราศจากเชอ 107.0 ml เพอเตรยม stock solution

ทมความเขมขนของยา 1280 μg /ml

3. ส�าหรบยาทละลายไดงายในน�ากลนปราศจากเชอ เตรยม stock solution ของยาใหมความเขมขนไมนอย

กวา 1,000 μg/ml (ยาทไมละลายในน�า ใหละลายยาดวยตวท�าละลายในปรมาตรนอยทสดทสามารถท�าใหยาละลาย

จนหมด) เตรยมยาใหมระดบความเขมขนมากพอทจะครอบคลมชวงความเขมขนทยอมรบไดของเชอควบคม

คณภาพการทดสอบอยางนอย 1 ชนด stock solution ทเตรยมดวยวธปลอดเชอไมจ�าเปนตองกรอง และสามารถเกบ

ทอณหภมนอยกวาหรอเทากบ -20 °C ไดนาน 6 เดอน

4. ท�าการเจอจาง stock solution ดวย CAMHB ใหมความเขมขนลดลง 10 เทา เปน working solution จาก

นนเจอจาง working solution ทไดใหมความเขมขนสดทายของยาลดลง 2 เทา (ดงตารางท 6-9) โดยเปลยน pipette

ทกครงหลงการเจอจางแตละความเขมขน


ตำรำงท 6-9 ตวอยำงแสดงกำรเตรยม working solution

ควำมเขมขนของยำ (µg /ml)

ปรมำตรของยำ (ml) ปรมำตรของ CAMHB (ml)

ควำมเขมขนสดทำยของยำ (µg /ml)

5120 (stock solution) 1 9 512

512

512

512

1

1

1

1

3

7

256

128

64

64

64

64

1

1

1

1

3

7

32

16

8

8

8

8

1

1

1

1

3

7

4

2

1

1

1

1

1

1

1

1

3

7

0.5

0.25

0.125

ดด CAMHB ทผสมยา ใสลงถาด 96 หลม (กนหลมแบบตว U หรอ V) หลมละ 0.1 ml โดยเรมจากความเขมขน

ของยาต�าสดไปหาสงสด แตละความเขมขนจะม 8 หลม (แถว A-H) ดงรป และดด CAMHB ทไมผสมยาลงในหลม

ท A12-H12 หลมละ 0.1 ml


ภำพท 6-1 ตวอยำงกำรทดสอบหำคำ MIC ดวยวธ Broth microdilution

กำรเตรยมเชอแบคทเรย

1. เตรยมเชอโดยวธ direct colony หรอ growth method เชนเดยวกบทกลาวไวในวธทดสอบความไวของเชอตอ

ยาดวยวธ disk diffusion ใหไดเชอทความขนเทากบ 0.5 McFarland (1.0 x 108 CFU/ml) ใน CAMHB แลวเจอจาง

เชอลงอก 20 เทาจะไดความเขมขนของเชอ 5 x106 CFU/ml

2. ดดเชอแตละสายพนธใสหลม 1-12 ของแตและแถว (A-F) หลมละ 0.01 ml ภายใน 15 นาท (ความเขมขน

สดทายของเชอจะลดลงเปน 5 x105 CFU/ml) ดงรป โดยหลม G1-G12 ใชเปนหลมทใสเชอควบคม และหลมท

H1-H12 ใชเปนหลมควบคมทไมใสเชอแบคทเรย

3. อบถาดหลมขามคนทอณหภม 35±2 °C ในกลองพลาสตกโดยไมซอนถาดมากกวา 4 ถาด


1. ตรวจดหลมแรกทไมพบการเจรญของเชอแตละตวทท�าการทดสอบ อานคาความเขมขนของยาในหลม

นนเปนคา MIC

2. หากพบหลมทไมมการเจรญของเชออยระหวางกลาง ใหอานคา MIC ทสงสด แตหากพบหลมดงกลาวมากกวา

1 หลมใหท�าการทดสอบใหม

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12



1. ทดสอบกบเชอควบคมตามทก�าหนดใน CLSI M100-S24 ควบคกบเชอแบคทเรยตวอยางทกครงทท�าการทดสอบ

2. ตองไมพบการเจรญของเชอในหลมของแถว H1-H12 และตองพบการเจรญทดของเชอในหลม A12-G12

ตำรำงท 6-10 แสดงเชอแบคทเรยทควรทดสอบควำมไวดวยวธ broth microdilution

Organisms Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Abiotrophia spp.

Granulicatella spp.

CAMHB

+ LHB 2.5-5%

+pyridoxal

hydrochloride

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

penicillin

cefotaxime หรอ

ceftriaxone

vancomycin

Bacillus spp. ยกเวน

B. anthracis

CAMHB direct colony

suspension

in MHB

35 °C

16-20 ชม.

S. aureus

ATCC 29213

vancomycin

fluoroquinolones

clindamycin

Campylobacter

jejuni/coli

CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

36-37 °C

48 ชม.

หรอ 42 °C

24 ชม.

microaerobic

C. jejuni

ATCC 33560

erythromycin

ciprofloxacin

Corynebacterium spp.

(รวม C. diphtheriae)

CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

24-48 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

E. coli ATCC

25922 กบยา

gentamicin

penicillin

vancomycin

gentamicin

erythromycin

Erysipelothrix

rhusiopathiae

CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

penicillin หรอ

ampicillin

กลม HACEK CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

24-48 ชม.

5% CO2

S. pneumoniae

ATCC 49619

E. coli ATCC

35218 กบยาทม

β-lactamase

inhibitor

ampicillin

amoxicillin-

clavulanic acid

cefotaxime หรอ

ceftriaxone

imipenem


Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Leuconostoc spp. CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

E. coli ATCC

25922 กบยา

gentamicin


ampicillin

Listeria

monocytogenes

CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619


ampicillin

trimethoprim-

sulfamethoxazole

Moraxella

catarrhalis

CAMHB direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. aureus

ATCC 29213

amoxicillin-

clavulanic acid

cefaclor หรอ

cefuroxime

Pasteurella spp. CAMHB

+ LHB 2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

18-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

E. coli ATCC

35218 กบยาทม

β-lactamase

inhibitor

ยากลม

penicillins,

cephalosporins,

tetracyclines,

fluoroquinolones

Pediococcus spp. CAMHB

+ LHB

2.5-5%

direct colony

suspension

in MHB

35 °C

20-24 ชม.

S. pneumoniae

ATCC 49619

E. coli ATCC

25922 กบยา

gentamicin

penicillin

cefotaxime

หรอ

ceftriaxone

vancomycin

Acinetobacter spp. CAMHB direct colony

suspension

in MHB

35±2 °C

20-24 ชม.

E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

colistin

Bacillus anthracis CAMHB direct colony

suspension

in CAMHB

35 °C

16-20 ชม.

E. coli

ATCC 25922

S. aureus

ATCC 29213

penicillin

doxycycline

ciprofloxacin

ตำรำงท 6-10 แสดงเชอแบคทเรยทควรทดสอบควำมไวดวยวธ broth microdilution (ตอ)


Organism Medium Inoculum Incubation QC Primary testing

Brucella spp. Brucella broth

pH 7.1 ± 0.1

direct colony

suspension

in CAMHB

35 °C

48 ชม.

E. coli

ATCC 25922

S. pneumoniae

ATCC 49619

gentamicin

streptomycin

tetracycline

Burkholderia mallei CAMHB direct colony

suspension

in CAMHB

35 °C

16-20 ชม.

E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

ceftazidime

imipenem

tetracycline

Burkholderia

pseudomallei

CAMHB direct colony

suspension

in CAMHB

35 °C

16-20 ชม.

E. coli

ATCC 25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

ceftazidime

imipenem

tetracycline

amoxicillin-

clavulanic acid

Franciscella

tularensis

CAMHB

+ 2%

defined growth

supplement

direct colony

suspension in

CAMHB

35 °C

48 ชม.

E. coli

ATCC 25922

S. aureus

ATCC 29213

P. aeruginosa

ATCC 27853

gentamicin

streptomycin

tetracycline

ciprofloxacin

chloramphenicol

Yersinia pestis direct colony

suspension in

CAMHB

35±2 °C

24-48 ชม.

E. coli

ATCC 25922

gentamicin

streptomycin

tetracycline

ciprofloxacin

trimethoprom-

sulfamethoxazole

LHB: Lysed Horse Blood

HACEK : Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter paraphrophilus, Aggregatibacter segnis,

Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium spp., Eikenella corrodens,

Kingella spp.

Microaerobic: 10% CO2, 5% O

2, 85% N

2

ตำรำงท 6-10 แสดงเชอแบคทเรยทควรทดสอบควำมไวดวยวธ broth microdilution (ตอ)


3. β-lactamase test

3.1 หลกกำร β-lactamase เปนเอนไซมทแบคทเรยหลายชนดสรางขนเพอท�าลายยากลม β-lactam ดงนนการ

ตรวจหาการสรางเอนไซม β-lactamase ซงสามารถกระท�าไดอยางรวดเรวในแบคทเรยกลม Haemophilus spp., N.

gonorrhoeae, staphylococci, enterococci และ M. catarrhalis จะชวยใหการรกษาดวยสารตานจลชพมประสทธภาพ

มากขน วธทดสอบม 3 วธไดแก acidometric, iodometric และ nitrocefin-based (cefinase) method ซงวธสดทาย

เปนวธทสามารถใชทดสอบกบเชอทกกลมดงกลาวขางตน จงเปนวธทนยมมากทสดและจะน�ามากลาวไวในทน


3.2.1 วาง cefinase disk บนแผนสไลดทสะอาด หยดน�ากลนปราศจากเชอ 1 หยดลงบน disk

3.2.2 ใช loop หรอ swab เขยเชอทตองการทดสอบน�ามาปายลงบน cefinase disk

3.2.3 ตรวจดการเปลยนสของ disk ผลบวกคอเชอสราง β-lactamase ไปเปลยน substrate ใน disk เปนส

แดงภายใน 15 วนาท ถง 5 นาท แตถาทดสอบเชอ staphylococci ตองอานผลหลงปายเชอ 1 ชม. และ

ถาทดสอบเชอ enterococci ตองอานผลหลงปายเชอ 30 นาท ผลลบคอเชอไมสราง β-lactamase จะ

ไมเหนการเปลยนแปลงสของ disk

หมำยเหต การทดสอบกบเชอ staphylococci ควรทดสอบกบเชอทถกเหนยวน�าใหสรางเอนไซมเพมขน (ตามวธ

ขางลาง) เนองจากบางสายพนธสราง β-lactamase ในปรมาณนอยมากจนไมสามารถตรวจสอบได

3.3 วธเหนยวน�ำ กำรสรำงเอนไซม β-lactamase ใน staphylococci

3.3.1 Streak เชอบน BA เปน 3 ระนาบ แลววาง oxacillin disk (1 μg) ลงบนระนาบเชอ

3.3.2 อบเชอท 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.

3.3.3 เขยเชอทเจรญตรงขอบของ inhibition zone ไปทดสอบการสราง β-lactamase ขางตน

3.4 กำรรำยงำนผล

ผลบวก หมายถงเชอดอตอยากลม penicillinase-labile penicillins (amoxicillin, ampicillin, penicillin) กรณ

staphylococci จะรวมถง carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin, และ piperacillin) หากไดผลลบยงไมสามารถสรป

วาเชอไมดอยา ตองท�าการทดสอบความไวตามวธมาตรฐานกอน

3.5 กำรควบคมคณภำพ

ทดสอบการสราง β-lactamase กบ reference strains ดงน

Staphylococcus aureus ATCC 29213 ใหผลบวก

Haemophilus influenzae ATCC 10211 ใหผลลบ


4. ESBLs

4.1 หลกกำร ESBLs เปนเอนไซม β-lactamase ทเชอสรางขนจากการ mutation ของยนส ท�าใหสามารถท�าลาย

ยากลม penicillins, third generation cephalosporins (ceftazidime, cefotaxime, และ ceftriaxone), และ aztreonam

พบมากใน Enterobacteriaceae โดยเฉพาะ Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Escherichia coli และ Proteus

mirabilis ทเปนสาเหตการตดเชอในโรงพยาบาล วธทตรวจดการสรางเอนไซม ESBLs มทงวธ screening และ

confirmation


4.2.1 วธ Screening

4.2.1.1 เตรยม inoculums และเพาะเชอบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชอตอยา

ดวยวธ disk diffusion

4.2.1.2 ทดสอบความไวของเชอ K. pneumoniae, K. oxytoca และ E. coli ตอยา cefpodoxime (10 μg)

หรอ ceftazidime (30 μg) หรอ aztreonam (30 μg) หรอ cefotaxime (30 μg) หรอ ceftriaxone

(30 μg) หากเปนเชอ P. mirabilis ใหทดสอบกบยา cefpodoxime (10 μg) หรอ ceftazidime

(30 μg) หรอ cefotaxime (30 μg) อบเชอท 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.

4.2.1.3 วดขนาด inhibition zone ของเชอ ถาไดตามตารางท 6-11 แสดงวาเชออาจสรางเอนไซม

ESBL ควรท�าวธ confirmation เพอยนยนตอไป

ตำรำงท 6-11 ตำรำง inhibition zone ของเชอในกำรทดสอบ ESBL

สำรตำนจลชพขนำด inhibition zone (mm)

E. coli K. pneumoniae K. oxytoca P. mirabilis

Cepodoxime (10 μg) ≤17 ≤17 ≤ 17 ≤ 22

Ceftazidime (30 μg) ≤ 22 ≤ 22 ≤ 22 ≤ 22

Aztreonam (30 μg) ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 -

Cefotaxime (30 μg) ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27 ≤ 27

Ceftriaxone (30 μg) ≤ 25 ≤ 25 ≤ 25 -

4.2.2 วธ confirmation

4.2.2.1 เตรยม inoculums และเพาะเชอบน MHA ตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชอตอ

ยาดวยวธ disk diffusion จ�านวน 2 plate ตอเชอ 1 ตวตามมาตรฐานการทดสอบความไว

ของเชอตอยาดวยวธ disk diffusion

4.2.2.2 ทดสอบความไวของเชอตอยา ceftazidime (30 μg) และยา ceftazidime-clavulanic acid

(30/10 μg) ใน plate ท 1 และวาง disk ยา cefotaxime (30 μg) และยา cefotaxime-

clavulanic acid (30/10 μg) ใน plate ท 2 อบเชอท 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.


4.2.2.3 วดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone ของยาแตละค ถา inhibition zone ของ disk ยา

ทมสวนผสมของ clavulanic acid มขนาดใหญกวา inhibition zone ของ disk ยาชนดเดยวกน

ทไมมสวนผสมของ clavulanic acid ≥ 5 mm. แสดงวาเชอสรางเอนไซม ESBL


รายงานวาเชอสรางเอนไซม ESBL


4.4.1 วธ screening : ทดสอบความไวของเชอ E. coli ATCC 25922 (ไมสราง ESBLs) ตอยาดงกลาว

ขางตน สปดาหละครง

4.4.2 วธ confirmation: ทดสอบความไวของเชอ E. coli ATCC 25922 (ไมสรางESBLs) และ เชอ

K. pneumoniae ATCC 700603 (สราง ESBLs) ตอยา ceftazidime (30 μg) คกบยา

ceftazidime-clavulanic และยา cefotaxime (30 μg) คกบยา cefotaxime-clavulanic acid

(30/10 μg) สปดาหละครง โดย inhibition zone ของเชอ E. coli ATCC 25922 ตอยาทง 2 คจะ

ตางกน ≤ 2 mm และ inhibition zone ของเชอ K. pneumoniae ATCC 700603 ตอยา ceftazidime

(30 μg) และยา ceftazidime-clavulanic จะตางกน ≥ 5 mm แตส�าหรบยา cefotaxime (30 μg)

คกบยา cefotaxime-clavulanic acid (30/10 μg) จะตางกน ≥ 3 mm

5. Carbapenemases detection

5.1. หลกกำร carbapenemases activity ในเชอ Enterobacteriaceae ทแยกไดจากสงสงตรวจของผปวย เกดจาก

การสรางเอนไซม β-lactamase หลายชนดมทงใน classes A, B และ D เชน เอนไซม KPC ทอยใน class A เอนไซม

NDM ทอยใน class B และเอนไซม OXA ทอยใน class D ซงเปนเอนไซมหลกทมความส�าคญทางคลนกดงแสดง

ในตารางท 6-12

ตำรำงท 6-12 β-lactamases และ carbapenemase activity

β-lactamase class เชอทพบ ตวอยำงเอนไซม

A K. pneumoniae และ

Enterobacteriaceae อนๆ

KPC, SME

B Enterobacteriaceae

P. aeruginosa

Acinetobacter baumannii

Metallo- ß-lactamases

ทถกยบยงโดย EDTA

เชน IMP, VIM, NDM

C Acinetobacter baumannii

Enterobacteriaceae

OXA

Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases เปนกลไกการดอยา carbapenems ทส�าคญ carbapenemases มรายงาน

พบทวโลกในเชอ Enterobacteriaceae เอนไซน carbapenemases ชนด KPC type มรายงานครงแรกในสหรฐอเมรกา

และมระบาดมากใน อสราเอล และกรก metallo-enzymes (VIM, IMP...) พบมากในทางใตของยโรปและเอเชย

OXA-48 เปน carbapenemases ทรายงานลาสดจากกลมประเทศเมดเตอรเรเนยน และมโครงสรางทแตกตางจาก


carbapenemases อน carbapenemase genes สวนใหญอยท plasmid ของเชอ K. pneumoniae ทแยกไดจากโรคตด

เชอในโรงพยาบาลแตมรายงานการตดเชอในชมชนดวย

การตรวจยนยนการสรางเอนไซม KPC สามารถท�าโดย modified Hodge Test แตยงไมม phenotypic test ทเชอ

ถอไดส�าหรบการตรวจยนยนหาเอนไซม NDM และ metallo-β-lactamases อยางไรกตาม breakpoints ของการ

ทดสอบความไวโดย disk diffusion method หรอการท�า MIC ส�าหรบยาในกลม carbapenem ทก�าหนดโดย CLSI

ใน M100-S20-U (June 2010 Update) สามารถใชแปลผลการทดสอบความไวของเชอ Enterobacteriaceae ทสราง

เอนไซมชนด NDM และ other metallo-β-lactamase เพอใชเปนแนวทางในการเลอกสารตานจลชพส�าหรบการตด

เชอดงกลาว

การตรวจคดกรองและการยนยนการสราง carbapenemase ของเชอ Enterobacteriaceae โดยใชเกณฑการแปล

ผล CLSI June 2010 (M100-S20-U) การตรวจคดกรองเบองตนส�าหรบการสราง carbapenemase ของเชอ

Enterobacteriaceae ใหท�าตามวธทแสดงใน Table 3C ของ M100-S24; CLSI 2014 การทดสอบความไวตอสารตาน

จลชพในงานบรการประจ�าวน การตรวจยนยนการสราง carbapenemase ของเชอ Enterobacteriaceae โดยวธ

Modified- Hodge Test ท�าเฉพาะกรณตองการศกษาระบาดวทยาเพอใชประโยชนในการควบคมการแพรกระจาย

ไมจ�าเปนตองท�าในงานบรการประจ�าวน การแปลผลของการทดสอบความไวของยากลม carbapenem ส�าหรบเชอ

Enterobacteriaceae โดยวธ disk diffusion และการหาคา MIC ใหองตาม break point ทก�าหนด โดยไมตองค�านง

ถงผลของ Modified-Hodge test

เชอ Enterobacteriaceae ทสราง carbapenemase มกจะใหผล intermediate หรอ resistant ตอยาในกลม carbapenem

อยางนอยหนงชนด ertapenem non-susceptibility เปนตวชวดทไวดส�าหรบการตรวจหาการสรางเอนไซม carbapenemase

และเชอกลมนมกดอตอยาตวใดตวหนงในกลม cephalosporin subclass III ดวย เชน cefoperazone, cefotaxime,

ceftriazone, ceftazidime ดงนนการตรวจหาการสรางเอนไซม carbapenemases ส�าหรบ Enterobacteriaceae ตอง

ท�าการทดสอบความไวของเชอตอยาทง ertapenem, imipenem, และ meropenem รวมทงยาในกลม cephalosporin

subclass III เสมอ

5.2 กำรตรวจคดกรอง carbapenemase production ของเชอ Enterobacteriaceae

5.2.1 วธปฏบต

5.2.1.1 ท�าการทดสอบตามวธ disk diffusion ดวยแผนยาทดสอบ ertapenem 10 μg หรอ

meropenem 10 μg หรอวธ broth dilution โดยใชยา ertapenem 1 μg หรอ meropenem

1 μg หรอ imepenem 1 μg

5.2.1.2 อบจานเพาะเชอท 35 + 2°C เปนเวลา 16-18 ชม. ส�าหรบวธ disk diffusion หรอ 16-20

ชม. ส�าหรบ broth dilution

5.2.1.3 การตรวจคดกรองถา inhibition zone ของ ertapenem = 19-21 mm หรอ meropenem

= 16-21 mm แสดงวาเชอททดสอบอาจมการสรางเอนไซม carbapenemase

5.2.1.4 MICs ของ ertapenem = 2 μg/ml หรอ imepenem = 2-4 μg/ml หรอ meropenem = 2-4

μg /ml แสดงวาเชอททดสอบอาจมการสรางเอนไซม carbapenemase

5.2.1.5 กรณไดผลตรวจคดกรองบวกตองตรวจยนยนโดยวธ modified-Hodge test

หมำยเหต ไมใช imepenem disk ในการตรวจคดกรองหา carbapenemases เพราะใหผลไมด


5.3 กำรตรวจยนยนกำรสรำง Carbapenemase ของเชอ Enterobacteriaceae โดย modified- Hodge test (MHT)


5.3.1.1 เตรยม E.coli ATCC 25922 ใหไดความขน 0.5 McFarland standard โดยวธ direct colony

suspension หรอ growth method ใน broth หรอน�าเกลอแลวเจอจางใหเปน 1:10 ใน broth

หรอน�าเกลอ

5.3.1.2 ใช cotton swab ปายเชอในขอ 1 ลงบน MHA แบบเดยวกบการท�า disk diffusion test

5.3.1.3 หลงปลอย plate ไว 3-10 นาทใหแหง วางแผนยาทดสอบ ertapenem ขนาด 10 μg หรอ

meropenem 10 μg ทกลาง plate

5.3.1.4 ใช loop ขนาด 10 μl เขยเชอทจะทดสอบ 3-5 โคโลนทเพาะบน BA นาน 18-24 ชม. ปายเปน

เสนตรงลากจากแผนยาทดสอบมาจนสดขอบ plate ยาวอยางนอย 20-25 mm

5.3.1.5 ท�าการทดสอบในขอท 4 กบเชอมาตรฐานทใชควบคมคณภาพทงสายพนธ MHT positive

และ MHT negative

5.3.1.6 อบเชอทอณหภม 35±2 °C เปนเวลา 16-20 ชม.

5.3.2 การอานผล

อานผลโดยดการเหนยวน�าการเตบโต (enhanced growth) ของเชอ E. coli ATCC 25922 ทต�าแหนงทตด

กบเชอททดสอบ ถาพบ enhanced growth แสดงวาเชอททดสอบมการสราง carbapenemase หรอ carbapenemase

production บวก ถาไมพบ enhanced growth คอ carbapenemase production ลบ

5.3.3 การรายงานผล

5.3.3.1 เชอทใหผล MHT positive และการตรวจคดกรองโดย ertapenem หรอ meropenem disk

diffusion บวก (inhibition zone; ertapenem 19-21 mm meropenem 16-21 mm) ตองหาคา

MIC กอน รายงานผลการสราง carbapenemase

5.3.3.2 เชอทให MHT positive และ ertapenem MIC 2 μg/ml, imipenem MIC 2-4 μg/ml, หรอ

meropenem MIC 2-4 μg/ml รายงาน carbapenem ทกตววาดอ

5.3.3.3 เชอทให MHT negative แปลผล carbapenem MICs ตาม CLSI interpretive criteria ตาราง

2A ใน M100-S24 (January 2014)

5.3.3.4 เชอ Enterobacteriaceae ทสราง carbapenemase ไมไดใหผล MHT บวกทกตว และผล MHT

ทบวกอาจพบในเชอสายพนธทดอ carbapenem ดวยกลไกอนทไมใชการสราง carbapenemase

5.3.3.5 MIC ของ imipenem ส�าหรบ Proteus spp., Providencia spp. และ Morganella

morganii มกจะสงกวา MIC ของ meropenem หรอ doripenem เชอเหลานม MIC ตอ

ยา carbapenem สงอาจเนองจากกลไกอนๆ ทไมใชการสราง carbapenemases

5.3.4 การควบคมคณภาพ

เชอควบคมคณภาพตองท�าการทดสอบบนจานเพาะเลยงเดยวกบเชอททดสอบ และตองท�าการควบคม

คณภาพทกวนทท�าการทดสอบ ใชเชอ K. pneumoniae ATCC BAA-1705 เปน MHT positive control และ K.

pneumoniae ATCC BAA-1706 เปน MHT negative control


MAC ท supplemented ดวย imipenem 1 μg/ml สามารถใชตรวจคดกรองหาเชอ carbapenem-resistant

Enterobacteriaceae (CRE) ท colonize ในทางเดนอาหารไดดวยความไวมากกวา 80% และความจ�าเพาะมากกวา

90% และสามารถใชตรวจหาเชอ carbapenem-resistant Enterobacteriaceae สายพนธทมคา carbapenem MIC ต�าๆ

ไดดวย

6. กำรตรวจคดกรองกำรดอยำ aminoglycoside ระดบสงของเชอ Enterococcus spp.

6.1. หลกกำร การดอยา gentamicin และ/หรอ streptomycin ระดบสง ชบงวาเชอ enterococcal isolate นน

จะไมถกท�าลายโดยการเสรมฤทธของ penicillin หรอ glycopeptides รวมกบ aminoglycoside agar หรอ broth ทม

gentamicin (500 μg/ml) หรอ streptomycin (1,000 μg/ml ในวน หรอ 2,000 μg/ml ในอาหารเหลว) ความเขมขน

สง สามารถใชในการตรวจคดกรองการดอยาดงกลาวได (ตาราง Screening test for Detection of High-Level

Aminoglycoside Resistance (HLAR) in Entrococcus species ใน M100) aminoglycosides อนๆ นอกเหนอจาก

gentamicin และ streptomycin ไมตองน�ามาตรวจคดกรองเพราะไมไดผลทดกวา

Enterococci อาจดอยา penicillin และ ampicillin เนองจากมการผลต low affinity PBPs และอาจเกดจาก

กลไกทพบไดนอย คอ การผลต β-lactamase ทง agar และ broth dilition test สามารถตรวจหาเชอทม altered PBPs

ไดเมนย�า แตไมสามารถตรวจการผลต β-lactamase ได เชอ β-lactamase-producing strains of enterococci สามารถ

ตรวจหาไดโดย nitrocefin-based β-lactamase test ผลบวกของ β-lactamase test ใชในการชบงวาดอตอยา

penicillin. เชอ enterococci ทม ampicillin และ penicillin MICs > 16 mg/ml จดวาดอยา

เชอ Enterococci ทดอ penicillin (MICs ≤ 64 μg/ml) หรอ ampicillin (MICs ≤ 32 mg/ml) ในระดบต�า อาจ

ถกท�าลายโดยการเสรมฤทธของ penicillin รวมกบ gentamicin หรอ streptomycin ในกรณทเชอไมไดดอยา

gentamicin หรอ streptomycin ในระดบสง และผปวยไดรบ high dose of penicillin เชอทดอในระดบสงตอยา

penicillin (MICs ≥ 128 μg/ml) หรอ ampicillin (MICs ≥ 64 μg/ml) อาจไมไดผลดในการเสรมฤทธทกลาวมา

6.2 Disk diffusion test


6.2.1.1 ปายเชอทมความเขมขนเทากบ 0.5 McFarland ลงบน MHA ตามวธการ Standard disk

diffusion test

6.2.1.2 วางแผนยาทดสอบ gentamicin 120 μg หรอ streptomycin 300 μg ลงบนจานเลยงเชอ

ในขอ 6.2.1.1

6.2.1.3 อบเชอท 35+2 °C เปนเวลา 16-18 ชม. ส�าหรบ gentamicin และ 24-28 ชม. ส�าหรบ

streptomycin

6.2.2 การอานและการแปลผล

6.2.2.1 Inhibition zone ขนาด 6 mm รายงานวาดอยาททดสอบ ซงหมายความวา ไมมการเสรม

ฤทธ (synergist) ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบยาทออกฤทธทผนงเซลล เชน

penicillin, ampicillin และ vancomycin

6.2.2.2 Inhibition zone ขนาด 7-9 mm ยงรายงานผลไมได ตองท�าการตรวจยนยนดวย agar

dilution test หรอ broth micro-dilution test


6.2.2.3 Inhibition zone ขนาด ≥ 10 mm รายงานวาไวตอยาทใชทดสอบ ซงหมายความวา มการเสรม

ฤทธ (synergist) ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบยาทออกฤทธทผนงเซลล เชน



รายงานผลดอหรอไวตอยา aminoglycoside ทใชทดสอบ และควรระบขนาดของยาทใชทดสอบ

เชน รายงาน

6.2.3.1 Susceptible to gentamicin (120 μg) หรอ streptomycin (1,000 μg)

6.2.3.2 Resistant to gentamicin (120 μg) หรอ streptomycin (1,000 μg)

6.2.3.3 ไมมการรายงานผล intermediate


6.2.4.1 ใชเชอ E. faecalis ATCC 29212 ส�าหรบการควบคมความไวตอยา aminoglycoside

ของเชอ Enterococcus spp.

6.2.4.2 ใชเชอ E. faecalis ATCC 51299 ส�าหรบการควบคมการดอยา aminoglycoside ของ

เชอ Enterococcus spp.

6.3 Broth microdilution test


6.3.1.1 เตรยมเชอตามวธการ Standard broth dilution method ส�าหรบการท�า susceptibility test

6.3.1.2 ใช BHI broth ทมยา gentamicin 500 μg/ml หรอ streptomycin 1,000 μg/ml

6.3.1.3 อบเชอท 35± 2 °C เปนเวลา 24 ชม. ส�าหรบ gentamicin และ 24-28 ชม. ส�าหรบ

streptomycin ถาไวตอยาตองอบจนครบ 48 ชม.


6.3.2.1 ถาพบมเชอขนแสดงวามการดอยา aminoglycoside ตวทใชทดสอบในระดบสงซง

หมายความวา ไมมการเสรมฤทธ (synergist) ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบสาร

ตานจลชพทออกฤทธทผนงเซลล เชน penicillin, ampicillin และ vancomycin

6.3.2.2 ถาพบไมมเชอขนแสดงวาไวตอยา aminoglycoside ทใชทดสอบ ซงหมายความวา มการ

เสรมฤทธ (synergist) ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบสารตานจลชพทออกฤทธทผนง

เซลล เชน penicillin, ampicillin และ vancomycin


รายงานผลดอหรอไวตอยา aminoglycoside ทใชทดสอบ และควรระบขนาดของสารตานจลชพทใชทดสอบ

เชน รายงาน

6.3.3.1 Susceptible to gentamicin (500 μg/ml) หรอ streptomycin (1,000 μg/ml)

6.3.3.2 Resistant to gentamicin (120 μg/ml) หรอ streptomycin (1,000 μg/ml)


6.3.4.1 ใชเชอ E. faecalis ATCC 29212 ส�าหรบการควบคมความไวตอยา aminoglycoside ของ

เชอ Enterococcus spp.

6.3.4.2 ใชเชอ E. faecalis ATCC 51299 ส�าหรบการควบคมการดอยา aminoglycoside ของเชอ

Enterococcus spp.


6.4 Agar dilution test


6.4.1.1 เตรยมเชอ ตามวธการ Standard agar dilution method ส�าหรบการท�า susceptibility test

6.4.1.2 ใช BHI agar ทมยา gentamicin 500 μg/ml หรอ streptomycin 2,000 μg/ml

6.4.1.3 หยดเชอทเทยบความขนไดเทากบ 0.5 McFarland ปรมาณ10 μl ลงบนอาหารเลยงเชอ

ในขอท 6.4.1.2

6.4.1.4 อบเชอท 35± 2 °C เปนเวลา 24 ชม. ส�าหรบ gentamicin และ 24-28 ชม. ส�าหรบ

streptomycin ถาไวตอยาตองอบจนครบ 48 ชม.


6.4.2.1 ถาพบมเชอขนมากกวาหรอเทากบ 1 โคโลน อานผลวาเชอดอยา แสดงวามการดอยา

aminoglycoside ทใชทดสอบในระดบสง ซงหมายความวา ไมมการเสรมฤทธ (synergist)

ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบยาทออกฤทธทผนงเซลล เชน penicillin, ampicillin

และ vancomycin

6.4.2.2 ถาพบไมมเชอขนแสดงวาไวตอยา aminoglycoside ทใชทดสอบ ซงหมายความวา มการ

เสรมฤทธ (synergist) ของ aminoglycoside ทใชทดสอบกบยาทออกฤทธทผนงเซลล เชน



รายงานผลดอหรอไวตอยา aminoglycosise ทใชทดสอบ และควรระบขนาดของยาทใชทดสอบ เชน

รายงาน

6.4.3.1 Susceptible to gentamicin (500 μg/ml) หรอ streptomycin (2,000 μg/ml)

6.4.3.2 Resistant to gentamicin (500 μg/ml) หรอ streptomycin (2,000 μg/ml)


6.4.4.1 ใชเชอ E. faecalis ATCC 29212 ส�าหรบการควบคมความไวตอยา aminoglycoside

ของเชอ Enterococcus spp.

6.4.4.2 ใชเชอ E. faecalis ATCC 51299 ส�าหรบการควบคมการดอยา aminoglycoside ของเชอ

Enterococcus spp.

7. กำรตรวจคดกรองกำรดอยำ vancomycin ในเชอ Enterococcus spp.

7.1 หลกกำร การตรวจหาเชอ vancomycin resistant enterococci (VRE) ใหไดผลแมนย�าสามารถท�าโดยวธ

agar หรอ broth dilution และยงสามารถทดสอบโดยการใช vancomycin screen plate ทมยา vancomycin 6 μg/ml


7.2.1 เตรยมเชอโดยวธ growth method หรอ direct colony suspension ใหไดความขนเทากบ 0.5 McFarland

7.2.2 เตรยม BHI agar ทมยา vancomycin 6 μg/ml

7.2.3 หยดเชอในขอ 7.2.1 ปรมาณ 1-10 μl ลงบนอาหารเลยงเชอในขอท 7.3.2 หรอใช swab จมเชอและบด

ใหแหงหมาดๆ ปายเปนวงใหไดเสนผานศนยกลางเทากบ 10-15 mm. หรอปายเปนแถบสนๆบน plate

7.2.4 อบเชอท 35± 2 °C เปนเวลา 24 ชม.


7.3 กำรอำนและกำรแปลผล

ถาพบมเชอขนมากกวาหรอเทากบ 1 โคโลน (presumptive vancomycin resistance) ตองท�าการตรวจยนยน

การดอยาโดยหา MIC ของยา vancomycin เพอแยกเชอทดอยา vancomycin ชนด acquired resistance (vanA หรอ

vanB) ออกจากเชอทดอยาชนด intrinsic intermediate level resistance to vancomycin (vanC) เชนเชอ

E. gallinarum และ E. casselifavus ซงม MIC ตอยา vancomycin 8-16 μg/ml


รายงานผลการตรวจคดกรองวาดอหรอไวตอยา vancomycin

Negative report: “Negative - No Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) isolated”

Positive report: “Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium isolated”

เมอพบเชอ enterococci ดอ vancomycin ท�าการวนจฉยชนดของ enterococci และรายงานใหผใชบรการทราบ

ควรรายงานเชอ vancomycin-resistant enterococci ทแยกไดจากผปวยทกรายใหกลมงานทเกยวของกบการควบคม

โรคตดเชอในโรงพยาบาลทราบทนททแยกเชอได


7.5.1 ใชเชอ E. faecalis ATCC 29212 ส�าหรบการควบคมความไวตอยา aminoglycoside ของเชอ

Enterococcus spp.

7.5.2 ใชเชอ E. faecalis ATCC 51299 ส�าหรบการควบคมการดอยา aminoglycoside ของเชอ

Enterococcus spp.

8. กำรตรวจหำกำรดอ vancomycin ของเชอ Staphylococcus coagulase positive โดยวธ agar screen

8.1 หลกกำร ประเทศสหรฐอเมรกาไดรายงานเชอ Staphylococcus aureus ทใหคา MIC ของ vancomycin ตงแต

32 μg/ml-1024 μg/ml ในชวงป 2545-2550 และกลไกของการดอ vancomycin ในเชอกลมนยงไมทราบสาเหตชดเจน

แตพบยนส vanA ในทกสายพนธและคาดวานาจะมาจากการพฒนาของเชอสายพนธทเปน MRSA การตรวจหา S.

aureus ทใหคา MIC ของ vancomycin ≥ 32 μg/ml สามารถใชวธ disk diffusion หรอ vancomycin screen agar และ

การหา MIC แตหากคา MIC < 32 μg/ml จะไมสามารถใชวธ disk diffusion ได ส�าหรบ vancomycin screen agar

สามารถใชไดดในกรณทคา MIC ≥ 8 μg/ml แตไมสามารถตรวจหาเชอ S. aureus ทให MIC 4 μg/ml (vancomycin

intermediate) ได และวธนยงไมถกรบรองใหใชตรวจใน coagulase-negative staphylococci


8.2.1 เตรยม inoculums ของเชอตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชอตอยาดวยวธ disk diffusion

8.2.2 ใช swab จม inoculum แลวแตะขางหลอดเพอบบใหสวนเกนไหลออก น�ามาแตะและวนเปน

วงเสนผานศนยกลาง 10-15 mm บน BHI agar ทผสม 6 μg/ml vancomycin อบเชอท 35± 2 °C

นาน 24 ชม.

8.2.3 ตรวจดโคโลนเลกๆของเชอ (> 1 โคโลน) หรอฝาของเชอบนผว agar หากพบการเจรญดงกลาว

แสดงวาเชอไวตอยา vancomycin นอยลง


กอนรายงานผลตองท�าการวนจฉยเชอซ�า และหาคา MIC ของ vancomycin เพอยนยนวาเชอไวตอยา

vancomycin นอยลง



ทดสอบกบเชอ E. faecalis ATCC 29212 หรอ S. aureus ATCC 29213 (vancomycin susceptible) ซงเปน

negative control และ เชอ E. faecalis ATCC 51299 (vancomycin resistant) ซงเปน positive control

9. D-test

9.1 หลกกำร เปนวธทใชตรวจหา inducible clindamycin resistance ในเชอกลม staphylococci และ β-hemolytic

streptococci ทดอตอยากลม macrolides วธการตรวจสามารถกระท�าได 2 วธ ไดแก disk diffusion และ single well

broth microdilution test แตวธแรกเปนวธทท�าไดงาย จงขอน�ามากลาวไวในทน


9.2.1 เตรยม inoculum ของเชอตามมาตรฐานการทดสอบความไวของเชอตอยาดวยวธ disk diffusion

9.2.2 กรณเชอ staphylococci ให spread บน MHA แตเชอ β-hemolytic streptococci ให spread บน

MHA ท ผสม 5% sheep blood

9.2.3 วาง disk ยา erythromycin (15 μg) และ disk ยา clindamycin (2 μg) ใหหางกน 15 -26 mm .

ส�าหรบเชอ staphylococci และหางกน 12 mm ส�าหรบเชอ β-hemolytic streptococci

9.2.4 อบท 35± 2 °C นาน 16-18 ชม.ส�าหรบเชอ staphylococci และ อบท 35± 2 °C, 5% CO2 นาน

20-24 ชม. ส�าหรบเชอ β-hemolytic streptococci

9.2.5 ตรวจด inhibition zone ของเชอตอยา clindamycin ดานทอยใกลกบ erythromycin วาแบนเปนรป

อกษร D หรอพบการเจรญของเชอภายใน inhibition zone ของยา clindamycin แมจะไมเหน D zone

แสดงวาเชอเปน inducible clindamycin resistance

ภำพท 6-2 ลกษณะของ D-test


หากพบลกษณะดงกลาวขางตนใหรายงานวาเชอดอยา clindamycin และเพมเตมขอความวา inducible

clindamycin resistance


ทดสอบกบเชอ S. aureus ATCC BAA-976 ซงเปน D-zone test negative control และ เชอ S. aureus ATCC

BAA-977 ซงเปน D-zone test positive control


10. E-test

10.1 หลกกำร

Epsilometer test (E-test) เปนวธการทางหองปฏบตการทใชตรวจหาความไวของเชอแบคทเรยหรอ

เชอราตอสารตานจลชพแบบปรมาณวเคราะหโดยอาศยหลกการของ agar diffusion method ใชแถบทเปน

rectangular strip ซงมสารตานจลชพทตองการทดสอบเคลอบอยในปรมาณทลดหลนเปนสดสวนกบต�าแหนง

บนแถบยา เมอวางแถบยาทดสอบบน agar plate ทปายเชอททดสอบไว ยาในแถบทดสอบจะแผกระจาย

(diffuse out) ไปในเนอวนเกดเปน exponential gradient ทแถบยาทดสอบมตวเลข บอกปรมาณสารตาน

จลชพในแตละต�าแหนง หลงจากเพาะไว 24 ชม. จะเกด inhibition zone ลกษณะเปนวงร (elliptical zone of

inhibition) จดตดของ inhibition zone กบขอบของแถบยาทดสอบ จะเปนคา MIC (minimum inhibitory

concentration) ทอานไดดงแสดงในรป

E-test เหมาะส�าหรบการทดสอบหาคา MIC ของเชอทตองการทดสอบกบสารตานจลชพเพยงชนดเดยว

หรอไมกชนด เนองจากท�าไดสะดวกและมความเมนย�าสง แตแถบยาทดสอบทใชมราคาสง งานบรการประจ�าวน

ทใช E-test เชน การหาคา MIC vancomycin ในเชอ Staphylococcus spp., MIC penicillin, cephalosporins,

vancomycin ในเชอ Streptococcus pneumoniae

ภำพท 6-3 Epsilometer test (E-test)


10.2.1 ปายเชอทมความเขมขนเทากบ 0.5 McFarland ลงบน MHA ตามวธการ Standard disk diffusion test

10.2.2 วางแถบยาทดสอบ E-test ลงบนผววนทใชเพาะเลยงเชอตามขอ 10.2.1 โดยใหดานทมตวเลขบอก

ปรมาณอยดานบนและใหผวของแถบยาทงแถบแนบกบผว agar อาจใช forceps กดแถบยา เบาๆ

ไมใหมฟองอากาศใตแถบยา

10.2.3 จานเพาะเลยงเชอขนาด 100 mm วางแถบยา E-test ไดหนงแถบ จานขนาด 150 mm วางได

6 แถบ


10.2.4 อบเชอตามอณหภมและเวลาทเหมาะสมส�าหรบสารตานจลชพและเชอแตละชนดตามการ

ทดสอบ disk diffusion test

10.3 กำรอำนและกำรแปลผล

10.3.1 จดตดของ inhibition zone ทเปนวงรกบขอบของแถบยาทดสอบ E-test จะเปนคา MIC

(minimum inhibitory concentration) โดยสามารถอานคาตามตวเลขทระบบนแถบยาทดสอบ

ทต�าแหนงจดตดน

10.3.2 กรณไมม inhibition zone คอเชอขนชดขอบของแถบยาตลอดแนว รายงานคา MIC มากกวา

คาสงสดของความเขมขนยาทระบบนแถบยา E-test

10.3.3 กรณทจดตดของ inhibition zone อยต�ากวาปรมาณยาทต�าสดของ E-test รายงานคา MIC ต�า

กวาคาต�าสดของยาทระบบนแถบยา E-test

10.3.4 กรณ MIC ทอานไดอยระหวางคาทระบบนแถบยา ใหรายงาน MIC ตามคาทสงกวาจดตด

ของ inhibition zone กบขอบของแถบยา


10.4.1 ใชเชอ E. coli ATCC 25922 ส�าหรบการควบคมคณภาพการทดสอบความไวของเชอ

แบคทเรยแกรมลบ

10.4.2 ใชเชอ S. aureus ATCC 29213 ส�าหรบการควบคมคณภาพการทดสอบความไวของเชอ

แบคทเรยแกรมบวก

10.4.3 ใชเชอ P. aeruginosa ATCC 27853 ส�าหรบการควบคมคณภาพการทดสอบความไวของเชอ

แบคทเรยแกรมลบ Non-fermentative

10.4.4 ท�าการควบคมคณภาพตามความเหมาะสม ส�าหรบเชอและยาแตละชนดตามทใชในการทดสอบ

แบบ disk diffusion test



1. Adler A, Navon-Venezia S, Moran-Gilad J, Marcos E, Schwartz D, Carmeli Y. Laboratory and Clinical

evaluation of screening agar plates for detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae from sur

veillance rectal swabs. J Clin Microbiol 2011; 49: 2239-2242.

2. Hindler JF and Munro S. Beta-lactamase Test. In Garcia, L.S. editor in chief. Clinical Micro

biology Procedures Handbook, 3rd edn. ASM Press. Washington DC; 2010.p.5.1.3-5.1.6

3. Landman D, salamera J, Singh M, Quale J. Accuracy of carbapenem nonsusceptibility for identification

of KPC-possessing Enterobacteriaceae by use of the revised CLSI breakpoints. J Clin Microbiol

2011;49:3931-3933.

4. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved

Standard-Ninth Edition. CLSI M07-A49 January 2012.

5. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Tenth Edition.

CLSI M02-A10 January 2009.

6. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard Eleventh Edition.

Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M2-A11, Wayne, PA.

7. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for bacteria That Grow Aerobically; Approved

Standard-Ninth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M07-A9, Wayne, PA.

8. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty Informational Supplement (June

2010, Update). Clinical and Laboratory Standard Institute, 2010 M100-S20-U (June 2010, Update). Wayne, PA.

9. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Second Informational

Supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute 2012 M100-S22, Wayne, PA.

10. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement.

CLSI M100-S24 January 2014.

11. Willey B. M., B. N. Kreiswirth, A. E. Simor, G. Willaims, S. R. Scriver, A. Phillips, D. E. Low Detection

of vancomycin resistance in Enterococcus species. J Clin Microbiol 1992; 30: 1621-1624.

12. Willey B. M., R. N. Jones, A. McGeer, W. Witte, G. French, R. B. Roberts, S. G. Jenkins, H. Nadler, D.

E. Low Practical Approach to the Identification of Clinically Relevant Enterococcus Species Diag

Microbiol Infect Dis 1999; 34: 165-171.

บทท7

การควบคมคณภาพในหองปฏบตการ

แบคทเรย


การควบคมคณภาพในหองปฏบตการแบคทเรยปทมพศ วมลวตรเวท

การควบคมคณภาพในหองปฏบตการแบคทเรยนบวามความส�าคญอยางยงในการทจะน�าผลการตรวจวเคราะห

ไปใชเปนแนวทางในการรกษาผปวย ปองกนการแพรกระจายของเชอโรคไดอยางถกตองและเปนไปอยางม

ประสทธภาพ ซงผปฏบตงานจะตองมความรความสามารถในการตรวจวเคราะหเพอใหทราบถงสาเหตของการกอ

ใหเกดโรค การควบคมคณภาพใหไดผลดควรมการปรบปรงคณภาพและแกไขขอผดพลาดทเกดขนอยางตอเนอง

ในทกขนตอนตงแตกระบวนการกอนการตรวจวเคราะห เชน การเกบสงสงตรวจ การน�าสงสงตรวจสงหองปฏบต

การ กระบวนการในการตรวจวเคราะห ซงรวมถงการเตรยมอาหารเลยงเชอ การแยกวนจฉยเชอ การตรวจสอบทาง

น�าเหลองวทยา การทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ และกระบวนการหลงการตรวจวเคราะห

แนวทางการควบคมคณภาพในหองปฏบตการแบคทเรย มดงน

1. กระบวนกำรกอนกำรวเครำะห

1.1 คมอคณภำพกำรปฏบตงำน หองปฏบตการตองมการจดเตรยมเอกสารคมอคณภาพตางๆ

1.1.1 คมอในการเกบสงสงตรวจตางๆ เพอใชเปนแนวทางในการเกบสงสงตรวจ แจกจายใหกบผใช

บรการ และตามหอผปวยตางๆ โดยระบถงวธการเกบทถกตอง ปรมาณของสงสงตรวจชนดและประเภทภาชนะท

ใชในการเกบสงสงตรวจ พรอมทงระบสภาวะและก�าหนดระยะเวลาในการน�าสงยงหองปฏบตการ เพอปองกน

ไมใหสงสงตรวจแปรสภาพหรอแปรสภาพนอยทสดกอนท�าการวเคราะห

1.1.2 คมอคณภาพในการปฏบตงานทเปนปจจบน เชน คมอการตรวจวนจฉยสงสงตรวจชนดตางๆ ขอ

ควรระมดระวงและขอพงปฏบตในหองปฏบตการ การใชและการบ�ารงรกษาอปกรณเครองมอตางๆ รวมถงการ

ตดตอสอสารกบผใชบรการ

1.2 กำรเกบสงสงตรวจและกำรน�ำสงหองปฏบตกำร

สงสงตรวจทน�าสงหองปฏบตการนน จ�าเปนอยางยงทจะตองมการเกบใหถกวธและเลอกเกบจากบรเวณท

เกดสภาวะของโรค ถาสงสงตรวจมการเกบไมถกตองจะมผลถงการแยกวนจฉยเชอแบคทเรยทเปนสาเหตของการ

กอโรค นอกจากนนกระบวนการในการน�าสงยงหองปฏบตการจะตองเปนไปตามขอก�าหนดของหองปฏบตการ

ในขณะน�าสงหองปฏบตการ

1.3 ใบน�ำสงสงสงตรวจ

ตองมการระบชอ นามสกล อาย เพศ HN ของผปวย การวนจฉยเบองตนของแพทยทชดเจน ซงเปนสวน

ประกอบทมความส�าคญ ในการใชเปนแนวทางในการตรวจวเคราะห

1.4 ภำชนะบรรจสงสงตรวจ

ภาชนะทบรรจสงสงตรวจไปยงหองปฏบตการตองสะอาดมฝาปดใหเหมาะสม ตองไมมสงสงตรวจรวซม

มขนาดเหมาะสมกบสงสงตรวจทจะเกบ ปายชอและรายละเอยดของผปวยทตดไวขางภาชนะจะตองเขยนใหชดเจน

และตดแนนไมลอกหรอหลดงาย

1.5 กำรตรวจสอบสงสงตรวจ

ชนดของสงสงตรวจทจดเกบสงหองปฏบตการ ตองถกตองตรงกบทระบไวในใบน�าสง และมปรมาณท

พอเพยงตามทหองปฏบตการก�าหนดไวและตองน�าสงหองปฏบตการตามระยะเวลาทก�าหนด ในการรบสงสงตรวจ

หองปฏบตการจะตองตรวจสอบดความเรยบรอยของภาชนะทบรรจสงสงตรวจโดยจะตองไมมการแตก รวซม หรอ

มการหกเลอะเทอะ ตองตรวจสอบชอ นามสกล อาย เพศ HN ใหตรงกบระบไวในใบน�าสงสงสงตรวจ


หองปฏบตการจะตองมการก�าหนดเกณฑในการรบหรอปฏเสธสงสงตรวจ การสงสงสงตรวจเพอใหหอง

ปฏบตการตรวจวเคราะหนนจ�าเปนตองมใบน�าสงสงสงตรวจมาพรอมกบสงสงตรวจเสมอ และสงสงตรวจจะตอง

มคณสมบตถกตองตามเกณฑทหองปฏบตการก�าหนด

2. กระบวนกำรในกำรตรวจวเครำะห

2.1 บคลำกร

บคลากรทปฏบตงานในหองปฏบตการแบคทเรย จะตองเปนผ ทมความรความสามารถ และม

ประสบการณในการปฏบตงานในการตรวจวเคราะห ควรมการจดท�าบนทกการฝกอบรมและตองไดรบการพฒนา

เพอเพมพนทกษะอยเสมอ การปฏบตงานจะตองปฏบตตาม universal precaution

2.2 สถำนทและสงแวดลอม

พนทในการปฏบตการตรวจวนจฉยเชอแบคทเรยนน จะตองมพนททเหมาะสมแยกเปนสดสวนเพอ

ปองกนไมใหเกดการปนเปอนและแพรกระจายของเชอโรค มการถายเทอากาศทดและมอณหภมทเหมาะสม ม

แนวทางปฏบตทไมใหบคลากรทไมเกยวของเขาปฏบตการ

2.3 สงสงตรวจ

ผปฏบตงานในหองปฏบตการแบคทเรยกอนปฏบตงานจะตองตรวจสอบวาสงสงตรวจนนเหมาะสม

เชน สงสงตรวจทเปนเสมหะจะตองไมใชน�าลายหรอมน�าลายปนเปอนมาก ภาชนะทบรรจสงสงตรวจตองไมมการ

รวซม หรอมสงสงตรวจหกเลอะเทอะ ตรวจสอบ ชอ นามสกล HN และชนดสงสงตรวจใหตรงกบใบน�าสงอกครง

กอนด�าเนนการตรวจวเคราะห ระยะเวลาในการน�าสงและสภาวะของสงสงตรวจตองเปนไปตามเกณฑทก�าหนด

2.4 กำรด�ำเนนกำรตรวจวเครำะห

หองปฏบตการจะตองมการจดท�านโยบายและระบบในการบรหารจดการระเบยบในการปฏบตงาน ม

การเลอกวธการตรวจวนจฉยเชอแบคทเรยทเหมาะสม จดท�าเปนคมอคณภาพและสอสารใหบคลากรทกคนรบ

ทราบ

2.4.1 อำหำรเลยงเชอ

หองปฏบตการจะตองมการตรวจสอบคณสมบตของอาหารเลยงเชอ มการบนทกวนท ทไดรบจาก

บรษทผแทนจ�าหนาย บนทกวนททมการเปดใชใหมทกครง หลงการใชงานตองปดฝาใหสนทแนน เกบไวในอณหภม

ทเหมาะสมตามชนดของอาหารเลยงเชอทระบไวขางภาชนะทบรรจ และจดท�า stock ใหเพยงพอตอการใชงาน ซง

ขนกบปรมาณงานของแตละหองปฏบตการ

ในการเตรยมอาหารเลยงเชอใหปฏบตตามทระบไวทขวดของอาหารเลยงเชอแตละชนดโดยเครงครด

ตองอานฉลากขางขวดใหละเอยด มการตรวจสอบและค�านวณน�าหนกใหถกตอง เนองจากอาหารเลยงเชอของ

แตละบรษทจะใชปรมาณไมเทากน อาหารเลยงเชอทหมดอาย หรอจบกนเปนกอนแขงหรอมสเปลยนไป ไมควร

น�ามาใช เมอใชเสรจแลวตองปดฝาขวดอาหารเลยงเชอใหสนท หลงจากชงเสรจเรยบรอยแลว ควรใชน�าลางอาหาร

เลยงเชอทตดบนกระดาษชงสารลงไปในภาชนะทใชเตรยมดวย เพอจะไดปรมาณของอาหารเลยงเชอทถกตอง

เมอเตรยมอาหารเลยงเชอเสรจแลว ใหสงเกตสวาผดปกตหรอไม ตรวจสอบ pH คา pH ทวดไดไมควร

เกน ± 0.2 ของคา pH ทก�าหนด โดยตรวจสอบหลงจากทงไวใหเยนทอณหภมหอง ตองตรวจสอบดวยวาอาหาร

เลยงเชอชนดใดบางทไมตองน�าเขา autoclave หรอบางชนดตองท�าใหปลอดเชอโดยการกรอง ส�าหรบอาหารเลยง


เชอทตองเตมสาร enrichment ตองท�าใหอาหารเลยงเชอเยนลงประมาณ 50-55 °C กอน เนองจากสาร enrichment

สวนใหญจะไมทนตอความรอน การตรวจสอบคณสมบตของอาหารเลยงเชอนนจะตองใชเชอมาตรฐานตามท

ก�าหนดไวดงตารางท 7-1

ตำรำงท 7-1 เชอมำตรฐำนทใชในกำรควบคมคณภำพอำหำรเลยงเชอ

Medium Length of

incubation

Control organism b ATCCc

no.

Expected resultsd

Acetamide agar 1-4 days Pseudomonas aeruginosa

Stenotrophomonas

maltophilia

27853

13637

Pink to red

No color change

Acetate agar 1-2 days Escherichia coli

Shigella flexneri

25922

12022

Growth; ( blue

No growth or color

change

α-Hemolytic Streptococcus

agar

1 day Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes


E. coli

6305

19615

25923

25922

Growth; α-hemolysis

Growth; β-hemolysis

Inhibition

Inhibition

Blood agar basee 1 day S. pneumoniae

S. pyogenes

S. aureus

E. coli

6305

19615

25923

25922



Growth

Growth

Blood culturee

aerobic (vented) bottle

1-7 days P. aeruginosa

S. pneumoniae

Haemophilus

influenzae

27853

6305

10211

Growth

Growth

Growth

Anaerobic(unvented)

bottle biphasic bottle

1-7 days S. pneumoniae

B. fragilis

Candida albicans

S. pyogenes

6305

25285

10231

19615

Growth

Growth

Growth

Growth


Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Bordet-Gengou agar 1-4 days Bordetella bronchisepticaBordetella pertussisS. aureus

10580

12742

25923

Growth

Growth

Inhibition

Campylobacter agars 2-3 days Campylobacter jejuni

Staphylococcus

epidermidis

E. coli

P. mirabilis

P. aeruginosa

C. albicans

33291

12228

25922

12453

27853

10231

Growth

Inhibition

Inhibition

Inhibition

Inhibition on some

selective media but

growth on Campy,

BAP, Skirrow,

THIO

Inhibition on some

selective media but

growth on Campy,

Skirrow, Preston

Cetrimide agar 1day P. aeruginosa

E. coli

S. maltophilia

27853

25922

13637

Growth; fluorescein

pigment

Inhibition

Inhibition

Chocolate agar 1-3 days Neisseria gonorrhoeae

H. influenzae

43069 or

43070

10211

Growth

Growth

Modified Thayer-Martin,

Martin-Lewis,

modified Martin-Lewis

N. gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

S. epidermidis

E. coli

P. mirabilis

C. albicans

Neisseria sicca

43069

13090

12228

25922

43071

60193

9913

Growth

Growth

Inhibition

Inhibition

Inhibition

Inhibition

Inhibition

ตำรำงท 7-1 เชอมำตรฐำนทใชในกำรควบคมคณภำพอำหำรเลยงเชอ (ตอ)


Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Clostridium difficile agar 2 days Clostridium difficile

C. perfringens

B. fragilis

E. coli

9689

13124

25285

25922

Growth

Inhibition

Inhibition

Inhibition

Columbia agar basee

5% Sheep blood

Colistin-nalidixic acide

1 day S. pyogenes

S. pneumoniae

S. aureus

P. mirabilis

19615

6305

25923

12453



Growth

Inhibition

Cooked meat 2 days C. perfringens

B. fragilis

13124

25285

Growth; proteolysis

Growth

Cystine lactose electrolyte

decient agar (CLED agar)

1 day S. aureus

E. coli

Proteus vulgaris

25923

25922

8427

Growth;yellow

Growth;yellow

Growth;blue-green

Control

(nocarbohydrate added)

Glucose

N. gonorrhoeae

N. gonorrhoeae

Moraxella catarrhalis

43069

43069

25240

No color change or deep

red

Yellow

No color or deep red

Lactose Neisseria lactamica

N. gonorrhoeae

23971

43069

Yellow


Maltose N. meningitidis

N. gonorrhoeae

13090

43069

Yellow


Mannitol Enterococcus faecalis

S. pyogenes

29212

19615

Yellow


Sorbitol E. faecalis

Streptococcus bovis

29212

9808

Yellow


Sucrose Neisseria sicca

N. gonorrhoeae

9913

43069

Yellow


Decarboxylase broth 4 days

Control

(no amino acid added)

K. pneumoniae

Enterobacter cloacae

13883

13047

Yellow or no change

Purple to yellow-purple



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Arginine K. pneumoniae 13883 Yellow or no change

Lysine K. pneumoniae


13883

13047


Yellow or no change

Ornithine E. cloacae

K. pneumoniae

13047

13883


Yellow or no change

Deoxycholate agar 1-2 days Salmonella enterica

serotype Typhimurium

S. flexneri

E. coli

E. faecalis

14028

12022

25922

29212

Growth; colorless

Growth; colorless

Growth; pink to red

inhibition

Egg yolk agar 1-2 days C. perfringens

Clostridium sporogenes

13124

3584

Lecithinase + lipase -

Lipase + lecithinase -

Eosin methylene bluee 1 day S. enterica serotype

Typhimurium

E. faecalis

E. coli

14028

29212

25922

Growth; colorless

Inhibition (partial)

Growth; blue-black

with metallicsheen

Esculin

Bile esculin agare 1-3 days E. coli 25922 Inhibition

Bile esculin azide agar 1-2 days E. faecalis

S. pyogenes

29212

19615

Growth; blackens agar

Inhibition

Esculin agar 1-3 days K. pneumoniae

E. coli

13883

25922

Growth; blackens agar

Growth

Gardnerella agar 1-2 days Gardnerella vaginalis

P. mirabilis

14018

12453

Growth;β-hemolysis

Inhibition

Gelatin 2-14 days S. marcescens

E. coli

43861

25922

Medium liquefied

Medium remains solid

Gram-negative brothe 2-8 days S. enterica serotype

Typhimurium

Shigella sonnei

E. coli

14028

9290

25922

Growth on subculture


Inhibition



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Heart infusion fepmentation

base

3-5 days

Control

(no carbohydrate added)

K. pneumoniae 13883 No color change

Adonitol E. aerogenes

E. coli

13048

25922

Yellow

No color change

Arabinose E. aerogenes

S. marcescens

13038

43861

Yellow

No color change

Glucose E. coli

M. osloensis

25922

10973

Yellow; gas

No color change; no gas

Inositol E. aerogenes

E. coli

13048

25922

Yellow

No color change

Inulin S. pneumoniae

S. bovis

6305

9809

Yellow

No color change

Lactose E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

No color change

Maltose E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

No color change

Mannitol E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

No color change

Melibiose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

No color change

Raffinose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

No color change

Rhamnose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

No color change

Salicin E. aerogenes

Salmonella spp.

13048

35664

Yellow

No color change

Sorbitol E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

No color change



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Sucrose E. aerogenes

Salmonella sp.

13048

35664

Yellow

No color change

Trehalose E. coli

Edwardsiella tarda

25922

15947

Yellow

No color change

Hektoen enteric agare 1-2 days S. enterica serotype

Typhimurium

S. flexneri

E. coli

14028

12022

25922

Growth;blue-green

colonies ( black centers)

Growth; green with blue-

green centers)

Partial inhibition; yellow

colonies

Hippurate broth 2 days Streptococcus agalactiae

S. pyogenes

12386

19615

Precipitate that does

not dissolve with shaking

Precipitate that dissolves

with shaking

Loeffler 1 day Corynebacterium

diphtheriae

Corynebacterium

pseudodiphtheriticum

13812

10700

Growth

Growth

Lysine iron agar 1 day P. mirabilis

S. enteric serotype

Typhimurium

S. flexneri

12453

14028

12022

Red slant; H2S; acid butt

Alkaline slant; H2S;

alkaline butt

Alkaline slant; acid butt

MacConkey MACe 1-2 days P. mirabilis

E.coli

S. enterica serotype

Typhimurium

E. faecalis

12453

25922

14028

29212

Colorless colony;

inhibition of swarming

Red colony

Colorless colony

Inhibition

Malonate broth 1–2days E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Green or yellow

Blue to Prussian blue



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Mannitol salt agare 1- 2days S. aureus

S. epidermidi

P. mirabilis

25923

12228

12453

Colonies have yellow

zones

Colonies have red zones

Inhibition

Methylred - Voges Proskauer

(MR - VP)

1-5 days E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

MR + ; VP –

MR - ; VP +

Motility-indole-lysine 1 day E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Mot+;Ind+;Lys-Mot-;Ind-;Lys+

Motility-indole-ornithine 1 day E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Mot+;Ind+;Orn+

Mot-;Ind-; Orn-

Motility test 1 day E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Positive

Negative

Nitrate reduction

(agar or broth)

1-5 days P. mirabilis

P. aeruginosa


12452

27253

15308

Positive + gas

Positive + gas

Negative

Nutrient basee

(agar or broth)

1 day S. aureus

E. coli

25923

25922

Growth

Growth

Phenol red

(agar or broth) 1 day

Adonitol E. aerogenes

E. coli

13048

25922

13048

25922

Arabinose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

Red or no change

Arabitol K. pneumoniae

M. morganii

13883

25830

Yellow

Red or no change

Dulcitol C. freundii

S. marcescens

8090

43861

Yellow

Red or no change

Glucose E. coli

M. osloensis

25922

10973

Yellow

Red or no change



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Inositol E. aerogenes

E. coli

13048

25922

Yellow

Red or no change

Lactose E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

Red or no change

Raffinose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

Red or no change

Rhamnose E. aerogenes

S. marcescens

13048

43861

Yellow

Red or no change

Sorbitol E. coli

P. mirabilis

25922

12453

Yellow

Red or no change

Trehalose K. pneumoniae

M. morganii

13883

25830

Yellow

Red or no change

Phenylalanine agar 1 day P. mirabilis

E. coli

12453

25922

Positive

Negative

Pyruvate broth 3-5 days E. faecalis

S. bovis

29212

9809

Yellow

No change or

yellow-green

Salmonella-shigella agare 1 day S. enterica serotype

Typhimurium

S. flexneri

E. coli

E. faecalis

14028

12022

25922

29212

Colorless colonies +

black centers

Colorless colonies

Inhibition or pink

colonies

Inhibition

Salt tolerance (6.5% NaCl) 1 day E. faecalis

S. bovis

29212

9809

Growth

No growth

Simmons citrate agar 1-2 days K. pneumoniae

E. coli

13883

25922

Growth ± blue

No growth or color

change

ตำรำงท 7-1 เชอมำตรฐำนทใชในกำรควบคมคณภำพอำหำรเลยงเชอ


Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Streptococcus group B

selective broth

1 day S. agalactiae

E. coli

12386

25922

Growth

Inhibition

Streptococcus selective

(trypticsoy), sheep

blood + neomycin,

and sheep blood +

trimethoprim

sulfamethoxazole

1 day S. pneumoniae

S. pyogenes

S. aureus

P. mirabilis

6305

19615

25923

12453



Inhibition

Inhibition

Thiosulfat ecitrate bile salts

agar (TCBS)

1 day Vibrio alginolyticus

Vibrio parahaemolyticus

E. coli

17749

17802

25922

Yellow colony

Green colony

Inhibition

Thioglycolatee broth

( ± Indicator)

3-7 days S. aureus

Clostridium novyi A

C. perfringens

P. levii

Bacteroides vulgatus

25923

7659

13124

29147

8482

Growth

Growth

Growth

Growth

Growth

Todd-Hewitt broth 4 -18 h S. pyogenes

E. faecalis

19615

29212

Growth

Growth

Transport media

Amies or Stuarts

± charcoal

Cary-Blair or enteric

pathogen

6-8 h

1 day

S. pyogenes

N. gonorrhoeae

C. jejuni

S. flexneri

Yersinia enterocolitica

19615

43069

33291

12022

9610






Triple-sugar iron agar 1 day S. enteric serotype

Typhimurium

E coli

P. aeruginosa

14028

25922

27853

Alkaline slant; acid

butt; H2S + ; + gas

Acid slant; acid butt;

no H2S; gas

Alkaline slant and

butt; no H2S; no gas



Medium Length of

incubation


no.

Expected resultsd

Tryptic soy (aerobic)

Plain agar or brothe

Sheep blood agare

1 day

1 day

S. pyogenes

E. coli

S. pneumoniae

S. pyogenes

S. aureus

E. coli

19615

25922

6305

19615

25923

25922

Growth

Growth



Growth

Growth

Tryptone 1 day E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Positive for indole

Negative for indole

Urea broth or agar 1 day P mirabilis

E. coli

12453

25922

Pink to red

No change or pale

yellow

Xylose lysine

deoxycholate agare (XLD)

1-2 days S. enterica serotype

Typhimurium

S. flexneri

E. coli

E. faecalis

14928

12022

25922

29212

Red colony with

black center

Red colony

Partial inhibition;

yellow colony

Inhibition

aAbbreviations are as follows.

A, for testing nutritive properties. Dilute standardized cell suspension (0.5McFarland standard) 1:100 (0.1 ml

of suspension plus 9.9 ml of saline). Inoculate each medium with 10 μl of dilution. If isolated colonies are

not obtained, use 10-fold-lighter inoculum.

B, for testing elective properties. Dilute standardized cell suspension (0.5 McFarland standard) 1:10 (0.1 ml of

suspension plus 0.9 ml of saline). Inoculate each medium with 10 μl of dilution.

C, for testing tubed media. Inoculate medium with 10 μl of the standardized suspension (0.5 McFarland

standard). Adjust the inoculums if heavier or lighter growth is required.

D, for testing biochemical media. Inoculate each medium according to the procedure for the routine use of the

medium.

E, for testing transport media. Place a sterile swab in the standardized suspension (0.5 McFarland standard),

squeeze out excess fluid on the wall of the tube, and submerge the swab in the transport medium. Hold at

room temperature, and plate on the appropriate medium.



bOrganisms recommended for QC testing of media (2,7–12, 14, 16, 17). Although American Type Culture

Collection strains are listed, any organism that will yield an identical result is acceptable. cATCC, American Type Culture Collection. dMR, methyl red; VP, Voges Proskauer; Mot, motility; Ind, indole; Lys, lysine; Orn, ornithine; +, positive; -,

negative; oxidation, color change in open tube; fermentation, color change in over laid tube. eExempt from QC by user (14).Applie sonly to commercially prepared media.

กำรเกบอำหำรเลยงเชอทเตรยมแลว

อาหารเลยงเชอชนดเหลวทเตรยมแลวนนถาเปนอาหารเลยงเชอทไมคอยไดใชและตองการเกบไวใชนานๆ

ควรจะใชหลอดแกวจกเกลยว เกบไวท 2-8 °C ยกเวน Thioglycollate broth ใหเกบทอณหภมหองไมใหถกความ

รอนและแสงแดด ส�าหรบอาหารเลยงเชอทเท plate ควรเกบไวในตเยน และถาจ�าเปนตองเกบไวนานใหบรรจในถง

พลาสตกปดสนท อายการใชงานของอาหารเลยงเชอขนอยกบชนดของภาชนะทบรรจและอณหภม ดงตารางท 7.2

ตำรำงท 7-2 อำยกำรใชงำนของอำหำรเลยงเชอทเตรยมแลว

ประเภทอำหำรเลยงเชอ ไมไดบรรจ

ในถงปดสนท

บรรจ

ในถงปดสนท

อณหภม

Plate 2 สปดาห* 4 เดอน* 2-8 °C

Tube จกส�าลหรอจกหลวมๆ 2 สปดาห 2 เดอน 2-8 °C

Tube screw capped 2 เดอน 4 เดอน 2-8 °C

CTA 2 สปดาห - อณหภมหอง

Indole, nitrate broth - 2 สปดาห อณหภมหอง

Thioglycollate 4 เดอน - อณหภมหอง

* กรณทเปน selective medium ทเตรยมเองมอายการใชงานนอยกวา เชน TCBS มอายการใชงานเพยง 1 สปดาห

(ตามก�าหนดของ Mindy J Perilla, et al. 2003. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Sus-

ceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. WHO.CDS/

CSR/RMD/2003.6) Mueller Hinton agar มอายการใชงานเพยง 1 สปดาห (ตามก�าหนดของ CLSI) รายละเอยดด

ในภาคผนวก

กำรตรวจสอบ sterility

อาหารเลยงเชอทเตรยมในแตละครง ควรมการสมตวอยางอยางนอย 5-10% ถาพบเชอเจรญมากกวา 2

colonies/plate ใหทงทงหมด


2.4.2 สและน�ำยำตำงๆ

สและน�ายาทใชในการทดสอบในหองปฏบตการแบคทเรยควรมการตรวจสอบคณภาพหรอคณสมบต

กอนใชงาน หรอตามความเหมาะสม ซงความถในการทดสอบขนอยกบความคงตว (stability) ของสารนนๆ ถา

สงเกตเหนวาสทใชในการยอมมสเปลยนไปหรอน�ายาทใชมความขนหรอมตะกอนไมควรน�ามาใชงาน

ตำรำงท 7-3 เชอมำตรฐำนทใชในกำรทดสอบคณภำพของสและน�ำยำตำงๆ

Stain Control organisma ATCCb

No.

Expected results Frequency of testing

Acid-fast

Fluorochrome

Modified (Nocardia)

Ziehl-Neelsen

Mycobacterium tuberculosis

Escherichia coli

Nocardia asteroides

Streptomyces spp.

M. tuberculosis

E. coli

25177

25922

19247

25177

25922

Yellow-green florescing

bacilli

No fluorescing bacilli

Pink-red bacilli

Blue bacilli

Pink-red bacilli

Blue bacilli

Each lot and each day of

use


use


use

Bacitracin disk Streptococcus pyogenes

Streptococcus agalactiae

19615

12386

Zone of inhibition

No zone of inhibition

Each batch, lot number,

and shipment

β-Lactamase disks Staphylococcus aureus

H. influenzae

25923

10211

Positive; red

Negative; no color change


use (other than cefinase)


and shipment (cefiase)

Catalase (3% H2O

2) S. aureus

S. pyogenes

25923

19615

Positive (bubbles)

Negative (no bubbles)


and shipment

Coagulase S .aureus

Staphylococcus epidermidis

25923

12228

Positive (any clotting)

Negative (no clotting)


and shipment

Deoxycholate (10%)

(bile solubility test)

Streptococcus pneumoniae

Enterococcus faecalis

6305

29212

Positive (lysis)

Negative (no lysis)


and shipment

Ferric chloride (10%) Proteus vulgaris

Escherichia coli

33420

25922

Positive (green)

Negative (no color change)


and shipment

Flagellum Proteus mirabilis

Klebsiella pneumoniae

12453

13883


No flagella

Each lot and each use

Gram E. coli

S. aureus

25922

25923

Gram-negative bacilli

Gram-positive cocci


use


Stain Control organisma ATCCb

No.

Expected results Frequency of testing

Indole (spot, Kovacs,

or Ehrlich)

E.coli

Pseudomonas aeruginosa

25922

27853

Positive (color depends

on reagent)

Negative ( no color change)


and shipment

Methyl red E. coli

K. pneumoniae

25922

13883

Positive (red)



and shipment

Nitrate reagents E. coli


25922

19606

Positive (red)



and shipment

ONPGc E. coli

Proteu smirabilis

2 5922

29245

Positive (yellow)



and shipment

Optochin disk (10 μg) S. pneumoniae

E. faecalis

6305

29212

Zone of inhibition ≥16mm

No zone of inhibition


and shipment

Oxidase P. aeruginosa

E. coli

27853

25922

Positive (red to blue-black)



and shipment

Spore Bacillus spp. Spores stain one color and

bacillus stains with

counter stain

Each lot and each week

of use

Voges-Proskauer Enterobacter cloacae

E. coli

13047

25922

Positive(red)



and shipment

X,V, and XV disks or

strips

H. influenzae 10211 Growth around XV and

Only between X and V

when closely spaced


and shipment

a Organisms recommended for QC testing of strains.b ATCC, America Type Culture Collectionc orthonitrophenyl-β-galactosidase

ตำรำงท 7-3 เชอมำตรฐำนทใชในกำรทดสอบคณภำพของสและน�ำยำตำงๆ (ตอ)


2.4.3 Antiserum

ควรมการบนทกวนทเมอไดรบ antiserum จากบรษทผขาย และเกบในอณหภม ทระบไวขางขวด

(4-8 °C) ถาเปน lyophilized form ใหบนทกวนทเมอท�าการละลายไวบนฉลากดวย ควรมการตรวจสอบกบเชอ

control ทกครง เมอไดรบจากบรษทผขาย และควรตรวจสอบทกเดอนหรอเมอมกรณทสงสย โดยท�าการตรวจ

สอบทง positive และ negative control organisms หามน�ามาใชงานเมอ antiserum นนหมดอาย

2.4.4 อปกรณและเครองมอตำงๆ

อปกรณและเครองมอตางๆ ควรมการบ�ารงรกษาใหมการใชงานไดดและมประสทธภาพอยาง

สม�าเสมอ ควรมการจดท�าแผนในการบ�ารงรกษาและตรวจสอบประสทธภาพของอปกรณเครองมอทกชนด ใน

หองปฏบตการตามความเหมาะสมของการใชงานของเครองมอนนๆ

Autoclave

- เปลยนถายน�า และท�าความสะอาดใน chamber อยางนอยทกสปดาห หรอเมอมอาหารเลยงเชอหกลงใน

chamber

- กอนใชงานทกครงใหตรวจสอบระดบน�าใน chamber ใหอยในระดบทก�าหนด น�าทใชควรเปนน�ากรอง ไม

ควรใชน�าประปา เพราะจะท�าใหมตะกรนจบทกน chamber มาก

- บนทกเวลา อณหภม และความดนทกครงทใชงาน

- ตรวจสอบระบบการท�างานและประสทธภาพของเครอง autoclave สปดาหละครง หรออยางนอยเดอนละ

ครง ขนกบความถของการใชงาน โดยใช spore ของ Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 ซงอาจเปน

suspension ทบรรจใน ampule เชน Kilit ampule (BBL), Sterikon-Bioindikator (Merck), Attest (3M) หรอ อาจ

เปน spore strip ถาเครอง autoclave มประสทธภาพดจะท�าลาย spore ของ G. sterothermophilus ได

- เกบรกษา spore ของ G. sterothermophilus ทอณหภม 4-8 °C

- Autoclave indicator tape เปน heat sensitive tape ทใชเปน indicator เพอแสดงวาสงของนนๆ ไดผาน

ขบวนการ autoclave แลวเทานนไมใชเปน tape ทใชตรวจสอบประสทธภาพของเครอง autoclave โดย tape จะ

เปลยนสเมอถงเวลา และอณหภมทเหมาะสม

- จดท�าแผนในการสอบเทยบประสทธภาพโดยชางเทคนค

Centrifuge

- เชดท�าความสะอาดภายในของเครองดวย 70% alcohol ทกสปดาหหรอทกครงเมอมสารหก หรอหลอด

ทดลองแตกขณะทปน

- ถาเปนเครองปนทใชแทง carbon brush ควรตรวจสอบเปลยนแทง carbon ทกป หรอหากตรวจพบแทง

carbon หดสนเกน 1 cm ควรเปลยนใหม

- ตรวจสอบคณภาพของขอบยาง ตองตดเรยบกบเครองและมคณภาพไมเสอมสภาพ

- ตรวจสอบฝาปดของตวเครอง ตองปดสนท

- จดท�าแผนในการตรวจสอบ และสอบเทยบความเรวรอบของการหมนเหวยงโดยชางเทคนค

Hot air oven (ส�ำหรบ sterile เครองแกว)

- เชดท�าความสะอาดภายในต ทกเดอน

- บนทกอณหภมทกครงทใชงาน ซงปกตจะใชงานในชวง 155-165 °C


- ตรวจสอบ ประสทธภาพ sterility ทก 3 เดอน โดยใช spore strip ของเชอ Bacillus subtilis var niger

(globigii) ATCC 9372

- จดท�าแผนในการตรวจสอบระบบการท�างานโดยชางเทคนคเปนประจ�า

Incubator

- เชคท�าความสะอาดภายในตอยางนอยทกเดอน

- จดบนทก ระดบอณหภมทกวน กอนเรมปฏบตงานประจ�าวน และควรตงอณหภมไวท 35 ± 2 °C

- ตรวจสอบ และสอบเทยบอณหภมของ incubator กอนน�ามาใชงานและจดแผนในการตรวจสอบระบบการ

ท�างานเปนประจ�า

Microscope

- เมอไมใชงานควรหาถงคลมใหเรยบรอย เพอปองกนฝนละออง

- หลงจากใชงานในแตละวน ท�าความสะอาดตวกลองและเชดเลนสดวยกระดาษเชดเลนสกอนเกบกลอง หาม

เชดดวย alcohol หรอ acetone อยางเดยว ควรใช lens cleaning solution (diluted acid, isopropyl alcohol และ

acetone)

- ไมวางกลองจลทรรศนไวใกลหนาตางทแสงแดดสองเขาโดยตรง

- ไมเกบกลองจลทรรศนในทชน เพราะจะท�าใหเกดเชอราไดงาย และไมเกบรวมในททมการจดเกบสารเคม

- ถาสารเคมหยดใสตวกลองหรอ stage ใชผานมทสะอาด ชบน�าพอหมาดๆ เชดทนท

- ไมให objective lens ชนดหว oil แชอยใน oil immersion บน slide เปนเวลานานๆ หลงจากไมใชแลวใหหมน

objective lens ชนดหว oil เบยงออกไป

- ไมให objective lens ชนดทไมใชชนดหว oil จมลงใน oil immersion

- ไมควรใชนวมอสมผส lens

- กอนน�า slide ออกจาก stage ควรหมนให objective lens ก�าลงขยายต�าสดอยเหนอตรง slide เพอปองกนไม

ให slide ขด lens เปนรอย

- จดท�าแผนการตรวจสอบสภาพโดยชางผช�านาญทกป

Refrigerator

- ท�าความสะอาดภายในตทก 2 เดอน หรอหลงจากมการซอมบ�ารง

- สงของตางๆ จดวางเปนหมวดหมเปนระเบยบเรยบรอย เพอความความสะดวกในการน�าไปใชงาน และถา

น�ายาใดหมดอายหรอเสอมสภาพใหก�าจดทงไป

- บนทกอณหภมของตเยนทกวน อณหภมควรอยระหวาง 2-8 °C

- จดท�าแผนในการตรวจสอบระบบการท�างานเปนประจ�า

Water bath

- ท�าความสะอาดภายใน chamber ทกสปดาหหรอยางนอยทกเดอน

- น�าทใชควรเปนน�ากลน และตรวจสอบระดบน�าภายใน chamber กอนใชงานทกครง

- บนทกอณหภมและการใชงานทกครง

- จดท�าแผนในการตรวจสอบระบบการท�างานเปนประจ�า


ตำรำงท 7-4 กำรบ�ำรงรกษำอปกรณเครองมอในหองปฏบตกำร

Equipment Routine care Monitoring

Technical

Maintenance

and

inspection

Anaerobic Jar Clean inside of jar each week

Reactivate catalyst after each

run (160 °C, 2hrs)

Replace catalyst every 3 months

Use methylene blue indicator strip

with each run

Note and record decolorization

time of indicator each week

Inspect gasket

sealing in the

lid weekly

Autoclave Clean and change water monthly Check and adjust water level

before each run

Record time and temperature or

pressure for each run

Record performance with spore

once a week

Every 6 months

Centrifuge Wipe inner walls with antiseptic

solution weekly or after breakage

of glass tubes or spillage

Replace brushes

annually

Hot-air oven for

sterilization

of glassware

Clean inside monthly Record time and temperature for

each run

Every 6 months

Incubator Clean inside walls and shelves

monthly

Record temperature at the start

of each working day (allowance

35 ± 2 °C)

Every 6 months

Microscope Wipe lenses with lens paper

after each day’s work

Clean and lubricate mechanical stage

weekly

Protect with dust cover when not in

use

Check alignment of condenser

monthly

Annually


Equipment Routine care Monitoring

Technical

Maintenance

and

inspection

Refrigerator Clean and defrost every 2 months and

after power failure

Record temperature on first day of

each week (allowance 2-8 °C)

Every 6 months

Waterbath Wipe inside walls and change water

monthly

Check water level daily

Record temperature on first day of

each week (allowance 54-57 °C)

Every 6 months

หมายเหต - ใช spore ของเชอ Geobacillus sterothermophilus ATCC 7953 ในการทดสอบประสทธภาพ

ของเครอง autoclave

- ใช spore ของเชอ Bacillus subtilis var niger (globigii) ATCC 937 ในการทดสอบ

ประสทธภาพของต Hot air oven

3. กระบวนกำรหลงกำรตรวจวเครำะห

3.1 กำรรำยงำนผลกำรตรวจวเครำะห

หองปฏบตการควรมการจดท�าคมอแนวทางในการบนทกขอมลการรายงานผลของหองปฏบตการ ม

การก�าหนดคณสมบตของผรายงานผลการตรวจวเคราะหและผตรวจสอบผลการวเคราะหขอมล มนโยบายในการ

เกบรกษาความลบของผลการวเคราะหของผปวยและขอมลตางๆ ตองสามารถสอบกลบได การรายงานผลการ

วเคราะหตองรายงานภายในระยะเวลาทก�าหนด รวมถงก�าหนดนโยบายในการแกไขขอบกพรองทตรวจพบ และ

แนวทางในการปองกนไมใหเกดขอบกพรองซ�า

3.2 กำรเกบรกษำสงสงตรวจ

หองปฏบตการตองก�าหนดเกณฑทเหมาะสมในการจดเกบรกษาสงสงตรวจแตละประเภทหลงจาก

การตรวจวเคราะหแลวเพอน�าสงสงตรวจมาวเคราะหซ�าในกรณทอาจเกดปญหา

3.3 กำรท�ำลำยสงสงตรวจ

หองปฏบตการตองก�าหนดวธทเหมาะสมในการท�าลายสงสงตรวจและวตถทดสอบทไมใชแลวกอน

น�าไปทง

ตำรำงท 7-4 กำรบ�ำรงรกษำอปกรณเครองมอในหองปฏบตกำร (ตอ)



1. Forbes BA, SAhm DF, Weissfeld AS. Bailey and Scott’s Diagnostic microbiology. 11th ed. St. Louis:

Mosby Inc.; 2002.

2. Garcia L.S. Clinical Microbiology Procedure Handbook 3rd ed. American Society for Microbiology

Prss, Washington, DC 2010.

3. International Organization for Standardization (ISO) 15189 Medical laboratories-Particular

requirements for quality and competence 1st ed.2003.

4. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology.

6th ed. Washington D.C.: ASM Press; 1995.

5. Sonnenwirth AC, Jarett L. Gradwohl’s clinical laboratory methods and diagnosis. 8th ed.

Missouri: The C > V > Mosby Company: 1980.

6. Treagan L, Pulliam L. Medical Microbiology Laboratory Procedures. Philadelphia: W.B. Saunders

Company; 1982.

7. Vandepitte J, Engbaek K, Piot P, Heuck CC. Basic laboratory procedure in clinical bacteriology. World

Health Organization: Geneva; 1991.

บทท8

การทวนสอบผล


การทวนสอบผล


หลกกำร

การทวนสอบผลเปนขนตอนการตรวจสอบผลทไดจากการทดสอบในหองปฏบตการมาตรวจสอบความถกตอง

กอนรายงานผลใหผใชบรการ โดยน�าความรทมอยมาประมวลใช การทวนสอบผลตองครอบคลมตงแตความถก

ตองในการเขยนรายงาน ผลทไดมความขดแยงกนหรอไมถามจะตองตรวจสอบในรายละเอยดทบนทกไว

ขอบเขต

ครอบคลมการทวนสอบผลการทดสอบกอนรายงานผล ซงรวมการตรวจสอบทกขนตอนตงแตการดความถก

ตองของการเขยนรายงาน ความสอดคลองของผลการตรวจเบองตนดวยกลองจลทรรศน การวนจฉยเชอ ผลการ

ทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ


1. ตรวจสอบความถกตองของรายงานวา ไมสะกดผด ในกรณทรายงานผลดวยคอมพวเตอรเมอบนทกขอมล

เรยบรอยแลวตองอานทวนกอนทจะสงรายงานผลออกไปเพราะอาจเกดความผดพลาดในการบนทกขอมล เชน การ

กด enter ชอเชอผดบรรทด เปนตน

2. ตองก�าหนดวา “เชอ/ผลความไวทพบไมบอยตองแจงหวหนา/ผทระบและตองเกบสไลดการยอมแกรม

จานเพาะเชอ และการทดสอบทงหมดไวจนกวาจะรายงานผลเสรจสนและสามารถเรยกดได” เมอพบการรายงาน

เชอ/ผลความไวทพบไดนอยผทวนสอบตองดสไลดการยอมแกรม จานเพาะเชอ และการทดสอบทงหมด เพอสรป

วาผลทรายงานถกตองหรอไม

3. ความสอดคลองของผลการยอมแกรมและผลการเพาะเชอทได เชน การยอมหนองจากตบของผปวยพบ

แบคทเรยแกรมลบรปแทงขนาดเลก ตดสหวทายคลายเขมกลดซอนปลาย ผลการเพาะเชอได Staphylococcus

coagulase positive ผลทไดนไมนาจะถกตอง การอานผลการยอมแกรมผอานผลควรนกตอไปวาควรเปนเชอใด ถา

ผลการเพาะเชอไมไดตามทคาดหมาย ควรพจารณาตอไปวาเปนไปไดหรอไม ถาเปนไปไมไดควรกลบไปดสไลดการ

ยอมแกรมใหมและวเคราะหหาสาเหต หากไมสามารถรบความขดแยงทไดควรขอใหผใชบรการสงสงสงตรวจซ�า

การสลบสงสงตรวจเปนปจจยส�าคญทท�าใหผลการตรวจทางกลองจลทรรศนมความขดแยงกบผลการเพาะเชอ

4. ผลการยนยนเชอสอดคลองกบลกษณะจ�าเพาะ (key characteristic) ของเชอนนหรอไม การวนจฉย

แบคทเรยตองค�านงถงลกษณะจ�าเพาะของแบคทเรยแตละ genus/species เชน

- Bacillus anthracis เปนแบคทเรยแกรมบวกรปแทง catalase บวก ไมเคลอนไหว และไม hemolyse เลอด

- Brucella spp. เปนแบคทเรยแกรมลบรปแทงขนาดเลก (fine sand appearance) ขนไดไมดบน blood agar ไม

เกด satellite phenomenon, oxidase ใหผลลบ catalase ใหผล weakly positive, β-lactamase บวก และ urease

test บวก

- Francisella tularensis เปนแบคทเรยแกรมลบรปแทงขนาดเลก ขนไดไมดหรอไมขนบน blood agar ไมเกด

satellite phenomenon, oxidase, catalase และ urease test ลบ


- Neisseria spp. เปนแบคทเรยแกรมลบ cocci อยเปนค oxidase บวก DNase ลบ

- Morganella morganii และ Proteus spp. ใหผล lysine deaminase/phenylalanine deaminase บวก urease ให

ผลบวกภายใน 4 ชม. ยกเวน Proteus inconstans ดอ colistin/polymyxin B

- Providencia spp. ใหผล lysine deaminase/phenylalanine deaminase บวก urease ลบ/ไมแนนอน

- Erysipelothrix rhusiopathiae เปนแบคทเรยแกรมบวกรปแทงไมมสปอร บน BA โคโลนเปน nonhemolysis

ไมสรางเอนไซม catalase ให H2S ใน TSI

- Rhodococcus equi เปนแบคทเรยแกรมบวก coccobacilli (คลายหยดน�า) โคโลนม pigment สชมพ (salmon

pink) ตดส modified acid fast bacilli stain

- Roseomonas spp. เปนแบคทเรยแกรมลบรปแทงสวนใหญเปน cocci อยเปนคหรอสายสนๆ ไมมชองวางใน

เซลล สวนใหญขนบน MAC โคโลนเปนมกม pigment สชมพ ไมยอยสลายน�าตาล (non-fermenters), oxidase

weakly positive (หลง 30 วนาท)/catalase ลบและ urease บวก

- Methylobacterium spp. เปนแบคทเรยแกรมลบรปแทงมชองวางในเซลล โคโลนแหงม pigment สชมพ สวน

ใหญไมขนบน MAC ไมยอยสลายน�าตาล (non-fermenters) สามารถใช methanol เปนแหลงของ carbon,

oxidase บวก และ urease ลบ เปนตน

5. ความถกตองของผลความไวทได แผนความไวของแบคทเรยหมายถงความไวของแบคทเรยตอชดของ

สารตานจลชพซงแบคทเรยบางชนดมความไวทจ�าเพาะจงสามารถน�ามาใชในการทวนสอบผลความไวของแบคทเรย

ตอสารตานจลชพ และ/หรอทวนสอบผลการตรวจยนยนเชอ


1. การดอสารตานจลชพทเปน intrinsic resistance เชน

ตำรำงท 8-1 Intrinsic resistance ของ Enterobacteriaceae

Antimicrobial

Agents

Organisms

Am

pici

llin

Am

oxic

illin

cla

vulin

ic

Am

pici

llin

sulb

acta

m

Pipe

raci

llin

Tic

arci

llin

Cep

halo

spor

in I*

Cep

ham

ycin

s**

Cep

halo

spor

in II

***

Tet

racy

clin

e

Nitr

ofur

anto

in

Poly

myx

in B

, Col

istin

Citrobacter freundii R R R

Citrobacter koseri R R R

Enterobacter aerogenes R R R

Enterobacter cloacae R R R

Escherichia coli There is no intrinsic resistance to β-lactam in this

organism

Escherichia hermannii R R

Hafnia alvei R R R R R

Klebsiella pneumoniae R R

Morganella morganii R R R R R R R

Proteus mirabilis There is no intrinsic resistance to β-lactam in this

organism

R R R

Proteus penneri R R R R R R

Proteus vulgaris R R R R R R

Providencia rettgeri R R R R R R

Providencia stuartii R R R R R R

Salmonella and

Shigella spp.

There is no intrinsic resistance to β-lactam in these

organism

Serratia marcescens R R R R R R R R

Yersinia enterocolitica R R R R

* cefazolin, cephalothin ** cefoxitin, cefotetan *** cefuroxime

กำรจดท�ำโครงกำรส�ำหรบตรวจสอบแผนควำมไว

กอนทจะท�าการตรวจสอบแผนความไวของแบคทเรยเจาหนาทหองปฏบตการจ�าเปนตองร


2. แผนความไวทจ�าเพาะ เชน แผนความไวจ�าเพาะของเชอ Staphylococcus คอ ดอ penicillin, ไว clindamycin,

erythromycin, oxacillin, และ vancomycin เปนตน

3. ความสมพนธของสารตานจลชพททดสอบ เชน การออกฤทธ การจดระดบ

3.1 Penicillins

3.1.1 เชอ Enterobacteriaceae

piperacillin = mezlocillin >ticarcillin >carbenicillin

3.1.2 เชอ Pseudomonas aeruginosa

piperacillin >mezlocillin = ticarcillin >carbenicillin

3.1.3 เชอ Staphylococcus spp. ทสรางเอนไซม β-lactamase ดอตอ penicillinase-susceptible penicillins

เชน ampicillin, amoxicillin, penicillin, carbenicillin, mezlocillin, piperacillin ticarcillin เปนตน

3.2 Cephalosporins

3.2.1 Enterobacteriaceae

4th(cefipime) > 3rd > 2nd > 1st

3.2.2 Staphylococcus spp. (oxacillin-susceptible)

1st > 2nd > 3rd = 4th

3.2.3 Pseudomonas aeruginosa (มเพยง 3rd เทานนทใชได)

cefipime ≥ ceftazidime > cefoperazone > ceftizoxime = cefotaxime = ceftriaxone

aztreonem (monobactem) มฤทธนอยกวา ceftazidime

3.3 Aminoglycosides


amikacin > tobramycin > gentamicin = netilmycin

3.3.2 Pseudomonas aeruginosa

amikacin > tobramycin > gentamicin = netilmycin

3.4 Quinolones


ciprofloxacin > levofloxacin > ofloxacin > norfloxacin > cinofloxacin = nalidixic acid

3.4.2 Pseudomonas aeruginosa

ciprofloxacin > levofloxacin > ofloxacin > norfloxacin

3.5 อนๆ

3.5.1 เชอทดอ imipenem อาจไมดอ β-lactam อนเพราะเอนไซม imipenemases ท�าลาย

เฉพาะ imipenem

3.5.2 การดอ imipenem ในเชอ Enterobacteriaceae พบไดนอย

4. ขอยกเวน

4.1 แบคทเรยแกรมลบรปแทงอาจสรางเอนไซม extended-spectrum β-lactamases ซงท�าลายยาในกลม

cephalosporins


4.2 Serratia marcescens อาจไว gentamicin มากกวา tobramycin หรอ amikacin เนองจากเอนไซมทไปท�าลาย

aminoglycoside ทสราง

4.3 บางครงแบคทเรยแกมลบรปแทงอาจสรางเอนไซมทไปท�าลาย aminoglycoside หลายชนดรวมกน เชน

เชอ Enterobacteriaceae อาจสรางเอนไซมไปท�าลาย gentamicin, tobramycin และ amikacin แตไมท�าลาย netilmicin

เปนตน

5. เมอมการดอสารตานจลชพทผดปกตเกดขน เชน พบการระบาดของเชอ Providencia rettgeri ทดอ

gentamicin ทเปนสาเหตการตดเชอในโรงพยาบาลในแผนกศลยกรรม เปนตน

6. ระบผลความไวของแบคทเรยตอสารตานจลชพทตองใหความระวงเปนพเศษ เพราะการรายงานผลผดจะม

ผลตอการรกษาผปวย เชน

6.1 เชอ E. coli หรอ Klebsiella spp. ทดอ 3rd generation cephalosporins

6.2 เชอ Enterobacteriaceae ทดอ gentamicin ( tobramycin และ amikacin)

6.3 เชอ Enterobacteriaceae ทดอ imipenem ในผปวย ICU

6.4 เชอ Enterobacteriaceae ทดอ ciprofloxacin

6.5 เชอ Pseudomonas aeruginosa ทดอ gentamicin, tobramycin และ amikacin

6.6 เชอ Pseudomonas aeruginosa ทแยกไดจากปสสาวะดอ ciprofloxacin

6.7 เชอ Staphylococcus aureus ดอ oxacillin (MRSA)

6.8 เชอ Streptococcus pneumoniae ทแยกไดจากน�าไขสนหลงไมไวตอ penicillin

6.9 เชอ Streptococcus viridans จากผปวย endocarditis ดอหรอไวปานกลางตอ penicillin

6.10 เชอ Enterococcus ทดอ ampicillin, vancomycin และ/หรอ high level gentamicin

6.11 เชอทแยกไดจากน�าไขสนหลงทดอ 3rd generation cephalosporins

6.12 เชอแกรมบวกดอ vancomycin

6.13 เชอทดอตอสารตานจลชพทใชในการรกษา

กำรทวนสอบแผนควำมไวทไมปกต

1. ตรวจสอบความถกตองของขอมลทรายงาน

2. อานผลการทดสอบ disk diffusion test/MIC ใหม ตรวจสอบใหแนใจวาเชอทใชเปนสายพนธ บรสทธ เปนตน

เพราะ

2.1 ปญหาบางอยางอาจถกมองขามไปในการอานผลครงแรก

2.2 การตรวจสอบจานเพาะเชอ/panel (ส�าหรบเครองอตโนมต) อาจจะเหนวาในบางหลม ไมไดใสเชอ

ลงไปกได

2.3 ถามเชอนอยเกนไปอาจท�าใหไดผล false susceptible

2.4 ในกรณทใช MHA + 5% sheep blood เวลาอานผลตองวดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone ไมใช

เสนผานศนยกลางของ inhibition of hemolysis

3. ตรวจสอบผลครงทแลวของผปวยรายน วาพบแผนความไวทผดปกตหรอไม

4. ถาจ�าเปนท�าการทดสอบความไวและตรวจยนยนเชอใหม

5. สงตรวจหองปฏบตการอางองเกยวกบการทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพเพอยนยนผลความไว


ทไมปกต เชน เชอ Staphylococcus aureus ดอ vancomycin, เชอ Haemophilus influenzae ดอ cefotaxime เปนตน

และถาผลทไดยนยนวาพบการดอสารตานจลชพดงกลาวจรงควรแจงใหกระทรวงสาธารณสขทราบ

6. ในกรณทตองมการตรวจยนยนผลความไวทไมปกตถาตองใชเวลานานควรแจงใหแพทย/ผใชบรการทราบ

7. ควรระลกเสมอวาการทดสอบความไวบางครงอาจไดผลคลาดเคลอนบาง การไดผล false resistant ดกวาการ

ไดผล false susceptible ระวงอยาใชเชอนอยกวามาตรฐานในการทดสอบ (under inoclum)

ตำรำงท 8-2 กำรดอสำรตำนจลชพทใชในกำรวนจฉยเชอ (intrinsic resistance)

Antimicrobial Microorganisms

Cefoxitin C. freundii, C. difficile, Enterobacter spp.

Imipenem Stenotrophomonas maltophilia

Vancomycin E. rhusiopathiae, Lactobacillus spp., Nocardia spp., Pediococcus spp.,

gram-negative bacteria

ตำรำงท 8-3 กำรดอสำรตำนจลชพทเปนไปไมได

Microorganisms Resistant phenotypes

Group A, C, G Streptococci PenicillinR

Enterococci TeicoplaninR, vancomycin S

P. vulgaris, Serratia spp. Cefuroxime S

Enterobacteriaceae Broad-spectrum cephalosporinR, CPS, APS

Proteus spp., Providencia spp., Serratia spp. Colistin S

Gram positive cocci Gentamicin R, other aminoglycoside S

Gram positive cocci Minocycline R, tetracycline S

Staphylococcus aureus Oxacillin R, penicillin S

Staphylococcus aureus Oxacillin R, cephalosporins S


ตำรำงท 8-4 ตวอยำงกำรดอสำรตำนจลชพทพบไดนอย

Microorganisms Phenotype

Staphylococcus aureus Vancomycin R

Enterococci Penicillin resistance by β-lactamase production

Neisseria meningitidis Penicillin resistance by β-lactamase production

Bacteroides fragilis Metronidazole R

Enterobacteriaceae Imipenem R

ตวอยำงกำรดอสำรตำนจลชพทไมปกต

ตวอยำงท 1


Ampicillin S

Cephalothin S

Gentamicin S

Imipenem S

เชอ Enterobacter cloacae ดอ ampicillin และ cephalothin (intrinsic resistance) การทไดผล susceptible อาจ

เกดจากการใชเชอนอยเกนไปหรอวนจฉยเชอผด



Amikacin S

Ampicillin R

Cephalothin R

Gentamicin R

Tobramycin S

Imipenem R

เชอ Enterobacter cloacae ทดอ imipenem พบไดนอยมาก imipenem เปนสารตานจลชพทสลายตวงายในหอง

ปฏบตการ ควรท�าการทดสอบซ�าโดยใช disk ยา lot ใหมเพอยนยนวาดอจรงหรอไมกอนรายงานผล



Klebsiella pneumoniae

Ampicillin R

Cephalothin R

Ceftazidime R

Cefotaxime S

Gentamicin R

Imipenem S

เชอ E. coli และ Klebsiella spp. ทสรางเอนไซม ESBLs พบเพมขน การพบเชอ K. pneumoniae ทดอ

ceftazidime ควรตรวจหาเอนไซม ESBLs (Confirmatory test) ถาไดผลบวก ตองรายงานวาดอตอสารตานจลชพใน

กลม β-lactam ยกเวน cephamycins (cefoxitin และ cefotetan) และ carbapenem (imipenem, meropenem และ

irtapenem)


Pseudomonas aeruginosa

Ampicillin S

Ceftazidime S

Gentamicin S

Amikacin S

Imipenem S

ไมรายงานผล ampicillin ส�าหรบเชอ P. aeruginosa เพราะเชอทกสายพนธดอตอ ampicillin (ใชรกษาไมไดผล)

ผลทไดอาจเกดจากเชอเจรญไมเตมทท�าใหไวสารตานจลชพอนๆดวยจงควรตรวจสอบทงหมดไมใชไมรายงานผล

ampicillin เทานน



Stenotrophomonas maltophilia

Amikacin, gentamicin, tobramycin R

Ceftazidime R

Ciprofloxacin R

Imipenem R

Trimethoprim/sulfamethoxazole R

Trimethoprim/sulfamethoxazole เปนสารตานจลชพทใชในการรกษาการตดเชอ S. maltophilia ซงเปนเชอท

ดอสารตานจลชพอนเกอบทงหมด การดอ Trimethoprim/sulfamethoxazole พบไดไมบอย สารตานจลชพทอาจใช

ในการรกษาอนๆ ไดแก ticarcillin/clavulanic acid, ceftazidime, minocycline และ fluoroquinolones



Amikacin R

Ampicillin R

Ampicillin/sulbactam S

Gentamicin R

Tobramycin R

Netilmicin S

Acinetobacter อาจดอตอสารตานจลชพทใชกบแบคทเรยแกรมลบหลายชนด sulbactam ทผสมอยกบ

ampicillin มฤทธตอ Acinetobacter หลายสายพนธและมประโยชนในการใชรกษาผปวย Acinetobacter มผลความ

ไวตอ aminoglycosides ทไมปกตคอ มกดอตอ aminoglycoside เกอบทกชนด ยกเวน netilmicin สายพนธทดอสาร

ตานจลชพหมดอาจใช polymyxin ในการรกษาผปวย A. baumannii ดอสารตานจลชพมากกวา A. lwoffii




Ampicillin/sulbactam S

Cephalothin S

Clindamycin R

Erythromycin R

Oxacillin R

Penicillin R

Vancomycin S

เชอ Staphylococcus ทดอ oxacillin ตองดอสารตานจลชพกลม β-lactam ทงหมดรวมถง β-lactam ทม

β-lactamase inhibitor



Cephalothin S

Clindamycin S

Erythromycin S

Oxacillin S

Penicillin R

Vancomycin R

เชอ Staphylococcus ทดอ vancomycin ในปจจบนนยงพบไดนอยมาก หากไดเชอ S. aureus ทดอ vancomycin

จงควรท�าการตรวจสอบเพอยนยนความถกตองของผลการทดสอบ เพราะนอกจากจะใชเปนขอมลในการรกษาผ

ปวยยงใชเปนขอมลการเฝาระวงเชอดอสารตานจลชพทส�าคญ




Cephalothin S

Clindamycin R

Erythromycin R

Oxacillin S

Penicillin R

Vancomycin S

เชอ Staphylococcus aureus ทดอ clindamycin และ erythromycin มกเปนเชอทดอ oxacillin ควรตรวจสอบใหม



Erythromycin S

Oxacillin S (23 mm)

Penicillin S

Tetracycline S

ใช oxacillin 1 μg/disk ในการทดสอบความไวของเชอ S. pneumoniae ตอ penicillin ถาไดเสนผานศนยกลาง

ของ inhibition zone ≥ 20 mm ใหรายงานวาไว penicillin ถาไดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone ≤ 19 mm

หา MIC ของเชอตอ penicillin เพอดวาเชอดอปานกลางหรอไวตอ penicillin บางสายพนธอาจไดเสนผานศนยกลาง

ของ inhibition zone ≤ 19 mm แตได MIC 0.06 μg/ml ซงไวตอ penicillin เชอ S. pneumoniae ทได เสนผานศนยกลาง

ของ inhibition zone ≥ 20 mm. สามารถรายงานวาไวตอสารตานจลชพกลม β-lactam ท�าการหา MIC ของ

cefotaxime ในเชอ S. pneumoniae ทดอ penicillin




Cephalothin S

Clindamycin S

Erythromycin S

Oxacillin S

Penicillin R

Piperacillin S

Vancomycin S

Staphylococcus spp. ทดอ penicillin จะดอตอ penicillin ทถกท�าลายดวย β-lactamases คอ ampicillin,

amoxicillin และ extended-spectrum penicillins เชน carbenicillin, mezlocillin, piperacillin และ ticarcillin ในการ

ทดสอบทางหองปฏบตการใหใช penicillin เปนตวแทนของสารตานจลชพกลมน และไมทดสอบกบ extended-spec-

trum penicillins เพราะอาจไดผล false susceptible



Erythromycin S

Cefotaxime R

Penicillin S

Tetracycline S

เชอ S. pneumoniae ทไว penicillin ไว β-lactam อนดวย ไมทดสอบ cefotaxime หรอ ceftriaxone กบเชอ S.

pneumoniae โดยวธ disk diffusion method



Streptococcus viridans

Cephalothin <0.5 S

Penicillin 0.5 I

Vancomycin 0.5 S

คา MIC ของเชอ Streptococcus viridans ในผปวย endocarditisใชเปนแนวทางในการรกษาผปวย เชอทไวจะม

MIC ≤ 0.12 μg/ml อาจใช penicillin เพยงอยางเดยว แตถา MIC > 0.12 μg/ml ในการรกษาตองเพม aminoglycoside

เชอทม MIC >2.0 μg/ml อาจใช vancomycin ในการรกษา วธ disk diffusion ไมใชวธทเหมาะจะใชทดสอบความ

ไวของเชอ Streptococcus viridans


Enterococcus faecalis

Ampicillin S

Cefotaxime S

Trimethoprim/sulfamethoxazole S

Vancomycin S

เชอ Enterococcus อาจไดผลไว cephalothin และ trimethoprim/sulfamethoxazole แตการรกษาผปวยไมไดผล

จงไมควรท�าการทดสอบ



1. Janet Hindler. Antimicrobial Susceptibility Testing. (WHO Workshop on Antimicrobial

Susceptibility Testing, Viet Nam, October 1998)

2. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H Jorgensen, Michael A. Pfaller and Robert H. Yolken.

Manual of Clinical Microbiology 8th ed. Washington D.C.: American Society for Microbiology,

2003.P.331-808.

3. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational

Supplement. 2011. M100-S21. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011.

บทท9

บทบาทของหองปฏบตการจลชววทยา

ในดานการควบคม และปองกนโรคตดเชอ

ในโรงพยาบาล


บทบาทของหองปฏบตการจลชววทยาในดานการควบคม และปองกนโรคตดเชอในโรงพยาบาล

ก�าธร มาลาธรรม

โรคตดเชอในโรงพยาบาล มความส�าคญตอผลการรกษาผปวย คอท�าใหผปวยตองใชเวลาอยในโรงพยาบาลนาน

ขน เสยคาใชจายมากขน หรออาจเสยชวตได นอกจากน บคลากรยงมโอกาสทจะรบเชอกอโรคจากผปวยได ดงนน

โรงพยาบาลจงตองก�าหนดกระบวนการควบคมและปองกนมใหผปวยทมารบบรการของโรงพยาบาลเกดการตด

เชอขน รวมทงตองมมาตรการปองกนมใหบคลากรตดเชอจากผปวย โดยกระบวนการตาง ๆ คอ

1. การเฝาระวงการตดเชอของผปวย

2. การสอบสวนการระบาดของโรค

3. การควบคมการระบาดของเชอแบคทเรยทดอตอสารตานจลชพหลายชนด (multidrug-resistant bacteria)

ซงเปนปญหาทรนแรงมากขน

4. การก�าหนดและตดตามใหบคลากรปฏบต เพอลดอตราการตดเชอในระบบอวยวะตาง ๆ ของผปวย

กระบวนการทเกยวของกบการควบคมการระบาดของเชอดอสารตานจลชพ และการลดอตราการตดเชอ ไดแก

การสงเสรมใหบคลากรท�าความสะอาดมออยางถกตอง การท�าหตถการดวยความระมดระวงมใหเกดการปนเปอน

การแยกผปวย การก�าจดเชอในเครองมอทางการแพทย และการท�าความสะอาดสงแวดลอมจะเหนไดวา การควบคม

โรคตดเชอในโรงพยาบาลใหไดผลด จ�าเปนอยางยงทจะตองอาศยหองปฏบตการจลชววทยาทมประสทธภาพ

บทบาทของหองปฏบตการจลชววทยาในดานน ไดแก

1. การวนจฉยชนดของเชอกอโรค หากหองปฏบตการสามารถในการวนจฉยเชอกอโรคไดถกตองรวดเรว ยอม

ท�าใหแพทยผดแลผปวยสงการรกษาไดอยางมประสทธภาพ ท�าใหโอกาสทเชอจะแพรระบาดลดนอยลง และ

หากเปนเชอดอยา ผปฏบตงานดานการควบคมโรคตดเชอ จะสามารถก�าหนดมาตรการแยกผปวยไดอยาง

รวดเรว นอกจากนการวนจฉยเชอกอโรคทถกตอง ท�าใหการควบคมการระบาดเปนไปอยางเหมาะสม เชน

ถาเพาะเชอได Pseudomonas spp.โดยไมมการระบ species ของเชอใหชดเจน อาจท�าใหเขาใจวามการระบาด

แตหากทราบวาเปน species ตางกน กยอมไมถอวาเปนการระบาด เปนตน

2. การชวยยนยนการวนจฉยการตดเชอ เชน การตดเชอทระบบทางเดนหายใจสวนลาง บางครงแพทยอาจ

ตองการทราบจ�านวนเชอ ซงตองอาศย quantitative culture การวนจฉยการตดเชอทเกยวของกบการใชสาย

สวนหลอดเลอดด�า ซงมทงโดยการเพาะเชอจากปลายสายสวน และการเพาะเชอจากเลอดทไดจากหลอด

เลอดด�าเสนอน ทไดมาพรอมกบเลอดทดดผานสายสวนหลอดเลอด และเปรยบเทยบจ�านวนเชอ (ซงตองใช

เวลามาก) หรอเทยบระยะเวลาทตรวจพบเชอหากท�าการเพาะเชอดวยเครองอตโนมต (automatic continuous

monitoring blood culture systems) การทดสอบทางหองปฏบตการทถกตอง ท�าใหขอมลการตดเชอในโรง

พยาบาลมความนาเชอถอไดมากขน

3. การทดสอบความไวของเชอตอสารตานจลชพ และรวบรวมท�าเปนสถต เพอตดตามความเปลยนแปลงของ

อตราการดอยาของเชอกอโรคทส�าคญ (antibiogram) ท�าใหแพทยเลอกใชยาไดเหมาะสมยงขนโดยอาศยสถต

ทรวบรวมไวมาคาดการณความไวของเชอ และเลอกยาใหกบผปวยกอนทการทดสอบเชอจากผปวยรายนน

ๆ จะเสรจสนและท�าการปรบเปลยนชนดของยาตานจลชพใหเหมาะสมอกครงหนง


4. การตดตามแนวโนมการดอยาของเชอกอโรคมความส�าคญอยางยงทงในดานการรกษาและการปองกน หอง

ปฏบตการจลชววทยาควรประสานงานกบคณะกรรมการควบคมและปองกนโรคตดเชอในโรงพยาบาลอยาง

ใกลชดในการเฝาระวงเชอดอยาทเปนปญหาในโรงพยาบาล ดวยการมระบบการแจงขอมลใหคณะกรรม

การฯ อยางตอเนอง และหากพบเชอทแบบแผนความไวตอสารตานจลชพแปลกไปจากทควรจะเปน หรอ

ไมเคยพบมากอนในโรงพยาบาลนนๆ หองปฏบตการจลชววทยา ควรตรวจสอบใหแนชดวาผลการทดสอบ

นนถกตอง จากนนใหแจงผเกยวของ ทงในโรงพยาบาลแหงนนและหองปฏบตการสวนกลาง เชน กรม

วทยาศาสตรการแพทยทราบ เพอด�าเนนการทดสอบยนยน และหามาตรการควบคมการระบาดของเชอท

พบตามความเหมาะสมของระดบความรนแรงและลกษณะการบรการของสถานพยาบาลแตละแหงเชอ

ลกษณะดงกลาว เชน vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, vancomycin-resistant enterococci และ

carbapenem-resistant Enterobacteriaceae เปนตน

5. การควบคมการระบาดของเชอดอยา นอกจากการตดตามแนวโนมการเปลยนแปลงแบบแผนความไวของ

เชอกอโรคตอสารตานจลชพแลว บางครงยงอาจจะตองท�าการเพาะเชอเพมเตมเปนกรณพเศษ คอ การท�า

surveillance culture

5.1 การเพาะเชอจากผปวยทรกษาตวอยในโรงพยาบาล โดยทวไป เราจะทราบวาผปวยรายใดมเชอ

ดอยา colonize อย หรอมการตดเชอหรอไม จากการทแพทยสงสยวาผปวยรายนนจะมการตดเชอ

แลวท�าการสงสารคดหลงหรอสงสงตรวจอนๆ จากผปวยมาเพาะเชอ การตรวจหาเชอดอยาจาก

สงสงตรวจเหลาน โดยทวไปจะพบผปวยทมเชอดอยาเพยงจ�านวนหนงเพราะผปวยอาจจะมเพยง

เชอ colonize อยโดยไมมอาการได หากจะคนหาผปวยทงหมดจะตองเพาะเชอจากผปวยทกราย

และเพาะเชอตดตามไปหลาย ๆ ครง เชน ทก 3 หรอ 7 วน ซงจะพบผปวยมากกวาวธแรก

อยางไรกตาม ยงไมสามารถก�าหนดไดชดเจนวาการเพาะเชอจากสวนใดของรางกายจะพบเชอได

มากทสด สวนใหญมกจะท�า rectal swab culture และมกเพาะเชอจากหลายต�าแหนง เชน ทางเดน

หายใจ ทางเดนปสสาวะ เปนตน ท�าใหมคาใชจายคอนขางสง และยงเพมปรมาณงานของหอง

ปฏบตการเปนอยางมาก อาจจะไมเหมาะทจะท�าเปนประจ�า แตอาจจะพจารณาท�าเปนครงคราว

เมอมการระบาด

5.2 การเพาะเชอจากสงแวดลอมและบคลากร จะท�าเมอมขอมลทางระบาดวทยาทชวาอาจมแหลงปน

เปอนจากสงแวดลอม หรอมบคลากรเปนตนตอการระบาด หากไมมขอมลอนสนบสนน จะเปนการ

ยากทจะหาความเชอมโยงระหวางเชอทพบในสงแวดลอมกบเชอทพบในผปวย

6. การสอบสวนการระบาด ในบางครงอาจมการระบาดของเชอบางชนด ซงการทจะทราบสาเหตของการ

ระบาด หองปฏบตการจลชววทยาควรเกบเชอชนดเดยวกบเชอทก�าลงระบาดไวเพอการท�าการตรวจสอบ

สายพนธของเชอ (phenotype หรอ genotype) ในภายหลง การเพาะเชออาจจะเพาะเชอจากผปวยทมอาการ

ของการตดเชอ หรออาจจะตองเพาะเชอจากผปวยรายอน รวมทงจากสงแวดลอมรอบตวผปวยดวย หาก

มขอมลทางระบาดวทยาทชวา อาจจะมแหลงของเชอในสงแวดลอม เมอพบแหลงของเชอการควบคม

การระบาดจะท�าไดดวยประสทธภาพสงขน



1. Anonymous. NHSN Outline for Healthcare-Associated Infections Surveillance, April 2006. http://

www.cdc.gov/nhsn/PDFS/OutlineForHAISurveillance.pdf

2. 2. Fred C. Tenover. Rapid Detection and Identification of Bacterial Pathogens Using NovelMolecular

Technologies: Infection Control and Beyond. Clinical Infectious Diseases 2007; 44:418–423

3. Kolmos HJ. Role of the clinical microbiology laboratory in infection control--a Danish perspective.

J Hosp Infect. 2001; 48 Suppl A:S50-4.

4. Pfaller MA and Herwaldt LA. The clinical microbiology laboratory and infection control:emerging

pathogens, antimicrobial resistance, and new technology. Clin Infect Dis. 1997;25(4): 858-870.

5. Pfaller MA, Wakefield DS, Hollis R, Fredrickson M, Evans E, and Massanari RM. The clinical

microbiology laboratory as an aid in infection control: The application of molecular techniques in

epidemiologic studies of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Diagn Microbiol Infect

Dis. 1991; 14(3):209-217.

บทท10

การตดเชอแบคทเรยในชมชน : บทบาทของ

หนวยงานการปฏบตการดานแบคทเรย


การตดเชอแบคทเรยในชมชน : บทบาทของหนวยงานการปฏบตการดานแบคทเรย

สยมพร ศรนาวน

“โรค” และ “เชอโรค”

ในกรณทมการเจบปวยจากโรคตดเชอ นอกเหนอจากการวนจฉยวา ผปวยไมสบายจาก “โรค” ใด (เชน sepsis,

pneumonia) ยงมความจ�าเปนทจะตองวนจฉยวา “เชอโรค” ทเปนสาเหตนน คอเชออะไรซงการทจะแจงใหละเอยด

เพยงใด (เชน serotype, species, antimicrobial susceptibility) ยอมขนกบประโยชนทจะน�าไปใช

กำรวนจฉย

โดยทวไป การวนจฉย “โรค” อาศยขอมลจากการซกประวตการด�าเนนโรคและการตรวจพบความผดปกตของ

รางกายเปนหลก อาจมการตรวจทางหองปฏบตการเพมเตมบาง ในการวนจฉย “เชอโรค” ทเปนสาเหต จ�าเปนตอง

มขอมลจากการตรวจทางจลชววทยาหรอการตรวจทเกยวของ ขอมลดงกลาวอาจจะเปนขอมลทไดมการรวบรวม

อยางเปนระบบจากผปวยทไดรบการวนจฉยแลวจ�านวนมาก โดยเชอมโยงขอมลจากตวผปวย (ทส�าคญคอ อาย

ภาวะสขภาพกอนปวย ลกษณะอาการและอาการแสดง) กบเชอโรคทเปนสาเหต ขอมลนมความส�าคญมากในการ

วนจฉย จนอาจจะไมตองใชการตรวจหาเชอโรคเฉพาะตวผปวยคนนนทเรยกวาขอมลทางระบาดวทยาคลนก บาง

ครงเทานนทจ�าเปนตองใชขอมลของเชอโรคทไดมาจากตวผปวยรายนนๆ ซงมกจะเปนขอมลทางระบาดวทยา

คลนกไมสามารถชแนะได หรอผปวยอาการหนกมากและแพทยยงไมมนใจในการวนจฉย

บทบำทของกำรตรวจแบคทเรย

ในการเฝาระวงและตดตามขอมลโรคตดเชอแบคทเรย การตรวจแบคทเรยทไดมาตรฐานเปนพนฐานทส�าคญ

ขอมลเกยวกบแบคทเรยทเปนสาเหตนน เจาหนาทผท�าการตรวจวนจฉยตวเชอ เปนผก�าหนดความแมนย�าของการ

วนจฉยเชอ เปนคนแรกทรวาเปนเชออะไร แบบแผนความไวตอยาตานแบคทเรยเปนอยางไรรวมทงหองปฏบตการ

แบคทเรยเปนแหลงรวบรวมผลเพาะเชอแบคทเรย

กำรน�ำขอมลมำใชใหเกดประโยชน

หนวยงานการปฏบตการดานแบคทเรย ยงมความส�าคญในการทจะเปนศนยของการเฝาระวงดานระบาดวทยา

ของโรคตดเชอแบคทเรย รวมทงการผลตขอมลทจะชแนะการวนจฉยและรกษาโรคตดเชอแบคทเรยแตจะตองม

การประสานงานกบขอมลทส�าคญของผปวยอยางเหมาะสม จนเกดเปนขอมลระบาดวทยาคลนกทมคณภาพและ

เชอถอได จงจะน�าไปใชประโยชนไดอยางแทจรง การรวบรวมขอมลแบคทเรย โดยไมใชหลกการทางระบาดวทยา

หรอไมมความสมพนธกบลกษณะของผตดเชอหรอแหลงของแบคทเรยอยางถกตองจะกอใหเกดความสนเปลอง

ในการรวบรวมโดยเปลาประโยชน

ขอมลกำรตดเชอแบคทเรยในชมชน

การรวมรวมขอมลการตดเชอแบคทเรยในชมชน (community-acquired bacterial infection) โดยมหนวยงานการ

ปฏบตการดานแบคทเรยเปนฐาน (laboratory-based) และประสานกบขอมลของผปวย อยางเปนระบบและเชอถอ

ได มประโยชนอยางมาก ดงน

1. การปองกน การวนจฉยกอนการระบาด การสบคน ตดตาม และควบคมโรคตดเชอแบคทเรยในชมชน ไดแก


1.1 การตรวจหาผปวยเพอการสบคนและตดตาม ปองกน และควบคมการระบาด เชน

- การตดเชอแบคทเรยทกอโรครนแรง เชน Corynebacterium diphtheriae

- การตดเชอแบคทเรยทเปลยนไปหรอปรากฏขนใหม เชน (vancomycin-resistant

Staphylococcus aureus (VRSA) เชอ Salmonella spp. สายพนธใหม

- การระบาดทเกดขนใหม เชน การระบาดของการตดเชอ Streptococcus equi subsp. zooepidemicus

- การระบาดทยงคงเกดขนอยางตอเนอง เชน การตดเชอ non-typhoidal Salmonella spp.

1.2 การคาดการสถานการณของปญหา และการตดตามแนวโนมของอบตการณและการกระจายของโรค

1.3 ความสมพนธของการกระจายของโรคตดเชอชนดนนๆ กบสงทอาจเปนสาเหต และมาตรการในการ

ควบคม เชน

- การตดเชอ Streptococcus pneumoniae สายพนธตางๆ และความสมพนธกบการเปลยนแปลงของ

สภาพอากาศ หรอการตดเชอไวรส หรอผลจากวคซน

- การตดเชอ Streptococcus suis และความสมพนธกบการกนเนอหมทไมสก ซงมกจะกนแกลมเหลา

1.4 การตดตามการเปลยนแปลงของแบคทเรยกอโรค เชน ความไวตอสารตานแบคทเรยและลกษณะของการ

กอโรค เชน community-acquired MRSA

2. การก�าหนดแนวทางในการการวนจฉยและรกษาผปวยโรคตดเชอ ขอมลดงกลาวทรวบรวมอยางเหมาะสม

มประโยชนและความส�าคญมากตอการก�าหนดแนวทาง

2.1 การวนจฉยเบองตนถงแบคทเรยทเปนสาเหตของการเจบปวย ดวยอาการของโรคตดเชอทต�าแหนงตางๆ

อาย โรคประจ�าตว ของผปวย รวมถงแหลงรบรงโรค

2.2 การเลอกใชยาตานแบคทเรยในการรกษาผปวยในเบองตน ขณะทไมมผลการตรวจเชอของผปวยคนนน

3. ประโยชนตอการท�าวจยทางระบาดวทยา และการวจยทางหองปฏบตการ ขอมลดงกลาวสามารถตอเนองไป

ถงการตงค�าถามการวจยใหมๆ และการวจยเพมเตมในหองปฏบตการ

กำรตดเชอแบคทเรยชนดรกล�ำในชมชน

การตดเชอแบคทเรยชนดรกล�าในชมชน หมายถง การทแบคทเรยบางชนดสามารถเขาไปสกระแสเลอดของคน

ทอยเปนปรกตในชมชนนอกโรงพยาบาล อาจกอใหเกดการตดเชอทอวยวะส�าคญตางๆ เชน เยอหมสมอง ปอด

กระดกและขอ การตดเชอดงกลาวมกจะเปนอนตรายไดมากและมกลมเสยงทเปนประชากรทวไป จ�าเปนตองหา

วธการปองกน ซงทส�าคญคอวคซน การควบคมการกระจายของแบคทเรยในสงแวดลอม หรอ การเปลยนพฤตกรรม

เสยง แบคทเรยทกอโรคดงกลาวโดยทวไป ไดแก S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus แบคทเรยทเปนปญหา

คอนขางเฉพาะของประเทศไทยและบางประเทศใกลเคยง ไดแก non-typhoidal Salmonella, S. suis, B. pseudomallei

ทพบวาเปนปญหาทเพมขนมาก ไดแก การตดเชอ S. agalactiae ในผใหญ สวนแบคทเรยทตองเฝาระวงวาจะเกด

เปนโรคระบาดใหมในประเทศไทย เชน Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis

ระบบตดตามขอมลการตดเชอแบคทเรยชนดรกล�าในชมชน เปนสงจ�าเปนตอการพฒนาระบบการดแลสขภาพ

ของประชาชนโดยทวไป และจ�าเปนตองมบคลากรและหนวยงานการปฏบตการดานแบคทเรยของระบบการแพทย

และสาธารณสขเปนแกนการด�าเนนงานรวมกบพยาบาลและแพทย ซงจะเปนผเสรมขอมลทางคลนก ระบบนควร

จะไดรบการพฒนาใหเปนระบบทยงยนของประเทศ เชนเดยวกบระบบการตดตามขอมลระบาดวทยาของการเจบ

ปวยดวยภาวะตางๆ จะแตกตางเพยงความจ�าเปนทตองมขอมลแบคทเรยทดเปนแกนส�าคญ



1. Osterholm MT, Hedberg CW. Epidemiologic principles. Section C: Epidemiology of Infectious Diseases.

In: Mandel GL, Bennett, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 6thed. Pensylvania:

Elsevier Churchill Livingstone. 2005; p. 161-172.

2. สยมพร ศรนาวน, สรางค เดชศรเลศ, อนศกด เกดสน, และ ThaiIBIS Net work. Thailand Invasive

Bacterial Infection Surveillance 2010-2011: Pathogen-based surveillance. การสมมนาระบาดวทยาแหงชาต

กรมควบคมโรค กระทรวงสาธาณสข ครงท 21 วนท 6 - 8 กรกฎาคม 2554 กรงเทพฯ.

ภาคผนวก


การเตรยมอาหารเลยงเชอ (Culture media)อญชล เจนวรรธนะ

การเตรยมอาหารเลยงเชอตองจดเตรยมตามวธทก�าหนดไวขางภาชนะบรรจอาหาร (dehydrated medium) ปจจย

ทมผลตอคณภาพอาหารทเตรยม ไดแก

1. คณภาพของ dehydrated medium ตองไมใชอาหารหมดอาย ชน จบเปนกอนหรอมการเปลยนส

2. ภาชนะทใชในการเตรยมอาหารตองสะอาดไมมการปนเปอนของสารอน

3. การชงอาหารและปรมาตรของน�าทน�ามาละลายอาหารตองถกตองและมคณภาพตามก�าหนด

4. ตองละลายใหสมบรณแตตองไมใชความรอนสงเกนไปและตองไมตมจนอาหารไหม การเขา autoclave

ไมสามารถละลายวนไดสมบรณ

5. ตองวด pH ของอาหารเลยงเชอทเตรยมทกครง ถาไมได pH ตามก�าหนดตองปรบใหได pH ตามก�าหนดโดย

ใช 1 N HCl ในกรณทอาหารทเตรยมม pH สงกวาทก�าหนด ปรบดวย 1 N NaOH ถาอาหารทเตรยมม pH

ต�ากวาทก�าหนด

วธการเตรยมอาหารแบงตามลกษณะของอาหารเปนอาหารทบรรจใน plate อาหารทบรรจในหลอดซงแบงเปน

อาหารเหลวและอาหารแขงทท�าเปน slant กอนเทอาหารใส plate ควรคอยใหอาหารเยนลงจนมอณหภมประมาณ

50 °C กอนเท plate เมอเทเสรจตองรอจนอาหารแขงตวดและเยนจงน�าใสในถงพลาสตกปดปากถง ตดฉลากชอ

อาหาร วนทเตรยมและวนหมดอาย เกบท 4-8 °C ตามเวลาทระบ ส�าหรบอาหารทใสใน tube ใสตามปรมาตรของ

อาหารแตละชนด คลายจกเกลยวขณะเขา autoclave วางเปน slant หรอ ตงตรงตามชนดของอาหาร เมออาหารเยน

ปดจกใหแนน ตดฉลากชออาหาร วนทเตรยมและวนหมดอาย เกบท 4-8 °C ตามเวลาทระบ โดยทวไปอาหารทอย

ใน plate จะมอายการใชงานประมาณ 1 เดอน แตถาเปน selective media อาจมอายการใชงานสนกวาซงระบใน

อาหารนนๆ

เมอเตรยมอาหารเสรจเรยบรอยแลว ตองท�าการตรวจสอบคณภาพทงการดดวยตาเปลา เชน สของอาหาร ไม

เหลวหรอแขงผดปกต ผววนเรยบไมขรขระ ถามการเตมเลอด เลอดตองไม hemolyse เมอผานการประเมนคณภาพ

ดวยตาเปลาแลวจงน�าอาหารประมาณ 10% ไปอบในตอบเพาะเชอ 35-37 °C เพอดวามการปนเปอนเชอหรอไม

และน�าสวนหนงไปทดสอบคณภาพวามคณภาพตามตองการหรอไม อาหาร lot ใดไมผานการตรวจสอบคณภาพ

ตองท�าการหาสาเหตและแกไขปรบปรงและจดเตรยมใหม หามน�าอาหารทไมผานการตรวจสอบไปใช

วธตรวจสอบคณภำพของอำหำรเพำะเชอ

ตรวจสอบคณภาพของ media ทเตรยมในแตละวน โดยเขยเชอทใชทดสอบลงใน BHI broth บม 35-37 °C นาน

2-4 ชม. เลยงเชอบน media ทตองการทดสอบบมท 35-37 °C นาน 18-24 ชม. ตรวจการเจรญของเชอหรอปฏกรยา

ทเกดขน ถาอาหารทเตรยมไมไดคณภาพ ตองหาสาเหตความผดพลาด แกไข แลวเตรยมใหม หามน�าอาหารทไมได

คณภาพมาใช อาหารเลยงเชอทผานการตรวจสอบคณภาพแลวน�าไปเกบในหองเยน 2-8 °C เพอใชงานตอไป


กำรเกบรกษำเชอทใชทดสอบคณภำพ

1. การเกบรกษาระยะยาว เกบเชอใน fetal calf serum + glycerol หรอ skimmed milk + glycerol ใสใน vial เลก ๆ

แลวเกบใสกลองเกบในต freeze ทอณหภมต�ากวา -20 °C

2. การเกบระยะสน เพาะเชอทใชทดสอบ media และเชอมาตรฐานชนดตางๆ โดย subculture เดอนละ 2 ครง

เกบไวใน cold room/ตเยน

3. เชอทใชงานประจ�าวน

ก. เพาะเลยงเชอทใชทดสอบ media โดย subculture สปดาหละครง

ข. เพาะเลยงเชอทตายงาย เชน Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus, Streptococcus pneumoniae โดย subculture วนเวนวน

อำหำรเพำะเชอ (plating media)

Blood Agar (BA)

BA เปนอาหารเพาะเชอทใชส�าหรบสงสงตรวจทกชนด และใชในการเพมจ�านวนแบคทเรยเกอบทกชนด

BAเปนอาหารทวไป (non selective medium) แตใชในการแยกชนดของแบคทเรยทให hemolysis เปนลกษณะ

ส�าคญในการวนจฉยเชอ เชน Streptococcus, Listeria monocytogenes, Archanobacterium เปนตน มสวนผสมของ

เลอด 5% ซงอาจใช defibrinated sheep, horse, rabbit blood หรอใชเลอดหมดอายจากคลงเลอด โดยผสมกบ

trypticase หรอ tryptic soy agar ใน soy agar ม peptones ทเปนแหลงของ amino acid, carbon, nitrogen และ sul-

fur ในเลอดมสวนประกอบของ serum เมดเลอดแดง ชวยใหสามารถด hemolytic pattern (ตองใช sheep blood)

และการเจรญเตบโตของเชอ BA เปนอาหารทมคา pH คอนขางจะเปนกรด ซงมสวนชวยเสรมในการเพาะเชอ

streptococci และ pneumococci อาหารทเตรยมเองสามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 1 เดอน

กำรควบคมคณภำพ ใชเชอ

1. β - Streptococcus group A = เจรญและให β - hemolysis

2. Streptococcus pneumoniae = เจรญและให α - hemolysis

3. Non hemolytic Streptococcus = เจรญและไมเกด hemolysis

BACTEROIDES BILE ESCULIN AGAR (BBE)

BBE เปน selective medium ใชในการแยกและวนจฉยเชอ Bacteroides fragilis group เบองตน การตรวจพบ

อยางรวดเรวส�าหรบแบคทเรยกลมนมความส�าคญเพราะพบกอโรคในคนไดบอยและดอตอ penicillin ซงเปนยาท

ใชรกษาการตดเชอ anaerobic bacteria อาหารนประกอบดวย ox gall, esculin และ gentamicin เชอ Bacteroides

fragilis group เจรญไดดบนอาหารทมน�าด สามารถ hydrolyse esculin ไดท�าใหโคโลนมสด�า gentamicin ยบยงการ

เจรญของ anaerobic bacteria สวนใหญ แตไมมผลในการยบยง Bacteroides vugatus ขนไดบนอาหารนแตไม

hydrolyse esculin



1. Bacteroides fragilis = เจรญและใหโคโลนสด�า

2. Bacteroides vugatus = เจรญแตไมใหโคโลนสด�า

3. Clostridium perfringens = ไมเจรญ

ANAEROBIC BLOOD AGAR (ANA BA)

ANA BA เปน enriched medium ทใชในการแยกและเพาะ anaerobic bacteria สารอาหารคอ tryptic soy agar/

brain heart infusion agar/Columbia agar/ Schaedller agar/ CDC agar ทเสรมดวย yeast extract, vitamin K , hemin

และ 5% sheep blood ในกรณเตมเลอดเพอใชด hemolytic reaction อาหารนใชส�าหรบแยกแบคทเรยแกรมบวก

ไดดวย hemin และ vitamin K ชวยในการเจรญของ Prevotella spp. และ Porphyromonas spp. อาหารทเตรยมเอง

สามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 1 เดอน


1. Bacteroides fragilis = เจรญได

2. Clostridium perfringens = เจรญให double zone hemolysis

CHOCOLATE AGAR (CA)

CA เปน highly enriched medium ทใชในการเพาะเชอทตองการสารอาหารพเศษในการเจรญหลายชนด

(fastidious organisms) เชน Neisseria และ Haemophilus อาหารนมหลายสตรสวนประกอบพนฐานประกอบ

ดวย GC medium base, hemoglobin ซงเปน hemin หรอ X factor ท�าใหอาหารมส chocolate และ yeast extract/

IsoVitalex ซงเปนแหลงของ NAD ( nicotinamide adenine dinucleotide) หรอ V factor อาหารทเตรยมสามารถ

เกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 1 เดอน


1. Neisseria gonorrhoeae = เจรญ

2. Haemophilus influenzae = เจรญ

EOSIN - METHYLENE BLUE AGAR (EMB)

EMB เปน moderately inhibitory medium ใชในการแยกและตรวจหาพวก Enterobacteriaceae หรอแยก related

coliform bacilli จากสงสงตรวจผปวยทเปน mixed bacteria, aniline dyes (eosin และ methylene blue) จะยบยง

แบคทเรยแกรมบวกและ fastidious gram negative bacteria และท�าหนาทเปน indicator ซงจะใหความแตกตางได

อยางชดเจนระหวางโคโลนของเชอท ferment lactose และเชอทไม ferment lactose อาหารนม sucrose ดวย ใช

ตรวจหา coliform groups ซงจะ ferment น�าตาลชนดนไดชดเจนกวา lactose โคโลนทให lactose positive จะมสด�า

หรอจดตรงกลางด�าโดยบรเวณรอบ ๆจะใส ขณะท lactose หรอ sucrose negative จะไมมส อาหารทเตรยมเอง

สามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 1 เดอน



1. Escherichia coli = เจรญเปน lactose fermenter

2. Salmonella species = เจรญเปน non lactose fermenter

3. Staphylococcus coagulase negative = ไมเจรญ

MacConkey (MAC)

MAC เปน moderately inhibitory media เชนเดยวกบ EMB ใชในการแยกกลม Enterobacteriaceae และ related

enteric gram negative bacilli, bile salts และ crystal violet ยบยงการเจรญเตบโตของแบคทเรยแกรมบวก และ

fastidious gram negative bacteria บางชนด ม lactose เปนแหลงของ carbohydrate และ neutral red เปน indicator

เชอทสามารถยอยสลาย lactose จะให โคโลนสชมพ-แดง หลงเพาะเชอท 35-37 °C 16-18 ชม. เชน Escherichia coli

สวนเชอทไมยอยสลาย lactose (non lactose fermenting bacteria) จะใหโคโลนไมมส หรอใส เชน Salmonella spp,

Shigella spp. เปนตน อาหารทเตรยมเองสามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 1 เดอน


1. Escherichia coli = เจรญเปน lactose fermenter (colony สชมพ)

2. Proteus mirabilis = เจรญเปน non lactose fermenter (colony ไมมส) และไม swarm


HAEMOPHILUS TEST MEDIUM (HTM)

HTM เปน enriched medium ใชส�าหรบทดสอบหาความไวของเชอ Haemophilus species ตอสารตานจลชพ

ชนดตางๆ โดยใช MHA แลวเตม hematin (factor X) และ nicotinamide (NAD) ซงเปน factor V เพอเปนตวเสรม

ทจ�าเปนใหเชอเจรญเตบโตไดด ขอดของอาหารนกคอเปนอาหารทใส ท�าใหการอานผลสะดวกเพราะเหนรอยขอบ

การเจรญของเชอไดชดเจน อาหารทเตรยมสามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 2 สปดาห


1. Haemophilus influenzae = เจรญ

2. Quality control ของการทดสอบความไวกบเชอ Haemophilus ATCC 49247 และ Haemophilus ATCC

49766 ไดผลตามทก�าหนด

MUELLER HINTON AGAR (MHA)

MHA เปนอาหารทแนะน�าโดย CLSI ใชส�าหรบทดสอบหาความไวของ non fastidious microorganisms ตอสาร

ตานจลชพตาง ๆ โดยวธของ disk diffusion method อาหารทเตรยมเองสามารถเกบท 4-8 °C ในถงพลาสตกทปด

ไดนาน 7 วน


1. อาหารทเตรยมเสรจตองม pH 7.2-7.4 ทอณหภมหอง

2. ความหนาของอาหารในจานเพาะเชอเชอตองหนา 4 mm และสม�าเสมอทวจาน


3. อาหารทน�ามาใชตองไมแหง

4. การท�า Quality control กบเชอทใชทดสอบ E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, S. aureus ATCC

25923 และ P. aeruginosa ATCC 27853 ไดผลตามทก�าหนด

MUELLER HINTON AGAR WITH 5% SHEEP BLOOD

MHA with 5% sheep blood ใชส�าหรบการทดสอบหาความไวของเชอทไมขนบน MHA เชน Streptococcus

pneumoniae และใชกบเชอ Streptococcus group อนตอสารตานจลชพของเชอ อาหารทเตรยมเองสามารถเกบท

4-8 °C ในถงพลาสตกทปดไดนาน 2 สปดาห


1. Streptococcus pneumoniae = เจรญ

2. ดผล Quality control การทดสอบความไวของ S. pneumoniae ATCC 49619 ไดผลตามทก�าหนด

RAPPAPORT-VASSILIADIS (MSRV) MEDIUM

MSRV medium เปนอาหารกงแขงกงเหลว (semisolid) ม peptone เปนแหลงของ carbon และ nitrogen ซงม

ความจ�าเปนในการเจรญของแบคทเรย ม magnesium chloride ไปเพม osmotic pressure ในอาหาร เตม

novobiocin และ malachite green เพอยบยงแบคทเรยอนทไมใช Salmonella, magnesium chloride pH ต�าของ

อาหาร novobiocin และ malachite green ท�าใหอาหารนเปน selective medium ส�าหรบเชอ Salmonella เหมาะ

ส�าหรบใชตรวจหา Salmonella ทเคลอนไหวได (motile)ในอจจาระและอาหารโดยบรเวณรอบๆทมเชอ

Salmonella ขนจะเหนเปนวงไมมสแผออกรอบๆ


Salmonella enteritidis = เจรญและใหวงไมมสแผออกรอบๆ

Proteus mirabilis = ไมใหวงไมมส (Halo)

SABOURAUD DEXTROSE AGAR (SDA)

SDA เปนอาหารทถกแนะน�าใหใชส�าหรบเพาะเชอรากอโรค โดยเฉพาะในกลมทเกยวของกบการตดเชอทผวหนง

เนองจากอาหารมคา pH ต�า จงชวยยบยงการเจรญของแบคทเรย โดยทวไปอาหารนนยมใชกบ slide culture technique

เพอดลกษณะรปรางของเชอรา


1. Candida albicans = เจรญ

2. Trichophyton mentagrophytes = เจรญ

SABOURAUD DEXTROSE AGAR (SDA) WITH GENTAMICIN

SDA with gentamicin เปนการเพมสารตานจลชพ gentamicin ลงไปใน Sabouraud dextrose agar เพอเพม

ประสทธภาพในการยบยงแบคทเรยไมใหเจรญเตบโต ท�าใหเชอรากอโรคสามารถเจรญไดดขน




2. Escherichia coli ATCC 25922 = ไมเจรญ

MYCOSEAL AGAR (MYCOSEL)

Mycoseal agar เปน SDA ซงเปนอาหารส�าหรบเพาะเชอรากอโรคทเตม cycloheximide และสารตานจลชพ

chloramphenicol ท�าใหม selective มากยงขน เปนอาหารทมประโยชนสงมากในการแยกเชอรากอโรคทผวหนง

ผม เลบ และเชอรากอโรคอนๆ ทเปนสาเหตของ systemic disease ซง cycloheximide ชวยยบยงพวก saprophytic

fungi สวน chloramphenicol ชวยยบยงการเจรญของแบคทเรย



2. Escherichia coli ATCC 25922 = ไมเจรญ

3. Aspergillus niger = ไมเจรญ

SALMONELLA SHIGELLA (SS) AGAR

SS agar เปน highly selective medium ทสงเสรมให Salmonella และ Shigella spp. เจรญเตบโตในขณะทมสาร

ยบยงการเจรญของ coliform organisms สวนใหญ bile salts และ sodium citrate ชวยยบยงแบคทเรยแกรมบวก

ทงหมด แบคทเรยแกรมลบหลายชนดรวมทงกลม coliforms ม lactose เปนแหลงของคารโบไฮเดรตม neutral red

เปน indicator ซงจะมสแดงในสภาวะเปนกรดและไมมสในภาวะเปนดาง sodium thiosulfate เปนแหลงของ sulfur

gas และ hydrogen sulfide ทแบคทเรยสรางขนจะรวมตวกบ ferric citrate เกดเปน ferric sulfide ซงจะท�าให

โคโลนมจดสด�าตรงกลาง โคโลนของแบคทเรยทยอยสลายน�าตาล lactose (lactose fermenter) จะมสชมพ-สแดง

แบคทเรยทไมยอยสลายน�าตาล lactose โคโลนจะใสไมมส เชน Shigella spp. แบคทเรยทไมยอยสลายน�าตาล lactose

ทสราง hydrogen sulfide โคโลนจะใสไมมสและมจดด�าตรงกลาง เชน Salmonella spp.


1. Escherichia coli = ไมเจรญหรอเจรญนอย โคโลนมสชมพ

2. Salmonella spp. = โคโลนใสไมมสและมจดด�าตรงกลาง

3. Shigella sonnei = โคโลนใสไมมส


THAYER-MARTIN AGAR

Thayer Martin agar เปน enriched และ selective medium ใชส�าหรบแยกพวก Neisseria จากสงสงตรวจผปวย

ทมเชอประจ�าถน โดยเปน CA ทเตม vancomycin, colistin และ nystatin เพอยบยงเชอประจ�าถนทเปนแบคทเรย

แกรมบวก แกรมลบ และเชอรา



1. Neisseria gonorrhoeae = เจรญ


3. Candida albicans = ไมเจรญ

THIOSULFATE CITRATE BILE SALT SUCROSE (TCBS) AGAR

TCBS เปน highly selective medium ส�าหรบเชอ Vibrio ใชในการเพาะแยกเชอ Vibrio cholerae และ Vibrio

spp. อนๆจากอจจาระและสงสงตรวจอนๆ ใชเปนอาหารเพาะเชอเพอแยกเชอ V. cholerae จากอจจาระผปวย

อหวาตกโรค คดคนโดย Kobayashi และคณะซงดดแปลงจากอาหารทคดคนโดย Nakanishi การใช alkaline peptone

รวมกบ TCBS เพอแยกเชอ V. cholerae และ Vibrio spp. อนๆ การเตม ox gall ซงประกอบดวย bile salts และ

sodium cholate ใน TCBS เพอยบยงการเจรญของแบคทเรยแกรมบวกและม sodium thiosulfate เปนแหลงของ

sulfur ใชรวมกบ ferric citrate ในการตรวจการสราง hydrogen sulfide สวนน�าตาล sucrose ใชดความสามารถของ

เชอในการยอยสลาย sucrose โดยม thymol blue เปน indicator ความเปนดางของอาหารท�าใหแยกเชอ V. cholerae

ไดด โดยเชอ V. parahaemolyticus ซงไมยอยสลาย sucrose จะใหโคโลนสเขยวบนอาหารน สวนเชอ V. cholerae

ใหโคโลนสเหลองเพราะยอยสลาย sucrose กลม enteric bacteria เชน coliforms และ Proteus ซงพบปนเปอนมา

กบอจจาระจะถกยบยง บางสายพนธของ Proteus และ Enterococcus อาจโตได แตจะเปน colony ขนาดเลกและ

ใส ซงแยกความแตกตางไดชดเจน TCBS ทผลตโดยแตละบรษทและแตละ lot อาจมความจ�าเพาะแตกตางกน


1. Vibrio cholerae = เจรญ โคโลนสเหลอง

2. Vibrio parahaemolyticus = เจรญ โคโลน สเขยว

3. Escherichia coli = ไมเจรญ

XYLOSE LYSINE DESOXYCHOLATE AGAR (XLD)

XLD เปน selective differential medium ใชแยก Salmonella spp. และ Shigella spp. จากอจจาระหรอ rectal

swab แยก Salmonella และ Shigella จากเชอประจ�าถนในล�าไสโดยอาศยคณสมบตการยอยสลาย (ferment) xylose

และ lactose, lysine decarboxylation และการสราง hydrogen sulfide บน XLD Shigella ใหโคโลนใสสชมพหรอ

แดงขนาดเสนผานศนยกลาง 1-2 mm. โคโลนของ S. dysenteriae บน XLD มขนาดเลกกวา Shigella spp. อน สวน

coliform แบคทเรยใหโคโลนสเหลอง Salmonella ใหโคโลนสแดงมจดสด�าตรงกลางหรออาจใหโคโลนสเหลองม

จดตรงกลางสด�ากได


1. Escherichia coli = ไมเจรญหรอเจรญนอยโคโลนสเหลอง

2. Salmonella spp. = โคโลนสแดงและมจดด�าตรงกลาง

3. Shigella sonnei = โคโลนสชมพ



อำหำรเพำะเชอทบรรจเปนหลอด

BRAIN HEART INFUSION (BHI) BROTH

BHI broth เปนอาหารเหลวทใส ซงมสารอาหารทจ�าเปนตอการเจรญของเชอสงมาก จงเหมาะส�าหรบเพาะ

เลยงเชอไดหลายชนด นอกจากนยงใชเตรยม inoculum เชอ ส�าหรบทดสอบ susceptibility test และ identification


1. Escherichia coli = เจรญ

2. Staphylococcus coagulase positive = เจรญ

THIOGLYCOLLATE MEDIUM

Thioglycollate medium เปน enriched liquid medium ซงเปน supplement ทดในการชวยเสรมการเพาะเชอ

แบบ plating mediaในการแยกเชอทเจรญชาหรอตองการสารอาหารพเศษ นอกจากนยงชวยใหเชอเจรญเตบโตได

ด โดยเฉพาะพวก anaerobic bacteria ทพบจากสงสงตรวจผปวย ทงยงใชในการตรวจหาเชอจากต�าแหนงทไมมเชอ

ประจ�าถน


1. Bacteroides fragilis = เจรญ

2. Propionibacterium acnes = เจรญ

SELENITE BROTH

Selenite broth เปนอาหารส�าหรบแยกเชอ Salmonella จากสงสงตรวจผปวย เชน อจจาระ ปสสาวะ หรอน�า

ทง ซงอาจมแบคทเรยปะปนอยหลายชนด sodium selenite จะยบยง E. coli และ coliform bacilli อน ๆ อาหารน

จะท�าหนาทไดดทสดในสภาพทไรออกซเจนจงตองใสอาหารใหมความลกอยางนอย 2 นว หลงจากอบไวเปน

เวลา 8–12 ชม. ให subculture ลง SS agar เพอไมให coliform อน หรอเชอประจ�าถนของล�าไสขนครอบคลมเชอกอ

โรค


1. Salmonella spp. = ควบคมผลบวก

2. Escherichia coli = ควบคมผลลบ

หมายเหต sodium selenite เปนสารกอมะเรง ควรใชดวยความระมดระวง

อำหำรส�ำหรบทดสอบปฏกรยำชวเคม

BILE ESCULIN AGAR

Bile esculin agar ใชตรวจดความสามารถของแบคทเรยในการสราง hydrolyse glycoside esculin เปน

esculetin และ glucose ในอาหารทม bile 40% ซง esculetin ท�าปฏกรยากบ ferric ions ใหสารประกอบสด�าทซม

ได ใชในการแยก facultative anaerobic bacteria ตวอยางการใชปฏกรยาน เชน แยกเชอ


1. Streptococcus group D (+) จาก non group D Streptococcus (-)

2. Listeria spp. (+) จากแบคทเรยแกรมบวกไมมสปอรอน (-)

3. แบคทเรยทสราง pigment สเหลอง เชน Flavimonas oryzihabitans (-), Sphingomonas

paucimobilis (+) และ Chryseomonas luteola (+)


1. Enterococci = ควบคมผลบวก (สด�า)

2. β - Streptococcus group A = ควบคมผลลบ (ไมเกดสด�า)

1% CARBOHYDRATE BROTH FOR FERMENTATION TEST

อำหำรเหลวทเตมน�ำตำล 1% ใชเพอตรวจสอบความสามารถของแบคทเรยในการยอยสลายน�าตาลจ�าเพาะแตละ

ชนดทใสใน basal medium ซงม indicator ส�าหรบการทดสอบแบคทเรยในกลม Enterobacteriaceae นยมใช

phenol red broth base ซงเปน peptone ทไมมน�าตาล และม phenol เปน indicator เมอยอยสลายน�าตาลใหกรดอาหาร

จะเปลยนเปนสเหลอง ถาไมยอยสลายน�าตาลอาหารจะไมเปลยนส ถาเปนดางมากขนจะมสชมพเขมมากขน ส�าหรบ

การตรวจหาแกสใหใสหลอด Durham โดยคว�าหลอดอยาใหมแกสในหลอด ใสเฉพาะหลอดทใสน�าตาล glucose

หลอดเดยวและดการเกดแกส ในการทดสอบควรมหลอดทไมใสน�าตาลหนงหลอดเพอใชเทยบสกบหลอดทมน�าตาล

เมอมเชอขน

หมำยเหต Carbohydrate ทใชม 15 ชนดคอ

1. Arabinose 2. Cellobiose 3. Dextrose

4. Inositol 5. Lactose 6. Maltose

7. Mannitol 8. Mellibiose 9. Raffinose

10. Rhamnose 11. Salicin 12. Sorbitol

13. Sucrose 14. Trehalose 15. Xylose


Arabinose Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Serratia marcescens = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Cellobiose Enterobacter spp . = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Morganella morganii = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Dulcitol Salmonella spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Glucose Escherichia coli = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Moraxella osloensis = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Inositol Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Escherichia coli = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Lactose Escherichia coli = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Proteus mirabilis = ควบคมผลลบ (ชมพ)


Maltose Escherichia coli = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Mannitol Escherichia coli = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Mellibiose Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Raffinose Klebsiella pneumoniae = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Rhamnose Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Serratia marcescens = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Salicin Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Salmonella spp. = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Sorbitol Escherichia coli = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Sucrose Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (เหลอง)

Salmonella spp. = ควบคมผลลบ (ชมพ)

Trehalose Klebsiella pneumoniae = ควบคมผลบวก (เหลอง)


Xylose Klebsiella pneumoniae = ควบคมผลบวก (เหลอง)


SIMMONS CITRATE AGAR

Citrate agar ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการใช citrate เปนแหลง carbon อาหารนจงตองไมม protein

แตม sodium citrate เปนแหลงของ carbon และม ammonium phosphate เปนแหลงของ nitrogen ม bromothymol

blue เปน pH indicator แบคทเรยทสามารถใช citrate จะให ammonia ท�าใหเกดดาง อาหารจะเปลยนเปนสฟา

ผลลบจะเปนสเขยวเหมอนเดม ใชวนจฉย Enterobacteriaceae ตวอยางเชน ใชแยก

1. Edwardsiella (-) จาก Salmonella (+)

2. Klebsiella-Enterobacter (+) จาก E. coli (-)


1. Enterobacter spp. = ควบคมผลบวก (สน�าเงน)

2. Escherichia coli = ควบคมผลลบ (สเขยว)

CYSTINE TRYPTICASE AGAR (CTA)

CTA เปนอาหารกงแขงกงเหลวทเตมน�าตาล 1% เพอใชตรวจสอบความสามารถของ Neisseria ในการยอยสลาย

น�าตาลจ�าเพาะแตละชนด ม cystine trypticase agar เปน base และม indicator ใชทดสอบความสามารถของเชอ


Neisseria ในการยอยสลายน�าตาลชนดตางๆ ผลลพธทไดถาเปนกรดจะเปลยนสอาหารเปนสเหลอง ถาไมสราง

กรดอาหารจะเปนสชมพ

น�าตาลทใชม 4 ชนดคอ dextrose, lactose, sucrose และ maltose


1. Neisseria gonorrhoeae = dextrose acid (สเหลอง)

น�าตาลอน ควบคมผลลบ (สชมพ)

2. Neisseria meningitidis = dextrose และ maltose acid (สเหลอง)

น�าตาลอน ควบคมผลลบ (สชมพ)

ขอแนะน�ำในกำรทดสอบ

1. อาจเตม agar ในอาหารใหเปน 1% และวางเปน slant เวลาใสเชอใช loop ตกมาปายบนผว slant จะเหนการ

ยอยสลายน�าตาลชดขน

2. การทดสอบการยอยสลายน�าตาลของ Neisseria ไมอบเชอในภาวะทม CO2

DECARBOXYLASE TEST MEDIUM

Decarboxylase test medium เพอทดสอบความสามารถของจลชพในการสรางเอนไซมทไปแยก carboxyl group

(carboxylase) หรอ hydroxyl group (hydrolyse) ออกจากกรดอะมโน (lysine, ornithine และ arginine) เพอสราง

amine ซงมผลลพธเปนดาง การเตม glucose ในอาหารชวยใหแบคทเรยเจรญไดดขนและเตม pH indicator (bro-

mocresol purple) การเกดปฏกรยาจงเกดเปนสองขนตอนคอในภาวะทขาดออกซเจนแบคทเรยบางชนดสามารถ

ยอยสลาย glucose ได ท�าให pH ลดลง ซงจะเปลยนสของอาหารจากมวงเปนเหลอง pH ทต�านจะไปกระตนการ

สรางเอนไซม decarboxylase ซงเปลยน lysine เปน cardaverine และเปลยน ornithine เปน putrescine สวน arginine

จะถก hydrolyse เปน citrulline และ citrulline ถกเปลยนไปเปน ornithine และถก decarboxylate เปน putrescine

เชอทสามารถ decarboxylate amino acid จะไดดางท�าใหสของอาหารเปลยนกลบไปเปนสมวงเหมอนเดม ดงนน

ผลบวกคออาหารเลยงเชอมสมวง ผลลบอาหารมสเหลอง


Lysine Arginine Ornithine

1. Klebsiella pneumoniae + - -

2. Enterobacter cloacae - + +

DNase-TOLUIDINE BLUE AGAR

DNase-toluidine blue agar ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการสรางเอนไซม deoxyribonuclease (DNase)

ซงใชในการยอยสลาย deoxyribonucleic acid (DNA) ได oligonucleotides โดย inoculate เชอในอาหารทม DNA

และ metachromatic dye toluidine blue ตวอยางการใชปฏกรยาน เชน ใชแยกเชอ

1. Klebsiella-Enterobacter-Serratia spp. (+) ยกเวน S. proteamarculans subsp. proteamarculans (ชอเดม

S. liquefaciens สวนใหญใหผล V/+) จากเชอ S. fonticola (-) และ Klebsiella-Enterobacter spp. (-)

2. Moraxella catarrhalis (+) และ Kingella dentrificans (+) จาก Neisseria spp. (-) เชอประจ�าถนของทาง

เดนหายใจขนไดไมดบนอาหารนจงใชเปนอาหารทแยก Moraxella catarrhalis จากเสมหะอยางรวดเรว

3. Plesiomonas shigelloides (-) จาก Aeromonas spp. (+)


วธกำรทดสอบ ปายเชอทไดจากการเพาะบนอาหารเลยงเชอ เชน BA คางคนมาปายเปนวงบนอาหารน อบท 35-37 °C

24-36 ชม. จนเหนเชอเจรญเตมท ผลบวกจะเหนเปนวงสชมพ ผลลบไมเกดสชมพ


1. Escherichia coli = ควบคมผลลบ (ไมเกดสชมพ)

2. Serratia marcescens = ควบคมผลบวก (สชมพ)

GELATIN MEDIUM

Gelatin mediun ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการสรางเอนไซมทยอยโปรตน (gelatinases) ซงไปยอย

gelatin เปน amino acid ท�าใหเสยคณสมบตการเกด gelling ตวอยางการใชปฏกรยาน เชน ใชแยก

1. Listeria monocytogenes (-) จาก Arcanobacterium pyogenes (Actinomyces pyogenes/Corynebacterium

pyogenes) (+)

2. Nocardia brasiliensis (+) จาก Nocardia asteroids (-), N. farcinia (-), N. nova (-), N. otididiscarviarum

(-) และ N. transvalensis (-)


1. Serratia marcescens = ควบคมผลบวก

2. Escherichia coli = ควบคมผลลบ

INDOLE TEST

จลชพทสามารถสรางเอนไซม trytophanase จะเปลยน tryptophan เปน indole ตรวจ indole ไดโดยเตม

p-dimethyaminobenzaldehyde (Ehlich’s หรอ Kovac’s reagent) ลงในอาหารเหลวทม trytophan ทเลยงเชอ ผล

บวกจะมสแดงทชนบนของอาหารเหลว ผลลบจะเปนสเหลอง ตวอยางการใชปฏกรยาน เชน ใชแยก

1. E. coli (+) จาก Klebsiella spp. (-) ยกเวน K. oxytoca (+), Enterobacter (-), Hafnia (-), Serratia (-),

Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans) (-)

2. Cardiobacterium hominis (+weak) จาก Eikenella corrodens (-), Kingella spp. (-), และ Suttonella in-

dologenes (Kingella indologenes) (-)

3. Paenibacillus alvei (Bacillus alvei ) (+) จาก Bacillus spp. อน (-)

การควบคมคณภาพ ใชเชอ

1. Escherichia coli = ควบคมผลบวก (สแดงเมอหยด Kovac’s reagent)

2. Enterobacter cloacae = ควบคมผลลบ (สเหลองตรง Kovac’s reagent)

LYSINE IRON AGAR

Lysine iron agar ใชทดสอบความสามารถของแบคทเรยแกรมลบรปแทงในการ decarboxylate หรอ deam-

inate lysine และให hydrogen sulfide (H2S) เมอ glucose ทมปรมาณนอยในอาหารถกยอยสลาย (ferment) กนหลอด

จะเปลยนเปนกรด (สเหลอง) ถาเชอสามารถสรางเอนไซม lysine decarboxylase จะสราง cadaverine ขน cadaver-

ine จะ neutralize organic acids ทถกสรางจากการ ferment glucose ท�าใหกนหลอดเปลยนกลบไปเปนดาง (สมวง)


เชอทสามารถสรางเอนไซม lysine deaminase จะไดสารประกอบทท�าให slant เปลยนเปนสมวงแดง แตถาไมม

deamination, slant จะยงคงมสมวงเหมอนเดมแบคทเรยทสราง gas hydrogen sulfide เมอถกกบ ferric

ammonium citrate ในอาหารจะใหตะกอนสด�าของ ferrous sulfide


Organisms LDA LDC H2S

Salmonella spp. - + +

Proteus mirabilis + - -

MALONATE BROTH

Malonate broth ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการใช sodium malonate เปนแหลงของ carbon ถา

สามารถใชได จะไดผลลพธทเปนดาง

ขอควรระวงในกำรอำนผล การอานผล malonate เปนการอานความเปนดางในอาหารไมใชอานการใช malonate

เชอบางชนดใหดางจ�านวนนอย การอานผลจงควรเปรยบเทยบกบหลอดทไมไดใสเชอ การอานผลลบตองอานเมอ

อบหลอดทใสเชอไว 48 ชม. การอานผลหลง 48 ชม.หากมดางเลกนอยใหอานผลเปนลบ


1. Klebsiella pneumoniae = ควบคมผลบวก (สน�าเงน)

2. Escherichia coli = ควบคมผลลบ (สเขยว)

METHYL RED-VOGES PROSKAUER (MR-VP) MEDIUM

MR-VP medium ใช

1.ทดสอบความสามารถของจลชพในการสรางและคงไวซงผลทเปนกรดจากการยอยสลาย glucose เปนการ

ตรวจปรมาณของกรด (quantitative test) เชอบางชนดสรางกรดจ�านวนมากกวาเชอบางชนด อานผลโดยเตม methyl

red reagent ผลบวกใหสแดง ผลลบใหสเหลอง ตวอยางการใชปฏกรยาน เชน ใชในการแยกเชอ

1. E. coli (+) จาก Enterobacter aerogenes (-), Enterobacter cloacae (-)

2. Edwardsiella ictaluri (-) จาก E. tarda (+) และ E. hoshinae (+)

2.ทดสอบความสามารถของจลชพในการสราง acetylmethylcarbinol (acetoin) จากการยอยสลาย glucose ใน

ภาวะทเปนกลาง อานผลโดยเตม 5% α-naphthol ใน absolute ethyl alcohol และ 40% potassium hydroxide ผล

บวกใหสแดง ผลลบเปนสน�าตาล ปกตแบคทเรยจะใหผล MR (+) หรอ VP (+) หรอ (-) ทงสองปฏกรยา แบคทเรย

ทใหผล MR+/VP+ จงใชเปนลกษณะส�าคญทใชในการวนจฉยเชอ แบคทเรยทใหผล MR+/VP+ ไดแก

1. Aeromonas hydrophila

2. Aeromonas salmonicida subsp. masoucida

3. Aeromonas veronii

4. Listeria spp.

5. Vibrio metschnikovii



1. Escherichia coli = MR+(สแดง), VP-(สน�าตาล)

2. Enterobacter spp. = MR-(สเหลอง), VP+(สแดง)

MOTILITY TEST MEDIUM

Motility medium ใชทดสอบวาแบคทเรยเคลอนไหวไดหรอไม ซงแบคทเรยเคลอนไหวโดย flagella ซงพบใน

แบคทเรยทเปนรปแทง แบคทเรยทเคลอนไหวไดอาจม flagella เสนเดยวหรอหลายเสนกได ต�าแหนงของ flagella

อาจแตกตางกนในแบคทเรยแตละชนดและภาวะทเลยงเชอ ในบางครงแบคทเรยทเคลอนไหวไดอาจเปลยนเปน

แบคทเรยทไมเคลอนไหว แบคทเรยทเคลอนไหวไมไดไมม flagella ตวอยางการใชปฏกรยา motile ในการแยกเชอ

เชน

1. Bacillus anthracis (-) และ B. mycoides (-) จาก Bacillus spp. (+) อนๆ

2. Edwardsiella ictaluri (-) จาก E. tarda (+)

3. Salmonella spp. (+) จาก Shigella spp. (-)


1. Klebsiella pneumoniae = non motile

2. Enterobacter cloacae = motile

NITRATE BROTH FOR NITRATE REDUCTION TEST

Nitrate broth ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการเปลยน nitrate เปน nitrites หรอ nitrogen gas หลง

เพาะเชอใน nitrate broth เปนเวลา 16-24 ชม. เตมน�ายา α-Naphthylamine 0.5% (ตองระวงในการใชเพราะเปนสาร

กอมะเรง) หรอ N,N-dimethyl- α-Naphthylamine 0.6% แลวเตม sulfanilic acid ในปรมาณเทากน (อยางละ 5หยด)

การอานผล ผลบวกไดสแดง (แสดงวามการ reduce nitrate เปน nitrites) ถาไมเกดสแดงใหเตม zinc dust ถาเปลยน

เปนสแดงแสดงวาเปนผลลบ ถาไมเกดสแดงแสดงวา nitrate ถก reduce เปน nitrogen gas ใหอานผลเปนบวก


1. Escherichia coli = ควบคมผลบวก (สแดง)

2. Pseudomonas aeruginosa = ควบคมผลบวก มแกส (ไมมสหลงเตม Zinc dust)

3. β- Streptococcus group A = ควบคมผลลบ (ไมมสกอนเตม Zinc dust หรอ มสแดงหลงเตม

Zinc dust)

OF-BASAL MEDIUM

OF-basal medium เปน based ทใชเตม น�าตาลตางๆ 1% เพอทดสอบ oxidative หรอ fermentative metabolism

ของcarbohydrateในแบคทเรย แบคทเรยทสามารถ ferment น�าตาลในหลอด จะเปลยนสอาหารเปนสเหลองใน

ภาวะทมและไมมoxygen แตถาเปลยนเปนสเหลองเฉพาะภาวะทม oxygenเทานนแสดงวาเชอสามารถ oxidize

น�าตาลในหลอด ถาอาหารไมมการเปลยนสทงภาวะทมและไมม oxygen (เปนสฟา) แสดงวาแบคทเรยนนเปนเชอ

non-oxidizer ส�าหรบน�าตาลในหลอด


กำรควบคมคณภำพ เมอเตรยม 1% glucose OF ใชเชอ

1. Escherichia coli = fermenter (สเหลองทง 2 หลอด)

2. Pseudomonas aeruginosa = oxidizer (สเหลองหลอดทไมปด oil)

3. Acinetobacter lwoffii = non oxidizer (สน�าเงนทง 2 หลอด)

SALT TOLERANCE TEST

Salt tolerance test ใชดการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรยในภาวะทมเกลอสง ซงใชในการแยก enterococci

(positive) ออกจากพวก non enterococci (negative) ใช BHI broth เปนอาหารเลยงเชอ เตมเกลอ NaCl 6.5% ผล

บวกเชอเจรญ (ขน) ผลลบเชอไมเจรญ (ใส)


1. Enterococcus = ควบคมผลบวก (ขน)

2. β- Streptococcus group A = ควบคมผลลบ (ใส)

SODIUM CHLORIDE

Sodium chloride ทมความเขมขน 0%, 3%, 6%, 8% ถกน�ามาใชดความสามารถของเชอแบคทเรยทจะเจรญ

เตบโตไดในภาวะทมความเขมขนของเกลอ (NaCI) ในระดบตางๆกน ซงเปนลกษณะเฉพาะของเชอและสามารถ

น�ามาใชเปนหลกในการแยกเชอระหวางกลมของ Vibrio spp., Aeromonas spp. และ Pleisiomonas shigelloides

ผลบวกเชอเจรญ (ขน) ผลลบเชอไมเจรญ (ใส)


Sodium chloride 0% 3% 6% 8%

1. Vibrio cholerae + + +/- -

2. Vibrio parahaemolyticus - + + +

STUART’S TRANSPORT MEDIA

Stuart’s transport medium เปน transport medium ส�าหรบเกบสงสงตรวจผปวยทมแบคทเรย ยสต หรอรา

ในอาหารนใช glycerol phosphate เพอชวยรกษาสภาพของสงสงตรวจรวมทงสภาพของ pH methylene blue จะ

เปน redox indicator และ sodium thioglycollate จะชวยใหพวก anaerobic bacteria สามารถอยได ถานทเตมท�า

หนาทเปน detoxifying agent อาหารนใชสะดวกโดย sterile swab จะถกดงออกมาใช โดยปราศจากการปนเปอนท

ปลาย เปนวธทปลอดภยในการเกบสงสงตรวจรวมทงการรกษาตลอดจนการขนสงมายงหองปฏบตการ


1. Neisseria gonorrhoeae 8 ชม. subculture บน CA = เจรญ

2. Stretococcus group A 8 ชม. subculture บน BA = เจรญ


TRIPLE SUGAR IRON (TSI) AGAR

Triple Sugar Iron agar ประกอบดวยน�าตาลสามชนด คอ sucrose, lactose และ glucose ในสดสวน 10:10:1

ทดสอบการสราง H2S โดยม sodium thiosulfate เปนแหลงของ sulfur atoms ม ferrous sulfate และ ferric

ammonium citrate ซงท�าปฏกรยากบ H2S ใหตะกอนสด�าของ ferrous sulfide ในหลอด TSI สวนทเปน slant มภาวะ

aerobic เพราะสมผสกบoxygenในอากาศ ขณะทสวนทเปน butt มภาวะเปน anaerobe เพราะไมสมผสกบอากาศ

การสรางกาซ CO2 และ H

2 ตรวจไดจากการพบฟองอากาศในอาหาร การทดสอบใช needle ปราศจากเชอ แตะโค

โลนของเชอทอยเดยวๆหรอเชอทเลยงในอาหารเหลวแทงลงไปใหถงกนหลอดและขดทหนา slant อบเชอไว 16-18

ชม. อานผลดงน ไมมการเปลยนแปลงของอาหารเลยงเชอ (N/N) แสดงวาไมยอยสลายน�าตาลในอาหารจงไมใชเชอ

กลม Enterobacteriaceae ถาเชอยอยสลาย glucose อยางเดยว จะใหสเหลองท butt สวน slant จะเปนสแดงเนองจาก

การยอย peptones ในภาวะทมออกซเจนผลทไดเปน K/A ถาได A/A แสดงวายอยสลาย glucose และ lactose หรอ

sucrose


1. Escherichia coli = A/A, gas

2. Proteus mirabilis = K/A, H2S

3. Pseudomonas aeruginosa = K/K หรอ K/N

UREASE TEST MEDIUM

Urease test medium ใชทดสอบความสามารถของจลชพในการสรางเอนไซม urease ไป hydrolyse urea ใน

อาหารเลยงเชอได ammonia และ CO2 และรวมเปน ammonium carbonate ซงเปนดางมคา pH 8.1 ในอาหารม

phenol red เปน indicator เมอไดดางจะเกดสชมพ-สบานเยน ผลลบอาหารไมเปลยนส ตวอยางการใชปฏกรยานใน

การวนจฉยเชอ เชน

1. Genus Proteus ใหผลบวกอยางรวดเรว ยกเวน P. inconstans ใหผลลบ

2. Genus Providencia ใหผลลบหรอ variable

3. ใชแยก Actinobacillus seminis (-) จาก Actinobacillus spp. (+) อน

4. ใชแยก Bartonella felis (+) จาก Bartonella spp. (-) อน

5. ใชแยก Olligella ureolytica (+) จาก O. urethralis (-)

6. ใชแยก Weeksella zoohelcum (+) จาก W. virosa (-)

7. ใชชวยในการวนจฉย V. parahaemolyticus คอผล urease ไมแนนอนแตสวนใหญเปนบวก

Helicobacter spp., Brucella spp. ใหผล urease test บวกอยางรวดเรว เปนตน


1. Proteus mirabilis = positive (สบานเยน)

2. Escherichia coli = negative (ไมเปลยนส)

หมายเหต การท�าให urea ปราศจากเชอตองใชวธกรอง



1. Luis M. de la Maza, Marie T. Pezzlo, Janet T Shigei and Ellena M Peterson. Color Atlas of

Medical Bacteriology. Washington, D.C.:ASM Press;2004.

2. MacFaddin JE. Bio chemical Tests for Identification of Medical Bacteria 3rd ed., Philadelphia:

Lippincott Williams & Wilkins; 200.

3. Mindy J Perilla , et al. 2003. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial

Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World.

WHO.CDS/CSR/RMD/2003.6

คู่มือการปฏิบัติงานnih.dmsc.moph.go.th/data/data/61/lo_manual.pdfปฏิบัติการ...

Documents