alanin glycin - uni-regensburg.de · mechanismus der fmoc-abspaltung. o 2 c o n h h h c c o chr oh...
TRANSCRIPT
-
PeptidePeptide
Alanin Glycin
Peptidbindung
(Adapted from the handouts of Prof. AG Beck-Sickinger, Leipzig)
-
Peptidbindung
NHH
H O
Bindungslänge in Å
C=O C-N
Kristallverband
Gasphase
1,241
1,219
1,318
1,352
-
Dieder Winkel Φ und Ψ
-
H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH
-
H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH
H-Ala-Leu-Gly-Lys(Ac)-His-OH
Acetyl, CH3CO-
Acetylierung der Lys-Seitenkette
+
-
H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH
Ac-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH
Acetyl,CH3CO-
Acetylierung von N-Terminus
-
H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-OH
H-Ala-Leu-Gly-Lys-His-NH2
CONH2Säureamid
-
Verzweigte Peptide
O
S
-
Cyclopeptide und verzweigte Peptide
-
H-Ala-Lys(tert.butyl-oxy-carbonyl)-Asp(tert.butyl)-Tyr(tert.butyl)-Leu-OH
-
N
H
CC
R5
H
HO
O_
N
H
R4
CC
H
NC
R3
CN
H
R2
CC
H
NC
R1
COO_
H
H
H
H
O
O
O
H
C-Terminus
N-Terminus
Peptidbindung
α-Aminosäure Peptid
Kondensation zurKettenverlängerung
Schema der Peptidsynthese
H
+
H
+
-
N
H
CC
R2
H
HO
OH N
H
R1
CC
HO
H OH
N
H
CC
R2
H
HO
O_
N
H
R1
CC
HO
H O
H
+
Aktivierung
N
H
CC
R2
HO
N
H
R1
CC
HO
OHN
H
CC
R2
H
HO
N
H
R1
CC
HO
Aktivierungund Schutzgruppen
N
H
CC
R2
H
HO
N
H
R1
CC
HO
OH
_
H
+
-
Peptidsynthese
Chemische AktivierungChemische Aktivierung Enzymatische AktivierungEnzymatische Aktivierung
(keine Schutzgruppen)(Schutzgruppen)
-
H3
H3
H3
C
C
C
O C
OOH2 C
O
H
C
Nα -Schutzgruppen
Fmoc Bocbasenlabil
säurelabil
-
COOH-Schutzgruppen
Ester
Methyl-Estertert. Butyl-EsterBenzyl-EsterAllyl-Ester
alkalischsauerhydrogenolytischPd(0)
-
NH2
NH2
H COOHNH2
CH2
SH
H COOH NH2
CH2
OH
H COOH
COOHH
COOH
NH2NH2
CONH2
H COOH
Trifunktionelle Aminosäuren
LysCys
Tyr
GlnGlu
-
Seitenketten-Schutzgruppen in der Fmoc-Strategie (säurelabil, basenstabil)
R = Peptid
H3
H3
C
3HC
C O
SOR 2
C RH3
H3
H3
C
C
C
RH3
H3
C
H3C
C
O C
O
R
tert. butyloxycarbonylBoc
Lys, Orn, Trp
tert. butyltBu
Tyr, Thr, SerGlu, Asp
tritylTrt
His, Cys, Asn, Gln
pentamethylchromansulfonylPmc
Arg
ohne Schutzgruppe: Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val
3HC
3HC
-
O2 C
O
N
H
H
H
C C
O
OHCH
Fmoc-Ala-OH
Aktivierung, Kupplung
O2
C
O
N
H
H
H
C C
O
CHR
N
H
H C
O
OCH2 CH2
CH3
H-Gly-Bzl
C
O
OCH2 CH2N
H
Fmoc-Ala-Gly-Bzl
-
Reagenzien zur Aktivierung
+
BF4_
NN
N
O
CH3
CH3
H3C
CH3
C
N
N NN
N
OH
DIC TBTU HOBt
-
R CO
OH
+
+
+
+ C
N
N
R C
O
O CN
N
H
NN
N
OH
_
1-Hydroxybenzotriazol
R C
O
NH R`R
O
C O NN
NH2N R`
NN
N
OH
NH C NH
O
DIC O-Acylisoharnstoff
Aktivester
Mechanismus der Aktivierung
Peptidbindung
-
C
N
N
CH3
H3C
H3C
CH3
N
P
N
N
H3C CH3CH3
CH3CH3H3C
N
P N
N
C
N
N
CH3
H3C
H3C
CH3
N
N
N
X
OR
BF4
PF6
HBTU (X=CH)HATU (X=N)
PF6
PyBOP (X=CH)
PF6
BOP (X=CH)
TBTU (X=CH)
mit R =
Uronium-Aktivierungsreagenzien
-
O2 C
O
N
H
H
H
C C
O
OHCH
Fmoc-Ala-OH
Aktivierung, Kupplung
O2
C
O
N
H
H
H
C C
O
CHR
N
H
H C
O
OCH2 CH2
CH3
H-Gly-Bzl
C
O
OCH2 CH2N
H
Fmoc-Ala-Gly-Bzl
-
COOH-Schutzgruppen
Ester
Methyl-Estertert. Butyl-EsterBenzyl-EsterAllyl-Ester
Merrifield (Nobelpreis 1978): Polymer
1963: Festphasenpeptidsynthese
-
(OCH
H2C
CH2CH2)nO CH2 CH2 X
Poly(ethylen-glykol)-Spacer
Polystyrol-Matrix
FunktionelleGruppe
-
Festphasensynthese vonPeptide, Proteine und Peptidmimetika
Polymerträger
Peptidketten gebunden amPolymerträger
Synthese
Linker
LinkerLinker
Kupplungs-reagenzien
H
G
PD
E
L
Linker
LinkerLinker
-
FestphasensyntheseAnkergruppe: Chlorid, Alkohol
Linker
LinkerLinker
Linker
LinkerLinker
Cl
Cl NH(Pg)CH(R)COOH
BaseCl
Cl
OC(O)CH(R)NH(Pg) H[NHCH(R)CO]nOH• Synthese
2. Abspaltung mit1 % TFA
OH
O NH(Pg)CH(R)COOH
Aktivierungsreagens, BaseH[NHCH(R)CO]nOH
• Synthese
2. Abspaltung mit> 80 % TFA
OH
O
4-BenzyloxybenzylAlkohol
2-ChlortritylChlorid
NH
O
O
OMeOH
NH(Pg)CH(R)COOH
Aktivierungsreagens, BaseH[NHCH(R)CO]nOH
• Synthese
2. Abspaltung mit1-5 % TFA
NH
O
O
OMeOH
4-Hydroxymethyl-3-Methoxyphenoxybutter-säure Benzhydrylamin
OC(O)CH(R)NH(Pg)
OC(O)CH(R)NH(Pg)
-
FestphasensyntheseAnkergruppe: Amin
Linker
LinkerLinker
Linker
LinkerLinker
H[NHCH(R)CO]nNH2
• Synthese
2. Abspaltung mit1 % TFA
Amino-xanthen-3-yloxy
NH(Pg)CH(R)COOH
Aktivierungsreagens, Base
• Synthese
2. Abspaltung mit> 5 % TFA
4-(2´,4´-Dimethoxyphenyl-aminomethyl-phenoxy
NH2
OO
NH(Pg)CH(R)COOH
Aktivierungsreagens, Base
NH2
OO
COCH(R)NH(Pg)
H[NHCH(R)CO]nNH2
NH2
O
OMe
OMe
NH
O
OMe
OMe
COCH(R)NH(Pg)
-
FestphasensyntheseAnkergruppe: Aldehyd
Linker
LinkerLinker
Linker
LinkerLinker
4-Formyl-3-methoxyphenoxy
O
OMe
H
O
O
OMe
HN
R
RNH2/TMOF
DCM/NaBH(OAc)3
O
OMe
RN
R´
O
O
OMe
RN
S
O O
R´
R´COO
H/HOA
t/DIC
R´SO2Cl/TEA
25 % TFA 5 % TFA
R´ NHR
O
S
O O
R´ NHR
-
FestphasensyntheseAnkergruppe: Sulfamyl
Linker
LinkerLinker
Linker
LinkerLinker
4-Sulfamyl-butyryl
HN RCOOH/DIC/MeIm
ICH2CN/DIPEA
R´NH2
R NHR´
O
O
(CH2)3
S
O O
NH2HN
O
(CH2)3
S
O O
HN
O
R
HN
O
(CH2)3
S
O O
N
O
R
CN
R OR´
O
R OH
O R SR´
OR´OHOH -
R´SH
-
O2 C
O
N
H
H
H
C C
O
OH ACHR HO-
Fmoc-AminosäurePolymer mit Anker
Aktivierung, Beladung des Polymers
Polymer
O2 C
O
N
H
H
H
C C
O
OCHR A Polymer
-
PiperidinAbspaltung der Nα -Schutzgruppe
O2
C
O
N
H
H
H
C C
O
OCHR A Polymer
H N
H
C
O
OCHR A Polymer
-
CH2 + CO
ONHR
_
_
+
+H2N
HN
H2N++
H
C NH2
CO2
+
Dibenzofulven Carbaminsäure- Anion
Carbanion
_
OH2 C
O
NHR
H
C_
OH2 C
O
NHRC
NH2R
R = Peptid
Mechanismus der Fmoc-Abspaltung
-
O2
C
O
N
H
H
H
C C
O
OHCHR
Fmoc-Aminosäure
H N
H
C
O
OCHR A Polymer
Aktivierung, Kupplung
O2 C
O
N
H
H
H
C C
O
CHR N
H
C
O
OCHR A Polymer
Fmoc-geschütztes, Dipeptid am Polymer
-
Synthese Cyclus
Peptid
AbspaltungKupplung
Deblockieren
Aktivierung
Aminosäure
Polymer
-
BocBut-
Trifluoressigsäure
Trifluoressigsäure
Schema der Fmoc-Strategie
C
O
O
Piperidin
O2 C
O
N
H
H
H
C A PolymerPeptid
-
Trifluoressigsäure
Schema der Boc-Strategie
C
O
OO C
O
N
H
A PolymerPeptid
HF, TFMSA
HF
ZCH3
CH3
H3C
Ada
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Automatisierung der SPPS (Festphasen-Peptidsynthese)
polymerer Träger: - filtrieren, statt kristallisieren- auswaschen der Reagenzien- hoher Ueberschuss an Reagenzien
Probleme: Fehlsequenzen, ähnliche Peptide gute Analytik nötig (HPLC)
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Syntheseprotokoll
1. Quellen den Harzes:2. Waschen mit DMF:3. Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe: 30 % Piperidin in DMF 4. Waschen mit DMF5. Kupplung der Aminosäure 10-facher Ueberschuss Aminosäure TBTU/HOBt/Diisopropylethylamin6. Waschen mit DMF7. Waschen mit Ether8. Trocknen mit Stickstoff
10 min2 x 5 min
2 x 10 min
8 x 5 min2 x 30 min
6 x 5 min2 x 5 min
20 min
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Multiple Peptidsynthese gleichzeitige, parallele Synthese von vielen Peptiden
Bedingung: Festphasensynthese
Vorteile: rasch viele, unterschiedliche Peptide kleiner Ansatz, günstig
Fmoc-Abspaltung, Waschschritte gemeinsam, Kupplung selektiv
Nachteile: keine Synthesekontrolle möglich Aufarbeitung und Analytik aufwendig
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Synthesizer für Parallel-Peptidsynthese