amp-activatedkinase protein-mtor신호전달과정이b형...
TRANSCRIPT
이학 석사학 논문
AMP-activatedkinase
protein-mTOR신호 달 과정이 B형
간염 증식에 미치는 향
아 주 학 교 학 원
의생명과학과/분자의학 공
김 주 미
AMP-activatedkinase
protein-mTOR신호 달 과정이 B형
간염 증식에 미치는 향
지도교수 김 경 민
이 논문을 이학 석사학 논문으로 제출함.
2015년 2월
아 주 학 교 학 원
의생명과학과/분자의학 공
김 주 미
김주미의 이학 석사학 논문을 인 함.
심사 원장 김 경 민 인
심사 원 박 선 인
심사 원 신 호 인
아 주 학 교 학 원
2014년 12월 19일
i
- 국 요약 -
AMP-activated protein kinase-mTOR 신 달 과 이 B 간염
이러스 증식에 미 는 향
`
B 간염 이러스(hepatitis B virus, HBV)는 Hepadnaviridae family 에 속하며,
genome 크 가 약 3.2kb 작 DNA 이러스이다. 계 약 3 억
5 천만 명 이상이 만 HBV 에 감염 어 있다. HBV 는 과 만 B
간염 일 키며 만 B 간염 자는 간경변이나 간암 할 가능 이
높다. AMP-activated protein kinase(AMPK)는 ATP 소 생 균 해
필요한 에 지 단 질이다. Hepatitis C virus(HCV) 증식 해 는
AMPK 억 mammalian target of rapamycin(mTOR) 이 필요하며 이를
통해 이러스 복 에 필요한 지질 합 한다. HBV X 단 질(HBx) mTOR
증가시 hepatocellular carcinoma(HCC) 포 증식 도한다. 본
연구에 는 HBV 가 증식할 AMPK mTOR 에 변 가 있는지
알아보았고, AMPK-mTOR 신 달 과 변 가 HBV 증식에 향 미 는지
알아보고자 하 다. HCC 포인 HepG2 포에 래한 HBV 가 증식하는
HepG2.2.15 포, PEB 포 Huh7 포에 래한 HBV 가 증식하는 Huh7 HBV
WT stable 포에 AMPK 과 인산 를 조사한 결과 가지 포에
AMPK 인산 가 감소한 것 냈다. HepG2.2.15 포, PEB 포 Huh7
HBV WT stable 포에 mTOR 과 인산 가 증가하 다. HepG2.2.15
ii
포에 AMPK 인산 가 감소하 에도 불구하고 regulatory-associated protein
of mTOR(Raptor) tuberous sclerosis 2(TSC2) 인산 는 증가하 다.
HepG2.2.15 포에 Akt 과 인산 가 증가하 다. Protein phosphatase
2A(PP2A), S6 kinase 1(S6K1) eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein
1(4E-BP1) 과 인산 는 HepG2.2.15 포에 증가하 다. Huh7 HBV WT
stable 포에 는 S6K1 인산 , PP2A 과 인산 가 증가하 다. AMPK
alpha 2 가 과 HBV core particle 과 그 속 핵산, HBV DNA 가
감소하 다. HepG2.2.15 포에 metformin 처리하 AMPK 인산 는
증가하 고 이에 라 Akt, mTOR, PP2A, S6K1 4E-BP1 인산 도 어들었다.
그 에 mTOR, Akt, PP2A, S6K1 과 4E-BP1 는 AMPK downstream
추 었다. Rapamycin 에 해 HepG2.2.15 포에 mTOR 인산 가
억 었고 S6K1 인산 한 감소 었다. 그리고 Akt 인산 는
감소하 고 AMPK 인산 는 증가하 다. 앞 Akt, mTOR, S6K1 과 PP2A
억 를 처리함 써 AMPK upstream 과 mTOR downstream 낼
것이다.
핵심어: B 간염 이러스, AMPK-mTOR 신 달과 , Akt, PP2A, S6K1, 4E-BP1
iii
차
국 요약 ················································································································ ⅰ
차 ························································································································ ⅲ
그림차 ················································································································ ⅴ
Ⅰ. ···················································································································· 1
A. B 간염 이러스 ························································································ 1
B. B 간염 이러스 증식 ·············································································· 2
C. AMPK 신 달 과 ·················································································· 3
D. 연구목 ········································································································ 5
Ⅱ. 재료 법 ···································································································· 7
A. 포 양········································································································ 7
B. HBV 가 증식하는 stable 포 구축 ···························································· 7
C. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE) electrophoresis ········ 8
D. Western blotting ······························································································ 9
E. Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) ····························· 10
F. HBV core particle 분 ················································································· 12
G. HBV DNA 인 한 Southern blotting ················································· 13
H. 억 처리에 한 HBV 증식 변 ······························ 14
I. AMPK 과 벡 작 ············································································ 14
iv
Ⅲ. 결과 ················································································································· 16
A. HBV 증식 포에 AMPK mTOR 인산 변 ··········· 16
B. HBV 증식 포에 Raptor TSC2 인산 변 ············· 18
C. HBV 증식 포에 Akt 인산 변 ································· 20
D. HBV 증식 포에 PP2A, S6K1 과 4E-BP1 인산 변 ····· 22
E. AMPK 과 에 한 AMPK 변 가 HBV 증식에 미 는 향 ··· 24
F. Metformin 에 한 AMPK-mTOR 신 달 과 변 ······················· 26
G. Rapamycin 에 한 AMPK-mTOR 신 달 과 변 ····················· 28
Ⅳ. 고찰 ················································································································· 30
Ⅴ. 결 ················································································································· 32
참고 헌 ················································································································ 34
ABSTRACT ··········································································································· 44
v
그림 차
Fig. 1. Phosphorylation of AMPK was down-regulated and phosphorylation and
expression of mTOR were up-regulated in HBV replicating stable cells
·················································································································· 17
Fig. 2. Phosphorylations of Raptor and TSC2 were up-regulated in HBV replicating
stable cells ···································································································· 19
Fig. 3. Akt activation was up-regulated in HepG2-derived in HBV replicating
stable cells ···································································································· 21
Fig. 4. Phosphorylations and expressions of PP2A, S6K1 and 4E-BP1 were up-regulated
in HBV replicating stable cells ······································································ 23
Fig. 5. Effects of AMPK overexpression on AMPK-mTOR signaling and HBV replication.
ㄴㄴ s ····················································································································· 25
Fig. 6. Effect of metformin, an AMPK activator, on AMPK-mTOR signaling pathway
ㅇㅇㅇ ····················································································································· 27
Fig. 7. Effect of rapamycin, a mTOR inhibitor, on AMPK-mTOR signaling pathway
ㅊㅊ ······················································································································· 29
- 1 -
I.
A. B 간염 이러스
B 간염 이러스(hepatitis B virus, HBV)는 Hepadnaviridae family prototype
이러스이며, genome 크 가 약 3.2kb 작 DNA 이러스이다(Liang, 2009;
Cougot 등 2012). 계 20 억 명이 HBV 에 감염 어 있 며, 이 약
3 억 5 천만 명 이상이 만 HBV 감염자이다(Lee, 1997; Cougot, Allemand 등, 2012).
HBV 는 과 만 B 간염 일 키는데, HBV 감염 자 에 2/3 는
증상이 가볍거나 거 없다. 그리고 나 지 1/3 피 , 스꺼움, 황달 증상과
드 게는 간 손상이 일어난다(Liang, 2009; McMahon 등 1985). 그러나 만
B 간염 자는 간경변이나 간암 할 가능 이 높다(Guo 등 2007).
동남아시아, 국, 그리고 아프리카 같 나라에 는 도 인구가
HBV 에 감염 어있고 약 8%는 만 B 간염 자이다. 이러한 나라에 는
모체 부 신생아에게 달 는 직 감염과 다른 사람 부 달 는 평
감염에 해 HBV 에 감염 다. 북아 리카, 동 럽, 그리고 주에 도 소
사람들이 감염 어 있다. 이러한 국가에 는 , 염 주사 사용,
직업 인 노출, 이나 액 에 해 HBV 에 감염 다(Lee, 1997; Kane,
1995).
- 2 -
B. B 간염 이러스 증식
3.2kb HBV genome 에는 4 개 open reading frame(ORF)이 겹쳐 있 며,
HBV 는 각각 ORF 에 해 암 4 개 단 질인 polymerase, core,
surface(S, HBs) X(HBx)가 있다. Surface ORF 는 pre-S1, pre-S2, S 부 가 있 며 이
가지 부 가 번역 면 large surface(LHBs)가, pre-S2 S 부 가 번역 면 middle
surface(MHBs)가, S 부 만 번역 면 small surface(SHBs)가 합 다.
Precore/Core(PreC/C) ORF 는 precore core 단 질 암 하고 있다.
Polymerase(P, pol) ORF 는 polymerase 단 질 암 하고 있 며, 가지
도 인(terminal 단 질, spacer, 역 사효소[reverse transcriptase] ribonuclease
H) 구 어 있다(Liang, 2009). 감염 있는 HBV virion 인 Dane particle
과 만 B 자 액 속에 견 는데(Summers 등, 1975), Dane
particle LHBs pre-S1 부 가 간 포 multiple transmembrane transporter 인
sodium taurocholate cotransporting polypeptide(NTCP) 붙어 간 포에
감염 다(Yan 등, 2012). 감염 후에 relaxed circular DNA(rcDNA)가 핵 안
들어가 episomal covalently closed circular DNA(cccDNA) repair 다. 이
cccDNA 는 이러스 RNA 사를 한 template 사용 어 pregenomic
RNA(pgRNA) subgenomic RNA 들 사한다. pgRNA 는 core 단 질과
polymerase 를 합 하 한 mRNA 역할 한다. Core 단 질 core particle
하여 pgRNA polymerase 를 같이 packaging 한다. 이러한 과
encapsidation 이라 부른다. Polymerase 역 사효소 에 해 pgRNA 부 (-
- 3 -
) strand DNA 가 합 고 HBV polymerase RNase H 에 해 새
합 (-) strand DNA 결합 RNA 를 분해한다. (-) strand DNA 를 template
하여 (+) strand DNA 가 합 어 결 한 태 rcDNA 가 합 다.
rcDNA 가 있는 한 core particle cccDNA 를 증폭하 해 다시 핵 속
들어가거나 소포체 골지체를 통해 외피를 획득하여 포
출 다(Cougot 등, 2012; Beck 과 Nassal, 2007; Seeger Mason, 2000).
C. AMPK 신 달 과
AMP-activated protein kinase(AMPK)는 ATP 소 ·생 균 해 필요한
에 지 단 질이다. 이 AMPK 는 catalytic α subunit, regulatory β, subunit 이
heterotrimer 를 이루고 있다. AMPK 는 산소증, 양분 결핍과 같 사
생 학 스트 스를 아 AMP ADP 양이 ATP 보다 높아
다(Lee, Wong 등, 2012). 이 AMP ADP 는 AMPK regulatory
subunit 과 붙어 AMPK 구조 인 변 를 도하여 인산 를 진시키며
인산 AMPK 를 phosphatase 부 보 하여 지하도
한다(Mihaylova Shaw, 2011). 그리고 포 에 는 catalytic α subunit
암 하는 α1, α2 자, regulatory β subunit 암 하는 β1, β2 자,
그리고 subunit 암 하는 1, 2, 3 자가 존재한다(Hardie, 2007). AMPK
α1 subunit 포질에 많이 존재하고 AMPK α2 는 핵과 포질에 존재하는데
핵에 주 존재한다(Ju 등, 2011). AMPK upstream 에는 여러 가지 단 질이
- 4 -
있다. 그 에 하나인 liver kinase B1(LKB1) 근에 암 억 단 질 다.
LKB1 AMPK 를 인산 시 시킨다(Hawley, Boudeau 등, 2003; Shaw,
Kosmatka 등, 2004). 암 억 단 질인 LKB1 이 AMPK 를 시키 에
근 AMPK 가 암 생과 연 어 연구 고 있다(Shackelford Shaw, 2009).
그리고 다른 단 질인 calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase
2(CAMKK2)도 AMPK 를 인산 시킬 있다(Hawley 등, 2005; Hurley 등, 2005;
Woods 등, 2005; Fogarty 등, 2010). Transforming growth factor beta-activated kinase 1
(TAK1)에 해 도 AMPK 가 인산 있다. 하지만 AMPK 를 인산 시키는
자 한 작용 아직 지 지지 않았다. 그리고 palmitate 에 해
protein phosphatase 2A(PP2A)는 AMPK 를 억 한다(Wu 등, 2007).
인 AMPK downstream mTOR 이다. AMPK 가 tuberous sclerosis
2(TSC2) Ser1387 부 를 인산 시 mTORC1 억 한다. 한 인산
AMPK 는 mTORC1 regulatory subunit 인 regulatory-associated protein of
mTOR(Raptor)를 인산 시 mTORC1 인산 를 막아 mTORC1
억 한다(Mihaylova Shaw, 2011). mTOR 는 포 장에 여하는 eukaryotic
translation initiation factor 4E-binding protein 1(4E-BP1)과 p70-S6 kinase 1(S6K1)
조 한다. mTORC1 이 인산 어 면 4E-BP1 S6K1 인산 시키며
인산 4EB-P1 번역 개시 인자인 eukaryotic translation initiation factor 4E(eIF-
4E)를 붙잡지 못해 eIF-4E 는 다른 개시 인자 결합하여 번역 진행한다.
인산 S6K1 포 장과 자가 소 작용에 여한다. 그리고 AMPK 는
UNC-51-like kinase(ULK1) 직 인산 시키거나(Egan 등, 2011; Kim 등,
2011), mTOR 를 억 함 ULK1 시 자가 소 작용 도한다.
- 5 -
AMPK 는 acetyl-CoA carboxylase(ACC1, ACC2) HMG-CoA reductase(3-hydroxy-3-
methyl-glutaryl-CoA reductase)를 억 하여 지 산과 스 합
조 한다(Carling 등, 1987; Sato 등, 1993). 그리고 지 에 AMPK 는 지 분해
효소인 hormone-sensitive lipase(HSL) 76 과 adipocyte-triglyceride lipase(ATGL) 77
인산 시킨다(Watt 등, 2006). AMPK 는 아 틸 달 효소인 p300, 히스톤
아 틸라아 , 그리고 히스톤 인산 시 사를 조 한다(Mihaylova Shaw,
2011). AMPK 는 지질 합 에 여하는 사 인자인 sterol regulatory element-binding
transcription factor 1(SREBP1) 인산 시킴 써 SREBP1 이 downstream 인
ACC1 과 fatty acid synthase(FASN) 자극하여 지 산 합 진한다(Li 등,
2011). 즉, AMPK 는 포 장과 자가 소 작용 조 하며, 질 사에
여하는 효소 사 인자를 통해 질 사를 조 한다. AMPK 는 번역 개시에
필요한 eIF-4F 복합체 에 요한 단 질인 mTOR 억 함 써
단 질 합 억 한다. 게다가 mTOR AMPK 다른 조 식 포
내 질 사, 자가 소 작용 조 한다. AMPK 가 면 포 고분자
복합체 자가 소 작용 진하여 에 지 양 생 하고,
mTOR 가 면 autophagy 를 억 하여 포 장과 증식 진시킨다.
D. 연구목
지속 인 HBV 감염 만 B 간염과 간암이 있다.
간암 포는 AMPK 이 억 어 간암 포 증식과 장 진한다(Yang 등,
- 6 -
2014; Cheng 등 2014). HBV 처럼 만 간염 간암 하는 hepatitis C
virus(HCV)에 감염 면 AMPK 이 감소 써 지 축 도하여
HCV 증식이 진 다(Mankouri 등, 2010). 그리고 protein kinase B(Akt)
신 달 과 시키고 TSC1/2 억 하여 mTOR
증가시킨다. HCV 는 AMPK mTOR 신 달 과 통해 이러스 복 를
해 필 인 지질 합 한다. 한편, human cytomegalovirus(HCMV), simian virus
40(SV40)에 감염 면 AMPK mTOR 이 증가한다. Arboviruses 인 Rift
Valley fever virus(RVFV)에 감염 면 AMPK 이 억 다(Brunton 등, 2013).
그리고 근에 HBV X 단 질이 mTOR 신 달 과 증가시
간암 포 증식 증가시킨다고 다(Yen 등, 2012). 간암 포 HCV 가
증식하는 포에 AMPK 인산 가 감소하 에 HBV 가 증식할
AMPK mTOR 에 변 가 있는지 분 하 고, AMPK-mTOR
신 달 과 변 가 HBV 증식에 변 를 주는지도 알아보았다.
- 7 -
II. 재료 법
A. 포 양
HepG2 포에 래한 HepG2.2.15 포는 HBV genome 이 안
복 다. HepG2.2.15 포는 10% (v/v) fetal bovine serum(FBS, Gibco, Invitrogen), 100
units/ml penicillin 과 100 μg/ml streptomycin(Gibco, Invitrogen), 1 mg/ml G418(Duchefa
biochemie)이 들어간 DMEM 지를 사용하여 양하 다. HepG2 포는
앞 HepG2.2.15 포 양 지에 1 mg/ml G418 이 없는 동일한 지에
양하 다. 그리고 포들 5% CO₂ 37°C 인큐베이 에 키웠다. 실험할
HepG2 포, HepG2.2.15 포 PEB8 포를 2 × 10⁶ cell / 6 cm dish 양한
48 시간 뒤에 하 다. Huh7 포 Huh7 HBV WT stable 포는 1 × 10⁶ cell /
6 cm dish 양한 48 시간 후에 하 다.
B. HBV 가 증식하는 stable 포 구축
HBV adw R9 1.1 length 를 가지고 있어 증식이 가능한 HBV genome
진핵 포 벡 인 pcDNA3 에 어 CMV 프 모 하에 HBV 가 할
있도 작한 HBV WT #12 플라스미드 DNA 를 Huh7 포에 감염시킨다.
감염시킨 1 일 후에 새 지 꾸고, 지를 꾼 2 일 후에 HBV WT #12
플라스미드 DNA 를 가지고 있는 포만 자라도 , 앞에 1 mg/ml G418 이
- 8 -
포함 지에 양하 다. 그 뒤 2 일에 한 번씩 1 mg/ml G418 이 포함 새
지 갈아주었다. 이런 법 통해 HBV 를 안 하는 포를
구축하 다. 한 HBV WT #12 DNA 부 작한 돌연변이인 TP Y65F, X-
deficient-3 변이주 한 같 법 실험 진행하 다. 그리고 X 단 질
자를 진핵 포 벡 인 p3×Flag-CMV-10(Sigma-Aldrich)에 클 닝하여
CMV 프 모 하에 X 단 질만 할 있도 작하여 실험
진행하 다. 마찬가지 HepG2 포에 도 Huh7 포에 동일한 법
HBV 가 안 는 stable 포를 구축하 다.
C. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE)
electrophoresis
HepG2 포 HepG2.2.15 포를 2 × 10⁶ cell / 6 cm dish 양한 48 시간
후에 4 ml phosphate buffered saline(PBS) 1 회 씻어낸 후 1 ml PBS 를 고
스크래퍼를 이용하여 하 다. 그리고 원심 분리하여 PBS 를 거한 후
protease inhibitor cocktail(calbiochem, USA)이 들어간 lysis 용액(50 mM Tris-Cl pH 8.5,
2 mM EDTA, 0.5% Noniodet P-40, 50 mM NaF, 25 mM glycerol phosphate, 2 mM sodium
orthovanadate) 200 μl 어 만든 탁액 얼 에 10 분간 었다. 그
후 4°C 에 13,000 rpm 2 분간 원심 분리하여 핵과 포 소 거하여
lysate 를 얻었다. 각각 lysate 에 sample 충용액(250 mM Tris-Cl pH 6.8, 8% SDS,
0.1% bromophenol blue, 40% glycerol, 100 mM dithiothreitol) 고 100°C 에 5
분간 다. 8%, 10%, 는 12% polyacrylamide gel sodium dodecyl
- 9 -
sulfate(SDS)-PAGE 를 행하 다. 그 후에 동 단 질 2 시간 동안 250
mA 처리하여 PVDF membrane 에 이동시 다.
D. Western blotting
C 에 얻 membrane bovine serum albumin(BSA)를 Tris buffered saline–
0.1% tween-20(0.1% TBS-T, pH 7.4)에 4% 녹인 용액에 고 1 시간 동안
상 에 킹하 다. 일차 항체(polyclonal rabbit anti p-AMPK antibody[cell
signaling], monoclonal rabbit anti p-Akt antibody[cell signaling], polyclonal rabbit anti p-
mTOR antibody[cell signaling], monoclonal rabbit anti p-PP2A antibody[cell signaling],
polyclonal rabbit anti p-S6K1 antibody[cell signaling] polyclonal rabbit anti p-4E-BP1
antibody[cell signaling])를 0.1% TBS-T 에 1:1,000 희 하여 4°C 에 새
시 고, membrane 0.1% TBS-T 10 분씩 3 회 씻어주었다. 그리고 horse
radish peroxidase(HRP)가 결합 이차 항체(HRP-polyclonal rabbit anti
immunoglobulins, DAKO)를 0.1% TBS-T 에 1:2,000 희 하여 상 에 1 시간
동안 시킨 후 membrane 0.1% TBS-T 10 분씩 3 회 씻어주었다.
Membrane 에 enhanced chemical luminescence(ECL, GE healthcare, Amersham™)
사용하여 X-ray film 에 감 하 다. Phospho-protein 본 membrane stripping
용액(100 mM β-mercaptoethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.8)에 고 68℃에
30 분 처리하여 붙어있 항체를 거하 다. 4% BSA-0.1% TBS-T 상 에 1
시간 동안 킹하 다. 일차 항체(polyclonal rabbit anti AMPK antibody [cell
signaling], polyclonal rabbit anti Akt antibody [cell signaling], polyclonal rabbit anti mTOR
- 10 -
antibody [cell signaling], monoclonal rabbit anti PP2A antibody [abcam], polyclonal rabbit
anti S6K1 antibody [cell signaling] polyclonal rabbit anti 4E-BP1 antibody [cell
signaling])를 0.1% TBS-T 에 1:1,000 희 하여 4°C 에 새 시
식과 동일하게 실험 행하 다.
E. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
HepG2 포 HepG2.2.15 포를 2 × 10⁶ cell / 6 cm dish 양한 48 시간
후에 포 체 RNA 를 얻었다. 즉, 포 양 dish 에 1 ml Trizol(Ambion, life
technologies) 용액 고 균질 시킨 후 1.5 ml 튜 에 겼다. 그 후 200 μl
chloroform 고 뒤 얼 에 5 분간 었다. 그리고 4°C 에 13,000
rpm 15 분간 원심 분리하여 얻 상 액 1.5 ml 새 튜 에 다. 500
μl isopropanol 후 상 에 10 분간 시킨 후 4°C 에 13,000
rpm 10 분간 원심 분리하여 RNA 를 침 시킨 후 상 액 거하 다. 1
ml 70% ethanol 뒤 4°C 에 13,000 rpm 5 분간 원심 분리하여
침 시킨 RNA 를 씻어주었다. 그리고 nuclease free 증 용 하 다.
이 게 얻 RNA 는 ethidume bromide(EtBr)가 들어간 1% agarose gel 상에
리보솜 RNA 를 인한 후 spectrophotometer 포 체 RNA 농도를
인하 다. 1 μg RNA 500 ng oligo dT(17 mer, 500 μg/ml), 2.5 mM dNTP
(takara, Clontech)를 어 65°C 에 변 시킨 후 얼 에 1 분간 었다. Superscript
III reverse transcriptase(Invitrogen, Life technologies) cDNA 를 합 하 다. 합
cDNA 를 이용하여 AMPK α1 sense primer(5’-CTCTATGCTTTATTATGTGG-3’) /
- 11 -
AMPK α1 antisense primer(5’-GATCCTGGTGATTTCTGTTG-3’), AMPK α2 sense
primer(5’-TTGCAGTGGCTTATCATCTT-3’) / AMPK α2 antisense primer(5’-
TGTCATACGGTTTGCTCTGA-3’), AMPK β1 sense primer(5’-
ATGGGCAATACCAGCAGTGA-3’) / AMPK β1 antisense primer(5’-
TTGTATAACAAGGTGGTGAC-3’), AMPK β2 sense primer(5’-
CAGCCATGGGAAACACCAC-3’) / AMPK β2 antisense primer(5’-
GGTCCAGGATGGCAACAAAG-3’), AMPK 1 sense primer(5’-
GCTACAGATTGGCACCTATG-3’) / AMPK 1 antisense primer(5’-
TCAGGGCTTCTTCTCTCCAC-3’), AMPK 2 sense primer(5’-
GCCTTCTTTGCTTTGGTAGC-3’) / AMPK 2 antisense primer(5’-
GCTCATCCAGGTTCTGCTTC-3’), AMPK 3 sense primer(5’-
TGACCATCACTGACTTCATC-3’) / AMPK 3 antisense primer(5’-
CATCAAAGCGGGAATAGAGG-3’), S6K1 sense primer(5’-
TACTTCGGGTACTTGGTAA-3’) / S6K1 antisense primer(5’-
GATGAAGGGATGCTTTACT-3’) PP2A α sense primer(5’-
ATTACTTGTTTATGGGAGATTATGT-3’) / PP2A α antisense primer(5’-
AAGTGGTCACGGCTGTTGATG-3’)를 사용하여 원하는 자 DNA 를
증폭시킨 다 EtBr 이 포함 1% agarose gel 에 증폭 DNA 드를
인하 다.
- 12 -
F. HBV core particle 분
HepG2 포 HepG2.2.15 포를 2 × 10⁶ cell / 6 cm dish 양한 48 시간
후에 4 ml phosphate buffered saline(PBS) 1 회 씻어 후 1ml PBS 를 고
스크래퍼 하 다. 그리고 원심 분리하여 얻 침 포에 protease
inhibitor cocktail(calbiochem, USA)이 들어간 lysis 용액(50 mM Tris-Cl pH 8.5, 2 mM
EDTA, 0.5% Noniodet P-40, 50 mM NaF, 25 mM glycerol phosphate, 2 mM sodium
orthovanadate) 200 μl 를 고 탁액 만들어 얼 에 10 분간 었다. 그
후 4°C 에 13,000 rpm 2 분간 원심 분리하여 핵과 포 소 거하여
lysate 를 얻었다. Tris-acetate EDTA(TAE) 충액 1% native agarose gel 에 lysate 를
동 하 다. PDVF membrane methanol 에 를 거한 후
증 씻 후 10 × SSC buffer 에 담가 었다. Up-stream 식 이용하여
gel 에 membrane 단 질 이동시 다. 상 4% Skim milk-0.1% TBS-
T 용액에 1 시간 동안 membrane 처리하여 킹하 다. 일차 항체(anti
hepatitis B virus core antibody from rabbit serum)를 4% skim milk-0.1% TBS-T 에
1:1,000 희 하여 상 에 2 시간 시 고, 0.1% TBS-T 10 분씩 3 회
씻어주었다. 그리고 HRP 가 결합 이차 항체(HRP-polyclonal rabbit anti
immunoglobulins, DAKO)를 0.1% TBS-T 에 1:2,000 희 하여 상 에 1 시간
동안 시킨 후 membrane 0.1% TBS-T 10 분씩 3 회 씻어주었다.
Membrane 에 ECL 뿌린 후 X-ray film 에 감 하 다.
- 13 -
G. HBV DNA 인 한 Southern blotting
F 에 분리한 core particle lysate 를 10 mM MgCl2 8 mM CaCl2 충액에
micrococcal nuclease(45 U/ml; Worthington)를 처리하여 37°C 에 1 시간 시
포 내에 있는 플라스미드 DNA RNA 를 거하 다. Core particle lysate 에 core
particle 등 침 시키 한 polyethleneglycol(PEG) 용액(26% PEG, 1.4 M NaCl, 40
mM EDTA) 어 얼 에 1 시간 동안 시킨 후, 4°C 에 15 분
동안 13,000 rpm 원심 분리하여 pellet 얻었다. 얻 pellet 200 μl
DNase I 충액(10 mM Tris-Cl pH 8.5, 6 mM MgCl2)에 재 부 하고, 200
μl proteinase K 충액(20 mM Tris-Cl pH 8.5, 10mM EDTA, 1% SDS)
뒤 proteinase K(10 μg/ml)를 어 37°C 에 2 시간 이상 시 다. 그 후 400
μl phenol / chloroform / isoamylalcohol(25:24:1) 고 5 분 동안 13,000 rpm
원심 분리하 다. 상 액 새 운 1.5 ml 튜 에 후 ethanol DNA 를
침 시킨다. 침 DNA 를 nuclease free 증 에 녹인 후 DNA 를 1% agarose gel
electrophoresis 하 다. Nylon membrane 증 에 담근 후 20 × SSC 용액에
담가놓았다. Up-stream 식 DNA 를 gel 에 nylon membrane 새
겼다. UV cross-linking 통해 DNA 가 membrane 에 잘 부착 게 한 후
hybridization 용액 어 68°C 에 킹하 다. Random primer labeling
법 작한 HBV 열에 특이 인 α-32P [dATP]-labeled probe 를 사용하여
68°C 에 새 HBV DNA 결합시 다. 다 날 2 × SSC buffer 씻어 낸 후
X-ray film 에 감 하 다.
- 14 -
H. 억 처리에 한 HBV 증식 변
HepG2 포 HepG2.2.15 포를 양한 48 시간 후에 각 포에 AMPK
인 metformin(Sigma-Aldrich) 0.01, 0.05, 0.2 2 mM 는 AMP analog 인
AICAR(Toronto Research Chemicals, TRC)를 0.1, 1, 2 5 mM 30 분 는 1 시간
처리한 뒤 하 다. 한 mTOR 억 인 rapamycin(10 ng/ml, Calbiochem,
Merck Millipore) 10 nM 24 시간 72 시간 처리한 후 하 다. 그 후
C. D. 법 SDS-PAGE 하여 Western blotting 실시하 다. Akt 억 인
Akti-1/2(5 μm, Calbiochem, Merck Millipore), PP2A 억 인 okadaic acid(2 nM,
abcam) 처리하여 AMPK-mTOR 신 달 과 를 악하는 실험도 할
이다.
I. AMPK 과 벡 작
AMPK 과 벡 는 pcDNA3 에 AMPK α2(T172) 염 열 삽입하여
작하 다. 우 AMPK α1(D159, S172), AMPK α1(D159, T174) 그리고 AMPK
α2(T172)에 한 염 열 증폭하 해 E. 에 법
통해 HepG2.2.15 포에 RNA 를 얻었다. 그 RNA cDNA 를 합 한 후 PCR
증폭하 다. 이 PCR 조건 AMPK α2(T172) sense primer(5’-
GCGAAGCTTGCCACCATGGCTGAGAAGCAGAAGCACGAC-3’) / AMPK α2(T172)
- 15 -
antisense primer(5’-GCGAATTCTCAACGGGCTAAAGTAGTAATCAGACTGGC-3’) 를
사용하여 95°C 에 30 , 55°C 에 30 , 72°C 에 2 분씩 30 cycle 돌 증폭시킨
다 EtBr 이 포함 1% agarose gel 에 증폭 DNA 를 인하 다. 그리고
Geneclean kit(MP Biomedicals)를 이용하여 DNA 를 추출하 다. 증폭 AMPK
α2(T172) 자 pcDNA3 를 HindⅢ / EcoRI 자른 후 DNA 연결 효소를
이용하여 붙 다. Ligated DNA E. coli DH5α competent 포를 질 하 다.
100 μg/ml ampicillin 이 있는 luria broth(LB) agar plate 에 colony 를 100
μg/ml ampicillin 이 있는 5 ml LB broth 에 종하여 37°C 진탕 양 에 16
시간 키웠다. 16 시간 후에 플라스미드 DNA 를 추출한 후 삽입 pcDNA3-AMPK
α2(T172)를 HindⅢ / EcoRI 자른 후 EtBr 이 포함 1% agarose gel 에
조각 DNA 드를 인하 다. 그 후 sequencing 분 통하여 pcDNA3-AMPK
α2(T172)를 인하 다. 그리고 AMPK α1(D159, S172) AMPK α1(D159, T174)에
한 AMPK 과 벡 도 같 법 실험할 것이다. 그 는 AMPK
α1(D159, S172) sense primer(5’-GGTACCATGCGCAGACTCAGTTCCTGGAGA-3’) /
AMPK α1(D159, S172) antisense primer(5’-
GGCGCTCGAGCTGTTTATTGTGCAAGAATTTTAATTAG-3’), AMPK α1(D159, T174)
sense primer(5’-GCGAATCCGCCACCATGGCGACAGCCGAGAAGCAGAAA-3’) /
AMPK α1(D159, T174) antisense primer(5’-
GGCGCTCGAGCTGTTTATTGTGCAAGAATTTTAATTAG-3’)를 사용하여 AMPK 를
증폭시키고 각각 KpnI/ XhoI 는 EcoRI/ XhoI 이용하여 진행할 것이다.
- 16 -
III. 결 과
A. HBV 증식 포에 AMPK mTOR 인산 변
여러 가지 이러스 증식 AMPK mTOR 과 연 어 있다.
HBV 처럼 만 간염 일 키는 HCV 증식 포에 AMPK 이 감소 면
mTOR 증가한다(Brunton 등, 2013). 라 HBV 가 증식하는 포에
AMPK 과 인산 를 조사하 다. 포를 양 후 24, 48 과 72 시간
나 어 실험 한 결과, 이 시간 에 AMPK mTOR 인산 도는
슷하 다. 그 에 48 시간에 결과가 가장 일 하 다. 이후에는
포 양 48 시간 후를 실험 진행하 다. AMPK 인산 가
감소 어 있는 간암 포인 HepG2 포 HepG2 포에 래한 HBV 가
증식하는 HepG2.2.15 포를 해본 결과 HepG2.2.15 포에 AMPK
인산 는 HepG2 포보다 감소한 것 냈다. 그 mTOR
과 인산 는 증가하 다. HepG2 에 래한 HBV 가 증식하는 다른
PEB8 포에 도 AMPK 인산 는 감소한 면 mTOR 과 인산 는
증가하 다. 다른 간암 포인 Huh7 포에 래한 HBV 가 증식하는 Huh7
HBV WT stable 포에 도 AMPK 인산 가 감소하 고 mTOR 과
인산 는 증가하 다.
- 17 -
Figure 1. Phosphorylation of AMPK was down-regulated and phosphorylation and
expression of mTOR were up-regulated in HBV replicating stable cells. (A) Core
particles from HepG2 cells, HepG2.2.15 cells, HepG2-derived HBV replicating stable cells,
were analyzed using anti-HBc antibody, HRP-conjugated secondary antibody, and ECL.
Nucleic acid inside of core particles and HBV DNAs were analyzed using a random-primed
32P-labeled probe specific for HBV sequences. (B, C and D) 48 h after incubations, proteins
from cell lysates were analyzed using primary antibody, HRP-conjugated secondary
antibody, and ECL. HepG2 and Huh7 cells are negative controls. HepG2.2.15 cells (B) and
PEB8 cells (C) are the HepG2-derived stable HBV replicating cells. Huh7 HBV WT cells
(D) are the Huh7-derived stable HBV replicating cells. GAPDH is a loading control.
*p<0.05 vs. control, **p<0.02 vs. control (n=3).
- 18 -
B. HBV 증식 포에 Raptor TSC2 인산 변
AMPK 가 mTOR 를 억 하는 법에는 가지가 있다. AMPK 가
면 TSC2 Ser1387 부 를 인산 시 mTORC1 억 하거나
mTORC1 regulatory subunit 인 Raptor 를 인산 시 mTORC1 인산 를
막아 억 한다(Mihaylova Shaw, 2011). HBV 가 증식하는 포에 모
AMPK 인산 는 감소하 에 HBV 가 증식할 Raptor TSC2
인산 한 감소할 것이라고 상하 다. 그러나 HepG2.2.15 포에 Raptor
TSC2 인산 가 히 증가하 다. 라 AMPK mTOR 신 달
과 에 Raptor TSC2 는 여하지 않았다.
- 19 -
Figure 2. Phosphorylations of Raptor and TSC2 were up-regulated in HBV replicating
stable cells. 48 h after incubations, Proteins were analyzed using primary antibody, HRP-
conjugated secondary antibody, and ECL. HepG2 cell is a negative control and HepG2.2.15
cell is the HepG2-derived stable HBV replicating cell. Actin is a loading control. *p<0.05 vs.
control, **p<0.02 vs. control (n=3).
- 20 -
C. HBV 증식 포에 Akt 인산 변
AMPK 이 억 었 에도 불구하고 Raptor TSC2 인산 가
증가하 에 AMPK-mTOR 신 달 과 에 다른 단 질이 여하는지
알아보았다. AMPK 가 인산 면 signaling adapter 인 insulin receptor substrate
1(IRS-1) 인산 시 protein kinase B(Akt)를 억 한다(Tzatsos Tsichlis, 2007).
AMPK 가 면 PP2A 통해 Akt 탈인산 를 도한다(Kim 등,
2009). HBV X 단 질이 IRS1 분해시킨다고 보고 었다(Kim 등, 2010). 한
Akt 는 mTOR 증가시킨다고도 알 있다(Martelli 등, 2007). 한
PP2A 는 HBV 가 증식하는 포에 AMPK 가 억 었 에 Akt 이
증가 어 mTOR 이 증가한다라는 가 인하 해 Akt 과
인산 를 인해 보았다. 상과 같이 HepG2.2.15 포에 Akt 인산 는
증가하 다.
- 21 -
Figure 3. Akt activation was up-regulated in HepG2-derived HBV replicating stable
cells. 48 h after incubations, proteins were analyzed using primary antibody, HRP-
conjugated secondary antibody, and ECL. HepG2 cell is a negative control and HepG2.2.15
cell is the HepG2-derived stable HBV replicating cells. GAPDH is a loading control.
*p<0.05 vs. control, **p<0.02 vs. control (n=3).
- 22 -
D. HBV 증식 포에 PP2A, S6K1 과 4E-BP1 인산
변
보통 PP2A 는 AMPK 를 억 한다고 알 있지만(Wu 등, 2007),
AMPK 가 PP2A 를 시킨다는 보고도 있다(Kim 등, 2009). 한 PP2A 는
mTOR 에 해 인산 어 억 다고 한다(Hay Sonenberg, 2004).
HepG2.2.15 포에 PP2A 과 인산 변 를 조사한 결과 PP2A
인산 가 증가하 다. mTOR 인산 가 증가하 에 mTOR
downstream 잘 알 진 S6K1 4E-BP1 도 조사하 다. 그 결과 HepG2.2.15
포에 S6K1 과 4E-BP1 과 인산 가 증가하 다. 그리고 Huh7 HBV WT
stable 포에 는 PP2A 과 인산 가 증가하 며 S6K1 에는
변 가 없지만 인산 는 증가하 다.
- 23 -
Figure 4. Phosphorylations and expressions of PP2A, S6K1 and 4E-BP1 were up-
regulated in HBV replicating stable cells. (A and B) 48 h after incubations, proteins were
analyzed using primary antibody, HRP-conjugated secondary antibody, and ECL. HepG2
and Huh7 are negative controls. HepG2.2.15 cells are HepG2-derived stable HBV
replicating cells and Huh7 HBV WT cells are Huh7-derived stable HBV replicating cells.
GAPDH is a loading control. *p<0.05 vs. control, **p<0.02 vs. control (n=3).
- 24 -
E. AMPK 과 에 한 AMPK 변 가 HBV 증식에 미 는
향
HepG2.2.15 포에 AMPK 인산 가 감소한 것 냈다(그림 1.).
라 AMPK 과 에 해 AMPK 가 변 할 HBV 증식에 향
미 는지 인하 해 AMPK 를 과 시 다. HepG2 포를 2 × 10⁶ cell /
6 cm dish 양한 24 시간 후에 pcDNA3, pcDNA3-AMPK α2, pcDNA3-HBV WT
플라스미드 DNA 를 포에 감염시 다. 감염시킨 후 3 일 뒤 하여 AMPK
과 인산 를 인한 결과, AMPK α2 과 벡 에 해 AMPK 과
인산 모 증가하 다. 한 AMPK α2 가 과 었 HBV core
particle 과 core particle 속 핵산이 감소하 고 HBV DNA 도 감소하 다.
- 25 -
Figure 5. Effects of AMPK overexpression on AMPK-mTOR signaling and HBV
replication. HepG2 cells were plated and were co-transfected with pcDNA3, HBV WT, and
pcDNA3-AMPK alpha 2 plasmid. After 72 hours of co-transfection, cells were harvested.
Core particles from HepG2 cells were analyzed using anti-HBc antibody, HRP-conjugated
secondary antibody, and ECL. Nucleic acid inside of core particles and HBV DNAs were
analyzed using a random-primed 32P-labeled probe specific for HBV sequences. Proteins
were analyzed using primary antibody, HRP-conjugated secondary antibody, and ECL.
GAPDH is a loading control.
- 26 -
F. Metformin 에 한 AMPK-mTOR 신 달 과 변
HepG2.2.15 포에 AMPK 인산 가 감소한 것 냈고 mTOR
과 인산 는 증가하 다(그림 1.). 한 HepG2.2.15 포에 Akt 인산
증가하 다(그림 2.). HepG2.2.15 포에 PP2A S6K1 인산
도 증가하 다(그림 3.). AMPK downstream 과 upstream 이 엇인지
인하 해 AMPK 인 metformin 처리하 다. HepG2 포
HepG2.2.15 포를 양한 48 시간 후에 metformin 0.01, 0.05, 0.1 과 1 mM
1 시간동안 처리한 결과 1 mM metformin HepG2.2.15 포에 처리하
metformin 처리하지 않 군에 해 증가시 다. 그에 라 Akt, mTOR, PP2A
S6K1 인산 는 metformin 처리하지 않 군에 해 감소하 다. 이
Akt, mTOR, PP2A S6K1 metformin 처리하여도 변 가 없었다. Akt,
mTOR, PP2A S6K1 이 AMPK downstream 일 것이라고 추 하 다.
- 27 -
Figure 6. Effects of metformin, an AMPK activator, on AMPK-mTOR signaling
pathway. 48 h after incubations, HepG2 and HepG2.2.15 cells were treated with metformin
(0.01mM, 0.05mM, 0.1mM and 1mM) for 60 min. Core particles were analyzed using anti-
HBc antibody, HRP-conjugated secondary antibody, and ECL. Nucleic acid inside of core
particles were analyzed using a random-primed 32P-labeled probe specific for HBV
sequences. Proteins from cell lysates were analyzed using primary antibodies, HRP-
conjugated secondary antibodies and ECL. HepG2 cell is a negative control and HepG2.2.15
cell is the HepG2-derived stable HBV replicating cell. GAPDH is a loading control.
- 28 -
G. Rapamycin 에 한 AMPK-mTOR 신 달 과 변
HepG2.2.15 포에 mTOR 증가하 다(그림 1.). mTOR
downstream 이 S6K1 이고 upstream 이 AMPK Akt 이 맞는지 인하 해
mTOR 억 인 rapamycin 처리하 다. HepG2 포 HepG2.2.15 포를
양한 48 시간 후에 rapamycin 10 nM 24 72 시간 처리하 다. 그 결과
HepG2.2.15 포에 rapamycin 처리하 , mTOR 인산 는
감소 었고 downstream 인 S6K1 인산 한 감소 었다. Upstream 이라고
추 했 Akt AMPK 인산 는 변 가 없 것 상하 나
HepG2.2.15 포에 rapamycin 처리했 Akt 인산 는 감소하 고
AMPK 인산 는 증가하 다.
- 29 -
Figure 7. Effect of rapamycin, an mTOR inhibitor, on AMPK-mTOR signaling
pathway. 48 h after incubations, HepG2 and HepG2.2.15 cells are treated with rapamycin
(10nM) for 24 or 72 hours. (A and B) Proteins were analyzed using primary antibody, HRP-
conjugated secondary antibody, and ECL. HepG2 cell is a negative control and HepG2.2.15
cell is the HepG2-derived stable HBV replicating cell. GAPDH is a loading control.
- 30 -
IV. 고 찰
AMPK 는 ATP 생 ·소 균 한 에 지 단 질 써 산소증,
양분 결핍과 같 사 생 학 스트 스 상태에 다. AMPK 가
면 자가 소 작용 진하여 에 지 양 생 하고 mTOR
억 함 써 단 질 합 억 한다. mTOR 가 면 자가
소 작용 억 하여 포 장과 증식 진한다. 이러한 AMPK mTOR
다른 조 식 통해 에 지 생산과 소 를 조 한다(Lee 등, 2012).
만 HBV 감염 자는 간경변이나 간암 할 가능 이 높다(Guo 등
2007). 간암 포는 AMPK 이 낮다고 보고 어 있다(Yang 등, 2014; Cheng
등 2014). 본 연구에 는 간암 포인 HepG2 포에
래한 HepG2.2.15 포 PEB8 포 HBV 가 증식하는 Huh7 HBV WT stable
포에 도 AMPK 인산 는 감소하 며, mTOR 과 인산 는 증가한
것 냈다(그림 1.). 본 연구에 조사한 HBV 가 증식하는 모든
포에 AMPK 인산 가 감소하 에 Raptor TSC2 인산 가
감소할 것이라고 추 하 나 히 증가하 다(그림 2.). 라 AMPK
mTOR 신 달 과 에 Raptor TSC2 가 직 여를 하지 않 것
추 하 다. Akt 가 mTOR 증가시킨다고 알 있 므 (Martelli
등, 2007), AMPK 가 억 상태에 는 Akt 이 증가 써 mTOR 이
증가한다는 가 웠다. 상 HepG2.2.15 포에 Akt 인산 가
증가하여(그림 3.) mTOR 이 증가한다고 생각 었다 (그림 1.). HBV 가
- 31 -
증식하는 HepG2.2.15, PEB8 Huh7 HBV WT stable 포에 mTOR 인산 가
증가하 에 mTOR downstream 인 S6K1 4E-BP1 를 조사하 며,
상 HepG2.2.15 포에 S6K1 과 4E-BP1 과 인산 가
증가하 다(그림 4.). 그 다 , PP2A 가 AMPK 를 억 하거나(Wu 등, 2007)
AMPK 가 PP2A 를 시킨다(Kim 등, 2009). mTOR 가 PP2A 를
인산 하여 PP2A 를 억 한다고 알 있 나(Hay N Sonenberg N, 2004) 아직
HBV 증식과 하여 진 것이 없다. HepG2.2.15 포 Huh7 HBV WT stable
포에 PP2A 과 인산 가 증가하 다(그림 4.). AMPK α2 가 과 면
HBV 증식이 감소 다(그림 5.). 한 AMPK 인
metformin 처리시 HepG2.2.15 포에 AMPK 인산 가 증가하 며 Akt, mTOR,
PP2A S6K1 인산 는 감소하 나 이들 단 질 양에는 변 가
없었다(그림 6.). 라 Akt, mTOR, PP2A S6K1 이 AMPK downstream 일
것이라고 추 하 다. HepG2.2.15 포에 mTOR 억 인 rapamycin 처리하여
mTOR 억 하 니 mTOR 인산 가 감소하 며 S6K1 인산
한 감소 었다(그림 7.). 그러나 upstream 이라고 상했 Akt 인산 는
감소하 고 AMPK 인산 는 증가하 다. 라 mTOR downstream 인
어떠한 단 질에 해 feedback 효과 upstream 인 AMPK Akt 에 향
것이라고 추 하 며 HBV 증식과 AMPK/Akt-mTOR 신 달 과 히
한 추가 실험이 필요하다.
- 32 -
V. 결
HBV 증식과 AMPK 신 달 과 에 해 는 알 진 것이 거 없다.
AMPK 이 감소 간암 포 그 간암 포에 래한 HBV 증식 포를
통해 HBV 증식 AMPK 여부를 조사하 다. 그 결과 HBV 가
없는 HepG2 Huh7 간암 포보다 HBV 가 증식하는 이들 간암
포에 AMPK 이 감소 것 다. 한 HBV 가 증식하는
HepG2.2.15 포에 는 Akt, mTOR, PP2A, S6K1 4E-BP1 과 인산 가
증가하 다. 한 Huh7 포에 래한 HBV 증식하는 포에 도 mTOR, PP2A
그리고 S6K1 인산 가 증가하 다. AMPK 를 과 하면 AMPK 과
인산 가 증가 며 이에 라 HBV core particle 과 HBV DNA 가 감소하 다.
AMPK 인 metformin HepG2.2.15 포에 AMPK 인산 를
증가시 며, Akt, mTOR, PP2A S6K1 인산 는 감소하 고 각각 단 질
변 가 없었다. 라 Akt, mTOR, PP2A S6K1 이 AMPK
downstream 일 것이라고 추 하 나 Akt, PP2A S6K1 에 한 억 를
처리하는 추가 실험이 필요하다. HepG2.2.15 포에 rapamycin 처리하여
mTOR 억 하 니 상 S6K1 인산 가 감소하 다.
Upstream 이라고 추 했 AMPK Akt 인산 에는 변 가 없 것
상하 지만 rapamycin 처리하 Akt 인산 는 감소하 고 AMPK
인산 는 증가하 다. 라 mTOR downstream 인 어떤 단 질이 feedback
- 33 -
효과 AMPK Akt 에 에도 여하는 것 추 하고 있 며 추가
실험이 필요하다.
- 34 -
참 고 헌
1. Beck J, Nassal M: Hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol 13: 48-64,
2007
2. Brunton J, Steele S, Ziehr B, Moorman N, Kawula T: Feeding uninvited guests:
mTOR and AMPK set the table for intracellular pathogens. PLoS Pathog 9:
e1003552, 2013
3. Carling D, Zammit VA, Hardie DG: A common bicyclic protein kinase cascade
inactivates the regulatory enzymes of fatty acid and cholesterol biosynthesis. FEBS
Lett 223: 217-222, 1987
4. Cheng J, Huang T, Li Y, Guo Y, Zhu Y, Wang Q, Tan X, Chen W, Zhang Y, Cheng W,
Yamamoto T, Jing X, Huang J: AMP-activated protein kinase suppresses the in vitro
and in vivo proliferation of hepatocellular carcinoma. PLoS One 9: e93256, 2014
5. Cougot D, Allemand E, Riviere L, Benhenda S, Duroure K, Levillayer F, Muchardt
C, Buendia MA, Neuveut C: Inhibition of PP1 phosphatase activity by HBx: a
mechanism for the activation of hepatitis B virus transcription. Sci Signal 5: ra1,
2012
- 35 -
6. Egan DF, Shackelford DB, Mihaylova MM, Gelino S, Kohnz RA, Mair W, Vasquez
DS, Joshi A, Gwinn DM, Taylor R, Asara JM, Fitzpatrick J, Dillin A, Viollet B,
Kundu M, Hansen M, Shaw RJ: Phosphorylation of ULK1 (hATG1) by AMP-
activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy. Science 331: 456-
461, 2011
7. Fogarty S, Hawley SA, Green KA, Saner N, Mustard KJ, Hardie DG: Calmodulin-
dependent protein kinase kinase-beta activates AMPK without forming a stable
complex: synergistic effects of Ca2+ and AMP. Biochem J 426: 109-118, 2010
8. Guo H, Zhou T, Jiang D, Cuconati A, Xiao GH, Block TM, Guo JT: Regulation of
hepatitis B virus replication by the phosphatidylinositol 3-kinase-akt signal
transduction pathway. J Virol 81: 10072-10080, 2007
9. Hardie DG: AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular
energy. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 774-785, 2007
10. Hawley SA, Boudeau J, Reid JL, Mustard KJ, Udd L, Makela TP, Alessi DR, Hardie
DG: Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRAD alpha/beta and MO25
alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol
2: 28, 2003
- 36 -
11. Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, Ross L, Bain J, Edelman AM, Frenguelli BG,
Hardie DG: Calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta is an alternative
upstream kinase for AMP-activated protein kinase. Cell Metab 2: 9-19, 2005
12. Hay N, Sonenberg N: Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 18: 1926-
1945, 2004
13. Hurley RL, Anderson KA, Franzone JM, Kemp BE, Means AR, Witters LA: The
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinases are AMP-activated protein
kinase kinases. J Biol Chem 280: 29060-29066, 2005
14. Ju TC, Chen HM, Lin JT, Chang CP, Chang WC, Kang JJ, Sun CP, Tao MH, Tu PH,
Chang C, Dickson DW, Chern Y: Nuclear translocation of AMPK-alpha1 potentiates
striatal neurodegeneration in Huntington's disease. J Cell Biol 194: 209-227, 2011
15. Kane M: Global programme for control of hepatitis B infection. Vaccine 13 Suppl 1:
S47-49, 1995
16. Kaplan PM, Greenman RL, Gerin JL, Purcell RH, Robinson WS: DNA polymerase
associated with human hepatitis B antigen. J Virol 12: 995-1005, 1973
- 37 -
17. Kim J, Kundu M, Viollet B, Guan KL: AMPK and mTOR regulate autophagy
through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol 13: 132-141, 2011
18. Kim K, Kim KH, Cheong J: Hepatitis B virus X protein impairs hepatic insulin
signaling through degradation of IRS1 and induction of SOCS3. PLoS One 5: e8649,
2010
19. Kim KY, Baek A, Hwang JE, Choi YA, Jeong J, Lee MS, Cho DH, Lim JS, Kim KI,
Yang Y: Adiponectin-activated AMPK stimulates dephosphorylation of AKT through
protein phosphatase 2A activation. Cancer Res 69: 4018-4026, 2009
20. Lamia KA, Sachdeva UM, DiTacchio L, Williams EC, Alvarez JG, Egan DF,
Vasquez DS, Juguilon H, Panda S, Shaw RJ, Thompson CB, Evans RM: AMPK
regulates the circadian clock by cryptochrome phosphorylation and degradation.
Science 326: 437-440, 2009
21. Laplante M, Sabatini DM: mTOR signaling in growth control and disease. Cell 149:
274-293, 2012
22. Lee CW, Wong LL, Tse EY, Liu HF, Leong VY, Lee JM, Hardie DG, Ng IO, Ching
YP: AMPK promotes p53 acetylation via phosphorylation and inactivation of SIRT1
in liver cancer cells. Cancer Res 72: 4394-4404, 2012
- 38 -
23. Lee WM: Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 337: 1733-1745, 1997
24. Li Y, Xu S, Mihaylova MM, Zheng B, Hou X, Jiang B, Park O, Luo Z, Lefai E, Shyy
JY, Gao B, Wierzbicki M, Verbeuren TJ, Shaw RJ, Cohen RA, Zang M: AMPK
phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and
atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab 13: 376-388, 2011
25. Liang TJ: Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology 49: S13-21, 2009
26. Mankouri J, Tedbury PR, Gretton S, Hughes ME, Griffin SD, Dallas ML, Green KA,
Hardie DG, Peers C, Harris M: Enhanced hepatitis C virus genome replication and
lipid accumulation mediated by inhibition of AMP-activated protein kinase. Proc
Natl Acad Sci U S A 107: 11549-11554, 2010
27. Martelli AM, Tazzari PL, Evangelisti C, Chiarini F, Blalock WL, Billi AM, Manzoli
L, McCubrey JA, Cocco L: Targeting the phosphatidylinositol 3-
kinase/Akt/mammalian target of rapamycin module for acute myelogenous leukemia
therapy: from bench to bedside. Curr Med Chem 14: 2009-2023, 2007
28. Martinez-Lopez N, Varela-Rey M, Fernandez-Ramos D, Woodhoo A, Vazquez-
Chantada M, Embade N, Espinosa-Hevia L, Bustamante FJ, Parada LA, Rodriguez
MS, Lu SC, Mato JM, Martinez-Chantar ML: Activation of LKB1-Akt pathway
- 39 -
independent of phosphoinositide 3-kinase plays a critical role in the proliferation of
hepatocellular carcinoma from nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 52: 1621-
1631, 2010
29. McMahon BJ, Alward WL, Hall DB, Heyward WL, Bender TR, Francis DP,
Maynard JE: Acute hepatitis B virus infection: relation of age to the clinical
expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis
151: 599-603, 1985
30. Mihaylova MM, Shaw RJ: The AMPK signalling pathway coordinates cell growth,
autophagy and metabolism. Nat Cell Biol 13: 1016-1023, 2011
31. Robinson WS, Clayton DA, Greenman RL: DNA of a human hepatitis B virus
candidate. J Virol 14: 384-391, 1974
32. Robinson WS, Greenman RL: DNA polymerase in the core of the human hepatitis B
virus candidate. J Virol 13: 1231-1236, 1974
33. Salt I, Celler JW, Hawley SA, Prescott A, Woods A, Carling D, Hardie DG: AMP-
activated protein kinase: greater AMP dependence, and preferential nuclear
localization, of complexes containing the alpha2 isoform. Biochem J 334 ( Pt 1):
177-187, 1998
- 40 -
34. Sato R, Goldstein JL, Brown MS: Replacement of serine-871 of hamster 3-hydroxy-
3-methylglutaryl-CoA reductase prevents phosphorylation by AMP-activated kinase
and blocks inhibition of sterol synthesis induced by ATP depletion. Proc Natl Acad
Sci U S A 90: 9261-9265, 1993
35. Seeger C, Mason WS: Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64: 51-68,
2000
36. Shackelford DB, Shaw RJ: The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth
control in tumour suppression. Nat Rev Cancer 9: 563-575, 2009
37. Shaw RJ, Kosmatka M, Bardeesy N, Hurley RL, Witters LA, DePinho RA, Cantley
LC: The tumor suppressor LKB1 kinase directly activates AMP-activated kinase and
regulates apoptosis in response to energy stress. Proc Natl Acad Sci U S A 101:
3329-3335, 2004
38. Summers J, O'Connell A, Millman I: Genome of hepatitis B virus: restriction
enzyme cleavage and structure of DNA extracted from Dane particles. Proc Natl
Acad Sci U S A 72: 4597-4601, 1975
- 41 -
39. Turnley AM, Stapleton D, Mann RJ, Witters LA, Kemp BE, Bartlett PF: Cellular
distribution and developmental expression of AMP-activated protein kinase isoforms
in mouse central nervous system. J Neurochem 72: 1707-1716, 1999
40. Tzatsos A, Tsichlis PN: Energy depletion inhibits phosphatidylinositol 3-kinase/Akt
signaling and induces apoptosis via AMP-activated protein kinase-dependent
phosphorylation of IRS-1 at Ser-794. J Biol Chem 282: 18069-18082, 2007
41. Watt MJ, Holmes AG, Pinnamaneni SK, Garnham AP, Steinberg GR, Kemp BE,
Febbraio MA: Regulation of HSL serine phosphorylation in skeletal muscle and
adipose tissue. Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E500-508, 2006
42. Woods A, Dickerson K, Heath R, Hong SP, Momcilovic M, Johnstone SR, Carlson
M, Carling D: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta acts upstream
of AMP-activated protein kinase in mammalian cells. Cell Metab 2: 21-33, 2005
43. Wu TT, Coates L, Aldrich CE, Summers J, Mason WS: In hepatocytes infected with
duck hepatitis B virus, the template for viral RNA synthesis is amplified by an
intracellular pathway. Virology 175: 255-261, 1990
44. Wu Y, Song P, Xu J, Zhang M, Zou MH: Activation of protein phosphatase 2A by
palmitate inhibits AMP-activated protein kinase. J Biol Chem 282: 9777-9788, 2007
- 42 -
45. Xu Y, Liu C, Chen S, Ye Y, Guo M, Ren Q, Liu L, Zhang H, Xu C, Zhou Q, Huang S,
Chen L: Activation of AMPK and inactivation of Akt result in suppression of
mTOR-mediated S6K1 and 4E-BP1 pathways leading to neuronal cell death in in
vitro models of Parkinson's disease. Cell Signal 26: 1680-1689, 2014
46. Yan H, Zhong G, Xu G, He W, Jing Z, Gao Z, Huang Y, Qi Y, Peng B, Wang H, Fu L,
Song M, Chen P, Gao W, Ren B, Sun Y, Cai T, Feng X, Sui J, Li W: Sodium
taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis
B and D virus. Elife 1: e00049, 2012
47. Yang CC, Chang SF, Chao JK, Lai YL, Chang WE, Hsu WH, Kuo WH: Activation
of AMP-activated protein kinase attenuates hepatocellular carcinoma cell adhesion
stimulated by adipokine resistin. BMC Cancer 14: 112, 2014
48. Yano M, Ohkoshi S, Aoki YH, Takahashi H, Kurita S, Yamazaki K, Suzuki K,
Yamagiwa S, Sanpei A, Fujimaki S, Wakai T, Kudo SE, Matsuda Y, Aoyagi Y:
Hepatitis B virus X induces cell proliferation in the hepatocarcinogenesis via up-
regulation of cytoplasmic p21 expression. Liver Int 33: 1218-1229, 2013
- 43 -
49. Yen CJ, Lin YJ, Yen CS, Tsai HW, Tsai TF, Chang KY, Huang WC, Lin PW, Chiang
CW, Chang TT: Hepatitis B virus X protein upregulates mTOR signaling through
IKKbeta to increase cell proliferation and VEGF production in hepatocellular
carcinoma. PLoS One 7: e41931, 2012
- 44 -
- ABSTRACT -
AMP-activated protein kinase-mTOR signaling pathway and
hepatitis B virus replication
Jumi Kim
Department of Biomedical science
The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Associate Professor Kyongmin Kim)
Hepatitis B virus(HBV) is a small and enveloped DNA virus, belongs to family
Hepadnaviridae. 350 million people worldwide are chronically infected. HBV causes acute
and chronic hepatitis B infections. Patients with chronic hepatitis B have a risk of developing
cirrhosis and hepatocellular carcinoma(HCC). AMP-activated protein kinase(AMPK), an
energy sensor, is a necessary protein to maintain energy balance. Even though hepatitis C
virus(HCV) replication decreases AMPK activity and increases mammalian target of
rapamycin(mTOR) activity, nothing has been known regarding HBV replication and AMPK
activity. HBV X protein(HBx) had been reported to up-regulate mTOR activity and
contribute to HCC development. In the present study, we examined whether HBV replication
can regulate AMPK-mTOR signaling pathway or vice versa. Expression and
- 45 -
phosphorylation of AMPK were analyzed in the HepG2-derived stable HBV replicating cells,
HepG2.2.15 and PEB 8 cells, and the Huh7-derived stable HBV replicating cells. We found
that phosphorylation of AMPK were down-regulated in the HepG2.2.15 cells and PEB8 cells
and the Huh7 HBV WT stable cells. We found that expression and phosphorylation of
mTOR were up-regulated in HepG2.2.15 cells, PEB8 cells, and Huh7 HBV WT stable cells.
Because phosphorylation of AMPK was decreased, we expected that phosphorylation of
regulatory subunit of mTOR (Raptor) and tuberous sclerosis 2 (TSC2) were decreased. But,
phosphorylations of Raptor and TSC2 were increased in HepG2.2.15 cells. We found that
phosphorylations of Akt was up-regulated in HepG2.2.15 cells. We found that expressions
and phosphorylations of PP2A, S6K1 and 4E-BP1 were up-regulated in HepG2.2.15 cells.
And expressions and phosphorylations of PP2A and S6K1 were up-regulated in the Huh7
HBV WT stable cells. When expression and phosphorylation of AMPK were up-regulated
via overexpression of AMPK alpha 2, HBV core particle, nucleic acid inside core particle,
and HBV DNAs were reduced in HepG2 cells. When HepG2.2.15 cells were treated with
1mM metformin, AMPK activator, Akt, mTOR, PP2A and S6K1 phosphorylation were
decreased. No significant changes in protein expressions. When HepG2.2.15 cells were
treated with 10nM rapamycin, mTOR inhibitor, phosphorylations of mTOR and S6K1 were
decreased. Surprisingly, phosphorylation of AMPK were increased and phosphorylation of
Akt were decreased. We will further pursue which molecules are upstream or downstream of
AMPK-mTOR signaling pathway.
Keyword : HBV, AMPK-mTOR signal, Akt, PP2A, S6K1, 4E-BP1