Современные методы улучшения протоколов витрификации...

Доклад к семинару Фонда перспективных исследований

“Криоконсервация органов и тканей” 

Современные методы улучшения протоколов

витрификации

для обратимойкриоконсервации органов

Научно-технический центркриобиологии и анабиоза,

февраль 2014 г., Москва Удалова В. В., scidep@ntckba.ru 

Витрификация («стеклование», от лат. vitrum «стекло» и лат. facio «делаю превращение» — переход жидкости при понижении температуры в стеклообразное состояние

Витрификация

ВОДА–124,4° С

Криосохранение тканей, эмбрионов с помощью

витрификации

Эмбрионы лошади восстанавливают форму после витрификации.

Общая сумма грантов NIH, в названии которых есть слово «витрификация»за 24 года

31 128 838 $

Витрификация и NIH

Лучшее достижение в области обратимой криоконсервации –

витрификация почки кролика

21 Century Medicine

Физико-химические аспекты витрификации

Быстрое и медленное замораживание витрифицированной жидкости до -196C

Синтетическиеблокаторы льда

(X-1000, 21CM)

Биологические аспекты витрификации

Витрифицированная и трансплантированная почка кролика извлекается для исследования после 29 дней работы в теле кролика.

Научные и технические проблемы криоконсервации органов такие же, как проблемы криосохранения мозга в крионических организациях.

Криоконсервация органови крионические

организации США

Размер и сложность объекта.

Трудность криоконсервации.

Клетки, эмбрионы

Органы Организм

Можно спорить о правомерности подхода крионических организаций, но именно в их рамках рождается много исследований, новых подходов.

• Cryonics Institute• Best B.P. "Scientific justification of cryonics practice", Rejuvenation

Research (2008, vol. 11), pg. 493-503.

• Alcor Life Extension Foundation• Lemler J, Harris SB, Platt C, Huffman T, in: Annals of the New York

Academy of Sciences (2004, vol. 1019), "The Arrest of Biological Time as a Bridge to Engineered Negligible Senescence", pg. 559-563

• 21st Century Medicine• Fahy GM, Wowk B, Wu J, Phan J, Rasch C, Chang A, Zendejas E, in:

Cryobiology (2004, vol. 48), "Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances", pg. 157-178

Криоконсервация органови крионические

организации США

Critical Care Research Inc. и 21st Century Medicine Inc.

Эксперименты по глубокой гипотермии

1985 год!

Витрифицирующие смеси

21st Century Medicine

Ведущие криобиологи – сторонники крионики

*Юрий Пичугин

*Joao Pedro De Magalhaes, University of Liverpool

*Сергей Шелег

*Gregory Fahy, 21st Century Medicine

*Brian Wowk, 21st Century Medicine

*Michael Federowicz

*Steve Van Sickle, Arigos Biomedical

Криосохранение тела и мозга человека и животных:

• Хирургические аспекты, в том числе микрохирургия (на крысах)

• Работа по современным протоколам витрификации и по протоколам замораживания с допустимым количеством льда

• Создание уникального оборудования для витрификации, включая технику для быстрого охлаждения объектов и для низкотемпературного хранения и транспортировки крупных биологических объектов при низких температурах

• Обратимая глубокая гипотермия животных (крыс, собак)

Наши компетенции

Подготовка к витрификации кота. Москва

Первая в России глицериновая перфузия собаки, 2008 год, компания «КриоРус».

Комплексный характер технологии витрификации

органов

При витрификации органов, в отличие от сохранения клеток, требуется как оценка функционального состояния органа, так и его структуры на всех уровнях, от макро до микро.

На данных электронных микрограммах (ув. x40200) видны синапс гиппокампа с гранулами нейротрансмиттеров (слева) и сохранность структура миелиновой оболочки (с одним небольшим нарушением) и внутриклеточные органеллы (справа).

Размер и структура органов

Образование льда в почке при девитрификации, если ее не избежать.

Демонстрация последствий неправильной процедуры. Растрескивание витрифицирующего раствора и почки

• По технологиям витрификации учеными накоплено уже очень много данных, более 50 лет исследований

• Понятен путь улучшения качества витрифицированного органа(снижение токсического воздействия криопротекторных смесей)

• За последние 10-15 лет появилось много технологических новшеств: Cells Alive System, разработка равномерного СВЧ-нагрева, персуфляция (инсуфляция) охлаждающим газом, новая приборная исследовательская база.

Апгрейд технологии витрификации — путь к

криоконсервации органов

Стандартный протокол витрификации

1) Увеличить скорость охлаждения (газовая персуфляция и другие новые методы)

2) Использовать новые режимы нагревания (СВЧ и персуфляция)

3) Подавление кристаллизации с помощью электромагнитных полей

4) Внедрение протокола качества процедур и контроля состояния органа

Мы знаем, как надо улучшить протокол

витрификации

То есть, нужна новая комплексная методика

Arigos BiomedicalDate funded: February, 2012

Location: Mountain View, CA

Arigos Biomedical развивает методы высокоскоростного охлаждения для обратимого криосохранения органа и целого организма без разрывов, ассоциированных с современными технологиями замораживания.

Соучредители Таня Джонс и Стивен Ван Сикл имеют совокупный более чем 35-летний практический опыт в исследованиях и разработке криоконсервации для тканей человека, начиная с работы в "Алькор Foundation".

Второй грант –от Питера Тиля, первого инвестора Facebook

Предлагается доработать экспериментальные методы персуфляции – газового охлаждения через кровеносную систему и внедрить их.

Повышение скорости охлаждения до 0.5°C/мин позволит снизить концентрацию криопротектора до 60%, а повышение скорости охлаждения до 20°C/мин позволит снизить концентрацию до 50%, при которой токсическое воздействие криопротекторной смеси гораздо менее критично.

Газовая персуфляция

WISAP TERTAFLATOR

Газовая персуфляцияИстория использования для сохранения органов

Мы предлагаем проработать возможность использования инсуффляции для нагрева органа от –130°C до –20°C, когда начинается процесс реперфузии.

Также планируется проверить возможность нагревания с помощью равномерного микроволнового излучения (в диапазоне 300-1000 MH и др.) под томографическим контролем для предотвращения образования очагов избыточного нагревания, возможно, в комбинации с газовым нагревом.

Новые режимы нагревания

Микроволновое нагревание

По некоторым данным имеет смысл проверить применимость экспериментальной технологии CAS и подобных электромагнитных установок.

Возможно, их использование поможет уменьшить токсическое воздействие криопротекторных смесей на самом начальном этапе витрификации, сократив потребность в криопротекторах в начале процедуры, до температуры –20°C (по современным данным до -3°C ).

Подавление кристаллизации с помощью

электромагнитных полей

Криомакроскоп (2013), Carnegie Mellon, Biotherm. Tech. Lab.

Протоколы изученияи контроля на всех

этапах

Первый вариант таблицы этапов криосохранения и уровней и способов контроля

Стабильно повторяемая процедура, которая позволит некоторый орган крупного млекопитающего охлаждать до криогенной температуры, хранить внутри специального устройства, и вне зависимости от срока хранения его можно будет пересаживать.

Ожидаемый результат

Спасибо за внимание!

Доклад «Современные методы улучшения протоколов витрификации

для обратимой криоконсервации органов»

Докладчик: Удалова Валерия Викторовна

Научно-технический центр криобиологии и анабиоза,

февраль 2014 г., Москва, scidep@ntckba.ru