Лекция 6 Функции белков - mipt. protein function.pdfЛекция 6....

Скоблов Михаил Юрьевич

Молекулярная биология

Лекция 6. Функции белков

Часть 1. Чем определяется функция белка

Структурная протеомика

Кристиан Бемер Анфинсен

• В 1972г. совместно с С. Муром и У. Стайном присуждена Нобелевская премия по химии за работу по «установлению связи между аминокислотной последовательностью рибонуклеазы А и ее биологически активной конформацией»

• Основоположник теории фолдинга белка – «аминокислотная последовательность уникальным образом определяет трёхмерное строение белковой молекулы»

Структурная протеомика

Общемировая цель структурной протеомики – получение как можно большего числа трёхмерных структур белков.

Информация получаемая при секвенировании организмов растет с каждым днём Количество выявляемых генов и кодируемых ими белков соответственно

База данных Gene - Всего организмов - 10’069; Всего генов - 11’468’785

Неописанных не зарегистрированных генов – миллиарды…

Что делать?

Структурная протеомика

функцию, структуру и многие другие свойства белка/ДНК определяет последовательность

родственные белки имеют похожие свойства

молекулы, похожие по последовательности, похожи и по свойствам

свойства можно предсказать, анализируя изученные последовательности, похожие на

данную

Гомологичные белки

Гомологичные белки

Гомологичные последовательности – последовательности, имеющие общее происхождение (общего предка)

Признаки гомологичности белков

• сходная 3D-структура

• в той или иной степени похожая аминокислотная последовательность

• аналогичная функция

• разные другие соображения…

Гомологичные белки

Ортологи — последовательности, возникшие из

одного общего предшественника в процессе видообразования. Ортологи, как правило, имеют одну и ту

же функцию

Паралоги — последовательности, возникшие из

одного общего предшественника в результате дупликации одного гена в одном организме. Паралоги, как правило, имеют разные функции.

Гомологичные белки

Рассчитано, что, если задаться оптимальной стратегией выбора «мишеней» для экспериментального определения структуры (такой, чтобы в результате для >90% практически значимых белков был доступен хотя бы один гомолог с уровнем идентичности аминокислотной последовательности >30%), потребуется всего около 16000 структурных экспериментов

Программа по структурным исследованиям белков

PSI - Protein Structure Initiative

Этапы Общее число

Выбрано 154 143

Клонировано 106 932

Выделено 26 868

Структуры в PDB 5 321

Неудачи 27 841

Автоматическая система для кристаллизации белков:

Диапазон температур – от 4С до 20С Срок кристализации - 28 дней Варианты буферов - 96 штук

Одна последовательность — больше одной структуры

• Более 15% эукариотических белков не имеют чётко заданной структуры — они либо слабо упорядочены, либо содержат довольно большие неупорядоченные области

• Классификация слабо упорядоченных белков показала, что они принимают участие во многих регуляторных процессах, связанных с транскрипцией и передачей сигналов.

Одна последовательность — больше одной структуры

Лимфотактин — небольшой белок семейства хемокинов, стимулирующий хемотаксис Т-лимфоцитов

Физиологическая форма лимфотактина образуется двумя примерно равновероятными, но при этом совершенно структурно отличными конформациями, динамически переходящими одна в другую

Структура Ltn10 состоит из трёхлопастного β-листа и C-концевой α-спирали, мономер.

Структура Ltn40 образована четырёхлопастным β-листом и функционирует в виде димера (один показан серым, другой — синим)

Одна последовательность — больше одной структуры

• Хоризматмутаза (mMjCM) —фермент катализирующий превращение хоризмовой кислоты (важного метаболита растений и микроорганизмов) в префеновою кислоту.

• Отсутствует третичная структура, находится в состоянии «расплавленной глобулы»

• В несвязанном с лигандом состоянии определить структуру mMjCM не удаётся из-за высокой подвижности, но с молекулой переходного состояния реакции (которая не расщепляется) удалось изучить её структуру.

• Стабилизация неупорядоченной белковой цепи при взаимодействии со специфической мишенью или лигандом — фолдинг, происходящий одновременно со связыванием с другой молекулой

Одна последовательность — больше одной структуры

Прионы - белки, обладающие аномальной трёхмерной структурой, способные катализировать структурное превращение гомологичного им нормального клеточного белка в себе подобный (прионный), присоединяясь к белку-мишени и изменяя его конформацию.

• Прионы - образовано от английского «proteinaceous infectious particles».

• Вызывают тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных

• Прионное состояние белка характеризуется переходом α-спиралей белка в β-слои

• Единственные известные инфекционные агенты, размножение которых происходит без участия нуклеиновых кислот.

Часть 2. Функции белков

Доменная структура белков

• Структура определяет функцию белка

• Домен – независимая глобулярная единица в белке, обладающая активностью

• На сегодняшний день зарегистрировано 173536 доменов

• Белки – можно утрированно представить в виде некого набора доменов, комбинация которых определяет их функцию.

Результаты 2 контрольной

Подоляк Е 7 9 Блинов Роман 5 8 Конина Д 8 8

Соловьева Полина 6 8

Герои

Слабое звено

Бальков А 3111 3 3 Дубинина Дарья 3113 - 3

Иджилова 3114 3 2

17 отсутствовало Средний бал 5,1 5,4

Функции белков

Белки являются самым функционально разнообразным классом биологических молекул

• Структурная • Регуляторная • Транспортная • Защитная • Каталитическая • Сигнальная • Рецепторная • Резервная

PANTHER Classification System homepage. Retrieved May 25, 2011

Функции белков

Белки человека

• У человека известна функция примерно для половины генов

• Каждый год примерно для 100 генов открывают функцию

Функции белков • Выявлено 860 РНК-

связывающих белков • Для 315 из них в первые было

показано что они могут связываться с РНК

Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Castello A, Fischer B, Eichelbaum K, Horos R, Beckmann BM, Strein C, Davey NE, Humphreys DT, Preiss T, Steinmetz LM, Krijgsveld J, Hentze MW. Cell. 2012 Jun 8;149(6):1393-406.

Структурные белки

• Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека.

• Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в частности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др.

• Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.

Структурные белки

• Коллагены — семейство белков, в теле человека составляют до 25 — 30 % общей массы всех белков. Кроме структурной функции коллаген выполняет также механическую, защитную, питательную и репаративную функции.

• Молекула коллагена представляет собой правозакрученную спираль из трёх α-цепей.

• Всего у человека имеется 28 типов коллагена. Все они сходны по структуре.

Структурные белки

• Помимо коллагена внеклеточный матрикс содержит белок эластин, способный довольно в широких пределах растягиваться и возвращаться в исходное состояние.

• Эластин широко распространён в соединительной ткани, особенно в коже, легких и кровеносных сосудах.

• Общими характеристиками для эластина и коллагена являются большое содержание глицина и пролина. В эластине значительно больше валина и аланина и меньше глутаминовой кислоты и аргинина, чем в коллагене.

• Эластин нерастворим в водных растворах (как и коллаген), в растворах солей, кислот и щелочей даже при нагревании.

• В эластине большое количество аминокислотных остатков с неполярными боковыми группами, что, по-видимому, обусловливает высокую эластичность его волокон.

Структурные белки

• Кератины — семейство фибриллярных белков, обладающих механической прочностью, которая среди материалов биологического происхождения уступает лишь хитину.

• В основном из кератина состоят мертвые клетки ороговевающего эпителия и их производные (волосы млекопитющих, рога, копыта, когти, перья птиц, чешуя рептилий и др.).

• В живых клетках эпителиальных тканей кератины образуют промежуточные филаменты.

• Кератины разделяются на две группы: α-кератины и β-кератины.

• Характерной особенностью кератинов является их полная нерастворимость в воде при pH 7,0.

• Отличаются от других фибриллярных структурных белков (например, коллагена) в первую очередь повышенным содержанием остатков цистеина.

• Первичная структура полипептидных цепей a-кератинов не имеет периодичности.

Структурные белки • Актин —филаментозный белок, из его мономеров при полимеризации образуются тонкие филаменты мышц и микрофиламенты немышечных клеток.

• Миозин входит в состав постоянных структур в скелетных и сердечной мышцах, образуя толстые филаменты.

Двигательные, сократительные белки

Ферменты Ферменты, или энзимы (от лат. fermentum, греч. ζύμη, ἔνζυμον — закваска) —белки илиих комплексы, катализирующие химические реакции в живых системах Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами.

Классификация ферментов

1. Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа. 2. Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую.

Пример: киназы, переносящие фосфатную группу. 3. Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза. 4. Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с

образованием двойной связи в одном из продуктов. Пример: лактат алдолаза, ванилин синтаза

5. Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.

Пример: хорисмат мутаза, лизолецитин ацилмутаза 6. Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за

счёт гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза.

Ферменты

• На октябрь 2014 года зарегистрировано 6547 типов ферментов, классифицирующихся по 6 основным классам

• Энзимология - раздел биохимии, изучающий ферменты и катализируемые ими реакции

Транспортные белки

Перенос веществ внутри клетки

Перенос веществ по организму

Перенос веществ через клеточную мембрану

Транспортные белки

Перенос веществ через клеточную мембрану

• Ионные каналы — порообразующие белки (одиночные либо целые комплексы), поддерживающие разность потенциалов, которая существует между внешней и внутренней сторонами клеточной мембраны

• Через ионные каналы проходят ионы Na+ (натрия), K+ (калия), Cl− (хлора) и Ca++ (кальция).

Транспортные белки

Ионные каналы

Потенциал-зависимые ионные каналы

Лиганд-зависимые ионные каналы

открываются и закрываются в ответ на изменение мембранного потенциала

активируются медиатором, который связываясь с их наружными рецепторными

участками, меняет их конформацию

Неуправляемые (независимые) ионные

каналы

пассивный транспорт за счёт диффузии

Транспортные белки

Перенос веществ внутри клетки

• Ядерныe поры — транспортные каналы, пронизывающие двухслойную ядерную оболочку

• Представляют собой многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками — нуклеопоринами

• Осуществляют как пассивный транспорт, так и активный

Транспортные белки

Перенос веществ внутри клетки

NLS (от англ., Nuclear Localization Signal)

Классический NLS K-K/R-X-K/R

Неклассический NLS PY-NLSs

Транспортные белки

Перенос веществ по организму

Гемоглобин

Транспортные белки

Перенос веществ по организму

Альбумины - простые растворимые в воде белки, с небольшим молекулярным весом около 65000.

• Наиболее известный вид альбумина — сывороточный альбумин, содержащийся в сыворотке

• Альбумин является самой большой фракцией белков плазмы крови человека - 55 - 65 процентов

• Осуществляет транспорт жирных кислот, гормонов, лекарств, неорганических ионов

Транспортные белки

Перенос веществ по организму

• Глобулин составляет около 40 процентов всех белков сыворотки крови человека.

• Глобулины делятся на: • Alpha 1 globulins • Alpha 2 globulins • Beta globulins • Gamma globulins (одна из групп «gamma globulin»

является иммуноглобулинами, антителами

Клеточные рецепторы

Клеточные рецепторы - белковые молекулы находящиеся на поверхности мембраны клеток и служащие для восприятия и преобразования различных сигналов, поступающих в клетку, как от окружающей среды, так и от других клеток.

Регуляторная, сигнальная функция

Клеточные рецепторы

• Лауреатами Нобелевской премии за 2012 год по химии стали два американских ученых — Роберт Лефковиц и Брайан Кобилка за изучение серпентинов — клеточные рецепторы (GPCR-рецепторы), и их взаимодействие с G-белком.

• Данные рецепторы являются посредниками в передаче сигналов между клетками организма: они отвечают за обоняние, вкус и чувствительность к свету.

• У человека насчитано несколько сотен генов, кодирующих GPCR-рецепторы.

Гормоны

• Слово «гормоны» произошло от др.-греч. ὁρμάω — возбуждаю, побуждаю

• Представляют собой биологически активные вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции, поступающие в кровь и оказывающие регулирующее влияние на обмен веществ и физиологические функции.

• Гормоны служат гуморальными (переносимыми с кровью) регуляторами определённых процессов в различных органах и системах.

• Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др.

• Некоторые гормоны являются производными аминокислот.

Регуляторная, сигнальная функция

Гормоны

Инсулин

Инсулин увеличивает проницаемость плазматических мембран для глюкозы, активирует ключевые ферменты гликолиза, стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена, усиливает синтез жиров и белков.

Гормоны

Глюкагон

• Глюкагон связывается со специфическими глюкагоновыми рецепторами клеток печени, активируя наработку глюкозы из гликогена

• Глюкоза поступает в кровь, увеличивая секрецию инсулина

Защитные

Иммунная система, антитела

Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) — это особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности В-клеток лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул

Иммунология….

Резервные белки

Питательная (резервная) функция

• Эту функцию выполняют резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины).

• Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию.

• Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы метаболизма.

• При длительном голодании у животных начинают использоваться белки мышц, лимфоидных органов, эпителиальных тканий, печени

Часть 3. Дизайн белков с заданными функциями

Дизайн белков

Первичная структура

Третичная структура

предсказание

Плохо….

Первичная структура

Третичная структура

дизайнирование

Хорошо!

Дизайн белков

Три технологии редактирования генома

Дизайн белков содержащих цинковые пальцы

Технология ZNFs – zinc finger nucleases

Дизайн TALEN белков TALEN - Transcription activator-like effector nucleases – искусственные ферменты рестрикции образованные слиянием «TAL effector DNA binding domain» с «DNA cleavage domain» TAL effectors - белки выделенные из Xanthomonas bacteria.

Технология CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Рекомбинационная репарация двунитевых разрывов: NHEJ и HR

Лилу, сверхсущество 200 тысяч хромосом

Yang L, Guell M, Byrne S, Yang JL, De Los Angeles A, Mali P, Aach J, Kim-Kiselak C, Briggs AW, Rios X, Huang PY, Daley G, Church G. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 2013 Oct;41(19):9049-61.

TALEN vs Cas9-gRNA

TALEN Cas9-gRNA

NHEJ 0,4% 3%

HDR 0,6% 1%

NHEJ

HDR

Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014 Jul;42. Epub 2014 May 26.

Yang L, Guell M, Byrne S, Yang JL, De Los Angeles A, Mali P, Aach J, Kim-Kiselak C, Briggs AW, Rios X, Huang PY, Daley G, Church G. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 2013 Oct;41(19):9049-61.

TALEN vs Cas9-gRNA

Мишень: 15 различных участков в гене CCR5 Объект: hiPSC

Делеция CCR5-Δ32 приводит к невозможности присоединения вируса ВИЧ к Т-клетке

Использование технологий редактирования генома

Hütter G1, Nowak D, Mossner M, Ganepola S, Müssig A, Allers K, Schneider T, Hofmann J, Kücherer C, Blau O, Blau IW, Hofmann WK, Thiel E. Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N Engl J Med. 2009 Feb 12;360(7):692-8.

• We transplanted stem cells from a donor who was homozygous for CCR5 delta32 in a patient with acute myeloid leukemia and HIV-1 infection.

• The patient remained without viral rebound 20 months after transplantation and discontinuation of antiretroviral therapy.

• This outcome demonstrates the critical role CCR5 plays in maintaining HIV-1 infection.

Аллогенная трансплантация как вариант лечения HIV инфекции

Ye L, Wang J, Beyer AI, Teque F, Cradick TJ, Qi Z, Chang JC, Bao G, Muench MO, Yu J, Levy JA, Kan YW. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jul 1;111(26):9591-6.

Редактирование генома для лечения HIV1

Ye L, Wang J, Beyer AI, Teque F, Cradick TJ, Qi Z, Chang JC, Bao G, Muench MO, Yu J, Levy JA, Kan YW. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jul 1;111(26):9591-6.

Редактирование генома для лечения HIV1

• We differentiated these modified iPSCs into monocytes/macrophages and demonstrated their resistance to HIV-1 challenge.

Xie F, Ye L, Chang JC, Beyer AI, Wang J, Muench MO, Kan YW. 2014. Seamless gene correction of betta-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res doi:10.1101/gr.173427.114