免 疫 酵 素 連 結 反 應 enzyme-linked immunosorbent assay 免 疫 酵 素 連 結 反 應

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

免 疫 酵 素 連 結 反 應免 疫 酵 素 連 結 反 應

ELISAELISA 的概念的概念• 抗原抗體間的專一結合關係抗原抗體間的專一結合關係

原理與免疫染色法類似，是利用抗體的專一性去偵測抗原量的多寡，並以酵素為放大信息的標示，因此有相當高的靈敏度；因為使用固相，故操作較為方便，同時可處理大量樣本，但解析力不及電泳轉印的免疫染色法。

ELISAELISA 的起源的起源• 19591959 年年由 Berson and Yellow 基於生物分子抗原

性，利用抗原抗體反應的專一性和高靈敏度來作生物分子的定量，並提出放射免疫分析 (Radio-immunoassay, RIA) 技術與理論。

• 19671967 年年 Catt 和 Tregear 等人首先提出以抗體吸附在塑膠管內壁來進行固定相放射免疫分析的理論，以便游離態與結合態的分離。

Berson SA and Yellow RS Quantitative Aspect of the Reaction Between Insulin and Insulin Binding Antibody. J Clin Invest 1959;38:1996-2016.

Catt K and Tregear GW Solid-Phase Radioimmunoassay In Antibody Coated Tubes. Science 1967;158:1570-1572.

細細胞胞

體體液液

兩兩種種方方式式

巨噬細胞巨噬細胞(Macrophage)

自然殺手細胞自然殺手細胞(Natural killer cell)

干擾素干擾素 (Interferon)

T T 細胞細胞

B B 細胞細胞

生 產

抗體抗體

兩大系統兩大系統 先天免疫系統先天免疫系統 後天免疫系統後天免疫系統

背景理論背景理論

YY

免疫反應免疫反應

初級反應初級反應Primaryresponse

次級反應次級反應Secondaryresponse

抗原 抗原

時 間

免疫反應

YY

YYYYYYYY

初次入侵初次入侵

再次入侵再次入侵

初級反應初級反應

次級反應次級反應

記憶細胞記憶細胞

記憶細胞記憶細胞

抗 原抗 原

抗 原抗 原

作用細胞作用細胞

作用細胞作用細胞

抗體抗體

• 抗體由四條蛋白質長短鍊所組成

• 抗體分子上有兩個抗原結合區

• 抗體與抗原結合是專一性的

IgGIgGImmunoglobulinYY

IgM IgM 五元體五元體

IgA IgA 二元體二元體

抗原決定位抗原決定位EpitopeEpitope

• 一個抗原分子上可能有數個抗原決定位

• 每個抗原決定位至少誘發一種專一性抗體

• 蛋白質性抗原決定位含有六個以上胺基酸

BB

BB

BB抗原抗原

Multivalent Antigen

11

22

2233 33

44

44

Y

Y

Y

Y Y

Y Y

• 一個 B 細胞只能生產一種抗體，對付某一 抗原決定位。

• 若有許多抗原決定位，則需許多個 B 細胞分別生產許多抗體。

BBBB親和力成熟

11抗原決定位

Y

抗原的種類抗原的種類• 蛋白質

• 人工合成胜肽

• 小分子– 稱為半抗原 Hapten ，需要和大分子的蛋白質載體 Car

rier 螯合，方得進行免疫。

小分子抗原的製備小分子抗原的製備• 載體的選擇

– Bovine Serum Albumin, Human Serum Albumin, Ovalbumin, Keyhole Limipt Hemocyanine 等。

• 螯合方法

• 去除未結合部份– 透析

螯合方法螯合方法Conjugate MethodConjugate Method

• Glutaraldehyde (GA) Method

• Carbodiimide (CD) Method

• Mixed Anhydride Method

Conjugate Conjugate MethodMethod

Type of BondType of Bond

Reactive group in Reactive group in hapten hapten

utilized for utilized for couplingcoupling

Glutaraldehyde

Method

R1-NH-CH(OH)(CH2)3CH(OH)NH-R2

-NH2 or -COOH

Carbodiimide

Method

R1-CONH-R2-NH2 or -COOH

Mixed Anhydride

Method

R1-CONH-R2-NH2 or -COOH

免疫流程免疫流程• 免疫

– 免疫動物• 兔 , 鼠 , 雞 , 羊等

– 免疫部位• 皮下 , 肌肉 , 脾內

– 佐劑• 完全佐劑和不完全佐

劑

– 次數

• 取得抗體– 處理

– 儲存

多株抗體多株抗體 vs.vs. 單株抗體單株抗體• 同一個抗原決定位，可有不同的 B 細胞反應，因

此產生不同程度親和力的抗體。或一個抗原有不同的抗原決定位，因此對一個抗原，可以有一群抗體認識它，這些抗體的親和力不一樣，所結合的抗原決定位也可以不一樣，但都對這大抗原能結合，這就是多株抗體 Polyclonal Antibody 。

• 單株抗體 Monoclonal Antibody 是透過細胞融合技術，可以使一個 B 細胞變成一個融合瘤 hybridoma ，並使其單株化 monoclonal ，再篩選產生高親和力的抗體，因此單株抗體是均質性的 (homogeneous) 。

• 單株抗體只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不會隨著個體不同而有變化。

• 單株抗體只含有一種抗體，無法與抗原產生免疫沈澱。

• 單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如多株抗體。

• 單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。

Ad

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多株抗體多株抗體

單株抗體單株抗體1 23 4

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4

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4

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+

細胞融合細胞融合Cell FusionCell Fusion

• 此關鍵技術是 1980 年代，由 Kohler 與 Milstein 兩位科學家在英國劍橋大學所研發，往後數十年無論在基礎研究或醫學應用上都有很大貢獻，也一起獲得諾貝爾獎 (1984 年 ) 。

• B 細胞與骨髓癌細胞融合的方法。因為一般的 B 細胞無法在培養皿中活太久，因此不能如上述大量培養 B 細胞；而骨髓癌是一種淋巴癌細胞，與 B 細胞的背景相似，並且可以在培養皿中永久繼代下去，具有長生不死的特性。若將這兩種細胞混合，並以化學試劑 PEG (polyethylene glycol) 誘導其相互融合，兩組染色體混合之後可能產生重組，當細胞分裂數次之後，染色體數目回復正常，將可能有子代細胞同時兼具分泌抗體及長生不死兩種特性，稱為融合瘤 (hybridoma) 。

其他產生抗體的技術其他產生抗體的技術• 選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，

再以人工方法合成出這條胜肽後，接到 carrier ，然後免疫產生多株抗體。因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為單專一性抗體 (monospecific Ab) 。

• 噬菌體表現 (phage display) 取代傳統的細胞融合方法，得到類似單株抗體的專一性探針。利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構，插入抗體基因上與抗原結合區的部份，然後在重組後噬菌體基因庫中篩選，找出可以表現對抗原具有高專一性結合的噬菌體。

• 將目標蛋白質的基因植在某種表現質體中，再以基因槍打入肌肉細胞中，此基因可以在體內表現出目標蛋白質，引發產生抗體或者細胞免疫。

ELISAELISA 的原理的原理固相免疫分析• 固定相種類

– 微滴定盤 (microtiter plate)– 亞硝基樹脂 (nitrocellulose)– 耐龍薄膜 (nylon membrane), cellulose nitrate ester

(nitrocellulose; NC), polyvinylidene difluoride (PVDF)

– 聚苯乙烯球 (polystyrene bead) 及微粒子 (microparticle)

蛋白質蛋白質 vs.vs. 固定相固定相• 蛋白質和聚乙烯的結合為共價鍵結。

• 50μL /well 蛋白質在常溫常壓下培養 2 hr ，每 well 可接上 100ng ，亦即 300ng/cm2, 4-37℃, pH6-9 中進行皆可。平均 1 well IgG約加入 1000ng/200μL即可達飽合。

• 蛋白質分子量與親和力成正比。

抗原抗原 vs.vs. 抗體抗體• 抗體對抗有特異性的結合 (specificity), 主要是靠氫鍵 (hydrogen bonding) ，靜電力 (electrostatic) ，凡得瓦爾力 (Van der Waals) ，及疏水性鍵結 (hydrophobic force) 以非共價鍵 (non-covalent bond) 的方式結合。

• 影響蛋白質構造的條件皆會影響抗原和抗体的結合 (antigen-antibody binding)– 溫度，離子濃度 (ionic strength) 及酸鹼值 (pH)

ELISAELISA 酵素呈色系統酵素呈色系統• Horseradish Peroxidase

• Alkaline Phosphatase

• beta- galactosidase

• Glucose Oxidase

• Glucose-6-phosphate Dehydrogenase

選擇酵素的考量選擇酵素的考量• 纯度高

• 催化反應轉化率高

• 對受質專一性强

• 價格不貴

• 操作便利– 易於螯合

• 穩定度– 螯合後保持活性及催化

能力

• 在樣品中無此酵素

• 對應的受質– 易於製備及保存 ,價格低廉 , 有色產物易於測定

酵素 酵素 vs.vs. 受質受質• HRP

– OPD O-phenylenediamine

– ABTS 2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)

– HPPA 3-(4-hydroxy)phenly propionic acid

– TMB 3,3’,5,5-Tetramethylbenzidine

• ALP– p-NPP p-nitrophenyl phosphate– Phosphate 4-mehtylumbelliferone

• beta- galactosidase– 4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside

Horseradish PeroxidaseHorseradish Peroxidase

• 糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量 44000 kDa 。• 為複合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（連鐵血红

素）結合而成。主酶無色糖蛋白在 275nm 有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環，在 403nm有最高吸收峰。

• HRP的純度用 RZ (Reinheit Zahl ，德文，意為純度）表示，是 403nm 的吸光值與 280nm 吸光度之比。

Alkaline PhosphataseAlkaline Phosphatase

• 常用的 AP有兩個來源，分别從大腸桿菌和小牛腸膜中萃取。不同來源的生化特性略不相同。

• 從大腸桿菌中萃取的 AP分子量為 80000 kDa ，最適合 pH 8.0；用小牛腸膜中萃取的 AP分子量為100000 kDa ，最適 pH 9.6。

• 在 ELISA中， AP系統的敏感度一般高於 HRP系統，背景值也較低，但 AP價格昂貴，製備螯合物所得率也較 HRP低。

ELISAELISA 實施方式實施方式• 直接 ELISA

– One-Step

• 間接 ELISA – Two-Step

• 三明治 ELISA– Sandwich ELISA

直接直接 ELISAELISA

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直接直接 ELISAELISAYY YY YYYYYYYYYY

間接間接 ELISAELISAYY YY YYYYYYYYYY

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三明治三明治 ELISAELISA

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