第六章 高效液相色谱分析法 hplc （ high pertormance liquid chromatography ， ）

第六章 高效液相色谱分析法 第六章 高效液相色谱分析法 HPLCHPLC （（ High Pertormance Liquid ChromatographHigh Pertormance Liquid Chromatograph

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第一节 概述第一节 概述第二节 基本理论和条件选择第二节 基本理论和条件选择第三节 各类高效液相色谱法第三节 各类高效液相色谱法第四节 高效液相色谱仪第四节 高效液相色谱仪

第一节 概述

高效液相色谱法： 它在经典色谱理论的基础上，采用了高

压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。

一、 HPLC 的特点和实际应用

1. 特点：“三高” “一快” “一广”

高柱效——大于 30000 塔板 / 米柱效高（远高于一般 LC ）

高灵敏度 10-9g （紫外检测）、 10-11g （荧光检测）

高压： 150-350*105 Pa 分析速度快 应用范围广泛（可分析 80% 有机化合物）

二、 HPLC 与 GC 差别

1 ．分析对象的区别GC ：对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子

型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 , 可测占有机物的 20%

HPLC ：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的 80%

2 ．流动相差别的区别GC ：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和 pH 值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。

3 ．操作条件差别GC ：加温操作HPLC ：室温；高压（液体粘度大，峰展

宽小）

第二节 基本理论和条件选择基础基础理论理论

热力学理论：塔板理论——平衡理论热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——动力学理论：速率理论—— VanderVander 方方

程程一、塔板理论一、塔板理论

理理 nLH / 22

21

2 )(16)(54.5)(W

t

W

ttn RRR

理

effeff nLH / 2

21

'2

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)(54.5)(16W

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W

tn RReff

0

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t

tk R

2)1

(k

knneff

理

2 ）涡流扩散项及其影响

向扩扩散项后uCAH：HPLC （忽略纵mDB 2

T

Dm

相忽略大低，流动相柱温 BT

RtnHu

uHscmu

，但柱效，

时，/1

min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，

讨论： 1 ）流动相流速对 HPLC 板高的影响（与 GC 对比）

dpA 2 dpA

柱效，， nHAdp

二、速率理论（与二、速率理论（与 GCGC 对比）对比）

1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （ dp≤10μm ） 首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，

约 1ml/min 3. 柱温的选择：选室温 250C 左右

三、三、 HPLCHPLC 法中分离条件的选择法中分离条件的选择

一、液固吸附色谱法（ LSC ） 二、液液分配色谱法（ LLC ）三、离子色谱法（ IC ）四、空间排阻色谱法（ SEC ）五、高效逆流色谱（ HSCCC ）

第三节 各类高效液相色谱法简介第三节 各类高效液相色谱法简介

1 ．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异

一、液固吸附色谱法（ LSC ） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂

2．固定相：与GC比，固定相粒径不同（<10μm）（1）硅胶——70% （2）氧化铝• 适用：中等相对分子量（200~2000） 同族分离或同分异构体分离

3 ．流动相：底剂（烷烃） + 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿 - - -注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间4 ．出柱顺序：弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱5 ．硅胶吸水量↑， LSC→LLC• 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大• 硅胶含水量 >17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液

1 ．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2 ．正相色谱与反相色谱正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（ NLLC ） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分：甾醇、类（磷）脂化合物、脂肪酸

反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（ RLLC ） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 理想的、普遍适用的分析方法，同族化合物 （有机化合物都存在疏水基团）

二、液液分配色谱法（ LLC ）

利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面分离机制：分配 + 吸附（以 LLC 为基础）特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱

3 ．固定相（ 1 ）载体 + 固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用（ 2 ）化学键合固定相

1 ）反相键合相色谱固定相：极性小的烷基键合相 C8 柱， C18 柱（ ODS 柱—— HPLC 约 80% 问题）

流动相： 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈， THF适用：非极性 ~ 中等极性组分（ HPLC80% 问题）

（ 1 ）反相离子对色谱法（ IPC 或 PIC ）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加 k 和 tR ，以改善分离

适用：较强的有机酸、碱

（ 2 ）反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相 pH 值，抑制

组分解离，增加其 k和 tR，以达到改善分离的目的

1 ）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH 一定的缓冲溶液2 ）调节 pH 范围： 3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子3 ）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸； pH=7~8 弱碱；两性化合物

2 ）正相键合相色谱固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小（同 LSC ） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿 - 甲醇，氯仿 -乙醇适用：• 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似• 氨基键合相与硅胶性质差别大，呈碱性 分析极性大物质、糖类等

• 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。

• 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。

• ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)• 流动相：水，通过盐浓度或PH控制组分保留值

三、离子交换色谱法（ IC ）

四、排阻色谱色谱 （ size- exclusion chromatography ）固定相：凝胶 ( 具有一定大小孔隙分布 ) ；

原 理：按分子大小分离。 可对相对分子量大（大于 2000 ）化合物

按质量分离（相对分子质量差别大于 10% ）

分离类型选择

第四节 高效液相色谱仪

11 ．贮液罐（滤棒，可滤．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）22 ．高压泵（输液泵）．高压泵（输液泵）33 ．进样装置．进样装置44 ．色谱柱——分离．色谱柱——分离55 ．检测器——分析．检测器——分析66 ．废液出口或组分收集器 ．废液出口或组分收集器 77 ．记录装置．记录装置

二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图

一 流动相贮存器

对流动相的要求：1 ）与固定液不反应2 ）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的3 ）与检测器匹配： UV （常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学4 ）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气

流动相中气泡？ •原因 •危害

•脱气 超声波振荡；惰性气体鼓泡吹扫脱气；真空脱气。

流速 不稳、基线 起伏、噪音峰 尖锐、检测器问题

氧气空气

二．泵： 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用

三 进样装置

1. 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）

GC 系统压力较小，可以 HPLC 系统压力太大，必须停泵进样（早期）

2. 阀进样：不必停泵，六通阀

进样装置

耐高压的六通阀进样装置

四 梯度淋洗装置载液（即流动相）中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。外梯度 :

内梯度 :

五 高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径 1 ～6 mm ，柱长5 ～40 cm 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

六 液相色谱检测器 1. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高； 线形范围高；流通池可做的很小（ 1mm × 10mm ，容积 8μL ）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2. 光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器： 1024 个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

光电二极管阵列检测器

3. 示差折光检测器（ differential refractive index detector ） 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；