ב. פלסמידים- plasmids

PlasmidsPlasmidsפלסמידים-פלסמידים- ב.ב.

זה נקרא זה נקרא DNADNA חוץ כרומוזומלי. חוץ כרומוזומלי. DNADNAלרבים מן החיידקים יש לרבים מן החיידקים יש

plasmidplasmid..

של פלסמיד DNA ה•

מעגלי DNAהוא

דוגדילי.

לפלסמיד יש כושר •

הכפלה עצמי.

תהליך זה מתקיים בין •חיידקים שיש להם את

הפלסמיד לאלה שאין להם.

מעבר של הפלסמיד עשוי •לשנות את התכונות של

החיידק המקבל. לדוגמא: במידה ויש ע"ג הפלסמיד גן לעמידות לאנטיביוטיקה גם

החיידק המקבל ייהפך לעמיד לאנטיביוטיקה.

transformation העברה של פלסמיד בין -חיידקים.

Restriction Restrictionאנזימי הגבלה -אנזימי הגבלה - ג.ג.EnzymesEnzymes..

אנזימים שחותכים אנזימים שחותכיםDNADNA.. אנזימים אילו נתגלו לאחר שנמצא, שבמקרים אנזימים אילו נתגלו לאחר שנמצא, שבמקרים

מסוימים, לא ניתן היה להעביר תורשתי בין חיידקים. מסוימים, לא ניתן היה להעביר תורשתי בין חיידקים.

אנזימים אילו כנראה שייכים •למנגנוני העמידות של

החיידקים מפני תוקפנותם של ( bacteriophage)נגיפים

המחדירים את החומר התורשתי שלהם לחיידקים

ופוגעים בהם.

המאפיינים של אנזימי ההגבלההמאפיינים של אנזימי ההגבלה RestrictionRestriction enzymesenzymes))))

בין האנזימים השוני•השונים בא לידי ביטוי:

ברצף הנוקלאוטידים א.באתר החיתוך.

באופי החיתוך חיתוך ב.ישר או מדורג.

במספר הבסיסים ג. או 4,6באתרי החיתוך

8.

קיימים מאות סוגים של אנזימים הגבלה.

לכל אנזימי ההגבלה הוא, שיש להם אזורי החיתוך המשותף •המתאפיינים ברצף נוקלאוטידים של פלינדרום.

..” ” sticky endssticky ends)“)“חיתוך עם קצוות דביקים )חיתוך עם קצוות דביקים )

יתרונות השיטה:הווקטור פחות יכול להסגר על עצמו.•שליטה על כיוון הכניסה של הפרגמנט.•

"(."(.bluntbluntחיתוך חלק )"חיתוך חלק )"

חסרונות: הווקטור יכול להסגר על עצמו. • אין שליטה על כיוון כניסת הפרגמנט.•

יתרונות: פשוט יותר לביצוע.• יוצרים תוצרים תואמים.”blunt“ כל שני אנזימים שחותכים •

44השוואה בין תוצרי חיתוך של אנזימי חיתוך עם השוואה בין תוצרי חיתוך של אנזימי חיתוך עם נוקלאוטידים באתר החיתוך. נוקלאוטידים באתר החיתוך.66ו ו

באנזים הגבלה, שאתר החיתוך שלו נוקלאוטידים, הסתברות 6הוא

( 46 )4069לחיתוך תהיה אחת לכל נוקלאוטידים.

באנזים הגבלה, שאתר החיתוך שלו נוקלאוטידים, הסתברות 4הוא

( 44 )256לחיתוך תהיה אחת לכל נוקלאוטידים.

בהרצה במכשיר אלקטרופורזה...בהרצה במכשיר אלקטרופורזה...

עקרון ההפרדה בג'ל אלקטרופורזה. עקרון ההפרדה בג'ל אלקטרופורזה.

מקרא העצים- ג'ל.• עכברים -מקטעי •

DNA .קטנים פילים- מקטעים •

.DNAגדולים של ה

. " המקטעים של גודל פ ע הפרדה .נקבל " המקטעים של גודל פ ע הפרדה נקבל

: .U.Vבעזרת . אלאחר ההרצה

טובלים את הג'ל בחומר אשר נספח ל

DNA ואשר זוהר ..U.Vתחת אור

אוטורדיוגרפיה: קודם ב.להרצה דואגים שה

DNA יסומן בחומר רדיואקטיבי. סימון זה

. P32נעשה ע"י האיזוטופ את הקרינה ניתן לזהות

ע"ג נייר צילום.

זיהוי המקטעים:

. ההגבלה אנזימי .מפת ההגבלה אנזימי מפת

ניתן להפעיל על אותו מקטע • מספר אנזימי DNAשל

חיתוך שונים. לאחר מכן להריץ את •

הדגימות השונות באלקטרופורזה.

זיהוי מקטעי ההרצה יעשה •ע"פ אחת השיטות שצויינו

וע"י . U.Vלעיל )אוטורדיוגרפיה(.

בעקבות ניתוח של סדרת •המקטעים ניתן לשרטט את

מפת ההגבלה של הקטע לאותם האנזימים.

RecombinantRecombinant)) רקומביננטי רקומביננטי DNADNA ד.ד.DNADNA ) )..

חיתוך שני מקטעים ע"י חיתוך שני מקטעים ע"י 1.1.אותו אנזים חיתוך.אותו אנזים חיתוך.

חיבור של המקטעים חיבור של המקטעים 2.2.)תהליך זה מתבצע )תהליך זה מתבצע

בטמפרטורות נמוכות(.בטמפרטורות נמוכות(.

איחוי של שני הגדילים איחוי של שני הגדילים 3.3.בעזרת אנזים ליגאז. בעזרת אנזים ליגאז.

, שנוצר ע"י חיבור של ייחודי DNA רקומביננטי הוא DNAהגדרה : שני מקטעים שאינם מצורפים יחדיו באופן טבעי.

DNA יצירת ה•הרקומביננטי.

לפלסמיד, ובכך לפלסמיד, ובכך DNADNA בשיטה זו ניתן להחדיר מקטעי בשיטה זו ניתן להחדיר מקטעי רקומביננטי. רקומביננטי.DNADNAלהפוך את הפלסמיד ל להפוך את הפלסמיד ל

DNADNAלפלסמיד תכונות שונות המכשירות אותו לשמש כנשא של לפלסמיד תכונות שונות המכשירות אותו לשמש כנשא של )כווקטור( זר לחיידק: )כווקטור( זר לחיידק:

kbkbמשקל מולקולרי נמוך )בד"כ עד משקל מולקולרי נמוך )בד"כ עד 1.1.( המקנות לו יציבות. מולקולה זו ( המקנות לו יציבות. מולקולה זו 1010

עמידה בפני שבירה בעת הטיפול. עמידה בפני שבירה בעת הטיפול.

בשל צורתו המעגלית קל הפריד בשל צורתו המעגלית קל הפריד 2.2.אותה מיתר מקטעי הכרומוזומים. אותה מיתר מקטעי הכרומוזומים.

הפלסמיד הוא בעל כושר הכפלה הפלסמיד הוא בעל כושר הכפלה 3.3.עצמי.עצמי.

לפלסמיד יש סימני ברירה )עמידות לפלסמיד יש סימני ברירה )עמידות 4.4.לאנטיביוטיקה( שבעזרתם ניתן לברור לאנטיביוטיקה( שבעזרתם ניתן לברור בין התאים שקלטו פלסמיד לבין אלה בין התאים שקלטו פלסמיד לבין אלה

שלא קלטו אותו.שלא קלטו אותו.

יש על הפלסמיד אתרי חיתוך למספר יש על הפלסמיד אתרי חיתוך למספר 5.5.אנזימי הגבלה.אנזימי הגבלה.

.הפלסמיד כמולקולת נשא

. ה.ה. בחיידקים גנים .שיבוט בחיידקים גנים שיבוט

)a)a-ה מקטע ה-בידוד מקטע חיבור DNADNAבידוד הרצוי. חיבור הרצוי. נשא למולקולת זה מקטע של נשא )ליגציה( למולקולת זה מקטע של )ליגציה(

((vectorvector מולקולה קבלת – מולקולה ( קבלת – )רקומביננטית.רקומביננטית.

)b)b המולקולה החדרת – המולקולה טרנספורמציה החדרת – טרנספורמציה הרקומביננטית לתאי פונדקאי.הרקומביננטית לתאי פונדקאי.

)c)c הרקומביננטיים התאים של הרקומביננטיים סלקציה התאים של סלקציה בעזרת אנטיביוטיקה.בעזרת אנטיביוטיקה.

( יצירת השבט( יצירת השבטcloneclone ה – ) ה – )DNADNA הרקומביננטי משתכפל בתוך תא הרקומביננטי משתכפל בתוך תא

הפונדקאי. כאשר תא הפונדקאי מתרבה, הפונדקאי. כאשר תא הפונדקאי מתרבה, מועברים עותקים של המולקולה מועברים עותקים של המולקולה

הרקומביננטית לצאצאים. בתום סדרה הרקומביננטית לצאצאים. בתום סדרה ( ( clonecloneשל חלוקות תא, מתקבל שבט )של חלוקות תא, מתקבל שבט )

של תאי פונדקאי זהים. כל תא בשבט של תאי פונדקאי זהים. כל תא בשבט DNADNAמכיל לפחות עותק אחד של המכיל לפחות עותק אחד של ה

הרקומביננטי.הרקומביננטי.

DNAבתהליך השיבוט יוצרים אוכלוסיית תאים עם ה הרקומביננטי.

..pBR322pBR322סימני הברירה בפלסמיד סימני הברירה בפלסמיד

לפלסמיד זה שני גנים המקנים לפלסמיד זה שני גנים המקניםלעמידות לשני סוגי אנטיביוטיקה לעמידות לשני סוגי אנטיביוטיקה

ampicillinampicillin ו ו tetracyclintetracyclin . . ה הDNADNA הזר הוחדר באתר הזר הוחדר באתר

. . SSalalllהחיתוך החיתוך הפלסמיד הוחדר לחיידקים הפלסמיד הוחדר לחיידקים

)טרנפורמציה(.)טרנפורמציה(. חיידקים שקיבלו את הפלסמיד חיידקים שקיבלו את הפלסמיד

הזר היו עמידים הזר היו עמידים DNADNAללא ה ללא ה לשני סוגי האנטיביוטיקה.לשני סוגי האנטיביוטיקה.

חיידקים שקיבלו את הפלסמיד חיידקים שקיבלו את הפלסמיד הזר היו עמידים כנגד הזר היו עמידים כנגד DNADNAעם ה עם ה

ampicillinampicillin ולא נגד ולא נגד tetracyclintetracyclin..

..pUC18pUC18סימני הברירה בפלסמיד סימני הברירה בפלסמיד לפלסמיד שני גנים. אחד המקנה עמידות כנגד לפלסמיד שני גנים. אחד המקנה עמידות כנגד

lacZlacZ והשני והשני ampicillinampicillinהאנטיביוטיקה האנטיביוטיקה

-x-xהמקודד לאנזים המפרק חומר חסר צבע -המקודד לאנזים המפרק חומר חסר צבע -

galgal .לתוצר עם צבע כחול. לתוצר עם צבע כחול

ה הDNADNA הזר הוחדר באתר החיתוך הזר הוחדר באתר החיתוך XXbaball..

.)הפלסמיד הוחדר לחיידקים )טרנפורמציה(.הפלסמיד הוחדר לחיידקים )טרנפורמציה

כל החיידקים שקיבלו את הפלסמיד התפתחו כל החיידקים שקיבלו את הפלסמיד התפתחו

. . ampicillinampicillinבצלחת עם האנטיביוטיקה בצלחת עם האנטיביוטיקה

חיידקים בהם נמצאו הפלסמידים עם החיידקים בהם נמצאו הפלסמידים עם הDNADNA

הזר פתחו מושבות לבנות. בעוד אלה שלא הזר פתחו מושבות לבנות. בעוד אלה שלא

הזר פיתחו מושבות כחולות. הזר פיתחו מושבות כחולות. DNADNAשולב בהם השולב בהם ה

X-galX-gal וסובסטרט וסובסטרט ampicillinampicillinתוצאות הזריעה בצלחת המכילה תוצאות הזריעה בצלחת המכילה ))bromo-chloro-indolyl-galactopyranosidebromo-chloro-indolyl-galactopyranoside((..

מקנה צבע כחול מקנה צבע כחול lacZlacZ פרוק סובסטרט זה ע"י האנזים פרוק סובסטרט זה ע"י האנזים •למושבה.למושבה.

חיידקים עם פלסמיד רקומביננטי

חיידקים ללא פלסמיד רקומביננטי

תוצר בעזרת גן תוצר זיהוי בעזרת גן זיהוי גם לאחר שמוצאים את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד •

הרקומביננטי, יש עוד מקום לבדוק האם הגן מתבטא בחיידק? תהליך זה יכול להיעשות ע"י זיהוי התוצרים.•

תיאור השיטה: יוצרים הדפס של המושבות •

ע"ג נייר ניטורצולוז. החלבונים נספחים לנייר.

מדגירים את הנייר עם נוגדן •כנגד החלבון.

שטיפה.• מדגירים עם נוגדן שניוני •

מסומן רדיואקטיבית. שטיפה.• בדיקה באוטורדיוגרפיה.•