1 bruno leonardo de freitas soares efeitos do alprostadil na sÍndrome de isquemia e reperfusÃo em...
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BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARESBRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES
EFEITOS DO ALPROSTADIL NA EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E SÍNDROME DE ISQUEMIA E
REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOSDE RATOS
São PauloSão Paulo20052005
Projeto de Tese apresentado à Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São PauloUniversidade Federal de São Paulo// Escola Paulista de Medicina, para Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em obtenção do título de Mestre em CiênciasCiências
22
1. Introdução 1.1 - Contexto Bywaters, 1941 Bywaters, 1941
Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticastraumáticas
Haimovici, 1960Haimovici, 1960
Síndrome metabólica pós-revascularização Síndrome metabólica pós-revascularização
Haimovici, 1973 Haimovici, 1973
Síndrome mionefropática ou de reperfusãoSíndrome mionefropática ou de reperfusão
Burihan, 1982Burihan, 1982
O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndromesíndrome
Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32.Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32. Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47.Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47. Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44.Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44.Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.
33
1.1- Contexto
Myers, 1986 Myers, 1986
Injúria renal decorre da magnitude e da duração da Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemiaisquemia
Joves, 1982 Joves, 1982
A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda tubular e necrose tubular aguda
Ward, 1988Ward, 1988
Pouco progresso no tratamento a despeito do Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimentoconhecimento
Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97.Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97.
Joves DB. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254.Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254.
Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7 ..
44
1.1- Contexto
Granger, 1988Granger, 1988
Radicais livres de oxigênio e lesão celular Radicais livres de oxigênio e lesão celular
Vargas, 1995Vargas, 1995
Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratosreperfundido em ratos
Kelly, 1996 Kelly, 1996
Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) adesão intercelular tipo 1 (ICAM1)
Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75.Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75.
Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.
Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.
55
1.1- Contexto Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1)Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Vargas, 1995Vargas, 1995
Bloqueio de substâncias quimioatrativas Bloqueio de substâncias quimioatrativas Linderman, 1998 Linderman, 1998
Diminuição da adesividade leucocitária Diminuição da adesividade leucocitária Gupta, 1998Gupta, 1998
Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Linderman, 1998Linderman, 1998
Diminuição da resistência vascular periférica Diminuição da resistência vascular periférica
Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renalProstaglandin E1 attenuation of ischemic renalreperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7.Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion
molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15.molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15.Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and
prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.
66
1.2- Hipótese
O uso do alprostadil, por via intravenosa, O uso do alprostadil, por via intravenosa,
atenua o efeito das lesões metabólicas e atenua o efeito das lesões metabólicas e
histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia
e reperfusão em tecido renal de ratose reperfusão em tecido renal de ratos
77
1.3- Objetivo
Avaliar os efeitos da infusão intravenosa Avaliar os efeitos da infusão intravenosa
do alprostadil num modelo experimental do alprostadil num modelo experimental
de isquemia e reperfusão em tecido de isquemia e reperfusão em tecido
renal de ratosrenal de ratos
88
2. MétodosProjeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/2004.
2.1-Tipo de estudo
- Ensaio clínico aleatório - Ensaio clínico aleatório em animais de em animais de experimentaçãoexperimentação
2.2-Local
2.2.1-Laboratório do 2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BOperatória - FMSP-BAA
99
2. Métodos2.3 –Amostra
Ratos machosRatos machos
Linhagem OUT B WistarLinhagem OUT B Wistar
Idade - 90 a 120 diasIdade - 90 a 120 dias
Peso - 250 a 350 gPeso - 250 a 350 g
15 dias - observação e adaptação15 dias - observação e adaptação
Condições controladasCondições controladas
2.3.1 – Amostragem
Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia
Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BAExperimental e Técnica Operatória da FMSP-BA
1010
2. Métodos
2.4 Procedimentos
2.4.1 - Randomização
- Envelopes- Envelopes
- Sorteio aleatório- Sorteio aleatório
- Examinadores- Examinadores
1111
2.4 Procedimentos
2.4.2 - Grupos experimentais Grupo ShGrupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia
ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento.jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento.
Grupo CtGrupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão.
Grupo AlGrupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.
2. Métodos
1212
2.4 Procedimentos
2.4.3 Modelo experimental Pré operatório
Foram submetidos a jejum (6h)Foram submetidos a jejum (6h)
Foram devidamente pesadosForam devidamente pesados
Submetidos a sorteioSubmetidos a sorteio
Anestesia
Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitonealFenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal
Sono profundoSono profundo
Estímulos dolorosos irresponsivosEstímulos dolorosos irresponsivos
Doses complementares de anestésicoDoses complementares de anestésico
1313
2.4- Procedimentos2.4.3- Modelo Experimental
Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa
Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbearTricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear
Incisão abdominal medianaIncisão abdominal mediana
Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do
segmento abdominal até acima das artérias renaissegmento abdominal até acima das artérias renais
Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al)Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al)
Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al)Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al)
No Grupo Sh não há isquemia e reperfusãoNo Grupo Sh não há isquemia e reperfusão
1414
2.4- Procedimentos
2.4.3- Modelo Experimental
Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusãoAlprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão
Amostras de sangue Amostras de sangue
Nefrectomia esquerda e preparo das peças Nefrectomia esquerda e preparo das peças
Eutanásia – dose anestésica letalEutanásia – dose anestésica letal
1515
2.4 Procedimentos
1616
2.4 Procedimentos
2.4.3 Modelo experimental
Estudo histológico (microscopia ótica)
Hematoxilina eosina Ácido Periódico de Schiff
(PAS) Azul patente (Azul de
Alcion)) Estudo Imunohistoquímico
(Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador)
Amostras de Tecido Renal
1717
2.5.1- Variáveis primárias
2.5.1.1- Estudo imunohistoquímico
Dosagem de Molécula de adesão Dosagem de Molécula de adesão
intercelular do tipo 1 (ICAM-1)intercelular do tipo 1 (ICAM-1)
Análise qualitativa de desarranjo estruturalAnálise qualitativa de desarranjo estrutural
1818
2.5.1- Variáveis primárias
Tecido renal sem isquemia Tecido renal com isquemia e reperfusão
1919
2.4 Procedimentos
Grau I Grau II
2020
2.4 Procedimentos
Grau III Grau IV
2121
2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.2- Estudo histológico Jablonski, 1983
Grau 0: NormalGrau 0: Normal Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmenteGrau 1: Mitoses e necrose de células individualmente Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos
contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveiscontorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo
contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderadocontorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo
contorcido proximal com desarranjo estrutural severo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticialintersticial
2222
2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico2.5.1.2 Estudo histológico
2323
2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico
Grau I Grau II
2424
2.5.1 Variáveis primárias
2.5.1.2 Estudo histológico
Grau III Grau IV
2525
2.5.2 Variáveis secundárias
2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica
Desidrogenase láticaDesidrogenase lática LeucometriaLeucometria
CreatinCreatinaa-fosfoquinase-fosfoquinase PotássioPotássio
Lactato Lactato HemHemoogasimetria gasimetria
Uréia Uréia
Sódio Sódio
CreatininaCreatinina
CálcioCálcio
2626
2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra 2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra
2.6.2- Análise estatística2.6.2- Análise estatística
Análise de variância por postos de Kruskal WallisAnálise de variância por postos de Kruskal Wallis
Teste de Mann-Whitney para duas amostras Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentesindependentes
P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidadenulidade
2.6- Modelo Estatístico
2727
3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias
Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Grau 0 Grau I Grau II Grau III Grau IV
Grupo ShGrupo CtGrupo Al
2828
3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias
Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Grau 0 Grau I Grau II Grau III Grau IV
Grupo ShGrupo CtGrupo Al
2929
3. Resultados3.3 Variáveis Primárias
Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
ausente leve moderada severo
Grupo ShGrupo CtGrupo Al
3030
3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra
Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento.
312
294
306
300
305
310
315
320
325
330
Pes
o (
gra
mas
)
□ Grupo Sh □ Grupo Ct □ Grupo Al
3131
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias
Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.
132 132,7 133,3
5,9 6,9 6,310,4 9,3 10,1
0
20
40
60
80
100
120
140
Sódio Potássio Cálcio
controle SF0,9% alfatocoferol
p=0,1
Grupo Al
Grupo Sh
3232
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias
Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento.
2432,42981,8
3464,2 3715,7
7269,7
4796,1
0
2000
4000
6000
8000
10000
LDH CPK
controle SF0,9% ■ Grupo Al
3333
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias
Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento.
151,3 149,8 153,6
54,648,6 50,4
0
50
100
150
200
pO2 pCO2
controle SF0,9% alfatocoferolAlprostadilControle SF0,9%
3434
3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias
Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento.
35,4
42,157,3
82,886,3
98,2
0
20
40
60
80
100
120
Lactato Uréia
controle SF0,9% ■ Alprostadil
3535
4. Conclusões
O Alprostadil, na dose de 20 microgramasO Alprostadil, na dose de 20 microgramas//kg, kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal renal
Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramasdose de 20 microgramas//kg, não foi capaz de kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo parâmetros utilizados neste estudo
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