2. model sistemi bh 2014

MODEL SISTEMI U MOLEKULARNOJ BIOLOGIJI

Model sistemi• Živi organizmi nad

kojima se vrše eksperimenti

• Izbor model sistema prevashodno zavisi od predmeta i ciljeva istraživanja ali i od karakteristika samih model sistema

• Razne prirodne nauke razni model sistemi

Model sistemi• Model sistem – čovek

• Sa etičkog, socijalnog i moralnog aspekta

POTPUNO NEPRIHVATLJIVO

Model sistemi u molekularnoj biologiji

• Laka eksperimentalna manipulacija i broj• Bakteriofagi• E. coli• Kvasac• C. elegans• D. melanogaster• M. musculus

Bakteriofagi

Bakteriofagi - virusi• Jednostavan sistem za istraživanje bazičnih procesa

molekularne biologije• U periodu razvoja molekularne biologije, pored bakterija,

glavni model sistem• Genom je molekul DNK ili RNK koji svoje gene

eksprimiraju tek nakon infekcije ćelije domaćina – obligatni intracelularni paraziti

Bakteriofagi

• Bakteriofagi su virusi čija je simetrija kompleksna, a veličina im se kreće u granicama od 24 nm do 200 nm.

• Otkrio ih je 1915. godine Englez Frederik Tvort.

• Prvi elektronsko-mikroskopski snimak bakteriofaga načinio je Tom Aderson 1942. godine.

Bakteriofag• Glava• Vrat• Okovratnik• Rep• Bazna ploča• Fibrile• Repne bodlje

Bakteriofagi “gajenje” u bakterijskim kulturama

• Latentni period – od infekcije do umnožavanja virusne nk i formiranja novih kapsida

• Period eksplozije u broju formiranih faga• Formiraju plakove

Litički rast

Nekoliko hiljada kopija DNK virusa

Lizogeni rast

• Umereni fag• Profag

Bakteriofag• Dvolančana DNK• 45 kb do 200 kb • Jednolančana DNK• Dvolančana RNK• Jednolančana RNK• fag - poseduje dvolančani molekul DNK

dužine168.903 bp na kojoj se nalazi 300 gena • M13 - filamentozni bakteriofag sa jednolančanim

molekulom DNK

Bakteriofagi

MODEL SISTEM ZA ISTRAŽIVANJE

• DNK replikacije• Ekspresije gena• Rekombinacija DNK• Ko-infekcija – za analizu mutacija

Značaj u tehnologiji rekombinovane DNKFagna terapija

Bakterije• Homologa populacija ćelija – klon• Razmnožavanje prostom deobom• Ćelijski ciklus kratak – 20 minuta

Naslednost osobinaMutabilnost

Bakterije – model sistem• Escherichia coli – gram -• Vreme generacije 20 minuta • Prekonoćna kultura sadrži oko 2x109 ćel/ml• Haploidna ćelija• Bacillus subtilis - gram +

Bakterije u laboratorijskim uslovima

• Rastu u tečnom ili čvrstom (agaroznom) medijumu u petrijevoj šolji – laboratorija

• Golim okom vidljive kolonije• Eksponencijalan rast do stacionarne faze

Bakterijska ćelija• 0.2 – 60 μm • 70S ribozomi• citoplazmatske vezikule i inkluzije • Zid• Pili• Flagela

Bakterijska DNK• Deo bakterijske ćelije u kojoj se

nalazi DNK molekul - nukleoid• Jedan kružni molekul DNK • “Bakterijski hromozom”• Veličina prokariotskog genoma

proporcionalna broju gena• Mali nekodirajući segmenti DNK -

kod E. coli 11 %

• Nema introna*• Geni organizovani u operone• Plazmidi i transpozoni

Plazmidi• Ekstrahromozomski molekuli DNK koji

imaju sposobnost autonomne replikacije - autonomni replikoni.

• Veličina od 1 kb do 400 kb. • Sadrže gene čiji proteinski produkti

učestvuju u procesu autonomne replikacije plazmidne DNK.

• Kod mnogih plazmida registrovano je prisustvo gena čiji su proteinski produkti odgovorni za razvoj otpornosti (rezistencije) bakterijske ćelije na određene antibiotike.

Bakterijski genom 105 – 107 bp

• Procesi koji mogu imati efekta na veličinu bakterijskog genoma:• Mutacije po tipu delecija i inverzija.• Transpozicija (aktivnost mobilnih genetičkih elemenata u okviru

genoma).• Horizontalni transfer gena - proces prenosa genetičkog

materijala - segmenta DNK molekula iz jedne bakterijske ćelije u drugu

Prenos genetičkog materijala

Donatorska ćelija

Recipijentna ćelija

Fragment DNK

a. inkorporiran u hromozom recipijentne ćelijeb. opstaje u ekstrahromozomskom obliku - plazmid

• HORIZONTALNI GENSKI TRANSFER• Transformacija• Transdukcija• Konjugacija

Transformacija• Prihvatanje slobodne DNK iz spoljašnje sredine i transport

u unutrašnjost ćelije.• Otkriće fenomena transformacije bio je prvi naučni korak u

dokazivanju nosioca naslednih osobina (Frederick Griffith).

Litički Lizogen

Transdukcija• Određeni umereni bakteriofagi kod prelaska iz lizogenog

u litički ciklus imaju mogućnost da “upakuju” fragment bakterijske DNK u kapsid. Takvi fagi nazivaju se transdukujući fagi.

• Transdukujući fagi prenose fragmente bakterijske DNK iz jedne u drugu bakterijsku ćeliju – GENERALIZOVANA TRANSDUKCIJA.

Transdukcija• Ako transdukujući fag (koji sadrži i deo DNK bakterijskog

hromozoma) nanovo pređe iz litičkog u lizogeni ciklus (u novoj bakterijskoj ćeliji) inkorporira bakterijski segment DNK u bakrerijsku DNK nove ćelije domaćina. Ovaj proces naziva se restriktivna transdukcija.

• MehanizamREKOMBINACIJA

Konjugacija• Prenos DNK koji se odvija direktnim kontaktom dve bakterije

• Plazmidi

Konjugacija• F faktor• Prvootkriveni plazmid• Konjugativni plazmidSadrži gene neophodne zaodigravanje konjugacijePROCESa. Kontakt 2 ćelije (preko pila)b. Replikacija plazmidac. Transfer plazmidapreko citoplazmatskogmostića

Mycoplasma genitalium • Klasa: Mollicutes• Bakterije bez ćelijskog zida• Veličina 0.2-0.3 μm • Izolovan iz uretralnog brisa

bolesnika sa uretritisom • Parazit respiratornog i

genitalnog trakta primata• Najmanji poznati genom

580,070 bp• 470 protein kodirajućih gena,

3 rRNK gena, 33 tRNK gena

E. coli

• Domaćin i čovek• 1997. godine “očitan” genom• 4,639,221 bp• 4.288 proteina • Najpoznatiji plazmid – F- faktor

BakterijePrvi prozor molekularne genetike

• Model sistem na kome su otkriveni i/ili dokazani fundamentalni molekularno - biološki procesi: Semikonzeravativan način replikacije molekula DNK, osnovi postulati regulacije procesa transkripcije, mutacije i reper sistemi....

• Tehnologija rekombinovane DNK i ostali metodološki pristupi

Saccharomyces cerevisiae

• Pivski kvasac veličine od 5 m• Jednoćelijski eukariot• Tipičan i najintezivnije istraživan eukariot• Laka eksperimentalna manipulacija• 90 minuta dovoljno da dođe do deobe

Saccharomyces cerevisiae• Haploidne forme a i α (jedna

kopija svakog hromozoma)• Haploidne ćelije opstaju

samo ako su delecijom ili nekom drugom mutacijom pogođeni neesencijalni geni

• Dipolidna forma (dve kopije svakog hromozoma) nastaje fuzijom dve haploidne ćelije kvasca

• Mejozom diploidne ćelije kvasca nastaju 4 produkta tzv. tetrade

• Sporulacija

Saccharomyces cerevisiae

• Najmanji eukariotski genom• 1996. godine “očitan”

genom• 16 hromozoma• 13.000.000 bp (13 Mb)• 6.275 gena (funkcionalno

5.885 gen) • U 231 genu detektovano

prisustvo introna

Saccharomyces cerevisiae

• Regulacija ekspresije gena eukariota• Rekombinacija molekula DNK• Replikacija molekula DNK• Translacija• Obrada primarnog transkripta• Prvi model sistem funkcionalne genomike• Kvaščev veštački hromozom – YAC – eukariotski vektor

Caenorhabditis elegans

• Phylum Nematoda • Model sistem u molekularnoj

biologiji i biologiji razvića od 1965. godine

• Prvi je u eksperimentalnom radu upotrebio Sydney Brenner (Nobelova nagrada 2002).

• Danas se C. elegans, kao model sistem, koristi u stotinama laboratorija širom sveta

Caenorhabditis elegans

• Valjkasti crvi široko rasprostranjeni u prirodi • 1 mm• Bilateralna simetrija• Hermafrodit • 959 ćelija u adultnom hermafroditu• 1031 ćelija u adultnom mužjaku

Caenorhabditis elegans• Embrionalni razvoj 12 sati• 131 ćelija hermafrodita

odnosno 111 ćelija mužjaka tokom embriogeneze umire procesom apoptoze

• Četiri larvena stadijuma (L1-L4),

• Dauer – forma larve rezistentna na sredinske faktore

• Juvenilni oblici i adult• Kompletan životni ciklus 3

dana

Caenorhabditis elegans• 1983. g. John Sulston – mapu ćelija C. elegans• 1986. g. Joch White – EM-snimci svih ćelija

• Mutacije u ćelijama vulve hemafrodita (22 epidermalne ćelije) dovodi do razvoja embriona unutar organizma.

• Detektovano na stotine mutacija koje uzrokuju promene na vulvi

• Neke od tih mutacija “pogađaju” gene čiji su proteinski produkti uključeni u procese prenosa signala i u kontroli ćelijske proliferacije

• Mnogi sisarski analozi ovih gena su onkogeni ili tumor supresorni geni

Caenorhabditis elegans

- Genom sekvenciran 2002. godine- 5 para autozoma i 2 polna hromozoma X- Jedinske sa dva polna hromozoma su

hermafroditi- Nondisjunkcijom, retko, gubi se jedan X

hromozom i takvi crvi postaju mužjaci sposobni da fertilišu jaja hermafrodita

- 100,258,171 bp duga DNK- 19.000 – 20,000 - protein-kodirajućih gena- Prosečno pet egzona po genu

2002. godine - Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu

• Za oktriće procesa regulacije razvića organizma i programirane ćelijske smrti kod Caenorhabditis elegans

• Sydney Brenner, H. Robert Horvitz, John E. Sulston

2006. godine - Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu

• Andrew Zachary Fire • Craig Cameron Mello• 1998. godine• RNK interferencija

Drosophila melanogaster

• Jedan og prvih i glavnih model sistema u biologiji

• 1908.g. Morgan – Columbia University• Istraživanje “naslednosti” • Boje očiju voćnih mušica• Dostupne i lake za laboratorijsku manipulaciju

Drosophila melanogaster

• Veličina vinske mušice do 3 mm• Ženke krupnije od mužjaka• Životni vek kratak i žive oko 2 nedelje

Drosophila melanogaster

• Ženka polaže 400 jaja• Embriogeneza 1 dan• Metamorfoza larvi duga je 5 dana• Adultni oblici nastaju sazrevanjem pupe.

• Larve karakteriše prisustvo imaginalnih diskova, tkiva nastalih invaginacijom epidermisa embriona.

• Svaki od njih ima oko 100 ćelija u embrionu i narasta u formaciju od preko 10.000 ćelija u larvi.

• Od ovih parnih formacija razvijaju se organi adultnih vinskih mušica kao što su oči, antene, genitalije, itd...

• Eksperimentalna manipulacija imaginalnim diskovima predstavlja jedan od najpoznatijih načina istraživanja metamorfoze i embrionalnog razvoja uopšte.

Drosophila melanogaster

• 4 para hromozoma: jedan (X ili Y) polni i tri autozomna obeležena kao 2,3 i 4.

• 1998.g. sekvenciran genom• 122.653.977 bp DNK• 13. 379 gena

Drosophila melanogaster

• 50% proteina D. melanogaster ima svoje sisarske homologe

• Model sistem za istraživanje - neurodegenerativnih bolesti - malignih bolesti - dijabetesa

Genetička sličnost sa H. sapiens

Mus musculus• Najčešći model sistem u molekularnoj biologiji i

medicini

• 14 – 28 g• do 20 cm• do 2 godine

• Najmarkantnija razlika između polova je ta štomužjaci nemaju bradavice

Embriogeneza

13 ICM ćelijaStem ćelije

Kultivacijom sa odgovarajućim faktorima rasta može se indukovati rast svih adultnih tipova ćelija miša

Placenta

Mus musculus

Bazični principiotkriveni kod

C. elegans i

D. Melanogaster

Bolesti čoveka

link

Mus musculus

• Genom “očitan” 2002. godine• 40 hromozoma• 2.267.775.209 bp • do 23.000 gena

“mini čovek”

Transgeni miševi i miševi sa izbačenim genom

Nezaobilazan eksperimentalan model u istraživanjima• Razvoja čoveka• Biologije ponašanje čoveka• Patogeneze bolesti čoveka

neoR TK

Transgeni miševi• Mikroinjekciona metoda• Muški pronukleusi izolovani iz

oplođene jajne ćelije• Gen od interesa inkorporiran u

vektor• Po principu slučajnosti klonirani

gen se raspoređuje po genomu• Jajna ćelija prenosi se u jajovod

“lažno” trudnih ženki• Embrioni sa kopijama

rekombinantne DNK - transgen

Invertni mikroskop ( 400x) i specijalna mikromanipulatorna

injekciona pipeta kojim se fragmenti molekula DNK insertuju u pronukleuse

Transgeni miševi• Transgeni se ugrađuju i u

somatske i u polne ćelije te se prenose i na potomstvo

• Proizvodnja linija transgenih miševa

• Model sistemi za istraživanje različitih aspekata funkcije gena i njihovih produkata

“Knockout” miš Miševi sa izbačenim genom

• Za razliku od transgenih miševa kod kojih je ugrađen novi genski materijal, mogu se “proizvesti” i životinje kod kojih neki gen nedostaje ili je nefunkcionalan.

• Proizvodnja takvih životinja zasniva se na postupku kojim se normalni gen in vitro “zamenjuje” mutiranim genom.

• Vrlo koristan model sistem – daju odgovore na pitanja kako nedostatak nekog gena utiče na različite funkcije u ćeliji, tkivu.... Organizmu.

“Knockout” miš• Kultivacija embrionalnih stem

ćelija• Homolognom rekombinacijom

“dobija se” mutirana / inaktivna kopija željenog gena

• Selektovane embrionalne matične ćelije koje sadrže promenjeni gen prenose se u novu blastocistu a ona se unosi u matericu “lažno” trudne ženke

Miševi sa izbačenim genom• Homolognom rekombinacijom se u ciljnu sekvencu

inkorporira gen za rezistenciju na lek npr. antibiotik neomicin.

• Fragmente sa normalnim alelima, kod kojih se nije odigrala rekombinacija, ubija neomicin

• Marker nehemologe rekombinacije je gen za timidin kinazu čiji proteinski produkt fosforiliše ganciklovir.

• Fragmenti koji su rezultat nehomologne rekombinacija “poseduje” i gen za timidin kinazu.

• Ovi fragmenti se “anuliraju” rastom u medijumu sa ganciklovirom.

• Fosforilisani ganciklovir je nukleotidni analog. Njegovo inkorporiranje u DNK, tokom sinteze DNK, dovodi do smrti ćelije.

“Knockout” miš

• Preživljavaju samo DNK fragmenti koji su rezultat rekombinacije sa genom za rezistentnost na neomycin i bez gena za timidin kinazu