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1 Analitica 26 16/17
APPLICAZIONI DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE
26
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2 Analitica 26 16/17
Le misure di assorbimento nelle regioni visibile ed ultravioletta
dello spettro forniscono informazioni qualitative e quantitative su
molecole organiche, inorganiche e biochimiche.
Specie molecolari che assorbono la radiazione ultravioletta e visibile
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3 Analitica 26 16/17
Assorbimento da parte di composti organici
Sono due i tipi di elettroni responsabili dell’assorbimento
della radiazione ultravioletta e visibile da parte di
molecole organiche:
➲ elettroni condivisi che partecipano direttamente alla
formazione del legame
➲ elettroni esterni non condivisi che sono localizzati intorno ad atomi come ossigeno, alogeni, zolfo e azoto
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4 Analitica 26 16/17
Gli elettroni condivisi in legami singoli come quello caronio-
carbonio o carbonio-idrogeno sono così fortemente legati che
l’assorbimento si ha solo in una regione dello spettro
ultravioletto (λ <180nm).
In suddetta regione assorbono anche i componenti dell’aria; la
regione è detta ultravioletto del vuoto.
Assorbimento da parte di composti organici
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5 Analitica 26 16/17
Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente e sono perciò più
facilmente eccitati dalla radiazione; le specie con legami
insaturi mostrano picchi di assorbimento utili nella regione
ultravioletta facilmente accesibile (>180nm).
Assorbimento da parte di composti organici
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6 Analitica 26 16/17
Assorbimento da parte di composti organici
I gruppi funzionali insaturi organici che assorbono nelle regioni
dell’ultravioletto e del visibile sono detti cromofori.
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7 Analitica 26 16/17
Caratteristiche di assorbimento di alcuni tipici cromofori organici
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8 Analitica 26 16/17
Gli ioni e i complessi di elementi delle prime due serie di transizione assorbono bande ampie di radiazione visibile in almeno uno dei loro stati di ossidazione.
Assorbimento da parte di specie inorganiche
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9 Analitica 26 16/17
Per scopi quantitativi l’assorbimento a trasferimento di
carica è particolarmente importante perché le assorbanze
specifiche molari sono inusualmente grandi (εmax>10000)
e portano di conseguenza una alta sensibilità.
Molti complessi inorganici ed organici esibiscono questo
tipo di assorbimento e sono detti complessi a
trasferimento di carica.
Assorbimento a trasferimento di carica
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10 Analitica 26 16/17
Un complesso a trasferimento di carica consta di un gruppo
elettron donatore legato ad uno elettron accettore.
Quando questo prodotto assorbe radiazione un elettrone dal
donatore è trasferito all’accettore.
Lo stato eccitato è così il prodotto di un genere di processi
ossido-riduttivi interni.
Assorbimento a trasferimento di carica
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11 Analitica 26 16/17
Specie molecolari che assorbono la radiazione infrarossa
Fatta eccezione per pochi composti omonucleari come O2, Cl2 e N2
tutte le molecole organiche ed inorganiche assorbono radiazione
infrarossa.
L’assorbimento di tale radiazione comporta transizioni fra i livelli
energetici vibrazionali dei più bassi livelli energetici elettronici delle
molecole.
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12 Analitica 26 16/17
Specie molecolari che assorbono la radiazione infrarossa
Il numero di modi in cui una molecola può vibrare è legato al numero di legami che essa contiene e al numero di atomi che la costituiscono.
Spettro infrarosso per l’n-butanale
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13 Analitica 26 16/17
Spettroscopia di assorbimento molecolare
La spettroscopia di assorbimento nell’ultravioletto/visibile è utilizzata
soprattutto per l’analisi quantitativa.
La spettroscopia di assorbimento nell’infrarosso è invece uno strumento potente per la determinazione qualitativa di composti sia organici che
inorganici.
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14 Analitica 26 16/17
◆ estesa applicabilità ◆ buona sensibilità ◆ limiti di rivelazione da 10-4 a 10-7 M ◆ selettività da moderata ad alta ◆ ragionevole accuratezza e precisione ◆ velocità e convenienza
Caratteristiche importanti della spettrofotometria ultravioletto/visibile
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15 Analitica 26 16/17
Applicazioni a specie assorbenti
La determinazione spettrofotometrica di composti organici contenenti uno o
più gruppi cromofori è effettuabile così come lo è anche quella di specie
inorganiche in grado di assorbire la radiazione ultravioletta e visibile.
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16 Analitica 26 16/17
Applicazioni a specie non assorbenti
La determinazione spettrofotometrica per questa
classe di analiti può essere effettuata previa reazione
con reagenti cromofori che porta alla produzione di
specie che assorbono fortemente nelle regioni
ultraviolette e visibile.
E’ importante che la reazione con l’analita da parte dei reagenti sia forzata a completezza.
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17 Analitica 26 16/17
Reagenti inorganici tipici sono: ◆ ione tiocianato per ferro,cobalto e molibdeno ◆ lo ione ioduro per bismuto, palladio e tellurio Tra i reagenti chelanti organici (che formano complessi colorati stabili con i cationi) ricordiamo: ◆ dietilditiocarbammato per il rame ◆ difeniltiocarbazone per il piombo ◆ 1-10-fenantrolina per il ferro ◆ dimetilgliossima per il nichel
Applicazioni a specie non assorbenti
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18 Analitica 26 16/17
Condizioni necessarie per avere una relazione riproducibile tra assorbanza e concentrazione dell’analita
➲ selezione della lunghezza d’onda ➲ variabili che influenzano l’assorbanza ➲ pulizia e maneggio delle cuvette
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19 Analitica 26 16/17
➲ determinazione della relazione tra assorbanza e concentrazione ➲ metodo dell’aggiunta standard ➲ analisi di miscele
Condizioni necessarie per avere una relazione riproducibile tra assorbanza e concentrazione dell’analita
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20 Analitica 26 16/17
Selezione della lunghezza d’onda
Per ottenere la massima sensibilità le misure di assorbanza spettrofotometriche sono ordinariamente eseguite ad una lunghezza d’onda corrispondente ad un picco di assorbimento.
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21 Analitica 26 16/17
La variazione di uno spettro di assorbimento è dovuta al tipo di solvente utilizzato, al pH della soluzione, alla temperatura, alla concentrazione dell’analita e alla presenza di sostanze interferenti. Gli effetti di queste variabili devono essere perfettamente conosciute.
Variabili che influenzano l’assorbanza
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22 Analitica 26 16/17
E’ sempre richiesto l’uso di cuvette accoppiate di elevata qualità. Esse dovrebbero essere calibrate tra loro per rivelare eventuali differenze causate da graffi, impronte, o più in genere dall’uso.
Pulizia e maneggio delle cuvette
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23 Analitica 26 16/17
Determinazione della relazione fra assorbanza e concentrazione
Gli standard di calibrazione per una analisi spettrofotometrica e
fotometrica dovrebbero approssimare quanto più possibile la
composizione complessiva del campione reale.
Tuttavia quasi mai è possibile assumere l’aderenza alla legge di
Beer; meno prudente ancora è basare i risultati su un valore
riportato in letteratura.
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24 Analitica 26 16/17
Il metodo dell’aggiunta standard
Le difficoltà legate alla preparazione di standard con una
composizione complessiva che approssimi strettamente
quella del campione sono enormi se non insormontabili;
in tali circostanze l’approccio dell’aggiunta standard può
essere utile.
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25 Analitica 26 16/17
L’assorbanza totale di una soluzione ad una qualsiasi lunghezza d’onda è uguale
alla somma delle assorbanze dei componenti individuali presenti nella soluzione.
Analisi di miscele
Nella figura a fianco viene riportato lo spettro di
una soluzione contenente una miscela della
specie M e della specie N insieme agli spettri di
assorbimento delle componenti individuali.
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26 Analitica 26 16/17
Per analizzare la miscela, le assorbanze specifiche molari per M e N
sono precedentemente determinate alle lunghezze d’onda λ1 e λ2 con
un numero di standard sufficiente ad assicurare il rispetto della legge
di Beer in un intervallo di assorbanze che comprende anche
l’assorbanza del campione.
Per completare l’analisi si determina l’assorbanza della miscela a queste due lunghezze d’onda.
Analisi di miscele
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27 Analitica 26 16/17
Le miscele contenenti più di due specie che assorbono dovrebbero
essere analizzate (almeno in teoria) effettuando una misurazione
aggiuntiva di assorbanza per ogni componente aggiunto.
Le incertezze nei dati risulterebbero però più grandi man mano che
aumenta il numero delle misure.
Analisi di miscele
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28 Analitica 26 16/17
Applicazioni della spettroscopia di assorbimento nell’infrarosso
La spettroscopia infrarossa è applicabile sia per l’analisi
qualitativa che per l’analisi quantitativa.
Le applicazioni qualitative sono però di gran lunga le più importanti.
Spettrometri dispersivi
Spettrometri in Trasformata di Fourier
Fotometri a filtro
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29 Analitica 26 16/17
Spettrometri in trasformata di Fourier
Non contegono elementi dispersivi e tutte le lunghezze
d’onda sono rivelate e misurate contemporaneamente.
PER SEPARARE LE LUNGHEZZE D’ONDA E’ NECESSARIO MODULARE IL SEGNALE DELLA
SORGENTE CHE ATTRAVERSA IL CAMPIONE, in
modo che esso possa essere regis trato come
INTERFEROGRAMMA.
L’interferogramma è successivamente decodificato con
una trasfprmata di Fourier.
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30 Analitica 26 16/17
Spettrometri in trasformata di Fourier
D u e i n t e r f e r o m e t r i p a r a l l e l i , u n o p e r modulare la radiazione IR proveniente dalla sorgente pr ima che attraversi il campione e u n s e c o n d o p e r modulare la luce rossa proveniente dal laser HE-Ne che fornisce un segnale di riferimento per l’acquizione dei dati derivanti dal rivelatore IR.
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31 Analitica 26 16/17
Spettri prodotti con uno spettrometro FTIR
Spettro IR del cloruro di metilene
Segnale in uscita (interferogramma) in funzione del tempo o spostamento dello specchio mobile
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32 Analitica 26 16/17
Applicazioni qualitative
La spettroscopia infrarossa è un potente metodo a disposizione del chimico per identificare e determinare la struttura di specie organiche, inorganiche e biochimiche poiché tutte le specie molecolari eccezione fatta per alcuni composti omonucleari (idrogeno, ossigeno e azoto) assorbono tale radiazione.
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33 Analitica 26 16/17
Applicazioni quantitative
Le applicazioni quantitative della spettroscopia infrarossa sono più
limitate di quelle analoghe ottenute con la radiazione ultravioletta/visibile
in virtù delle basse assorbanze specifiche molari, della larghezza esigua
dei picchi infrarossi e delle difficoltà strumentali nel misurare
accuratamente le trasmittanze.
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34 Analitica 26 16/17
Misure di assorbanza
L’uso di cuvette appaiate non è conveniente nell’infrarosso a causa delle difficoltà di avere celle con caratteristiche di trasmissione identiche. Tale difficoltà deriva dalla degradazione, dovuta all’uso, della trasparenza delle finestre delle celle per infrarosso dovuta all’attacco di tracce di umidità nell’atmosfera e nei campioni. Inoltre il cammino ottico è difficile da riprodurre perché le celle per infrarosso hanno uno spessore < 1mm.
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35 Analitica 26 16/17
Applicazioni tipiche
Oltre ad avere la capacità di determinare un numero
insolitamente elevato di sostanze visto che tutte le specie
molecolari assorbono in questa regione, l’unicità di uno
spettro infrarosso fornisce un grado di specificità
eguagliato o superato da pochi altri metodi analitici.
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36 Analitica 26 16/17
Errori nelle analisi spettrofotometriche
Sono stati paragonati due strumenti: lo Spectronic 20 ed il Cary 118 che è più costoso e viene utilizzato nell’ambito della ricerca.Dalla figura sottostante si evince che lo Spectronic 20 genera errori elevati anche quando l’assorbanza misurata è>1.2 mentre con il Cary 118 questo errore scompare.
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37 Analitica 26 16/17
Fotometri
Nei casi in cui non è richiesta un’alta purezza spettrale (come spesso accade) l’accuratezza e la precisione offerte dal fotometro raggiungono quelle fatte da uno spettrofotometro. Gli svantaggi maggiori dei fotometri sono la minore versatilità, l’incapacità a produrre spettri interi e la più ampia larghezza di banda effettiva.
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38 Analitica 26 16/17
Fotometri
Viene qui di seguito riportato a titolo di esempio uno schema ottico di un fotometro infrarosso portatile progettato per la determinazione quantitativa di inquinanti organici nell’atmosfera.
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39 Analitica 26 16/17
Fotometri
La sorgente del fotometro prima illustrato è una barretta di ceramica avvolta da un filo di nichel-cromo e il trasduttore è un rivelatore piroelettrico. Il cammino ottico nella cella è 0.5 m ma una serie di specchi riflettenti (non mostrati in figura) incrementa la lunghezza della cella fino a 20.5 m. Questa caratteristica aumenta enormemente l’intervallo di concentrazioni accessibili allo strumento.
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40 Analitica 26 16/17
Fotometri
Il fotometro infrarosso portatile presentato nei lucidi precedenti è sensibile a pochi decimi di parte per milione di sostanze quali acrilonitrile, idrocarburi clorurati, monossido di carbonio, fosgene e cianuro di idrogeno.
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