荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用
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荷斯坦奶牛隐性遗传疾病检测技术的建立及应用
报告人:张滢寅作者: 王成导师:张淑君教授
1
3
背景
2 材料和方法
结果
4 讨论
一、背景 隐形遗传疾病: ♣ 有害基因传代 繁殖、生长及经济
性状缺陷
♣ 人工授精、胚胎移植等现代繁殖技术 扩大危害范围 ♣ 国内检测技术缺乏,国外费用昂贵
♣ 很有必要建立一种准确、快速而且成本较低的遗传疾病鉴定方法♣ 对奶牛群进行检测
♣ 淘汰有害基因♣ 为健康的选育提供依据
疾病 DUMPS BLAD CVM
致病基因 UMPS CD18(β亚基 ) 基因 SLC35A3
碱基突变 C405-T405 A383-G383 Exon4:G-T
氨基酸转换 精氨酸 -终止密码 天门冬氨酸 -甘氨酸
缬氨酸 -苯丙氨酸
功能缺失 不能催化乳清酸转为尿甘酸
整合素表达明显减少或缺乏
核苷酸糖转运酶不足
酶切位点 AvaⅠ酶切位点消失
TaqⅠ酶切位点消失
无
致病分子机理:
二、材料和方法
材料 132 份精液样本; 417 头荷斯坦牛的血液样本
方法
提取 DNA
引物设计 退火温度摸
索
对所有样本进行疾病检测
筛选出有害基因携带者
AS-PCRCRS-PCR
PCR-RFLP测序
验证
结果
返回
Allele-specific PCR
根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计 PCR 引物, 其中一条引物根据突变位点邻近序列设计, 人为引入错配碱基, 使得引物 3’端和单碱基突变的一种突变型在 PCR扩增后形成一个酶切位点, 其 PCR 产物可用类似 PCR-RFLP方法进行分析。
返回
Created Restriction Site PCR
三、结果
AS-PCR
CRS-PCR
RFLP 测序
扩大样本检测及应用
建立
应用
验证 验证
1 、 DUMPS(尿苷酸合酶缺乏症)
扩增条件:两引物分开扩
Tm : 63.3℃
1-4 :健康个体( 90bp ); 5 :携带者( 261bp/90bp ); M : Marker
1.1 AS-PCR:
1.2 利用 RFLP和测序技术验证:
PCR 扩增结果:目的片段为 358bp
CC:健康个体; CT : DUMPS携带者; M : MarkerI
DUMPS 携带者测序结果 健康个体测序结果
所建技术准确、可靠
1.3 扩大样本检测 549 个:( 417个奶牛样本和 132个精液样本)
基因型Genotype
样本数Number
基因型频率Genotype frequency
等位基因频率Allele frequency
T C
CT 1 0 . 0018 0.0009 0.9991
CC 548 0.9982
合计 549 1.0
2 、 BLAD(白细胞黏附缺陷病)
扩增条件:两引物分开扩 Tm : 65℃
1-2 健康个体 818bp ;3 :携带者为 818bp/500bp ;M : Marker
2.1 AS-PCR:
2.2 利用 RFLP技术验证:
PCR 扩增结果:目的片段为 961bp
酶切结果:AA :健康个体;M : MarkerI
2.3 扩大样本检测: 549个( 417个奶牛样本和 132个精液样本)
无 BLAD有害基因
PCR 扩增结果:目的片段为 225bp
AA:健康个体;AB: CVM携带者;M : MarkerI
3 、 CVM(脊椎畸形综合症)3.1 CRS-PCR:
CVM 携带者测序结果 健康个体测序结果
3.2 利用测序技术验证: 该方法准确、可靠
基因型Genotype
样本数Number
基因型频率Genotype
frequency
等位基因频率Allele frequency
T G
GT 10 0.029 0.015 0.985
GG 332 0.971
合计( Tota
l )
342 1.0
3.3 扩大样本检测: 549个( 417个奶牛样本和 132个精液样本)
单管 AS-PCR技术
四、讨论
准确、快速、大规模应用
两步 AS-PCR 技术
PCR-RFLP 技术
减少了引物设计和条件摸索的难度,更稳定
比较
比较
难度减低快速低成本
三种隐形遗传疾病在公牛群携带情况表
DUMPS 美国1984 1990
2%0.2%-2.5%
BLAD
美国1992 1999
14.1% 9.6%
波兰1995-1997
1998-1999
2000-2001
2002-2003
2004-2006
7.9% 4.0% 2.1% 1.8% 0.8%
德国1997 2007
9.4% 0.3%
CVM 德国2002 2007
8.3% 2.3%
表明分子标记辅助选择能够从根本上降低有害基因频率
• 非常感谢导师张淑君教授
• 感谢实验室各位老师
• 感谢武汉市畜牧兽医研究所刘晓华老师
• 感谢张老师小组的所有成员和实验室的 同学
致谢
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