antigen-antitelo reakcije

ANTIGEN-ANTITELOREAKCIJE

Plan

• Ag-At reakcije (opšte osobine)

• Imunoaglutinacija

• Imunoprecipitacija

• Ag-At reakcije sa obeleženim reagensima

• Ag-At reakcije zavisne od komplementa

Ag-At reakcije su laboratorijske reakcije između antigena i odgovarajućih specifičnih antitela

Tradicionalno se zovu i serološke reakcije

1. Kvalitativne

2. Kvantitativne

Ispituje se prisustvo ili antigena (korišćenjem poznatog antitela) ili antitela (korišćenjem poznatog antigena) u uzorku (npr. serumu)

TITAR je mera količine specifičnih antitela i predstavlja vrednost (recipročnu) najvećeg razblaženja seruma koji daje pozitivnu

reakciju

POZITIVAN

NEGATIVAN

Ag - KONCENTRACIJA (npr. 2 mg/ml)

At - TITAR (npr. 1/80)

Mogu da budu:

Rezultat:

IMUNOAGLUTINACIJA

IMUNOAGLUTINACIJA je reakcija između korpuskularnog

(nerastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih

antitela

Antigen je najčešće na površini ćelije (npr. bakterije) ili je

solubilan molekul vezan za inertnu nesolubilnu česticu

(nosač)

Rezultat reakcije je aglutinat, vidljiva struktura nastala

zgomilavanjem tj. aglutinacijom čestica

Optimalno stvaranje aglutinata javlja se u zoni

ostvarivanja

ekvivalentnog odnosa između antitela i antigena

VIŠAK ANTIGENAVIŠAK ANTITELA

EKVIVALENTAN(OPTIMALAN)

ODNOS

Ag-At KOMPLEKSI:

AGLUTINACIJA:

REZULTAT:

MALI

NE POSTOJI

NEPOUZDAN(LAŽNO NEGATIVAN)FENOMEN PROZONE

VELIKI

POSTOJI

POUZDAN(POZITIVAN)

MALI

NE POSTOJI

NEPOUZDAN(LAŽNO NEGATIVAN)

IMUNOAGLUTINACIJA

INDIREKTNA(pasivna)

DIREKTNA

Detekcija Ag

Detekcija At

Detekcija At (Ag vezan za nosač)

Detekcija Ag (At vezano za

nosač)

Krajnja identifikacijabakterija

(enterobakterije)

BAB test(brucele)

Lateks RF test(reumatoidni

faktor)

HBsAg test(hepatitis B virus)

Primena (Primer)

IMUNOPRECIPITACIJA

IMUNOPRECIPITACIJA je reakcija između solubilnog

(rastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih antitela

Antigen je najčešće neki produkt mikroorganizma (npr. toksin) ili

protein plazme i drugih telesnih tečnosti (imunoglobulini,

komponente komlementa itd.)

Rezultat reakcije je precipitat (talog), tj. dolazi do izdvajanja

antigen-antitelo komkpleksa u vidu taloga

Do formiranja precipitata dolazi u zoni ostvarivanja ekvivalentnog

(optimalnog) odnosa koncentracija antitela i antigena

Metodi imunoprecipitacije mogu da se odigravaju u:

tečnoj sredini

polučvrstoj sredini (gelu)

slobodnom difuzijom (talog se formira posle nekoliko minuta)

slobodnom difuzijom (talog se formira posle više dana)pomoću električne struje (talog se formira posle nekoliko sati)

IMUNOPRECIPITACIJA

U POLUČVRSTOJ SREDINI (GELU)

U TEČNOJ SREDINI

RING test(Kvalitativna)

Nefelometrija(Kvantitativna)

Dvostruka imunodifuzija(Kvalitativna)

RID test(Kvantitativna)

Askolijeva reakcija(antraks)

određivanje koncentracije

proteina u serumu(Ig, komponente C‛)

Elekova proba(difterija)

PRIMER

određivanje koncentracije

proteina u serumu(Ig, komponente C‛)

Interfacijalni (interfazni) test prstena – RING test(princip)

Nefelometrija(princip)

Dvostruka imunodifuzija u gelu – Elekova proba (princip)

RID

IgG

1

2

3

4 5

Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test(princip)

1 standard poznate koncentracije

2 standard poznate koncentracije

3 standard poznate koncentracije

4 uzorak pacijenta

5 uzorak pacijenta

At u gelu

Ag u rupice:

Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test(princip)

Ag – koncentracija (g/l)

D2 (mm2)

1

2

3

4 5

ANTIGEN-ANTITELOREAKCIJE SA OBELEŽENIM

REAGENSIMA

ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE SA OBELEŽENIM ANTITELIMA

M

Fc

Fab

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) - marker ENZIM

IMUNOFLUORESCENCIJA (IF) - marker FLUORESCENTNA BOJA

RADIOIMMUNO ASSAY (RIA) - marker RADIOAKTIVNI IZOTOP

AtM - marker

Fab

Enzimski imuno-test(ELISA)

Marker je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)

Obavlja se u pločama za mikrotitraciju (pločama sa 96 rupica)

Signal se detektuje kolorimetrijski (pomoću spektrofotometra)

Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipično u serumu)

Bazira se na principu promene boje supstrata pod dejstvom enzima

Može da bude kvalitativna ili kvantitativna

ELISA(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 1)

ELISA(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 2)

ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)

neobeleženaAg-specifičnaAt

uzorak(serum)Ag

Inkubacija

12

6

Ispiranje

ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)

Inkubacija

12

6

Ispiranje

E

EE

E

E

obeleženaAg-specifičnaAt

ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)

Kolorimetrijska detekcija

12

6 E E

dodavanje supstrata

ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

Antigen kojim je obložena ploča

Ispitivani serum

InkubacijaIspiranje

6

12

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

ObeleženaIg-specifična At

EE

E

E

E

E

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

Inkubacija

EE

E

E

E

E

12

6

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

Ispiranje

EE

E E

EE

E

E

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

E

E E

E

12

6

Kolorimetrijska detekcija

ELISA detekcija antitela (detekcija At u serumu pacijenta)

Imunofluorescencija(IF)

Marker je fluorescentna boja (fluorohrom), a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)

Obavlja se obično na mikroskopskim pločicama

Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa

Koristi se za detekciju antigena u čvrstim uzorcima (npr. na ili u ćeliji/tkivu) ili antitela (tipično u serumu)

Bazira se na principu emitovanja boje pod dejstvom UV svetla

Može da bude samo kvalitativna i eventualno semi-kvantitativna

IMUNOFLUORESCENCIJA

INDIREKTNA (IIF)(obeleženo sekundarno At)

DIREKTNA (DIF)(obeleženo primarno At)

Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima

Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima

Detekcija At u serumu

specifičnost

osetljivost

Imunofluorescencija(primer 1)

Helicobacter pylori Borrelia burgdorferi

Imunofluorescencija(primer 2)

Neutrofili

Imunofluorescencija(primer 3)

Glomerulonefritis

DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

F

FF

F

fiksiraniuzorak

obeleženaAg-specifična

At

F

FF

F

InkubacijaIspiranje

12

6

DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

F F

Ekscitacija

Fluorescencija

DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

fiksiraniuzorak

neobeleženaAg-specifična

At

InkubacijaIspiranje

6

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

Inkubacija

ObeleženaIg-specifična AtF

F

F

F

F

FF

F

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

Inkubacija

FF

F

F

F

FF

F

12

6

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

Ispiranje

FF

F F

FF

F

F

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

F

F F

F

Ekscitacija

Fluorescencija

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija Ag u čvrstom uzorku)

fiksiraniantigen

Ispitivani serum

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

InkubacijaIspiranje

6

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

Inkubacija

ObeleženaIg-specifična AtF

F

F

F

F

FF

F

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

Inkubacija

FF

F

F

F

FF

F

12

6

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

Ispiranje

FF

F F

FF

F

F

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA (detekcija At u serumu pacijenta)

F

F F

F

Ekscitacija

Fluorescencija

Radio-imunotest(RIA)

Marker je radioaktivni izotop (npr. 125I), a obeležen je ili antigen iliantitelo

Problem zbog rada sa radioaktivnošću i odlaganja otpada

Signal se detektuje pomoću brojača (broj raspada)

Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili antitela (tipično u serumu)

Bazira se na principu radioaktivnosti

Vrlo osetljiv kvantitativan test

Antigen-antitelo reakcije zavisne od komplementa

Ag-At reakcija in vitro koje postaju detektabilne (merljive) usled aktivacije prisutnog komplementa

Koriste se za:

1. Funkcionalno ispitivanje komplementa Test titracije komplementa

2. Detekciju antigena ili antitela Reakcija vezivanja komplementa (RVK) Mikrocitotoksični test (HLA tipizacija)

Test titracije komplementa(Funkcionalno ispitivanje komplementa)

Postupak za određivanje ukupne hemolizne aktivnosti C’

Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih anti-eritrocitnim antitelima) u toku aktivacije klasičnog puta

Izražava se u:

CH50 jedinicama u ml (spektrofotometrijski na osnovu optičke gustine oslobođenog hemoglobina)

CH100 jedinicama u ml (golim okom)

Reakcija vezivanja komplementa(Test fiksacije komplementa)

Postupak za određivanje specifičnih antitela (npr. za respiratorne

viruse) u serumu pacijenata

Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih anti-eritrocitnim antitelima) usled aktivacije komplementa nastalim Ag-At kompleksima

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter31/animation_quiz_4.html

Reakcijavezivanja

Komplementa(princip)

Pozitivan

Negativan

Nema lize Er

Taloženje Er

Liza Er

Serum saantitelima

Serum bezantitela

Antigenvezan

Antigenslobodan

Komplement

vezan(aktiviran)

Komplement

slobodan(neaktivira

n)

Serum

Antigen

+

+

Komplement

+

Senzibilisani Er(indikator)

Rezultat

Nemakompleme

nta

Komplement

aktiviran

=

Liza eritrocita

negativan

Odsustvo lizeeritrocita

(eritrocitnodugme)

pozitivan

Brzi test za otkrivanje trudnoće

(demonstracija)

BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (princip)

detekcija beta HCG u urinu trudne žene

koriste se tri vrste antitela:

1. anti-HCG antitelo - obeleženo koloidnim zlatom (slobodno)

2. anti-HCG antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)

3. anti-imunoglobulinsko antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)

pozitivan

uzorak (urin)

negativan

uzorak (urin)

+

–

BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (rezultati)

pozitivan

uzorak (urin)

Z Z Z

Z

difuzija

Z

Z Z

difuzija

Z

HCG

obeleženoanti-HCG

At

neobeleženoanti-HCG

At

anti-IgAt

+

uzorak(urin)

Z

Z

BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (pozitivan rezultat)

Z

negativan

Z Z ZZ

difuzija Z Z

difuzija

ZZ Z

–

BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE (negativan rezultat)

uzorak (urin)

uzorak(urin) neobeleženo

anti-HCGAt

anti-IgAt

obeleženoanti-HCG

At

http://bio-alive.com/animations/immunology.htm