approche a la phytopathologie associee a la …
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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU
DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE
Option : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE
Présenté par : FALIHERINIAINA Mamy Lalaina
Maître ès-Sciences
Soutenu publiquement ce 13 Mars 2015 devant le Jury composé de :
Président : Professeur RALAMBORANTO Laurence
Examinateurs : Docteur RAZAFINDRAZAKA Vonimanitra
Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina
Encadreurs : Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry
Docteur RANDRIANIERENANA Ando
APPROCHE A LA PHYTOPATHOLOGIE ASSOCIEE A
LA GERMINATION IN VITRO DU Theobroma cacao
DE LA VARIETE Criollo
Table des matières
« Tout est possible à celui qui croit »
Marc 9 :23
REMERCIEMENTS
Je rends grâce à Dieu tout puissant qui, par son Eternel Amour et sa Bénédiction me guide chaque
jour et me donne la force pour accomplir ce présent travail.
Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements à :
Madame Suzanne RAKOTO-RATSIMAMANGA URVERG. Professeur titulaire de la Faculté
de Médecine et Présidente de la fondation RATSIMAMANGA ;
Au Docteur KIBAN-CHEUK. Directeur du Département Biomédical, Co-promoteur du projet
« Biodiversité et Biotechnologie »au sein de l’IMRA ;
Au Docteur Christian RABEMANANTSOA. Maître de Recherche et coordinateur pour l’IMRA
dans l’unité de Biodiversité, de nous avoir accueillis à bras ouvert au sein de l’Institut
Malgache de Recherches Appliquées.
Au Professeur RALAMBORANTO Laurence. Professeur titulaire en Biochimie Médicale au
Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, qui a bien voulu me faire l’honneur de
présider ce mémoire et d’avoir donné ses précieuses suggestions dans l’amélioration de ce
travail.
Au Docteur RAZAFINDRAZAKA Vonimanitra. Maître de Conférences au Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée et au Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina.
Maître de Conférences et responsable des laboratoires au sein de l’Université ASJA, qui ont
accepté de siéger parmi les membres du jury en tant qu’examinateurs. Leurs
recommandations ont été très indispensables pour l’amélioration de ce travail.
Au Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry. Docteur en Médecine et en Sciences de la vie
(Biotechnologie-Microbiologie) et responsable au sein du laboratoire LBM (unité
Biotechnologie), qui a bien voulu accepter de m’encadrer dans ce travail, pour sa
disponibilité, ses conseils et instructions malgré ses occupations et au Docteur
RANDRIANIERENANA Ando. Maître de Conférences et Chef de Département de Biochimie
fondamentale et appliquée, pour ses soutiens, ses remarques et ses suggestions et pour son
temps en dépit de ses lourdes responsabilités. Qu’elle trouve ici l’expression de ma haute
considération.
Nous addressons également nos vives reconnaissances :
A tous les enseignants de la Faculté des Sciences
A tous les personnels du laboratoire Biodiversité IMRA
A Monsieur ANDRIANTAHINARINJAKA D.T de m’avoir encouragé tout au long de ce travail
et aussi de m’avoir aidé à finaliser ce mémoire, qu’il trouve ici le témoignage de ma profonde
tendresse.
A mes parents, mes sœurs pour leur soutien aussi moral, physique que financier.
A tous mes amis de la promotion BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE
Table des matières
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENT
GLOSSAIRE i
LISTE DES ABREVIATIONS ii
LISTE DES TABLEAUX iii
LISTE DES FIGURES iv
INTRODUCTION 1
1ère
PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : CARACTERISQUES DU THEOBROMA CACAO
I.1 Position systématique 3
I.2 Description botanique 3
I.2.1 Appareil vegetative 5
I.2.1.1 Système racinaire 5
I.2.1.2 La feuille 5
I.2.1.3 Les tiges 5
I.2.2 Appareil reproducteur 5
I.2.2.1 Fleurs et inflorescences 5
I.2.2.2 Fruits et graines 6
I.3 Biologie et écologie 6
I.3.1 Biologie 6
I.3.1.1 Cycle de vie 6
I.3.2 Ecologie 7
I.4 Valeurs nutritionnelles 7
Chapitre II: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
II.1 Généralités 9
II.2 Principes et bases de la culture in vitro 9
II.3 Milieu de culture 10
II.4 L’hormone de la germination 10
II.5 Acclimatation en serre 10
Chapitre III: LA PHYTOPATHOLOGIE ET LES MICROORGANISMES
ENDOPHYTES
III.1 Généralités sur la phytopathologie 11
III.2 Les principales maladies des cacaoyers 12
Table des matières
III.3 Notions et définitions 13
III.3.1 Endophytes 13
III.4 Mode de transmission des endophytes dans la plante 13
III.5 Relation entre endophytes et phytopathogènes 14
2ème
PARTIE: MATERIELS ET METHODES
Chapitre I: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
I.1 Matériels 15
I.1.1 Matériels et équipements 15
I.1.2 Matériel biologique 15
I.2 Méthodes 15
I.2.1 Mode de désinfection 15
I.2.2 Préparation du milieu de culture 16
I.2.3 Mode et mise en culture 16
I.2.4 Incubation des cultures et paramètres à étudier 17
I.2.5 Acclimatation 17
Chapitre II: ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE
II.1 Matériels 18
II.1.1 Matériels et équipements 18
II.1.2 Matériel biologique 18
II.2 Méthodes
18
II.2.1 Isolement des germes issus des feuilles malades 18
II.2.1.1 Prétraitement des feuilles 18
II.2.1.2 Isolement proprement dite 19
II.2.1.3 Purification 19
II.2.1.4 Conservation 20
II.2.2 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades 20
II.2.2.1 Etude bactériologique 20
II.2.2.2 Etude mycologique 21
Chapitre III : VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES
(Postulat de Koch)
III.1 Matériels 22
III.1.1 Matériels et équipements 22
III.1.2 Matériel biologique 22
Table des matières
III.2 Méthodes 22
III.2.1 Recherche des germes responsables des maladies diagnostiquées 22
III.2.2 Préparation de l’inoculum 22
III.2.3 Désinfection des feuilles 22
III.2.4 Inoculation des feuilles saines 23
3ème
Partie: RESULTATS, INTERPRETATION, DISCUSSION
Chapitre I: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
I.1 Efficacités de la désinfection 24
I.2 Taux de germination 24
I.3 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des pousses 25
I.4 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des racines 25
I.5 Effets des différentes concentrations de GA sur le nombre de bourgeons
axillaires
26
I.6 Evolution de l’acclimatation 27
Chapitre II : ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE
II.1 Diagnostic des maladies 28
II.2 Isolement des germes issus des feuilles malades 29
II.2.1 Etude bactériologique 29
II.2.2 Etude mycologique 30
II.3 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades 31
II.3.1 Etude bactériologique 31
II.3.2 Etude mycologique 33
Chapitre III: VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES
(Postulat de Koch)
III.1 Inoculation avec les souches bactériennes 34
III.2 Inoculation avec les champignons 35
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 38
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES v
ANNEXES vi
i
Glossaire
GLOSSAIRE
Angiosperme : plante à graine dont l’ovule, fécondé par l’intermédiaire d’un tube
pollinique, se transforme en un fruit clos.
Callogenèse : phénomène de formation d’amas de cellules indifférenciées appelés :
cals lors de l’embryogenèse somatique.
Caulogenèse : désigne à la fois l’initiation et le développement des bourgeons
terminaux, axillaires.
Dicotylédone : plante angiosperme dont la graine possède deux cotylédons
généralement égaux.
Drupe : fruit charnu à noyau.
Nécrose : maladie des plantes caractérisée par un noircissement ou dessèchement.
Rhizogenèse : désigne la néoformation et la croissance des racines
Verruqueuse : qui est de la nature de la verrue ou qui en a l’aspect, dont la surface
présente des excroissances arrondies.
Vivace : se dit d’une plante dont la période de végétation s’étend sur plusieurs années.
ii
Liste des abréviations
Liste des abréviations
Densicheck : Densité Checking
CSS: Cacao Swollen Shoot
ICCO : International CoCoa Organization
IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées
McF : Mc Farland
MS : Murashige et Skoog
NA: Nutrient Agar
PDA: Potato Dextrose Agar
UFC : Unité Formant Colonie
G.A : Gibberilline Acid
iii
Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau 1 Efficacités de la désinfection ............................................................................ 24
Tableau 2 Taux de germination ........................................................................................ 24
Tableau 3 Longueurs de pousse en moyenne ................................................................... 25
Tableau 4 Longueurs des racines en fonction des milieux ............................................... 26
Tableau 5 Nombre de bourgeons axillaires ...................................................................... 27
Tableau 6 Caractères macroscopiques de chaque colonie bactérienne ............................ 31
Tableau 7 Récapitulatif des caractéristiques microscopiques des bactéries isolées ......... 31
Tableau 8 Morphologie et coloration de Gram de chaque bactérie .................................. 32
Tableau 9 Récapitulatif des caractères macroscopiques des champignons isolés ............ 33
iv
Liste des figures
Liste des figures
Figure 1 Pied de Theobroma cacao .................................................................................. 3
Figure 2 Les 3 variétés de Theobroma cacao ................................................................... 4
Figure 3 Principe et base de la culture in vitro ................................................................. 9
Figure 4 Formule développée de l’acide gibbérellique .................................................... 10
Figure 5 Coupe transversale d’une cabosse de Criollo montrant les fèves à l’intérieur . 15
Figure 6 Graine sans mucilage ......................................................................................... 15
Figure 7 Coupe de graine de cacao ................................................................................... 15
Figure 8 Plants de cacao après un mois d’acclimatation .................................................. 27
Figure 9 Symptôme 1 ......................................................................................... 28
Figure 10 Symptôme 2 ......................................................................................... 28
Figure 11 Souches isolées des deux symptômes ............................................................... 29
Figure 12 Souches pures des champignons isolés ............................................................ 30
Figure 13 Feuille inoculée par la souche 1C.AIII
............................................................... 34
Figure 14 Feuille inoculée par la souche 2C.B6 ............................................................... 35
Figure 15 Feuille inoculée par la souche 2C.C7 ............................................................... 35
Figure 16 Feuille inoculée par la souche 1C.A2 ............................................................. 36
Figure 17 Feuille inoculée par la souche 1C.A1 .............................................................. 36
Figure 18 Feuille inoculée par la souche 1C. C4
.............................................................. 37
Introduction
INTRODUCTION
1
Introduction
Si aujourd’hui le cacaoyer est mondialement apprécié pour son fruit appelé cabosse,
à base de chocolat, il faut remonter plus de 4000 ans en arrière pour en retrouver ses origines
et son étymologie, quelque part dans les forêts tropicales d’Amérique Centrale et d’Amazonie
[HUBERT, 1984].
Le cacaoyer a gardé dans son nom scientifique son origine Maya : « Theobroma » qui vient
du latin et signifie « nourriture des Dieux ».
A Madagascar, le premier cacaoyer a été introduit vers les années 1900, c’était des
Criollo, puis environ 10 ou 15 ans plus tard furent introduit les cacaoyers Forastero. Enfin, les
Trinitario, qui au Sambirano, dominent dans les plantations, sont des hydrides de Criollo et
Forastero, très vigoureux et très productifs, ils donnent en plus un produit de qualité. C’est la
particularité de Madagascar, quasi unique au monde d'accueillir ces trois variétés de cacaoyer,
dont la variété « Criollo », très recherchée pour son arôme prononcé et sa faible amertume, le
«Forestero », qui dégage une saveur acide et corsée et le «Trinitario » (hybride, issu du
croisement entre « Forestero » et « Criollo »), au goût fin, a une teneur plus élevée en
matières grasses [Tribune Diego, 2014].
La production cacaotière de Madagascar est assurée par le District d’Ambanja qui est
fortement reconnu pour ses fortes potentialités et son microclimat favorable à la culture du
cacao. Les 2/3 de la production locale sont assurés par les petites exploitations familiales. Les
grandes exploitations, gérées par les opérateurs économiques, contribuent pour le reste. La
culture du cacao tient une place prépondérante dans la vie des petits producteurs car il assure
une source financière régulière [Tribune Diego, 2014].
Historiquement, Madagascar est mondialement reconnu pour sa production de cacao
fin et aromatique. En effet, le cacao malagasy est très recherché par les plus grands maîtres
chocolatiers du monde tant pour son arôme que pour sa couleur. Mais actuellement, ces
critères de qualité tendent à se détériorer progressivement et les acheteurs commencent à se
méfier de nos produits. La renommée de la production cacaotière malagasy entre dans une
phase critique. Il est donc impératif que les producteurs mettent l’accent sur l’amélioration de
leurs techniques pour proposer des produits de qualité supérieure, facilement valorisables sur
le marché international [Tribune Diego, 2014].
Ainsi, le présent travail se consacre sur la relance de la variété Criollo qui est une
meilleure variété de cacaoyer et qui est malheureusement en voie de disparition alors que
c’est avec cette variété que Madagascar a obtenu le label « Cacao fine » de l’Organisation
Internationale du Cacao (ICCO).
2
Introduction
Par ailleurs, étant considéré comme le meilleur cacao du monde, sa reproduction, ou du moins
la relance de la meilleure variété à forte tendance Criollo est un enjeu bénéfique pour
l’économie malgache [Tribune Diego, 2014].
Bien que, la variété Criollo est à forte potentialité organoleptique et aromatique, elle
est fragile et peut être facilement atteinte de n’importe quelle maladie, d’où l’importance
d’une étude phytopathologique dont le but est de diagnostiquer sa maladie et d’identifier par
la suite le ou les pathogènes responsables afin de les maîtriser ultérieurement.
Ce travail a pour objectifs spécifiques :
La multiplication végétative in vitro de la variété Criollo par la méthode de germination
in vitro des fèves de cacao de cette dernière avec une gamme de concentration d’acide
gibbérellique et avec des témoins sans l’hormone. C’est la partie culture in vitro.
L’isolement et identification préliminaire des microorganismes pathogènes.
La vérification de la réapparition des symptômes des maladies bactériennes sur des plantes
apparemment saines : c’est le postulat de Koch qui se fera in vitro.
Pour atteindre ces objectifs, le travail sera structuré de trois grandes parties dont la
première sera consacrée sur la culture in vitro composé de la germination in vitro. Quant à la
deuxième, la partie phytopathologie sera mise en valeur par l’isolement et purification des
germes bactériens et des champignons issus des plantes malades. Et enfin la troisième partie
se consacrera à la vérification de la réapparition des symptômes des maladies sur des plantes
apparemment saines.
Synthèse bibliographique
1
1ère
PARTIE :
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
3
Chapitre I : CARACTERISQUES DU Théobroma cacao
I.1 Position systématique : [ALVERSON et al, 1999]
La position systématique du cacaoyer est la suivante :
Règne : VEGETAL
Embranchement : SPERMAPHYTE
Sous-embranchement : ANGIOSPERME
Classe : DICOTYLEDONES
Sous-classe : DILLENIIDAE
Ordre : MALVALES
Famille : STERCULIACEAE
Genre : Théobroma
Espèce : cacao
I.2 Description botanique
Le cacaoyer est un arbre vivace cultivé sur toute la ceinture tropicale pour ses
graines, ou ses fèves qui servent à fabriquer le chocolat. C'est un arbre qui mesure 10 à
15 mètres de haut, généralement taillé à 6 ou 8 mètres [ALVERSON et al, 1999].
Figure 1 : Pied de Theobroma cacao
Synthèse bibliographique
4
Traditionnellement, les cacaoyers sont répartis en 3 variétés : les Criollo, les Trinitario et
les Forastero:
Variété Criollo
La cabosse est petite et très verruqueuse. L’enveloppe ou mésocarpe est mince et
tendre. La couleur est violet rouge, à maturité avec quelques traces jaunes à l’intérieur des
sillons. Cette variété constitue les premières introduites à Madagascar, leurs fèves sont
dodues, de section presque ronde. Elle fournie un cacao à « casse claire » très recherché pour
son arôme prononcé et sa faible amertume. Actuellement, la variété n’est représentée que par
quelques pieds très vieux et correspondent à moins de 5% de la production mondiale
[ZEFOUO M.A.L, 2011].
Variété Trinitario [ZEFOUO M.A.L, 2011]
La variété Trinitario est issue d’un croisement entre le Criollo et le Forastero. Les
Trinitario ont de grosse cabosse, verruqueuse allongée. Les couleurs varient sur le fruit, le
plus souvent la partie supérieure est violet-rouge, puis rouge-jaune et la pointe verte très claire
avec quelques traces violettes. Le croisement combine la rusticité des premières variétés avec
les arômes fins mais moins intenses des seconds. Elles produisent un cacao de qualité
intermédiaire. C’est la forte proportion de ce type Trinitario (70%) qui dicte la réputation fine
et aromatique du cacao malagasy vue la disparition petit à petit de la variété Criollo.
Variété Forastero [ZEFOUO M.A.L, 2011]
Leur cabosse est peu allongée et parfois ronde, elle n’est pas verruqueuse, elle est de
couleur verte ou vert pâle et devient jaune à maturité. Leur mésocarpe est très dur. Ces
cabosses présentent une surface lisse, ces fèves sont plus ou moins aplaties. Elle donne un
cacao de saveur relativement amère et de goût souvent acide. La variété Forastero est très
appréciée par les producteurs du Sambirano du fait de leur rusticité et de leur productivité
élevée par rapport aux deux autres groupes. Cette variété est le plus productif et très résistant.
Figure 2 : Les 3 variétés de Theobroma cacao :
A :Criollo ; B :Trinitario ;C : Forastero
A
B
C
Synthèse bibliographique
5
I.2.1 Appareil végétatif [RANDRIANANDRASANA Z. 2014]
I.2.1.1. Système racinaire
Le cacaoyer possède des racines pivotantes et traçantes. Ces racines aident le cacaoyer à
se fixer profondément dans le sol ainsi qu’à puiser l’eau nécessaire pour son développement.
I.2.1.2. La feuille
Le cacaoyer porte un feuillage persistant sur les branches situées au sommet de son
tronc. Les jeunes feuilles sont rougeâtres et tendres ; lorsque ces jeunes feuilles atteignent
l’âge adulte, elles sont épaisses, brillantes et coriaces, d'une longueur moyenne de 30 cm et
d’une couleur vert foncé.
Chaque feuille est portée par un pétiole de 3 à 7 cm, leur limbe est entier et nervuré. Ces
feuilles sont alternes : disposées de chaque côté de la tige à des hauteurs différents : chaque
nœuds ne portant qu’une seule feuille.
I.2.1.3. Les tiges
Les graines germent très rapidement après leur extraction des cabosses et arrivent vite à
maturité et lorsqu’elles ont été mises dans des conditions favorables d’humidité. La croissance
de la tige se poursuit ensuite verticalement, avec une émission régulière de feuilles allongées.
La tige principale, dont la croissance est donc définie, différencie 3 à 5 bourgeons axillaires
qui donnent naissance à une couronne formée de branches plagiotropes et dorsiventrales, avec
des feuilles alternes à pétiole court et une phylotaxie 1/2.
I.2.2. Appareil reproducteur [ZEFOUO M.A.L, 2011]
I.2.2.1. Fleurs et inflorescences
Les fleurs sont reparties sur des coussinets floraux et regroupées en inflorescence sur
le tronc. Sur ces coussinets, il peut y avoir à la fois des fleurs et des fruits (le fruit à ce stade
est appelé : « chérelle ». Un coussinet floral chez le cacaoyer porte beaucoup de boutons
floraux (rosâtres au départ et vire au blanc après) dont un bouton floral mesure 3 à 5mm. Une
coupe longitudinale d’un bouton floral montre l’appareil reproducteur femelle (gynécée) et
les staminodes (étamines).
Une fleur de cacaoyer se compose de 5 sépales, 5 pétales, un androcée composée de 5
étamines, 5 staminodes.
La pollinisation doit obligatoirement être réalisée par les insectes (entomophile) non
seulement parce que les anthères qui portent ce pollen sont abritées sous les cuculles mais
Synthèse bibliographique
6
également parce que ce pollen est gluant et forme des amas difficilement transportables par le
vent.
I.2.2.2. Fruits et graines
Considéré comme une drupe, le fruit du cacaoyer est communément appelé « chérelle
» pendant la durée de sa croissance, puis « cabosse » lorsqu’il atteint la maturité après cinq à
six mois selon ses origines. Le fruit est indéhiscent et sa taille varie de 10 à 30 cm de
longueur. De forme allongée, il possède 5 à 10 sillons longitudinaux plus ou moins marqués et
régulièrement espacés longeant la cabosse d’une extrémité à l’autre. La surface du fruit peut
être parfaitement lisse ou, au contraire, très verruqueuse. Sa couleur varie de vert à rouge pour
jeune fruit [ZEFOUO M.A.L, 2011]. La cabosse contient entre 20 à 60 fèves de forme ovoïde
de 2 à 4 cm de long alignées sur cinq rangées, c’est l’organe principalement attaqué par les
Phytophtora.
La cabosse renferme à maturité une quarantaine de graines à la forme comparable à
celle d’une amande plus ou moins bombée, communément appelées fèves, logées dans une
pulpe mucilagineuse. Si l’on débarrasse la graine de la pulpe blanche sucrée et acidulée qui
l’entoure, elle apparaît revêtue d’une enveloppe mince, de couleur rosée, fortement nervurée,
provenant des téguments de l’ovule. Cette enveloppe constitue la coque de la fève de cacao.
A maturité, les fèves fraîches représentent jusqu'à 25% du poids du fruit.
I.3 Biologie et écologie [RANIAVOSON L.B, 2009]
I.3.1. Biologie
I.3.1.1. Cycle de vie
Phase de germination
Cette phase peut durer en moyenne une à 2 semaines environ. 4 à 6 jours après le
semi, la racine et l'hypocotyle (partie de l'axe de la plantule qui se trouve entre la racine et les
cotylédons) sont déjà bien développés. 6 à 8 jours : l’hypocotyle (lorsqu’il grandit) va pousser
les cotylédons hors du sol et les amener à l’air libre et à la lumière. 8 à 10 jours : la première
paire de feuille apparaisse.
Phase de croissance
Dans les conditions favorables, la croissance se caractérise par l'ouverture des deux
cotylédons d'une jeune plantule de cacaoyer et qui laisse apparaître la tigelle (axe épicotylé)
qui prolonge l'hypocotyle. Cette tigelle se transforme en tige où se développent les premières
feuilles dix à quinze jours après la germination. C'est un bourgeon terminal, situé au sommet
du jeune plant de cacaoyer, qui permet la croissance par poussées successives de l’axe vertical
Synthèse bibliographique
7
dit axe "orthotrope" (appelé aussi tige).
La croissance de la tige n’est pas continue, elle s’interrompt environ un an et demi
après le semi. On parle de croissance définie. Le bourgeon terminal cesse son activité et est
remplacé par une vague de 5 bourgeons qui vont donner chacun naissance à un rameau plus
ou moins horizontal dit axe plagiotrope, et une couronne va se développer.
Cette jeune plantule sera considérée comme adulte après une quinzaine à une vingtaine
d’année.
Phase de floraison
La phase de floraison se produit dès la 4ème
année de plantation pour les semis.
Phase de production
A compter de la formation de fleur, la maturité de cabosse est entre 150 à 180 jours.
I.3.2. Ecologie
Exigence édaphique
Le sol doit assurer une bonne rétention en eau et doit permettre une aération ainsi
qu’un drainage correct. Un sol à texture argilo-sableuse est idéal et un teneur en matière
organique élevé est essentiel voir obligatoire pour un bon développement de la plante.
Une jeune plantule de cacaoyer a besoin d’un ombrage provisoire : ne laissant passer
que 50 % de lumière totale.
Exigence climatique
La culture des cacaoyers nécessite des températures élevées dont la moyenne
(l’optimale) est de 25°C, la minimale est de 10°C.
Le cacaoyer a une hygrométrie constamment élevée. Les précipitations doivent être
ainsi abondantes dont la moyenne annuelle est de l’ordre de 1500 à 2000 mm, et ces
précipitations doivent être bien réparties tout au long de l’année. Le taux d’humidité optimale
est de 85%.
Les périodes sèches, moins de 100 mm de pluie par mois, ne doivent jamais excéder
de 3 mois.
I.4 Valeurs nutritionnelles [www.consoglobe.com]
Le cacaoyer est cultivé pour ses fèves dont on extrait le cacao et le beurre servant à
fabriquer du chocolat. [HUBERT, 1984].
Synthèse bibliographique
8
Le chocolat est reconstituant et énergétique :
• 100 g de chocolat noir peuvent apporter 520 kcals.
• 100 g de chocolat au lait apportent 540 kcals.
Le chocolat noir est riche en magnésium et apporte du fer tandis que le chocolat au
lait, il est riche en phosphore et apporte du calcium, du potassium ainsi que du sodium.
Le chocolat contient de la théobromine et de la caféine qui lui confèrent ses propriétés
toniques et stimulantes.
Le chocolat est également un antidépresseur car certains de ses composants ont un
effet euphorisant, crée un état de bien-être et une meilleure résistance à la douleur. Il est un
puissant protecteur des dommages oxydatifs (comme le vieillissement).
Il participe à l’élimination du cholestérol, prévient aussi l’athérosclérose.
Il constitue une source importante de minéraux majeurs, d’oligoéléments, contient des
fibres, participe à l’élimination des calculs biliaires et constitue une source équilibrée de
vitamine.
Synthèse bibliographique
9
Chapitre II: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
II.1 Généralités
De nos jours, la culture in vitro est en pleine expansion et constitue une belle
application de la biotechnologie. Elle est basée sur la mise en culture d’un explant dans un
milieu artificiel contrôlé. Elle est spécifique chez toutes les cellules végétales en raison de leur
totipotence [NOVELLO C, 2005].
Les cellules végétales possèdent l’aptitude à la dédifférenciation (lorsqu’elles sont
soumises à des conditions telles : la culture des cellules en milieu artificiel, en additionnant
des activateurs de croissance) et à la régénération d’un individu : c’est la totipotence.
La culture in vitro a pour but de :
- Préserver ou sauvegarder les espèces rares en voie de disparition
- Faire une multiplication à grand nombre
- Améliorer les variétés végétales (par clonage)
II.2 Principes et bases de la culture in vitro
A partir d’une plante donneuse, la partie qui sera mise en culture est extraite et conditionnée
L’organogenèse est la base fondamentale d’une multiplication végétative. Il est dit
direct si en partant d’un explant, il aboutit à la formation d’un individu par l’élaboration de
tige et bourgeon (caulogenèse et phylogenèse) et de racine (rhizogenèse).
Il est dit indirect si la régénération passe par un stade de cal.
Figure 3: Principe et base de la culture in vitro [NOVELLO C, 2005]
Synthèse bibliographique
10
II.3 Milieu de culture [NOVELLO C, 2005]
En culture in vitro, il y a différents types de milieu :
Le milieu carotte
Le milieu MS (Murashige et Skoog) : milieu de base de la plupart des cultures in vitro.
Le milieu MS-H : milieu MS mais sans hormone.
Le milieu MS/4 : milieu MS contenant 4 fois plus d’hormone.
II.4 .L’hormone de la germination
La gibbérelline (issue de Gibberella fujikuroi) est une famille de phytohormones. Le
composé actif est appelé acide gibbérellique. Les Gibbérillines sont souvent nommées G ou
GA. Elle fut mise en évidence pour la première fois en 1926, chez Gibberella fujikuroi
(Ascomycète parasite du riz qui allonge exagérément les tiges) par le phytopathologiste Eiichi
Kurosawa.
L’acide gibbérellique contribue à la levée de dormance des graines.
II.5 Acclimatation en serre
L’acclimatation est la dernière étape de la micropropagation in vitro et elle détermine
en partie la qualité finale de l’explant.
Les plants qui ont bien développé des appareils racinaires et aériens bien distingués
sont concernés par l’acclimatation. Ces plants sont transplantés dans des poches pour
pépinière contenants des terreaux stériles imbibés d’eau jusqu’à saturation. C’est la partie
racinaire qui est enfoncée dans la terre jusqu’au niveau du collet.
Pour maintenir les conditions de cultures in vitro, une solution nutritive contenant de la
vitamine ainsi que des hormones de croissances sont apportées une fois par semaine.
Figure 4: Formule développée de l'acide gibbérellique
Synthèse bibliographique
11
Chapitre III: LA PHYTOPATHOLOGIE ET LES MICROORGANISMES
ENDOPHYTES
III.1 Généralités sur la phytopathologie
La phytopathologie est définie comme l’étude des maladies des plantes au cours de
leur croissance mais aussi des altérations des produits végétaux. Les données biologiques de
n’importe quelle plante malade sont très importantes car une maladie peut être causée par une
rupture de l’équilibre physiologique et se manifester par un ensemble de modification
(anatomique, physiologique et métabolique) [MICHEL L, 2000].
D’habitude, les végétaux ont un pH acide et on sait que les champignons vivent en
milieu acide aussi alors que la plupart des bactéries vivent en milieu basique, ceci nous pousse
à croire que les parasites sont généralement des champignons et que la phytopathologie est
l’étude des champignons pathogènes [MICHEL L, 2000].
Parmi les différents types de maladies, on distingue les maladies non parasitaires ou
maladies abiotiques. Parmi celles-ci on a :
Les facteurs environnementaux tels la température, la pluie (en excès ou en
sécheresse), le vent, les polluants, l’humidité relative, etc.…
Les pratiques culturales : choix du site (incluant le non-respect de la rotation de
culture), la fertilisation, l’irrigation, le sol (pH et salinité), le drainage, etc.…
Les maladies physiologiques qui sont des troubles de fonctionnement causés par une
ou plusieurs carences en sels minéraux.
A part les maladies abiotiques, on distingue également les maladies parasitaires ou
maladies biotiques.
Selon l’American Phytopathological Society :
50 à 65% sont des maladies fongiques
10 à 20% virales
5 à 10% bactérienne et
1 à 2% sont dues aux phanérogames [MICHEL L, 2000].
Le cacaoyer est une plante endémique du bassin Amazonien et de l’Amérique centrale
[WHITLOCK B. et al, 2001]. Il est actuellement cultivé sur plus de cinq millions d’hectares à
travers le monde. C’est ce déplacement du cacaoyer de son centre d’origine qui l’a exposé à
de nombreux pathogènes opportunistes des hôtes indigènes.
Synthèse bibliographique
12
Fulton, en 1989 annonça que l’environnement de croissance du cacaoyer est
généralement confiné, humide, ombragé, qui sont des conditions extrêmement favorables aux
développements des agents pathogènes.
Or ces différentes maladies sont responsables de la perte d’environ 50% de la
production au niveau mondial.
III.2 Les principales maladies du cacaoyer
La pourriture brune des cabosses : est la maladie courante du cacao du niveau dont
l’agent responsable est un Oomycète du genre Phytophthora provoque des dégâts pouvant
s’élever à 90 ou 100% de perte de la production en fonction des zones de culture, du
génotype, de la souche pathogène et des conditions environnementales.
La pourriture brune se manifeste par l’apparition de lésions brunes sur les fruits et un
revêtement sporifère au bout d’une semaine d’infection [FLOOD J et al, 2003].
Le balai de sorcière : est causé par un champignon, Monioliophthora perniciosa , c’est
une maladie répandue dans les Caraïbes et en Amérique du Sud. Le pathogène infecte les
tissus méristématiques, ce qui provoque la prolifération anarchique des rameaux, des
coussinets floraux et des fruits. Les cabosses sont peu développées et pourrissent sur l’arbre
avant maturité [FLOOD J et al,2003].
La moniliose : est causée par un champignon : Monioliophthora roreri, originaire des
pays Andins. Dans les conditions naturelles, la moniliose affecte uniquement les cabosses.
Les fruits infectés présentent des fèves nécrosées et compactes. Elle est responsable de la mort
et la chute des feuilles, la mort des rameaux, puis de l’arbre entier [SCHAAD N.W, 2001].
Le cacao swollen shoot : le CSS est la principale maladie virale connue chez le
cacaoyer. L’agent responsable est le « cacao swollen shoot virus » appelé également virus du
gonflement des tiges de cacaoyer.
Les principaux ravageurs et insectes : le cacaoyer étant une espèce très sensible aux
insectes surtout les piqueurs (les mirides) qui attaquent les jeunes pousses et les cabosses.
Synthèse bibliographique
13
Heureusement, la plantation de cacao à Madagascar n’est touchée que par la maladie
de pourriture brune de la cabosse [TAYLOR et al, 2008].
III.3 Notions et définitions [RAJAONARIVELO A.J.P, 2006]
III.3.1 Endophytes
Les endophytes doivent s’adapter aux conditions de l’environnement internes
(physiologie, biochimie,…) une fois qu’ils sont à l’intérieur des tissus de plante. Toutefois,
leur développement dépend de deux facteurs : de la plante hôte et de son degré de virulence.
Il existe différentes possibilités d’interaction entre l’endophyte et leur hôte :
Les endophytes pathogènes latents
Les endophytes pathogènes latents sont des parasites, qui après transmission dans
l’hôte ne sont pas virulents dans l’immédiat, donc ne causent pas de symptômes
apparents, on peut dire qu’ils sont encore en phase de latence prolongée.
Au moment où le comportement de la plante hôte change, les endophytes pathogènes
latents deviennent ensuite virulents.
Les endophytes symbiotiques
Les endophytes symbiotiques ne sont pas virulents et ne causent pas de symptômes
apparents. Son interaction avec la plante hôte est bénéfique dans les deux sens : ils
soutirent de la plante hôte tous les éléments nutritifs dont ils ont besoin et par ailleurs ils
offrent à leur hôte une protection contre les parasites.
Les endophytes commensaux
La plante leur sert d’abri (gite) pour s’échapper aux différents prédateurs. Ils passent la
quasi-totalité de son cycle de vie dans leur hôte sans pour autant les endommagés.
III.4 Mode de transmission des endophytes dans la plante [RAJAONARIVELO
A.J.P,2006]
Il existe deux types de transmission pour les endophytes :
La transmission verticale
Les endophytes sont initialement contenus dans la graine et se retrouveront plus tard
dans les différentes parties de la plante après la germination (cas de transmission de
certains Ascomycètes notamment dans le genre Claviceps, endophytes d'herbe).
Synthèse bibliographique
14
La transmission horizontale
Les spores de champignons emportés par le vent ou la pluie se déposent sur les parties
aériennes (tiges et feuilles) et les racines de la plante, ils vont pénétrer à travers les
stomates et envahissent finalement l’intérieur de la plante (cas des endophytes du
cacaoyer).
III.5 Relations entre endophytes et phytopathogènes [RAJAONARIVELO A.J.P,2006]
Historiquement, les endophytes ont été considérés comme des phytopathogènes peu
virulents.
Les pathogènes latents, les endophytes symbiotiques et les phytopathogènes ont été
confondus et le sont encore quelques fois puisque des points communs existent entre eux tels
le mode de transmission ainsi que le mode de colonisation de la plante.
Or, les vrais pathogènes sont des espèces distinctes des parasites (infectant un mauvais
hôte). Ils sont souvent spécifiques ou apparentés d’une espèce ou d’un genre de plante qu’ils
infectent.
Il existe deux types de pathogènes de plantes :
les pathogènes virulents : causant des maladies sévères pouvant entraîner la mort de
leur hôte et se nourrissent des matières mortes : les champignons nécrotrophes;
les pathogènes non agressifs : causant des symptômes légers, pouvant vivre dans la
plante lorsqu'elle est en vie : les champignons biotrophes.
Matériels et méthodes
2ème
PARTIE :
MATERIELS ET
METHODES
Matériels et méthodes
15
Chapitre I : ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
I.1 Matériels
I.1.1 Matériels et équipements
Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont cités
dans l’annexe I.
I.1.2 Matériel biologique
Deux cabosses de la variété Criollo provenant d’Ambanja ont été utilisées.
Chaque cabosse contenait 25fèves.
I.2 Méthodes
I.2.1 Mode de désinfection
Dans chaque cabosse, 25 fèves ont été retenues. On a alors 50 graines à désinfecter :
1ère
étape de la désinfection
Passage des 50 graines dans de l’eau distillée stérile ajoutée d’une petite quantité de
tween. Cette première étape de désinfection dure 20 minutes et doit être effectuées sous hotte
à flux laminaire autour de la flamme d’un bec Bunsen et dans la zone aseptique de travail.
Coque
Cotylédon
Figure 6: Graine sans mucilage Figure 7 : Coupe de graine de cacao
Cabosse
Fèves entourés
de mucilage
Figure 5 : Coupe transversale d’une cabosse de Criollo montrant les fèves à l’intérieur
Matériels et méthodes
16
2ème
étape de la désinfection
Les 50 graines dans l’eau distillée stérile additionné de tween ont été transvasées dans
l’hypochlorite de calcium pendant 10 minutes.
3ème
étape de la désinfection
Après passage dans l’hypochlorite de Calcium, les graines ont été rincées dans de
l’eau distillée stérile 03 fois dont chaque rinçage dure 05 minutes.
L’eau distillée qui sert à la préparation des solutions désinfectantes et de rinçage, les
verreries nécessaires sous hotte et les pinces ont été stérilisées à l’autoclave à une température
de 120 ° C sous une pression de 1bar pendant 20 minutes.
I.2.2 Préparation du milieu de culture
La solution mère des macroéléments est préparée en avance, elle est nommée Stock1.
Le stock2 contient les microéléments, le stock3 regroupe les apports en fer.
Les solutions mères (macro et micro) peuvent être conservées plusieurs semaines dans
un réfrigérateur, c’est pourquoi elles sont préparées à l’avance. De même, les régulateurs de
croissance, le fer chélaté, les vitamines sont aussi conservées à basse température.
Les stocks et la composition du milieu MS et MS/2 sont détaillés en annexe II.
I.2.3 Mode et mise en culture
Les graines désinfectées ont été ensuite mises en culture en raison d’une graine par
tube, dans différents types de milieu de culture dont 10 tubes de verre contenant des milieux
MS/2 comme témoin.
Une gamme de concentration d’acide gibbérellique a été entamé allant de 0,5ml/l
jusqu’à 2ml/L (0,5ml/l ; 1ml/l ; 1,5ml/l et 2ml/l).
Chaque concentration possède 10 répétitions en tubes de verre et chaque tube contient
du milieu MS/2 comme milieu de base.
Toutes les étapes de la germination telle la levée, le développement de l’hypocotyle,
l’apparition du premier feuillage, l’ouverture des cotylédons, l’apparition de la tigelle,
l’apparition des bourgeons et les autres paires de feuille ont été notées tous les 5 jours.
La mise en culture est donc notée J-0.
Matériels et méthodes
17
I.2.4 Incubation des cultures et paramètres à étudier
Les cultures ont été incubées dans une chambre de croissance (salle de culture)
maintenue à 25°C sous un éclairement de 2000 Lux pendant 16h.
Les paramètres à étudier sont :
Le taux de germination en MS/2 seul et MS+H
La longueur de pousse, le nombre de bourgeons axillaires et la longueur de la racine.
I.2.5 Acclimatation
But
Le but est de soumettre les explants aux conditions externes pour le postulat de Koch.
Principe
Les plants qui ont développés des appareils racinaires et aériens bien individualisés ont
été transférés dans un pot contenant des substrats naturels.
Mode opératoire
Le terreau en sachet a été stérilisé 2 fois et a été laissé refroidir pendant 24 heures.
Ensuite, le terreau a été distribué dans 22 poches pour pépinière. Les plants ont été retirés du
tube un à un. Chaque racine a été lavée à l’eau pour enlever les débris. La partie racinaire est
enfoncée dans la terre jusqu’à hauteur du collet. Les petits sachets contenant la culture ont été
regroupés dans des bacs contenant de l’eau stérile. Ces bacs ont été recouverts par des caches
en plastique pour maintenir l’humidité.
Les plants ont été arrosés abondamment à l’eau du robinet stérile contenant de la
vitamine et de la kinétine chaque matin.
Matériels et méthodes
18
Chapitre II : ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE
II.1 Matériels
II.1.1 Matériels et équipements
Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont
cités dans l’annexe I.
II.1.2 Matériels biologiques
Feuilles de cacaoyer présentant deux symptômes différents.
II.2 Méthodes
II.2.1 Isolement des germes issus des feuilles malades
II.2.1.1 Prétraitement des feuilles
But
La désinfection a pour but d’éliminer tous les microorganismes épiphytes qui ne sont
pas nécessaires.
Principe
Il s’agit d’éliminer les microorganismes présents en surface par deux sortes de
désinfectants les moins sévères tels l’hypochlorite de sodium et de l’alcool éthylique 70°. Ils
vont juste tuer les microorganismes en surface sans pour autant toucher les endophytes.
Mode opératoire
La technique de désinfection utilisée ici est celle que l’on utilise au sein du
laboratoire de phytopathologie de l’IMRA.
Les échantillons présentant différents symptômes sont traités séparément mais le mode
de désinfection est le même.
Chaque feuille a été lavée à l’eau du robinet. Ensuite, sous la hotte à flux laminaire et
dans la zone aseptique chaque feuille a été trempée dans de l’eau de Javel à 2% pendant 10
minutes, puis, rincée dans de l’eau distillée stérile 3 fois pendant 5 minutes chacune.
Matériels et méthodes
19
II.2.1.2 Isolement proprement dite
But
L’isolement est une technique qui permet de séparer les microorganismes d’un
échantillon et d’obtenir des colonies différentes espacées les unes des autres.
Principe
On cherche à isoler les différentes cellules de l’échantillon. Chaque souche isolée étant
alors susceptible de conduire à une colonie.
Mode opératoire
Sous la hotte à flux laminaire et autour de la flamme du bec Bunsen, les feuilles
présentant les symptômes et désinfectées précédemment ont été découpées en petit carré à
l’aide d’un ciseau stérile. Une partie (8 morceaux par BP) est déposé sur une gélose nutritive
(NA dont la composition est detaillée en ANNEXE II) additionnée d’antifongique
(cyclohexemide à 50mg/L) et une autre partie est déposée sur un autre milieu : le milieu PDA
(composition en ANNEXE II) additionnée d’antibactérien (chloramphénicol à 200mg/L).
Les boîtes ont été ensuite incubées à 25°C pour les champignons pendant 5 jours et à
37°C pour les bactéries pendant 48 heures.
Une vérification du procédé de désinfection a été faite dans le but de savoir si la
désinfection effectuée était efficace ou pas. Pour s’y faire, 100µl de chaque dernière eau de
rinçage ont été ensemencées en nappe sur milieu de culture NA sans antibiotique.
Les cultures ont été observées tous les jours et les souches bactériennes qui émergent
les explants ont été transférées sur NA stérile sans antifongique. La même procédure a été
effectuée pour les champignons mais sur milieu PDA.
Le nombre de différentes souches isolées et purifiées pour chaque explant malade a été
noté.
II.2.1.3 Purification
But
La purification consiste à séparer les souches microbiennes. Elle nécessite au préalable
la caractérisation précise d’une colonie déjà isolée que l’on veut purifier.
Principe
Chaque colonie isolée est repiquée sur un autre milieu jusqu’à obtention d’une seule
colonie dans la boite identique à celle du départ.
Matériels et méthodes
20
Pour la purification, les souches ont été repiquées toutes les 24 heures sur de nouveaux
milieux :
milieu NA stériles sans antifongique pour les bactéries ;
milieux PDA sans antibiotique pour les champignons jusqu’à obtention de souche
pure (un seul type de colonies dans chaque boîte).
II.2.1.4 Conservation
La conservation des souches pures est indispensable car elles peuvent être utiles pour
d’autres études comme l’identification ou pour améliorer une recherche faite auparavant, ou
encore elles seront utilisées pour constituer des souches de référence.
Il existe de nombreuses méthodes de conservation comme la congélation à très basse
température avec l’utilisation de cryoprotecteur, la lyophilisation mais nous avons choisi la
conservation–20°C au congélateur dans des cryotubes contenant du glycérol.
II.2.2 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades
II.2.2.1 Etude bactériologique
Observation macroscopique
La première étape a été la caractérisation macroscopique des différentes colonies pures
isolées.
A partir d’une souche jeune de 24 heures : la couleur, la taille, la consistance, l’allure
du contour, l’aspect de leur surface, le relief et la transparence de chaque colonie ont été
observés puis notés.
Test à l’état frais
But :
Le but est de voir la mobilité ainsi que le mode de groupement des cellules
microbiennes.
Principe :
Les cellules fixées par de l’eau distillée stérile sont observées au microscope optique
avec un grossissement 400x.
Mode opératoire
Une goutte d’eau distillée est déposée sur une lame, une petite quantité de souche pure
est prélevée puis étalée de façon spirale sur la lame et le tout est recouvert d’une lamelle.
Matériels et méthodes
21
Enfin, la préparation a été montée sur microscope optique à fort grossissement.
Le mode de groupement ainsi que la mobilité de chaque bactérie ont été observés puis
notés.
Coloration GRAM
But
Le but est l’identification de chaque espèce bactérienne : gram+ ou gram-.
Principe
Les bactéries à Gram+ gardent la coloration violette après décoloration par l’alcool-
acétone. Les bactéries à Gram- décolorées par l’alcool-acétone, teintées par la Fushine
apparaissent rose ou fushia au microscope optique.
Mode opératoire
La troisième étape a été la coloration de Gram. A partir de la même souche jeune de
24 heures de chaque type de bactérie, une colonie isolée a été prélevée et étalée sur une lame
puis fixée par séchage sur une plaque chauffante.
Le frottis a été recouvert avec du violet de Gentiane durant une minute puis avec du
lugol pendant 30secondes. Il a été ensuite décoloré avec de l’alcool/acétone et rincé à l’eau de
robinet puis chaque extrémité est couverte par de la Fuschine pendant une minute.
La lame a été lavée à l’eau de robinet puis séchée sur plaque chauffante et observée au
microscope optique.
La forme et la couleur de la bactérie ont été notées.
II.2.2.2 Etude mycologique
Observation macroscopique
Dans le cas des mycètes, l’observation macroscopique se base sur la texture de chaque
colonie, la topographie, la couleur de la surface ainsi que du revers et la vitesse de croissance.
Ces critères d’observations ont été notés.
Matériels et méthodes
22
Chapitre III : VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES
(Postulat de Koch)
III.1 Matériels
III.1.1 Matériels et équipements
Les verreries, les équipements et les réactifs utilisés lors du travail sont
cités dans l’annexe I.
III.1.2 Matériels biologiques
Les feuilles saines provenant de l’acclimatation ont été utilisées pour le
Postulat de Koch
III.2 Méthodes
III.2.1 Recherche des germes responsables des maladies diagnostiquées
But
Le Postulat de Koch a pour but de confirmer les symptômes diagnostiqués
précédemment et de connaitre le ou les germes responsables de ces symptômes diagnostiqués
afin de continuer leur identification.
Principe
Le postulat de Koch consiste à inoculer tous les germes issus de l’isolement effectué
précédemment, un à un que ce soit bactéries ou champignons. L’évolution de l’apparition des
symptômes confirmera le responsable de la maladie et la persistance du symptôme.
III.2.2 Préparation de l’inoculum
A partir d’une culture jeune de 24h de chaque souche bactérienne, une suspension
bactérienne de 108 UFC équivaut à 0,5 Mcf a été préparée par le biais d’un densicheck.
III.2.3 Désinfection des feuilles
Des feuilles isolées de la variété Criollo issue de l’acclimatation d’apparence saine ont
été trempées dans de l’alcool éthylique dénaturé 70% puis elles ont été rincées deux fois avec
de l’eau distillée stérile puis séchées une fois avec du papier filtre stérile.
Matériels et méthodes
23
III.2.4 Inoculation des feuilles saines
Ces feuilles isolées ont été inoculées avec une suspension de chaque souche
bactérienne à l’aide d’écouvillons stériles. Ces feuilles ont été déjà écrasées à l’aide de l’oese.
Les feuilles ainsi inoculées ont été placées dans des boîtes de Pétri contenant des
billes de verre baignant dans de l’eau distillée stérile.
Quant aux champignons, des découpes de jeune mycélium sont déposés sur l’extrémité
inférieure et supérieure du limbe.
Un lot de feuille témoin sans inoculation est aussi préparé. Deux répétitions ont été
réalisées. Les boîtes ont été incubées sous lumière blanche continue et à une température de
25°C. Des observations ont été faites tous les 05 jours.
Résultats, Interprétation, Discussion
3ème
PARTIE:
RESULTATS,
INTERPRETATION,
DISCUSSION
24
Résultats, interprétation, discussion
Chapitre I: ETUDE SUR LA CULTURE IN VITRO
I.1 Efficacité de la désinfection
La désinfection est dite efficace lorsqu’il y a peu de graines contaminées par des
bactéries ou des champignons.
L’efficacité de la désinfection est notée en pourcentage et présentée dans le tableau 1.
Tableau 1: Efficacité de la désinfection
Nombres total de grains Nombres de graines
contaminés
Nombre de graines non
contaminés
50 10 40
La technique de désinfection est efficace jusqu’à 80%. La méthode adoptée a pu
éliminer les microorganismes épiphytes contenus sur les fèves.
La condition d’asepsie a été respectée.
I.2 Le taux de la germination
L’étude des taux de germination permet de déterminer le rôle de l’hormone sur la
germination. Ces différents taux sont présentés dans le tableau 2, selon la concentration en
hormone utilisée.
Tableau 2: Taux de germination
Types de milieu MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]
Taux de germination
en %
100 77,7 85,7 88,8 85,7
Les taux de germination obtenus ont variés entre 77,7 et 100%. Le milieu MS dilué
deux fois a permis d’obtenir 100% de germination.
Avec les milieux additionnés d’hormone, le taux de germination est supérieur à 50%.
L’acide gibbérellique a été actif selon les concentrations utilisées.
La présence d’acide gibbérellique dans les milieux a permis une levée de la
dormance des graines ainsi qu’un bon taux de germination.
25
Résultats, interprétation, discussion
I.3 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des pousses
La croissance en longueur des pousses n’a révélé de différences remarquables qu’à
partir du 15ème jour de la mise en culture pour le milieu MS/2 seul. La hauteur de la pousse
est entre 1,5 cm et 4,9 cm.
Quant au milieu MS/2 additionné de différentes concentrations en acide gibbérellique,
en 8 jours seulement, tous les échantillons ont présentés un bon développement de
l’hypocotyle et une formation de pré-feuille.
Ces résultats ont été pris entre le 5ème
et 15ème
jour et une moyenne a été faite entre les
valeurs prises.
Tableau 3 : Longueurs de pousse en moyenne
Types de
milieu
MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]
Hauteur de la
pousse (cm)
3,42
2,37
2,35
3,06
3,90
Selon [Quennoz, 2001], l’acide gibbérellique favorise la germination des graines, le
bourgeonnement après la dormance et l’élongation de la tige : dans notre cas, cette hypothèse
est fondée.
Cependant on a pu constater que l’effet de l’hormone dépend aussi de sa
concentration relative, c’est-à-dire que plus la concentration est forte, plus on obtient un bon
résultat..
I.4 Effets des différentes concentrations de GA sur la longueur des racines
Au bout de 9 jours, avec les milieux additionnés d’acide gibbérellique, on a déjà
un bon développement racinaire en moyenne 3,2cm de longueur.
Quant au milieu MS/2 sans hormone, ce n’est qu’à partir du 18è jours de culture
qu’il s’est révélé optimal avec en moyenne une longueur de 7cm.
Résultats, Interprétation, Discussion
26
Tableau 4 : Longueurs des racines en fonction des milieux
La rhizogenèse semble être stimulée par la présence d’acide gibbérellique surtout à
concentration élevée pendant les neuf premiers jours.
En 20 jours, c’est avec le milieu MS/2 qu’on a pu avoir une meilleure croissance
racinaire (7cm de longueur en 20 jours).
[Quennoz, 2001] a affirmé que le milieu MS/2 est un milieu riche contenant tous les
nutriments dont une plante a besoin.
I.5 Effets des différentes concentrations de GA sur le nombre de bourgeons
axillaires
Des différences importantes ont été observées entre les traitements au bout du 9è
jours ainsi qu’au 15è jours de culture.
Au bout de 20 jours, ce sont les milieux sans hormones qui se sont révélés
performants avec 5 bourgeons axillaires biens distincts en moyenne.
Types de milieu MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]
Longueur des
racines (en cm)
en 9 jours
2
3
3,5
3,5
4
Longueur des
racines (en cm)
en 18 jours
7
3
3,5
3,5
4
Résultats, Interprétation, Discussion
27
Tableau 5 : Nombre de bourgeons axillaires en fonction de la concentration en GA
Ici, on constate que la croissance semble être inhibée en présence d’acide
gibbérellique.
[Quennoz, 2001], l’effet des hormones dépend à la fois de leur concentration, leur
site d’action et le stade de développement de la plante.
Au bout de 30 jours, seuls les explants issus du milieu MS/2 sont prêts pour être
acclimatés tandis que ceux issus des milieux contenant l’hormone sont morts : ce sont
probablement les rejets d’exsudats phénoliques dans le milieu qui ont provoqué cette nécrose.
I.6 Evolution de l’acclimatation
L’évolution de l’acclimatation est montrée dans la figure 8
Figure 8: Plants de cacao après un mois d’acclimatation
Au bout d’un mois d’acclimatation, on a pu avoir de belles et de nombreuses feuilles qui
seront utilisées lors du postulat de Koch.
Types de milieu MS/2 seul MS/2+GA[0,5] MS/2+GA[1] MS/2+GA[1,5] MS/2+GA[2]
Nombre moyenne
de bourgeon
5
1
1
1
1
Résultats, Interprétation, Discussion
28
Chapitre II: ETUDE PHYTOPATHOLOGIQUE
II.1 Diagnostic des maladies
Deux échantillons ont été prélevés à Ambanja. La tâche brune est nommée symptôme
1 et la tâche jaune est nommée symptôme 2.
Description du symptôme 1 :
Des lésions nécrotiques brunes plus particulièrement localisées en bordure du limbe
déforment les folioles. Lorsqu’une lésion apparait à l’extrémité du limbe, elle s’étend
progressivement de façon centripète.
Le symptôme 1 est présenté dans la figure ci-dessous :
Description symptôme 2
Les tâches jaunes se repartissent tout le long de la feuille infectée. Ces tâches jaunes
sont en pointillées.
Le symptôme 2 est présenté dans la figure ci-dessous :
Figure 10: Symptôme 2
Figure 9: Symptôme 1
Résultats, Interprétation, Discussion
29
II.2 Isolement des germes issus des feuilles malades
II.2.1 Etude bactériologique
Après les différentes étapes de l’isolement et purification, 5 bactéries pures et une
levure ont été isolées des 2 échantillons avec des caractères macroscopiques bien distingués.
Parmi ces 5 bactéries, 4 dénommées : 1C.AI, 1C.A
II, 1C.A
II’,1C.A
III, ont été isolées
du symptôme 1 et une seule type de bactérie a été isolée du symptôme 2 (2C.AV).
La levure, notée 1C.AIV
a été isolée du symptôme 1.
Selon [Michel, 2001], des bactéries différentes peuvent donc induire un même
symptôme et deux espèces génétiquement différentes peuvent coloniser un même habitat.
1 : symptôme 1 A : boîte A C : cacao Criollo
2 : symptôme 2 Chiffre : numérotation des souches
Souche symptôme 1
Souche symptôme 2
Souche 1C.AI
Souche 1C.AII
Souche 1C.AII’
Souche 1C.AIV
Souche 2C.AV
Souche 1C.AIII
Figure 11: Souches pures isolées des deux symptômes
Résultats, Interprétation, Discussion
30
II.2.2 Etude mycologique
Huit champignons ont été isolés des 2 symptômes : 3 champignons ont été isolés du
symptôme 2 (2C.B6, 2C.C
7, 2C.C
8) alors que 02 types de champignons ont été isolés des 02
symptômes (1C.A2, 2C.B
3) et 03 types de champignon du symptôme 1 (1C.A
1, 1C.C
4, 1C.C
5).
1 : symptôme 1 A : boîte A C : cacao Criollo
2 : symptôme 2 B : boîte B Chiffre : numérotation des souches
Souche 1C.C4
Souche 1C.C5
Souche 2C.C8
Souche 2C.B3
Souche 2C.B6
Souche 2C.C7
Figure 12 : Souches pures des champignons isolés
Souches symptôme 2
Souches symptôme 1
Souche 1C.A1
Souche 1C.A2
Souche 1C.A1
Souche 1C.A2
Souche 1C.C4
Souche 1C.C5
Résultats, Interprétation, Discussion
31
II.3 Identification préliminaire des germes issus des feuilles malades
II.3.1 Etude bactériologique
Caractères macroscopiques des colonies
Les caractères macroscopiques des colonies sont présentés dans le tableau 6
Tableau 6 : Caractères macroscopiques de chaque colonie bactérienne
Types de
bactéries
1C.AI 1C.A
II 1C.A
II’ 1C.A
III 2C.A
V
Couleur Blanchâtre Jaunâtre Jaunâtre Blanchâtre Blanchâtre
Taille Grande Petite Petite Petite Moyen
Consistance Sèche Crémeuse Crémeuse Crémeuse Sèche
Allure du
contour
Irrégulier Régulier Régulier Irrégulier Irrégulier
Aspect de la
surface
Rugueuse Lisse Lisse Lisse Rugueuse
Relief Bombé Bombé Bombé Bombé Bombé
Transparence Opaque Opaque Opaque Opaque Opaque
Caractères microscopiques des colonies
Après observation à l’état frais, 4 bactéries sont mobiles et une seule bactérie est
isolée.
Les récapitulatifs des caractères microscopiques des colonies sont présentés dans les
tableaux 7 et 8 ci-dessous :
Tableau 7 : Récapitulatif des caractéristiques microscopiques des bactéries isolées
Types de bactéries Mobilité Mode de groupement
1C.AI Mobile Groupée 2 par 2
1C.AII Mobile Groupée 2 par 2
1C.AII’
Immobile Groupée 2 par 2
1C.AIII
Mobile En chainette
2C.AV Mobile Isolée
Résultats, Interprétation, Discussion
32
Après coloration Gram, 3 bactéries sont des bactéries à Gram (-) et 2 bactéries sont des
bactéries à Gram (+).
Les détails sont notés dans le tableau 8.
Tableau 8 : Morphologie et coloration de Gram de chaque bactérie
Souches Formes Gram
1C.AI Bacille Positif
1C.AII Bacille Négatif
1C.AII’
Coccobacille Négatif
1C.AIII
Cocci Négatif
2C.AV Arrondie Positif
Résultats, Interprétation, Discussion
33
II.3.2 Etude mycologique
Observation macroscopique
Les caractéristiques macroscopiques de ces champignons sont récapitulées dans le tableau 9 ci-après :
Tableau 9 : Récapitulatif des caractères macroscopiques des champignons isolés
Souches
Texture
Topographie
Couleur de la
surface
Couleur du revers
Vitesse de croissance
(diamètre en fonction du temps
d’incubation)
24h 48h
1C.A1
Duveteux
plane
blanchâtre
Centre noir verdâtre, blanc qui vire au jaune
poussin
4,8 cm
9,1 cm
1C.A2 Duveteux, plane blanchâtre Noir verdâtre 4,5 cm 9,1 cm
2C.B3 Duveteux plane blanchâtre Blanchâtre 3,8 cm 9,1 cm
1C.C4
Laineux
plane
blanchâtre
Verdâtre au centre, extrémité blanchâtre
4,3 cm
8,8 cm
1C.C5
Duveteux
plane
Blanchâtre
aux
extrémités,
noir au centre
Blanchâtre aux extrémités, noir verdâtre au
centre
4 cm
8,8 cm
2C.B6 Laineux
plane blanchâtre Noir au centre 3,9 cm 9,1 cm
2C.C7 Cotonneux
surélevée blanchâtre Rose grisâtre 1,1 cm 2,9 cm
2C.C8 Cotonneux
surélevée blanchâtre Blanc-rosâtre 0,8 cm 2,6 cm
Pour les champignons, on a pu isoler les mêmes souches venant des deux symptômes (type 2 et type 3). Ceci dit, un champignon peut
causer différents symptômes selon les tissus vasculaires envahis [HARINARIVO,2012].
Résultats, Interprétation, Discussion
34
Chapitre III: VERIFICATION DE LA REAPPARITION DES SYMPTOMES
(Postulat de Koch)
III.1 Inoculation avec les souches bactériennes
Toutes les souches ont été inoculées chacune sur une feuille saine mais seule la
souche 1C.AIII
a montrée les symptômes qui sera montrée dans la figure ci-dessous :
Avec la souche 1C.AIII
A partir du 4ème
jour, une petite tâche brune commençait à apparaître au niveau du bord
supérieur et bord inférieur du limbe.
La bactérie est moins sévère vu qu’en 8jours d’incubation, la tâche ne s’est pas
répartie tout le long de la feuille.
J-0
J-4
J-8
Figure 13 : Feuille inoculée par la souche 1C.AIII
Résultats, Interprétation, Discussion
35
III.2 Inoculation avec les champignons
Souche 2C.B6
La figure 17 montre qu’à partir du 4ème
jour d’incubation seulement, la feuille a été
recouverte par plusieurs tâches jaunâtres.
Souche 2C.C7
Les taches ont commencées sous les blocs d’agar contenant les mycéliums et se sont
réparties tout le long de la feuille au bout de 8 jours d’incubation.
J-0
J-4
J-8
J-0
J-4
J-8
Figure 14 : Feuille inoculée par la souche 2C.B6
Figure 15 : Feuille inoculée par la souche 2C.C7
Résultats, Interprétation, Discussion
36
Souche 1C.A2
La tâche brune a commencé au bord inférieur du limbe en 4 jours d’incubation. Au
bout de 8 jours la tâche s’est repartie le long de la feuille de façon centripète
Souche 1C.A1
La tâche brune a commencé au bord inférieur ainsi qu’à l’extrémité du limbe en 4
jours d’incubation. Au bout de 8 jours la tâche s’est repartie le long de la feuille de façon
centripète.
J-0
J-4
J-8
J-0
J-4
J-8
Figure 16 : Feuille inoculée par la souche 1C.A2
Figure 17 : Feuille inoculée par la souche 1C.A1
Résultats, Interprétation, Discussion
37
Souche 1C.C4
La figure 20 nous montre qu’en 4 jours d’incubation, la tâche commençait à apparaître
au niveau du bord inférieur du limbe.
En 8 jours le bord supérieur a aussi révélé une tâche qui s’est répartie de façon
centripète le long de la feuille.
Les maladies observées sont des nécroses associées à des bactéries et champignons.
Selon [MICHEL, 2001], un microorganisme phytopathogène responsable d’une
quelconque maladie doit reproduire les mêmes symptômes sur des plantes saines.
J-0
J-4
J-8
Figure 18 : Feuille inoculée par la souche 1C. C4
Conclusion et perspectives
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
Conclusion et perspectives
38
Le présent travail a été effectué au sein du laboratoire de recherche de l’IMRA et ayant
pour objectif la multiplication végétative in vitro de la variété Criollo par la méthode de
germination in vitro des fèves de cacao en présence d’acide gibbérellique et des témoins sans
l’hormone : dans la partie culture in vitro. L’isolement et identification préliminaire des
microorganismes pathogènes à l’origine de la tâche brune sur les jeunes feuilles ainsi que
pour les taches jaunes ainsi que la vérification de la réapparition des symptômes des maladies
bactériennes sur des plantes apparemment saines pour la partie phytopathologie.
La culture in vitro a révélé qu’une hormone agit en fonction de leur concentration et
selon le stade de développement de la plante. Des hormones doivent donc être ajoutées
pendant la période de croissance après la germination. Dans notre étude, le milieu MS/2 est
démontré comme étant un milieu riche d’après les résultats obtenus après 30 jours de culture.
L’étude de la phytopathologie du cacaoyer a permis de déterminer que les nécroses
observées sont associées à des champignons et bactéries. Ceci a été vérifié par la technique du
postulat de Koch qui est une technique simple et facile à appliquer.
Ce travail est une phase préliminaire de recherche concernant la culture in vitro et la
phytopathologie du Théobroma cacao. Cependant, notre stage nous a permis :
De nous initier aux manipulations microbiologiques et à la culture in vitro
De maîtriser les techniques d’isolement et purification surtout concernant les
champignons
A l’avenir, nous envisageons :
De compléter les identifications préliminaires utilisées en déterminant les genres
et espèces des germes responsables des symptômes diagnostiqués surtout pour les
champignons afin d’affirmer s’il s’agit encore du Phytophtora sp. ou bien des
nouveaux genres de champignons pathogènes.
D’optimiser la culture in vitro du Théobroma cacao en fonction des hormones de
croissances
Références bibliographiques
v
REFERENCES
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http://thesesmalagasy.org
http://www.google.com
http://www.memoireonline.com
Annexes
vi
ANNEXES
Annexes
ANNEXE I : LISTES DES MATERIELS ET EQUIPEMENTS
Matériels, verreries, réactifs et équipements
Agitateur magnétique chauffant HB 450
Autoclave Sanyo MLS-3780
Acide gibbérellique 1ml/L
Alcool éthylique dénaturé 70%
Bain ultrason SONOCLEAN
Balance
Balance de précision
Bec bunsen
Bocal alimentaire
Boîtes de Pétri 90mm
Ciseau
Centrifugeuse
Densichek
Eau distillée stérile
Eprouvettes graduée
Erlen meyer gradué
Fiole jaugée
Hotte à flux laminaire (flufrance)
Incubateur Napco
Incubateur Sanyo
Micropipettes et cônes
pH-mètre Inolab
Pince
Réfrigérateur Philips
Stock 1, 2,3
Vitamine
Annexes
ANNEXE II : LES MILIEUX DE CULTURE ET LEURS COMPOSITIONS
I. EN MICROBIOLOGIE
Milieu pour le rajeunissement des souches de bactéries
Nutrient Agar (NA)
Peptone--------------------------------- 5g/l
Beef extract----------------------------3g/l
Agar ------------------------------------ 15g/l
Eau distillée ---------------------------- 1l
Milieu pour repiquage des champignons
Potato Dextrose Agar (PDA)
Pomme de terre --------------------------------- 10g/l
Glucose ou dextrose ----------------------------10g/l
Agar ----------------------------------------------15g/l
Eau distillée ------------------------------------- 1l
II. EN CULTURE IN VITRO
STOCK COMPOSITION DE CHAQUE STOCK
Stock 1 : regroupe les macroéléments
Quantité pour 250ml d’eau distillée
CaCl2 : 1,1g
KH2PO4 : 0,425g
KNO3 : 4,75g
MgSO4, 7H2O : 0,925g
NH4NO3 : 4,125g
Stock 2 : regroupe les microéléments
Quantité pour 250ml d’eau distillée
CoCl2, 6H2O : 0,625mg
CuSO4,5H2O : 0,625mg
H3BO3 : 155mg
KI : 20,75mg
MnSO4, H2O : 422,5mg
Na2MOO4, 2H2O : 6,25mg
ZnSO4, 7H2O : 215mg
Stock 3 : apport en fer
Quantité pour 250ml d’eau distillée
FeSO4, 7H2O : 776mg
Na2EDTA : 932mg
Annexes
A ces 3 différents stocks sont ajoutés :
la vitamine : 1ml/L
le saccharose : 20g/L
le gélifiant qui est l’agar : 8g/L
La composition du milieu MS utilisé est le suivant :
MS MS/2
S1 : 100ml/L
S2 : 10ml/L
S3 : 10ml/L
Vitamine: 1ml/L
Saccharose: 20g/L
Agar: 8g/L
S1 : 5O ml/L
S2 : 10ml/L
S3 : 10ml/L
Vitamine: 1ml/L
Saccharose: 20g/L
Agar: 8g/L
Annexes
ANNEXE III : DIFFERENCES ENTRE LA PAROI D’UNE BACTERIE
GRAM – ET GRAM +
Gram négatif Gram positif
Paroi constituée d’une mince couche de
peptidoglycane
Leur paroi représente 5 à 10% de leur poids
Une membrane externe se trouve à l’extérieur du
peptidoglycane
La protéine la plus abondante est la lipoprotéine de
BRAUN (petite lipoprotéine attachée par liaison
covalente au peptidoglycane) : elle relie la membrane
externe et le peptidoglycane
La membrane externe est composée de
lyposaccharides (les LPS)
Il s’agit d’une paroi homogène et
épaisse constituée principalement
de peptidoglycane
Leur paroi représente 30% de leur
poids
Leur paroi est composé d’une
grande quantité d’acides
téïchoïques qui sont des polymères
de glycérol et de ribitol phosphate ;
des acides aminés tels que la D-Ala
ou des sucres comme le glucose
sont attachés au ribitol
Les acides téïchoïques sont
connectés soit au peptidoglycane
soit au lipide de la membrane
plasmique.
Name FALIHERINIAINA
First name Mamy Lalaina
Tittle Approch to the phytopathology associed to the germination in vitro of
Théobroma cacao variety Criollo
ABSTRACT
The present work has been done within the laboratory of research of the IMRA. The
survey dedicated itself on the raise of the Criollo variety that is in way of disappearance
whereas it is a variety to strong potentiality organoleptic and aromatic. The specific objectives
were the in vitro multiplication of the beans by the in vitro germination method in presence of
acid gibbérellique, the isolation and preliminary identification of the germs on observed
leaves patients and harvested to Ambanja as well as the verification of the resurgence of the
symptoms on healthy leaves.
Ranges of concentrations in acid gibberellic have been used for germination and the
technic of Assumption of Koch has been used for the verification of the resurgence of the
symptoms.
The in vitro culture demonstrated the specificity of the MS/2 middle that is a very rich
environment in nutriments whose plants have needed but also the efficiency of the acid
gibberellic in the levee of the dormance at the seeds.
The isolation of the pathogenic stumps from the sick leaves permitted to get 13
different colonies of which 5 are proven pathogenic by the method of Assumption of Koch. A
microorganism phytopathogen responsible for any illness must reproduce the same symptoms
on apparently healthy plants: this hypothesis is founded.
Before these promising results, it would be primordial to continue this survey on the
optimization of the in vitro culture according to the hormones of growth as well as the
determination of the kinds and species of the stumps proven like being pathogenic.
Keywords: Theobroma cocoa, in vitro germination, hormones of growth, phytopathology,
Assumption of Koch.
Advisors: Doctor RASAMIRAVAKA Tsiry
Doctor RANDRIANIERENANA Ando
Nom FALIHERINIAINA
Prénoms Mamy Lalaina
Titre: Approche à la phytopathologie associée à la germination in vitro du
Théobroma cacao de la variété Criollo
RESUME
Le présent travail a été effectué au sein du laboratoire de recherche de l’IMRA.
L’étude s’est consacré sur la relance de la variété Criollo qui est en voie de disparition alors
que c’est une variété à forte potentialité organoleptique et aromatique. Les objectifs
spécifiques étaient la multiplication in vitro des fèves par la méthode de germination in vitro
en présence d’acide gibbérellique, l’isolement et identification préliminaire des germes sur
des feuilles malades observées et récoltées à Ambanja ainsi que la vérification de la
réapparition des symptômes sur des feuilles saines.
Des gammes de concentrations en acide gibbérellique ont été utilisées pour la
germination et la technique de Postulat de Koch a été utilisée pour la vérification de la
réapparition des symptômes.
La culture in vitro a démontré la spécificité du milieu MS/2 qui est un milieu très riche
en nutriments dont les plantes ont besoin mais aussi l’efficacité de l’acide gibbérellique dans
la levée de la dormance chez les graines.
L’isolement des souches pathogènes à partir des feuilles malades a permis d’obtenir 13
colonies différentes dont 5 sont prouvées pathogènes par la méthode de Postulat de Koch. Un
microorganisme phytopathogène responsable d’une quelconque maladie doit reproduire les
mêmes symptômes sur des plantes apparemment saines : cette hypothèse est fondée.
Devant ces résultats prometteurs, il serait primordial de continuer cette étude sur
l’optimisation de la culture in vitro en fonction des hormones de croissance ainsi que la
détermination des genres et espèces des souches prouvées comme étant pathogène.
Mots clés : Théobroma cacao, germination in vitro, hormones de croissance, phytopathologie,
Postulat de Koch.
Encadreurs : Docteur RASAMIRAVAKA Tsiry
Docteur RANDRIANIERENANA Ando
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