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Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW)
Orthopädische Klinik König Ludwig Haus
der Universität Würzburg
Vorstand: Professor Dr. med. Franz Jakob
Vergleich der genetischen Eigenschaften von Bone Ma rrow derived
Mesenchymal Stem Cells und Trabecular Bone derived Mesenchymal
Stem Cells
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Maximilian Heitmann
aus Berlin
Würzburg, April 2014
Referent: Prof. Dr. Franz Jakob
Korreferent: Prof. Dr. Torsten Blunk
Dekan: Prof. Dr. Matthias Frosch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.01.2015
Der Promovend ist Arzt
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ...................................................................................................... 1
1.1. Bedeutung der Stammzellen in der modernen Medizin ........................... 1
1.2. Stammzellen ............................................................................................ 2
1.2.1. Embryonale Stammzellen (ESCs)..................................................... 2
1.2.2. Hämatopoietische Stammzellen (HSCs) ........................................... 3
1.2.3. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) ............................................... 5
1.3. Vorkommen der MSCs im adulten Organismus....................................... 9
1.4. Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT).......................................... 10
1.5. Die Nische der MSCs............................................................................. 11
1.6. Differenzierungspotential der MSCs ...................................................... 12
1.7. Therapeutische Möglichkeiten der MSCs und Tissue Engineering........ 14
1.8. Zielsetzung dieser Dissertation.............................................................. 19
2. Material und Methoden .............................................................................. 21
2.1. Materialen .............................................................................................. 21
Chemikalien und Reagenzien ................................................................... 21
Zellkulturmedien und Bestandteile ............................................................ 22
Enzyme ..................................................................................................... 22
Puffer- und andere Lösungen.................................................................... 22
Bausätze ................................................................................................... 23
2.2. Methoden............................................................................................... 24
2.2.1. Zellen und Zellkultur ........................................................................ 24
2.2.2. RNA- Isolation mit dem Kit „Nucleospin RNA II“............................ 27
2.2.3. cDNA-Synthese............................................................................... 28
2.2.4. Array-Analyse.................................................................................. 28
2.2.5. RT-PCR........................................................................................... 29
2.2.6. Agarose-Gel-Elektrophorese........................................................... 33
2.2.7. Immuncytochemie ........................................................................... 33
3. Ergebnisse .................................................................................................. 36
3.1. Array-Analysen ...................................................................................... 36
3.2. Bestätigung der Ergebnisse durch RT-PCR (Passage 0) ...................... 39
3.3. Übereinstimmung von Array und PCR (Passage 0)............................... 41
3.4. Vergleich der Arrays aus Passage 0 und Passage 1............................. 43
3.5. Immuncytochemie mit CD24.................................................................. 47
4. Diskussion .................................................................................................. 48
4.1. Versuchsauswertungen ......................................................................... 48
4.1.1. Experimentelle Bestätigung des Microarrays .................................. 48
4.1.2. Kontamination der Zellkultur Passage 0.......................................... 49
4.1.3. Auswertung und Bedeutung der analysierten Gene........................ 51
4.1.3.1. Osteogene Markergene ............................................................ 51
4.1.3.2. Myogene Markergene............................................................... 56
4.1.3.3. Sonstige untersuchte Gene ...................................................... 59
4.2. Stellenwert der bhMSCs in der adulten Stammzellforschung im Hinblick
auf Expressionsunterschiede........................................................................ 62
4.3. Stammzellcharakter der MSCs .............................................................. 63
4.4. Zusammenfassende Schlussfolgerungen.............................................. 65
5. Zusammenfassung ..................................................................................... 68
6. Literaturverzeichnis ................................................................................... 70
7. Abbildungsverzeichnis .............................................................................. 77
8. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................. 82
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Bedeutung der Stammzellen in der modernen Medi zin
Der Begriff der Stammzellen ist heutzutage in aller Munde. Längst haben sich
die Diskussion und das Interesse an ihnen von medizinischen und biologischen
Fachkreisen in die breite Öffentlichkeit verlagert.
Die Fortschritte, die die moderne Medizin in den vergangenen Jahrzehnten
verzeichnen konnte, spiegeln sich in den Industrieländern in einer immer älter
werdenden Bevölkerung wider. Bei der Breite der medizinischen Versorgung
und der Möglichkeit potentiell tödliche Erkrankungen heute effektiv behandeln
zu können rückt der Wunsch nach steigender Lebensqualität im Alter immer
mehr in den Fokus der Bevölkerung. Daher rührt auch das stetig zunehmende
Interesse degenerative Erkrankungen effizienter behandeln oder gar heilen zu
können.
Nach heutigem Stand der etablierten Therapieoptionen werden degenerative
Erkrankungen vornehmlich symptomatisch ohne kurativen Ansatz behandelt.
Das Gesundheitssystem einer älter werdenden Gesellschaft wird dadurch
erheblich und dauerhaft belastet. Nicht nur Patienten würden von regenerativen
Therapieansätzen profitieren, sondern auch die Volkswirtschaft durch geringere
Folgekosten.
Als Beispiel für eine solche degenerative Volkskrankheit möchte ich die
Gelenkarthrose ansprechen. Diese kommt in den häufigsten Fällen an der Hüfte
oder am Knie vor und äußert sich klinisch in Gelenkschmerzen. Im Endstadium,
wenn konservative Schmerztherapiemöglichkeiten ausgeschöpft sind, wird
meist ein operativer Gelenkersatz durchgeführt. Künstliche Gelenke weisen nur
eine begrenzte Haltbarkeit (ca. 10 - 20 Jahre (Eskelinen, Remes et al. 2006))
auf und sind Fremdkörper im menschlichen Gewebe. Mögliche
Regenerationsmöglichkeiten des Gelenkknorpels durch Stammzellen können
viel versprechende Therapieansätze bieten. Darüber hinaus gibt es aber auch
interessante Forschungsansätze für Regenerationsmöglichkeiten durch
Stammzellen von vielen anderen Organsystemen des menschlichen Körpers.
Einleitung
2
Trotz aller Fortschritte zum besseren Verständnis der Biologie von
Stammzellen, die in den letzten Jahrzehnten erzielt werden konnten, bleiben
noch viele Fragen ungeklärt und es besteht noch erheblicher
Forschungsbedarf.
1.2. Stammzellen
Als Stammzellen bezeichnet man nach heutigem Verständnis Zellen mit
unbegrenzter Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung in
verschiedene Gewebe eines lebenden Organismus. Im Gegensatz dazu haben
reife Gewebszellen diese Fähigkeiten beim Differenzierungsprozess verloren
um bis zu ihrem Untergang eine bestimmte Funktion im Gewebe auszuüben.
Bereits im 19. Jahrhundert wurde die Existenz von Stammzellen vermutet, die
bei Verletzung oder Verlust von Gewebe eine Regeneration gewährleisten.
Julius Cohnheim postulierte 1867 eine Verteilung solcher Zellen aus dem
Knochenmark über den Blutweg um das geschädigte Gewebe zu erreichen.
1.2.1. Embryonale Stammzellen (ESCs)
Prinzipiell lassen sich embryonale von adulten Stammzellen unterscheiden.
Dabei wird nicht nur nominell ein anderer Zeitpunkt in der Entwicklungsstufe im
reifenden Organismus unterschieden, sondern je früher der Zeitpunkt in der
Embryogenese desto größer auch die Differenzierungsfähigkeiten einer
Stammzelle.
Embryonale Stammzellen konnten erstmals von Evans und Kaufman aus
Mäusen gewonnen und erfolgreich kultiviert werden und zeichnen sich durch
Pluripotenz aus, also ihrer Fähigkeit noch in jedes Gewebe des Körpers bzw. in
Zellen aller drei Keimblätter differenzieren zu können (Evans and Kaufman
1981; Reubinoff, Pera et al. 2000; Wobus 2001). Sie befinden sich im Inneren
der Blastozysten und besitzen eine hohe Aktivität des Enzyms Telomerase, das
ihnen ermöglicht, sich unbegrenzt ohne DNA-Verlust teilen zu können und nicht
zu altern (Bodnar, Ouellette et al. 1998; Thomson, Itskovitz-Eldor et al. 1998).
Einleitung
3
Als Nachweis von ESCs dienen unter anderem immunhistochemische
Färbungen von spezifischen Oberflächenmarkern wie SSEA-3, SSEA-4 (Stage-
specific embryonic antigens) oder Alkalischer Phosphatase (Thomson,
Kalishman et al. 1995).
Es wurden bisher einige Faktoren entschlüsselt, die das Zusammenspiel
zwischen Differenzierung und Erhaltung des Stammzellpools sowie der
Pluripotenz ermöglichen. Bei ESCs der Maus (mESCs) wurde der Signalweg
über Leukemia Inhibitory Factor (LIF) und den Transkriptionsfaktor STAT3
(Signal transducer and activator of transcription 3) als System zum Erhalt der
Pluripotenz nachgewiesen, beim Menschen (hESCs) scheinen zusätzlich
andere Mechanismen von Bedeutung zu sein (Daheron, Opitz et al. 2004). Eine
zentrale Rolle spielt dabei der Transkriptionsfaktor POU5F1 (ehemals Oct4,
Octamer binding transcription factor 4), dessen Aktivität bei zunehmender
Differenzierung in eines der drei Keimblätter abnimmt. POU5F1 induziert eine
Expression von Markerproteinen der Pluripotenz wie NANOG und Sox2 (Sex
determining region Y (SRY) box 2) und supprimiert Proteine, die
Differenzierungsprozesse der Zellen anstoßen wie CDX-2 (Caudal type
homebox 2), EOMES (Eomesodermin), BMP-4 (Bone morphogenetic protein 4)
und FGF8 (Fibroblast growth factor 8) (Babaie, Herwig et al. 2007).
1.2.2. Hämatopoietische Stammzellen (HSCs)
Da experimentelle Forschung an hESCs in Gesellschaft und Politik ethisch
schwer vertretbar ist, richtet sich das heutige Augenmerk vermehrt auf adulte
Stammzellen. Diese ermöglichen einen lebenslangen Nachschub für zu Grunde
gegangene Zellen und gewährleisten so eine permanente Regeneration
verschiedener Gewebe, ohne dass sich dabei der körpereigene Stammzellpool
aufbraucht.
HSCs spielen schon seit Jahrzehnten eine Rolle in der Therapie von
Erkrankungen der Blut bildenden Zellen wie beispielsweise Leukämie. Die
Existenz solcher Stammzellen wurde bereits 1909 von Alexander Maximov
postuliert. Nach heutigem Verständnis stammen HSCs aus dem Knochenmark,
Einleitung
4
sind multipotent und mittels Differenzierung über myeloische oder lymphoide
Progenitorzellen für eine permanente Regeneration aller Zellen des Blut
bildenden Systems und des Immunsystems verantwortlich. Dabei verlieren sie
bei zunehmender Differenzierung ihren Stammzellcharakter, also ihre
Multipotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung (Kondo, Weissman et al. 1997;
Akashi, Traver et al. 2000). Nach der Geburt machen HSCs etwa 0,05 - 0,5 %
aller Knochenmarkszellen aus (Gunsilius, Gastl et al. 2001).
Als Oberflächenmarker der Wahl für HSCs und hämatopoietische
Progenitorzellen gilt nach wie vor CD34, das sich bei zunehmender Zellreifung
und Differenzierung bei der Hämatopoese nicht mehr nachweisen lässt
(Krause, Fackler et al. 1996). Des weiteren wurde im Jahre 1997 AC133
(Hematopoietic stem cell antigen, heute CD133) als weiterer spezifischer
Oberflächenmarker beschrieben (Yin, Miraglia et al. 1997). Somit lassen sich
diese Zellen als CD34+ CD133+ CD38- HLA-DR- charakterisieren.
Als gängigstes Kriterium zur Identifizierung von HSCs gilt schon seit
Jahrzehnten ihre Fähigkeit unter geeigneten Bedingungen in reife Blutzellen zu
differenzieren. In Clonogenic in vitro culture assays können Kolonie bildende
Einheiten (CFUs) – die nachfolgend Zellklone generieren – identifiziert,
quantifiziert und ihrem Differenzierungsgrad zugeordnet werden (Gunsilius,
Gastl et al. 2001).
Seit über 30 Jahren schon werden HSCs mittels autologer und allogener
Stammzelltransplantation erfolgreich zu Therapiezwecken eingesetzt. Dadurch
sind sowohl die myeloablative Hochdosis-Radiochemotherapie bei
Tumorerkrankungen als auch die Therapie bösartiger Erkrankungen des Blut
bildenden Systems erst möglich geworden. Durch Stimulation der Blutbildung
des Donors mit Wachstumsfaktoren (meist G-CSF: Granulozyten Colony-
stimulating factor) treten vermehrt CD34+-positive Blutzellen aus dem
Knochenmark in den Blutkreislauf über und können mittels Apharese-Verfahren
aus dem Blut des Spenders isoliert werden. Dies hat den operativen Eingriff der
Kochenmarkpunktion heute weitgehend überflüssig gemacht. Trotz
jahrzehntelanger Forschung und therapeutischer Erfahrung besteht nach wie
vor Forschungsbedarf zum besseren Verständnis der Vorgänge bei Graft-
Einleitung
5
versus-host-Krankheit und Graft-versus-tumor-Phänomenen um bestmögliche
Therapieschemata für den Patienten zu etablieren (Gunsilius, Gastl et al. 2001;
Lagasse, Shizuru et al. 2001).
1.2.3. Mesenchymale Stammzellen (MSCs)
In den 70er Jahren des 20. Jahrhunderts beschrieb Alexander Friedenstein
erstmals eine Population adulter Stammzellen aus dem Knochenmark, die in
der Lage ist in Knochen und Knochenmarkstroma zu differenzieren. Diese
Zellen erscheinen spindelförmig und wurden aufgrund ihrer histologischen
Morphologie als Fibroblast-like Cells bzw. fibroblastische Vorläuferzellen
bezeichnet. Sie zeichnen sich durch eine ausgeprägte Adhärenz an Plastik aus,
wodurch sie erstmals als eigenständige Subpopulation von Stammzellen des
Knochenmarks isoliert werden konnten (Friedenstein, Piatetzky et al. 1966;
Friedenstein, Gorskaja et al. 1976). In weiteren Versuchen kultivierte
Friedenstein Zellklone stromaler Knochenmarkszellen in vitro, die sich nach
anschließender In-vivo-Transplantation in Diffusionskammern erfolgreich in
Knorpel und Knochen differenzieren ließen. Er nannte diese Zellen Osteogene
Stammzellen (Friedenstein, Chailakhyan et al. 1987; Bianco, Robey et al. 2008;
Bianco 2011).
Caplan prägte dann erstmals den Begriff der Mesenchymalen Stammzelle und
beschrieb ihr Potential aufgrund von extrinsischen (autokrine und parakrine)
und intrinsischen (genomisches Potential) Faktoren zu einem bestimmten
Phänotyp zu differenzieren. Der Begriff Mesenchym kommt aus dem
Griechischen und bedeutet soviel wie das „Mithineingeflossene“. Er beschreibt
das Vorkommen der MSCs zwischen den epithelialen Keimblättern Entoderm
und Ektoderm und ihre Eigenschaft sich zwischen diesen zu bewegen oder gar
ihre Entstehung aus epithelialen Zellen während der Embryogenese (Caplan
1991).
Zunehmendes Interesse und Hoffnungen für therapeutischen Nutzen weckten
die Studien von Pittenger, der auch nach spezifischen Oberflächenmarkern der
MSCs zur besseren Identifizierung suchte. Er beschrieb die Populationen
Einleitung
6
positiv für die Proteindomänen SH2 und SH3 sowie für CD29, CD44, CD71,
CD90, CD106, CD120a und CD124, negativ für CD14, CD34 und CD45, die
demgegenüber bei HSCs nachzuweisen sind (Pittenger, Mackay et al. 1999).
Außerdem wurden STRO-1, HOP26 (CD63), CD49a und SB10 (CD166) als
mögliche Oberflächen-Markerantigene untersucht (Stewart, Monk et al. 2003).
Auch Zelladhäsionsmoleküle der MSCs scheinen eine wichtige Rolle zu spielen,
zum Beispiel bei Zell-Zell-Interaktionen mit T- und B-Lymphozyten sowie für die
Bindung an Proteine der Extrazellularmatrix. Darüber hinaus ermöglichen diese
Moleküle den MSCs auch das Auffinden verletzten Gewebes durch Rollen und
Adhäsion am Endothel. Hohe Expression konnte unter anderem für die
Integrine α1, α5, und β1 gefunden werden (Majumdar, Keane-Moore et al.
2003; Barry and Murphy 2004).
Aus neueren Studien erwächst die Hoffnung CD146 (MCAM, Melanoma Cell
Adhesion Molecule) als möglichen Oberflächenmarker benutzen zu können, ist
er doch hoch exprimiert in stromalen Knochenmarkszellen, die als CFU-F
(Colony-forming unit Fibroblasten) bzw. mesenchymale Progenitorzellen
angesehen werden können. Differenzierte Osteoblasten hingegen zeigen
keinerlei Expression von CD146. Eine Herunterregulation von CD146 kann
dabei schon in frühen Stadien osteogener Differenzierung von CFU-F
beobachtet werden. Auch die Nähe zu Blutgefäßen scheint für die Expression
von CD146 essentiell. Nach Transplantation von MSCs zeigen nur solche
Zellen in unmittelbarer Umgebung von Blutgefäßen Expression von CD146. In
diesem Zusammenhang scheint die bloße Gegenüberstellung von
Vorläuferzellen und differenzierten Osteoblasten aber nicht mehr zeitgemäß. Im
Idealfall sollten sich verschiedene Reifestadien zwischen undifferenzierten
Vorläuferzellen und differenzierten Osteoblasten bzw. Osteozyten anhand
spezifischer Oberflächenmarker und morphologisch unterscheiden lassen
(Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al. 2011).
Es kann also festgestellt werden, dass MSCs eine heterogene
Stammzellpopulation darstellen, für die noch kein eindeutiger
Oberflächenmarker gefunden werden konnte. Folgende Minimalkriterien sollten
deshalb zur Charakterisierung erfüllt werden: die Adhärenz an Plastik, die
Einleitung
7
spindelförmige Morphologie, die Differenzierbarkeit zu Chondroblasten,
Osteoblasten und Adipozyten und die Expression von CD105, CD73 und CD90,
sowie die fehlende Expression von CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79
oder CD19 (Dominici, Le Blanc et al. 2006). Diese Kriterien erlauben jedoch
generell nur eine retrospektive Identifikation von MSCs. Aktuelle Forschungen
konzentrieren sich darauf MSCs prospektiv in vivo zu identifizieren und
spezifisch mittels Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated cell sorting,
FACS) aufzureinigen. Dieses Verfahren wird beispielsweise für die Gewinnung
von CD34+-HSCs seit Jahren erfolgreich angewandt. Neben den von Dominici
vorgeschlagenen Oberflächenmarkern könnten dabei auch LNGFR (Low-affinity
nerve growth factor receptor, CD271) und CD49a geeignete Kandidaten sein.
Es konnte zudem gezeigt werden, dass sich diese MSCs, die mittels FACS
gewonnen wurden, morphologisch vom typischen spindelförmigen Aussehen
der MSCs aus der Zellkultur unterscheiden und eher als großovale Zellen mit
prominenten Nucleoli erscheinen. Daher liegt der Verdacht nahe, dass Biologie
und Morphologie der MSCs in vivo und in vitro differieren (Jones, English et al.
2006; Jones and McGonagle 2008; Augello, Kurth et al. 2010).
Im adulten Organismus haben MSCs bei vielen Regenerations- und
Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle inne. Sie sind essentiell für die
Entwicklung der HSCs, indem sie im Rahmen einer stromalen Differenzierung
durch parakrine Ausschüttung der Zytokine IL-6, IL-11, G-CSF und GM-CSF
deren Proliferation und Differenzierung beeinflussen (Majumdar, Thiede et al.
2000). Dabei wird erst durch Anwesenheit von MSCs eine physiologische
Mikroumgebung geschaffen. Vor allem CD146 scheint dabei eine Schlüsselrolle
in der essentiellen Interaktion von Endothelzellen mit MSCs zu spielen
(Sacchetti, Funari et al. 2007). Endostale Gewebeoberflächen und sinusoidale
Gefäßwände (Adventitia) als Reservoir für CD146+ stromale retikuläre Zellen
(osteogene Progenitor-/ Stammzellen) werden hier als Stammzellnische für
HSCs diskutiert (Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al. 2011).
Ein wichtiger Regenerationsprozess im Organismus ist die Frakturheilung. Über
Hämatomausbildung und inflammatorische Kaskaden im Frakturspalt wird die
Bildung von Kallus vorangetrieben, aus dem sich neuer Knochen bildet. MSCs
Einleitung
8
hemmen die Entzündungsreaktion, indem proinflammatorische Zytokine wie
TNFα oder IL-1 herunterreguliert werden. Gleichzeitig wird die Kallusbildung
positiv beeinflusst durch Ausschüttung von BMP-2 (Granero-Molto, Weis et al.
2008; Granero-Molto, Weis et al. 2009). Ein anderes Beispiel für
Geweberegeneration durch MSCs und Hoffnungen für therapeutischen Nutzen
liefern die Studien von Mansilla. Er konnte im Vergleich zu gesunden Patienten
im peripheren Blut starker Verbrennungsopfer ein erhöhtes Vorkommen von
MSCs messen (Mansilla, Marin et al. 2006).
Neben der Regeneration und Neubildung von Knorpel, Knochen,
Knochenmarkstroma und Bindegewebe gibt es zahlreiche Hinweise, die auch
Differenzierungswege in andere Gewebe vermuten lassen wie Muskulatur,
Sehnen und sogar Zellen des Zentralen Nervensystems (Jiang, Jahagirdar et
al. 2002). Dennoch werden diese Hinweise aus In-Vitro-Untersuchungen auch
heute noch von vielen Wissenschaftlern sehr kontrovers diskutiert. Eine
Reproduzierbarkeit der Differenzierung in Myozyten, Tenozyten und Neuronen
in vivo bereitet nämlich nach wie vor große Schwierigkeiten (Bianco, Robey et
al. 2008; Bianco 2011).
Anders als für HSCs konnte für MSCs bisher keine eindeutig identifizierbare
und klassifizierbare gemeinsame multipotente Stammzelle gefunden werden,
sodass MSCs nach wie vor als heterogene Population verstanden werden
müssen. Der Verdacht liegt nahe, dass bei Zellkulturversuchen nicht
multipotente MSCs die verschiedenen Differenzierungswege bedingen, sondern
Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Differenzierungswegen in einem
gemeinsamen Pool kultiviert werden. Somit scheinen eher gewebespezifische
Vorläuferzellen (gewebespezifische Perizyten) als multipotente Stammzellen für
die Regenerationsprozesse unterschiedlicher mesenchymaler Gewebe
verantwortlich zu sein (Bianco, Robey et al. 2008; Bianco 2011). Es ist also an
zukünftigen Forschungen diese Kontroversen zu klären. In meiner Arbeit
benutze ich dennoch den Begriff der MSC, da dieser in der heutigen Literatur
nach wie vor omnipräsent ist. Er soll als Überbegriff für sämtliche
Subpopulationen verstanden sein.
Einleitung
9
1.3. Vorkommen der MSCs im adulten Organismus
Wie bereits beschrieben, bildet das Knochenmark ein Reservoir für MSCs. Sie
konnten darüber hinaus aber auch aus zahlreichen anderen Geweben isoliert
werden. So lassen sich mesenchymale Vorläuferzellen aus peripherem Blut
(Zvaifler, Marinova-Mutafchieva et al. 2000) sowie aus Nabelschnurblut (Erices,
Conget et al. 2000) osteogen und adipogen differenzieren. Dies kann als
Hinweis dafür angesehen werden, dass im Blut nicht nur Vorläuferzellen der
hämatopoietischen Reihe anzutreffen sind. Auch aus dem Fettgewebe lassen
sich Zellen mit ähnlichem Phänotyp wie MSCs aus dem Knochenmark
gewinnen, die chondrogene, osteogene, adipogene, myogene und sogar
neurogene Differenzierbarkeit in vitro zeigen (Zuk, Zhu et al. 2002). Gleiches
konnte auch für MSCs aus Amnionflüssigkeit gezeigt werden (In 't Anker,
Scherjon et al. 2003). Neben dem Knochenmark beherbergen auch die
Kompakta (Guo, Li et al. 2006) und das Periost (De Bari, Dell'Accio et al. 2006),
die Synovialmembran (De Bari, Dell'Accio et al. 2003), die Synovialflüssigkeit
(Jones, English et al. 2004) sowie der Gelenkknorpel (Dowthwaite, Bishop et al.
2004) Nischen für MSCs bzw. mesenchymale Progenitorzellen. Außerdem
gelingt es in letzter Zeit zunehmend solche Zellen aus dem subkutanen
Fettgewebe zu isolieren (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).
Ob diese Zellen wirklich als multipotente Stammzellen angesehen werden
können oder vielmehr gewebespezifische Vorläuferzellen darstellen, ist noch
nicht hinreichend geklärt. MSCs aus der Zahnpulpa synthetisieren nämlich im
Vergleich zu solchen aus dem Knochenmark eher Dentin als Knochen, wenn
sie in vivo kultiviert werden (Gronthos, Brahim et al. 2002). Zellen aus anderen
vorher erwähnten Geweben lieferten äquivalente Ergebnisse (Bianco, Robey et
al. 2008).
Eine weitere Subpopulation der MSCs sind die so genannten bhMSCs
(trabecular bone-derived human mesenchymal stem cells), die sich aus
Fragmenten des trabekulären Knochens kultivieren lassen (Noth, Osyczka et al.
2002) und in dieser Arbeit mit den normalen stromalen mhMSCs (marrow-
derived human mesenchymal stem cells) verglichen werden.
Einleitung
10
1.4. Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT)
Der entscheidende Schritt zu einer Organogenese und somit zur Entstehung
von Metazoen wurde vor ungefähr 600 Millionen Jahren durch das erstmalige
Auftreten mesenchymaler Zellen bzw. einer Aufteilung in die drei Keimblätter
Ekto-, Ento- und Mesoderm während der Embryogenese ermöglicht. Dieser
Meilenstein legte die Grundlage für die Entwicklungsgeschichte der Wirbeltiere
und ist untrennbar an das funktionelle Potential mesenchymaler Zellen
gebunden, nämlich ihrer Fähigkeit zu Interaktionen zwischen den Keimblättern,
ihres Differenzierungspotentials in verschiedene Organe und Gewebe und ihrer
freien Beweglichkeit und Fähigkeit zum Ortswechsel innerhalb des Organismus.
Der Begriff der EMT beschreibt als weitere essentielle Funktion der
mesenchymalen Zellen für die Organentwicklung höherer Lebewesen, dass das
Mesenchym nicht nur aus dem Mesoderm, sondern auch aus epithelialen
Zellen der anderen Keimblätter entstehen kann. Unter bestimmten
Voraussetzungen können sich also epitheliale Zellen in mesenchymale
umwandeln. Die enorme Plastizität der mesenchymalen Zellen und der rege
funktionelle Austausch zwischen den Keimblättern spiegeln sich auch darin
wieder, dass der umgekehrte Prozess, die Mesenchymale Epitheliale Transition
(MET) bzw. die Umwandlung mesenchymaler in epitheliale Zellen möglich ist.
Diese Mechanismen ereignen sich aber nicht nur während der Embryogenese,
sondern auch im adulten Organismus und konnten in Studien nachgewiesen
werden, seit mesenchymale Zellen (z.B. durch Vimentin) von epithelialen (z.B.
durch E-Cadherin) phänotypisch abgrenzbar sind. Man stellt sich vor, dass
mesenchymale Zellen über den Blutweg oder durch selbständige Bewegung
innerhalb des Gewebes ihren Ort wechseln und sich dann in Epithel umwandeln
können. Die beschriebenen komplexen Prozesse werden weiterhin intensiv
erforscht und scheinen für eine funktionierende Physiologie, aber auch bei
degenerativen Veränderungen und bösartigen Tumoren von großer Bedeutung
zu sein (Thiery and Sleeman 2006; Baum, Settleman et al. 2008).
Einleitung
11
1.5. Die Nische der MSCs
Adulte Stammzellen zeichnen sich durch Multipotenz und Fähigkeit zur
unbegrenzten Selbsterneuerung aus. Zur Aufrechterhaltung dieses
Stammzellcharakters wird eine Organisation der Zellen in einem Zellverbund
angenommen, der sogenannten Stammzellnische, in der über Zell-Zell-
Kontakte und parakrine Signale zwischen Stammzellen und Gewebszellen
innerhalb der Nische Zellteilungen, Differenzierung und Aufrechterhaltung des
Stammzellpools gewährleistet werden.
Schofield postulierte 1978 erstmals das Vorkommen einer solchen Nische für
HSCs (Schofield 1978). Nach derzeitigem Wissensstand wird eine
perivaskuläre (Arteriolen, Kapillaren, Venolen) bzw. sinusoidale Lokalisation der
MSC-Nischen sowohl innerhalb des Knochenmarks als auch in anderen
mesenchymalen Geweben und Organen angenommen. Viele Autoren vermuten
sogar, dass es sich bei retikulären Zellen bzw. Perizyten um die native In-vivo-
Form der MSCs handelt, da diese ein gleichartiges Differenzierungspotential
und entsprechende Oberflächenmarker (CD44, CD73, CD90, CD105, CD146)
wie MSCs aufweisen. Innerhalb der Stammzellnische scheinen Sauerstoff- und
Calcium-Gradienten, Interaktionen über Integrine und Cadherine, der Wnt-
Signalweg sowie lokale Zytokin-Ausschüttungen von Bedeutung zu sein, die
jedoch bisher noch nicht im Detail verstanden werden. Diese Interaktionen
betreffen auch Nicht-Stammzellen wie zum Beispiel Endothelzellen in direkter
Umgebung der MSCs. Der direkte Kontakt zu Blutgefäßen würde auch eine
schnelle Verbreitung der Stammzellen über den Blutweg erklären. Ob Perizyten
aber die einzige Erscheinungsform von MSCs im Organismus sind, bleibt
fraglich, da auch avaskuläre Gewebe (z.B. Gelenkknorpel) MSC-ähnliche Zellen
enthalten (Kolf, Cho et al. 2007; Bianco, Robey et al. 2008; Augello, Kurth et al.
2010; Bianco 2011).
Bianco stellt in diesem Zusammenhang ein neues Erklärungsmodell für die
Stammzellnischen im Knochenmark zur Diskussion, in dem er unter anderem
eine gemeinsame Nische für HSCs und MSCs postuliert. Er versteht das
gesamte Knochenmark als ausgedehnten perivaskulären Raum. Dabei
Einleitung
12
verbindet er das Konzept der sinusoidalen bzw. endothelialen mit dem der
endostalen bzw. osteoblastischen Lokalisation der Nische und spricht von einer
gemeinsamen Nische im Subendothelialraum sowohl für HSCs als auch für
MSCs, die zwangsläufig koexistieren und sich gegenseitig beeinflussen. Von
großer Bedeutung scheinen Interaktionen über CD146 zwischen MSCs und
Endothelzellen zu sein. Er spricht also nicht von einem Nebeneinander der
sinusoidalen und der endostalen Nische im Knochenmark, sondern von einer
„Dualen Nische“, die beide Konzepte vereinigt. Auch die Rolle von Fettzellen im
Knochenmark kann mit dieser Sichtweise in Einklang gebracht werden, da mit
einer Differenzierung von MSCs in Fettzellen auch das Expressionspotential für
alle parakrinen Faktoren verloren geht, die für die Aufrechterhaltung des
hämatopoietischen Stammzellpools von Bedeutung sind. In der Tat ist „gelbes“
fettreiches Knochenmark nicht zur Hämatopoese in der Lage. Eine Umkehrung
dieses Prozesses von fettzellreichem „gelben“ in „rotes“ hämatopoietisches
Knochenmark wird durch Expression der MSCs von Angiopoietin 1 und anderen
angiopoietischen Faktoren ausgelöst (Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al.
2011).
Ein besseres Verständnis um die Biologie der mesenchymalen
Stammzellnischen würde die therapeutischen Möglichkeiten und Ergebnisse im
Rahmen des Tissue Engineering erheblich verbessern, wenn sich ins Gewebe
einzubringende MSCs oder differenzierte Zellen zur Regeneration schon in vitro
in einer optimalen Mikroumgebung befänden und sich somit potentiell effizienter
in vivo in den zu regenerierenden Gewebsdefekt integrieren ließen.
1.6. Differenzierungspotential der MSCs
MSCs werden, wie bereits erläutert, unter anderem durch ihre
Differenzierbarkeit in Knochen, Knorpel und Fettgewebe definiert. Eine
osteogene Differenzierung wird durch Inkubation der Zellkultur mit
Ascorbinsäure, β-Glycerophosphat und Dexamethason angestoßen und kann
über eine erhöhte Expression von Alkalischer Phosphatase (ALP) und Calcium-
Ablagerungen nachgewiesen werden. Alternativ zum Glucocorticoid
Einleitung
13
Dexamethason kann auch BMP-2 verwendet werden (Noth, Osyczka et al.
2002). Da die chondrogene Differenzierung der MSCs eine erhöhte Zelldichte
voraussetzt, müssen die isolierten MSCs vorerst zu Pellets zentrifugiert werden
um dann in einem serumfreien Medium unter Stimulation mit Transforming
Growth Factor β (TGFβ) zu reifen. Dabei lässt sich als Zeichen für die
Chondrogenese die zunehmende Produktion von proteoglykanreicher
Extrazellularmatrix und Typ-2-Kollagen histologisch erkennen. Die Adipogenese
lässt sich induzieren, indem die Zellkultur mit Dexamethason, Insulin, 1-Methyl-
3-Isobutylxanthin und Indomethacin inkubiert wird. Als Charakteristika von
Adipozyten gelten erhöhtes Vorkommen von Fettvakuolen, die sich mit Oil Red
O anfärben lassen, sowie Expression von Peroxisome Proliferation-activated
Receptor g2 (PPARγ2), Lipoproteinlipase (LPL) und das Fettsäuren bindende
Protein 2 (FABP2) (Pittenger, Mackay et al. 1999; De Bari, Dell'Accio et al.
2006; Augello, Kurth et al. 2010).
Darüber hinaus scheinen MSCs über ein weitaus größeres
Regenerationspotential zu verfügen. Sowohl in vitro als auch im Tiermodell ließ
sich durch MSCs eine Tenogenese anstoßen, die vor allem bei Überexpression
von Smad8 in den MSCs beobachtet werden konnte. Bei den Smad-Proteinen
handelt es sich um eine Gruppe von zellulären Mediatoren für BMP-gesteuerte
Signalwege. Nach Injektion von Smad8-vorbehandelten MSCs ins Peritoneum
von Mäusen bildeten sich Tenozyten und Achillessehnenrupturen zeigten
deutlich bessere Regeneration durch Einbringen von Smad8-MSCs in den
Sehnendefekt (Hoffmann, Pelled et al. 2006).
Bereits 1995 konnte Wakitani in vitro eine myogene Differenzierung von MSCs
aus dem Knochenmark von Ratten durch Inkubation mit 5-Azacytidin induzieren
(Wakitani, Saito et al. 1995). Eine solche Differenzierung in vivo gelang De Bari
mit humanen MSCs aus der Synovialmembran (hSM-MSCs), die er im
Tiermodell Mäusen mit Muskeldystrophie Typ Duchenne verabreichte. Er
konnte sowohl eine Differenzierung der menschlichen MSCs zu Muskelfasern
mit physiologischer Dystrophinproduktion innerhalb der erkrankten Muskulatur
der Maus beobachten als auch einen protektiven Effekt auf die pathologisch
veränderten Muskelfasern der Maus nachweisen (De Bari, Dell'Accio et al.
Einleitung
14
2003). Vor allem aufgrund der technisch relativ einfachen Gewinnung aus dem
subkutanen Fettgewebe erfreuen sich Adipogene Mesenchymale Stammzellen
(Adipose-derived stem cells) immer größerer Beliebtheit und zeigen ein
ausgeprägtes myogenes Differenzierungspotenzial. Die Myogenese und somit
die Ausbildung mehrkerniger Muskelzellen aus der Stammzellkultur wird dabei
zusätzlich durch zielgerichtete mechanische Stimulation der Zellkultur positiv
beeinflusst (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).
Zudem gibt es Hinweise, die ein neurogenes Differenzierungspotential von
MSCs andeuten. Woodbury entwickelte erstmals ein Protokoll, mit dem er
stromale MSCs zu einem Neuronen-ähnlichen Phänotyp differenzieren konnte.
Die untersuchten Zellen exprimierten Neuronen Spezifische Enolase (NSE),
Neuronales Nucleus Protein (NeuN) Neurofilament M (NF-M), Tau-Protein
(Tau) und Nerve Growth Factor Receptor (trkA), wohingegen die Expression
von Nestin, einem Marker neuronaler Vorläuferzellen, bei zunehmender
Differenzierung abnahm. Gleichzeitig glichen die Zellen unter dem
Lichtmikroskop morphologisch Neuronen und bildeten Dendriten-ähnliche
Zellfortsätze aus (Woodbury, Schwarz et al. 2000). Als weiteres wichtiges
Charakteristikum für Neuronen gilt ihre Fähigkeit Aktionspotentiale auszulösen.
Die dafür erforderlichen spannungsabhängigen Ionenkanäle konnten jedoch bei
den untersuchten Neuronen-ähnlichen Zellen bisher nicht nachgewiesen
werden (Hofstetter, Schwarz et al. 2002).
1.7. Therapeutische Möglichkeiten der MSCs und Tiss ue Engineering
Tissue Engineering beschreibt eine Disziplin der modernen Regenerativen
Medizin. Durch Züchtung von dreidimensionalen Gewebekonstrukten unter
Verwendung von Zellen, Wachstumsfaktoren und eines Trägergerüstes, einem
so genannten Scaffold, und Einbringen dieser in einen Gewebsdefekt im Körper
sollen die Heilungs- und Regenerationsmöglichkeiten von verschiedenen
degenerativ bzw. traumatisch veränderten Geweben verbessert werden. Neben
dem klassischen Tissue Engineering haben auch andere Verfahren mit MSCs
einen hohen Stellenwert in der zukünftigen Therapie degenerativer
Einleitung
15
Erkrankungen. Zum Beispiel die Infusion von MSCs mit anschließender
Rekrutierung im geschädigten Gewebe über den Blutweg oder die
pharmakologische Stimulation von Zytokin- und Chemokin-Rezeptoren, die eine
Rekrutierung von MSCs aus den Stammzellnischen bewirken soll. Von großem
Interesse sind in diesem Zusammenhang unter anderem eine bessere
Regeneration von bradytrophem Knochen alter Menschen oder großer
Knochendefekte, Knorpeldegeneration im Sinne der Gelenkarthrose sowie
verbessertes Remodelling nach Herzinfarkt. Für die jeweilige Indikation sind
verschiedenste Fragen zu klären um Erfolg versprechende Ergebnisse zu
liefern:
Woher und wie sind die MSCs am ehesten zu gewinnen? Sollten die
Stammzellen ex vivo vor der Replantation kultiviert und der gewünschte
Differenzierungsweg bereits initiiert werden? Welche Chemokine bzw. Zytokine
und Differenzierungsmedien wirken sich dabei am ehesten günstig aus?
Können auch mittels FACS gewonnene Stammzellen genügend große
Populationen liefern und welche Oberflächenmarker sind dafür besonders
geeignet? Welche Materialien eignen sich am besten für eine erfolgreiche
Integration der Scaffolds im geschädigten Gewebe? Inwiefern unterscheidet
sich die Biologie der MSCs in vitro und in vivo? Müssen MSCs überhaupt ex
vivo kultiviert werden oder können auch durch pharmakologische Stimulation
MSCs in vivo aus ihren Nischen in ausreichender Anzahl rekrutiert werden?
Jede Indikation verlangt folglich detaillierte und vor allem reproduzierbare
Anwendungsprotokolle um die Verfahren in klinischen Studien zu prüfen
(Augello, Kurth et al. 2010).
Viele Chemokine beeinflussen, wie man heute weiß, die mesenchymalen
Stammzellnischen und haben dabei auch einen Einfluss auf ein erfolgreiches
Auffinden verletzten Gewebes durch die MSCs. Eine Verbesserung der
Knochenheilung konnte für Stromal Cell-derived Factor 1 (SDF-1) und seinen
Rezeptor CXCR4 nachgewiesen werden. Das Chemokin wird aus dem Periost
in Nachbarschaft einer Knochenfraktur ausgeschüttet und sorgt für eine erhöhte
Rekrutierung von MSCs aus der direkten Umgebung des Knochendefektes
sowie aus dem Blut (Kitaori, Ito et al. 2009). Ein solcher positiver Effekt konnte
Einleitung
16
auch für das Remodelling nach einem Myokardinfarkt nachgewiesen werden.
Gerade in der frühen Phase des Remodelling, die mit hoher Expression von
SDF-1 einhergeht, werden besonders viele MSCs aus dem Blut rekrutiert.
Dieses Zeitfenster scheint somit für eine therapeutische Infusion von MSCs
nach einem Herzinfarkt am ehesten geeignet zu sein (Ma, Ge et al. 2005).
Im Folgenden möchte ich über den aktuellen Stand zum Einsatz von MSCs bei
Knochenerkrankungen und Defektheilung berichten. Größere posttraumatische
Knochendefekte führen regelmäßig zu mangelhafter Frakturheilung oder zur
Defektheilung mit Ausbildung von Pseudarthrosen. Nach Auffüllung des
Knochendefektes mit Scaffolds aus Hydroxylapatit, in den vorher kultivierte
stromale MSCs eingebracht wurden, konnte eine deutlich gesteigerte
Kallusbildung und somit Knochenheilung sowohl beim Schaf (Kon, Muraglia et
al. 2000) als auch beim Menschen beobachtet werden (Quarto, Mastrogiacomo
et al. 2001). Diese Ergebnisse und dabei vor allem die Knochenbildung im
Innern der Scaffolds waren in der Vergleichsgruppe im Schafmodell, in der
Scaffolds ohne MSCs benutzt wurden, deutlich geringer oder gar nicht
ausgeprägt (Kon, Muraglia et al. 2000). In einer klinischen Studie an Kindern
mit Osteogenesis imperfecta konnte Horwitz nach allogener
Knochenmarktransplantation einen positiven Effekt auf das Knochenwachstum
und die Knochendichte der Patienten feststellen. Dieser Effekt ließ sich in einer
nachfolgenden Studie an den gleichen Patienten zusätzlich durch Infusion von
MSCs verbessern. Er konnte in nachfolgenden Untersuchungen auch das
Einwachsen der zuvor markierten MSCs und ihre Differenzierung zu
Osteoblasten im genetisch defekten Knochengewebe nachweisen (Horwitz,
Gordon et al. 2002). Da mittlerweile davon ausgegangen wird, dass die
Zellkultur in vitro die Eigenschaften der MSCs verändert und es sich um eine
kostspielige Prozedur handelt, rücken heute zunehmend Methoden in den
Vordergrund, die eine direkte Isolierung der MSCs mittels FACS und
nachfolgende Implantation in Scaffolds oder Verabreichung durch Infusion
verfolgen. Aslan konnte für CD105+-positive Zellen sowohl in vitro als auch in
vivo eine osteogene Differenzierung zeigen (Aslan, Zilberman et al. 2006).
Nach wie vor ist auch die Frage nicht hinreichend geklärt, woher MSCs für eine
Einleitung
17
bestimmte Indikation zu gewinnen sind. MSCs aus dem Periost zeigen zum
Beispiel ein stärkeres osteogenes Potential als solche aus der
Synovialmembran. Aufgrund dieser Ergebnisse erstellte De Bari ein Modell, mit
dem sich anhand knochenspezifischer Biomarker das osteogene Potential für
MSCs vor einer Implantation vorhersagen lässt (De Bari, Dell'Accio et al. 2008).
Da MSCs eine sehr heterogene Population darstellen, werden wohl in Zukunft
derartige Modelle einen immer wichtiger werdenden Beitrag zur Vorhersage des
therapeutischen Nutzens einer gewonnenen Stammzellpopulation haben.
Auch die Rekonstruktion von physiologischem Gelenkknorpel bereitet nach wie
vor Schwierigkeiten, da dieser eine hochkomplexe dreidimensionale Struktur
mit zonaler Gliederung der Chondrozyten und Extrazellularmatrix bei
unterschiedlichem Aufbau der einzelnen Zonen aufweist. Trotz positiver
Resultate der Autologen Chondrozytenimplantation (ACI) in der klinischen
Anwendung bei lokalisierten Knorpelschäden kann dieses Verfahren der
komplexen Struktur des Gelenkknorpels nicht gerecht werden und im Bereich
des Transplantats bildet sich in vivo eine eher homogene Extrazellularmatrix
ohne zonale Gliederung aus. Zudem ist die Frage nach geeigneten Materialien
für Transplantate in einen Knorpeldefekt (Scaffold, Hydrogel-Matrix, Bioprinting)
sowie nach dem Ursprungsort der zu transplantierenden Zellen (Chondrozyten
vs. MSCs) noch nicht ausreichend geklärt. Verschiedene Studien vergleichen
deshalb das chondrogene Potential einzelner MSC-Subpopulationen (Knorpel,
Knochenmark, Synovialmembran, Fettgewebe, Nabelschnur) miteinander. In
modernen Protokollen wird versucht der Mikrostruktur des Gelenkknorpels
schon bei der Kultivierung möglichst gerecht zu werden, indem bereits ex vivo
eine Dreischichtung in Außen-, Mittel- und Innenschicht konstruiert wird und die
MSCs innerhalb jeder Schicht unterschiedlichen Differenzierungsstimuli
ausgesetzt werden. Heute kann in Bioreaktoren jede konstruierte Schicht des
Transplantates variierenden mechanischen und biologischen Reizen ausgesetzt
werden, was für eine physiologische Knorpelarchitektur unvermeidlich
erscheint. Die Ergebnisse aus den Erfahrungen mit der ACI und aus aktuellen
Tiermodellen sollten in den kommenden Jahren in reproduzierbaren klinischen
Studien erprobt werden. In Zukunft wird versucht werden schon frühere Stadien
Einleitung
18
der Arthrose, in denen die tieferen Knorpelschichten noch intakt sind, einer
regenerativen Therapie zuzuführen (Klein, Malda et al. 2009).
Große Hoffnungen schüren die immunmodulatorischen Eigenschaften der
MSCs, die sie zu einem potenten Werkzeug in der Bekämpfung von
Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen machen. MSCs
scheinen innerhalb gesunden und verletzten Gewebes für eine Homöostase der
Signale und Interaktionen zwischen verschiedenen Zellen zu sorgen. Dabei
beeinflussen sie den Erhalt des Stammzellpools sowie die Differenzierung
innerhalb der HSC-Nische durch trophische und anti-apoptotische parakrine
Stimulation der HSCs und der stromalen Gewebszellen in deren Umgebung.
Sie sezernieren Zytokine, die anti-inflammatorisch und anti-proliferativ auf
Immunzellen wirken und somit eine physiologische Heilung verletzten Gewebes
begünstigen. Eine zentrale Rolle für biologische Funktionen der MSCs spielt die
Interaktion mit dem Immunsystem, indem sie unter anderem die Proliferation
von T-Lymphozyten zu unterdrücken vermögen (Di Nicola, Carlo-Stella et al.
2002). Sie greifen wechselseitig in das Zusammenspiel von T-Lymphozyten,
Dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen Granulozyten
und Natürlichen Killerzellen ein und wirken dabei dem Entzündungsgeschehen
entgegen, sodass sich in Anwesenheit von MSCs eine verminderte Expression
der proinflammatorischen Zytokine INFγ, IL-12 und TNFα und eine erhöhte
Expression der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 messen lässt.
Zudem nimmt die zytolytische Aktivität von Natürlichen Killerzellen und CD8+ T-
Lymphozyten ab, während die Proliferation von regulatorischen T-Zellen
zunimmt. Diese Mechanismen können jedoch in Anwesenheit von Bakterien
oder anderen infektiösen Agenzien durch Aktivierung von Toll-like Rezeptoren
(TLR) umgangen werden, sodass MSCs nicht zwangsläufig eine Infektneigung
begünstigen. Die untersuchten Mechanismen sind vielfältig und kompliziert.
Zusammenfassend lässt sich jedoch sagen, dass MSCs für eine Deeskalation
und Stabilisierung von überschießenden Entzündungsreaktionen sorgen
(Uccelli, Moretta et al. 2008).
Diese Erkenntnisse wecken Hoffnungen für neue Strategien bei der Therapie
von Autoimmunerkrankungen. Im Mausmodell mit Multipler Sklerose konnten
Einleitung
19
infundierte MSCs über immunregulierende Effekte an T-Zellen die Stärke der
Erkrankungsschübe abmildern, wobei eine Anergie der krankheits-
verursachenden T-Zellen beobachtet wurde (Zappia, Casazza et al. 2005).
Außerdem zeigten sich im Mausmodell mit Diabetes mellitus nach Infusion von
MSCs Reparaturmechanismen an den geschädigten pankreatischen Inselzellen
und den Nierenglomeruli (Lee, Seo et al. 2006). In einem anderen Mausmodell
zur Rheumatoiden Arthritis konnte eine abgeschwächte Immunaktivität in den
betroffenen Gelenken und somit auch eine verminderte Gelenkzerstörung in
Anwesenheit von hMSCs nachgewiesen werden (Augello, Tasso et al. 2007).
Daneben eröffnen die immunmodulatorischen Eigenschaften der MSCs in
zahlreichen Studien therapeutisches Potential für die Behandlung anderer
Krankheiten wie zum Beispiel Myokardinfarkt (Orlic, Kajstura et al. 2003),
Schlaganfall (Li, Chen et al. 2002), Akutes Nierenversagen (Togel, Hu et al.
2005) oder Leberversagen (Parekkadan, van Poll et al. 2007). Viel
versprechende Therapieansätze ergeben sich auch aus den Versuchen zu
Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen, vor allem bei der Graft-versus-
host-Krankheit, bei der sich T-Lymphozyten aus dem Transplantat gegen den
Empfängerorganismus richten (Le Blanc, Rasmusson et al. 2004).
Bei aller Euphorie für zukünftige Therapieoptionen wird weiterhin das
potenzielle Risiko für die Entstehung bösartiger Tumoren durch die Therapie mit
MSCs diskutiert. Ob die verabreichten Stammzellen durch Unterdrückung des
Immunsystems eine Tumorgenese begünstigen oder die eingebrachten Zellen
selbst bösartig entarten, bleibt in diesem Zusammenhang noch zu klären
(Djouad, Plence et al. 2003). Außerdem wurden viele Erwartungen in die
möglichen Regenerationsfähigkeiten der MSCs bisher leider noch enttäuscht
(Bianco 2011).
1.8. Zielsetzung dieser Dissertation
Die Differenzierbarkeit von MSCs in Knorpel, Knochen, Binde- und Fettgewebe
sowohl in vitro als auch in vivo konnte bereits in zahlreichen Versuchen
nachgewiesen werden. Es muss also in zukünftigen Forschungen der
Einleitung
20
Stammzellcharakter der MSCs und die In-vivo-Differenzierung in andere
mesenchymale Gewebe wie zum Beispiel Muskelgewebe genauer beschrieben
werden. Außerdem stellt sich nach wie vor die Frage welches Gewebe bzw.
welche anatomischen Strukturen im menschlichen Körper am besten geeignet
sind sowohl ein hohes Maß an Differenzierungspotential sowie einfache
Gewinnung der Zellen zu gewährleisten.
In diesem Zusammenhang möchte ich in dieser Dissertation zwei Arten von
MSCs miteinander vergleichen, nämlich die bereits oben erwähnten und
vielfach untersuchten stromalen (mhMSCs: bone marrow-derived human
mesenchymal stem cells) mit den auch schon beschriebenen trabekulären
(bhMSCs: trabecular bone-derived human mesenchymal stem cells). Beide
Populationen werden aus dem Knochen gewonnen, jedoch erscheint die
Biologie der bhMSCs innerhalb des mineralisierten Knochens insofern
interessant, als es sich bei ihnen im Vergleich zu den mhMSCs um eine
homogenere Zellpopulation zu handeln scheint. Beide Subpopulationen sollen
auf ihr Differenzierungspotential hin untersucht werden.
Material und Methoden
21
2. Material und Methoden
2.1. Materialen
Chemikalien und Reagenzien
Aceton AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland
Agarose (Mehrzweck-) Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland
Antikörperverdünnungspufferlösung DCS, Hamburg, Deutschland Aquatex® Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Bovines Serum Albumin BSA 0,5 %
Amersham Bioscienes Europe GmbH, Freiburg, Deutschland
dNTP Mix PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland
Ethanol AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland
Ethidiumbromid AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland
Ethylendiamintetraacetatsäure (EDTA)-Tetranatriumsalzhydrat
Calbiochem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland
HPLC-Wasser Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
HPLC-Wasser Rotisolv (RNAse-frei) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
LE-Agarose Biozym Scientific GmbH, Hessisch- Oldendorf, Deutschland
Levamisol DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland
Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma-Aldrich Biochemie GmbH, Hamburg, Deutschland
Mausserum PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Natriumchlorid (NaCl) AppliChem, gekauft bei ein GmbH, Würzburg, Deutschland
β-Mercaptoethanol AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland
PBS Dulbecco with Ca2+, Mg2+ PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Pferdeserum PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Trisbase)
AppliChem, gekauft bei ein GmbH, Würzburg, Deutschland
Trypanblau (0,4 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland
Material und Methoden
22
Zellkulturmedien und Bestandteile
DMEM/Ham’s F-12 mit L-Glutamin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Fetales Kälberserum (FBS) PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Penicillin/Streptomycin 100x (PenStrep)
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Stammzellmedium (SZM) DMEM/Ham’s F-12 mit L-Glutamin 10% Fetales Kälberserum (FBS) 100 U/mL Penicillin 100 µg/mL Streptomycin 50 µg/mL L-Ascorbinsäure-2-Phosphat
Ca2+ freies SZM Zusammensetzung wie normales SZM, jedoch ohne Ca2+
Enzyme
Kollagenase XI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland
Reverse Transkriptase Promega GmbH, Mannheim, Deutschland Taq DNA-Polymerase PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen,
Deutschland 2,5% Trypsin (10x konzentriert) PAA Laboratories GmbH, Pasching,
Österreich
Puffer- und andere Lösungen
Blockierungslösung 1 g BSA 2,5 mL Pferdeserum 47,5 mL 1xTBS
Hämalaunlösung 6 g Hämatoxylin 1 g Natriumiodid 250 g Aluminiumkaliumsulfat 250 g Chlorhydrat 5 g Zitronensäure 5 l destilliertes Wasser 4 Wochen offene Lagerung bis Gebrauch
Kollagenasemischung 5 mg Kollagenase XI 5 ml DMEM/ F12 + PenStrep Mischung
Ladepuffer (Loading buffer), 5-fach konzentriert
0,25% Bromphenolblau (w/v) 0,25% (Xylencyanol (w/v) 30% Glycerin (w/v) 1 mM EDTA
1xPBS/ EDTA 9,55 g PBS Dulbecco w/o Ca2+, Mg2+ 0,2 g EDTA-Tetranatriumsalzhydrat 1 l destilliertes Wasser pH auf 7,4 eingestellt und autoklaviert
Material und Methoden
23
10xTBE (Tris-Borat-EDTA) 108 g Trisbase 55 g Borsäure 9,05 g EDTA-Tetranatriumsalzhydrat 1 l destilliertes Wasser pH auf 8,3 eingestellt und autoklaviert
Tris-Puffer 6,057 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan 8,010 g NaCl 1 l destilliertes Wasser pH auf 7,4 eingestellt
0,25% Trypsin 5 ml 2,5% Trypsin (steril) 50 ml 1xPBS
Waschpufferlösung
Vorratslösung: 10xTBS (0,5 M); pH 7,6 60,6 g Trisbase 87,66 g NaCl 1 l destilliertes Wasser pH-Einstellung auf 7,6; Autoklavieren Arbeitslösung: 1xTBS (0,05 M); pH 7,6 10xTBS 1:10 mit dest. Wasser verdünnt Ergänzen mit 0,5% Tween 20
Bausätze
Nucleospin RNA II Kit Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland
Super SensitiveTM ICH Detection System
BioGenex Laboratories, USA Bestandteile: - Link MultiLink® (Mouse, Rabbit): Konzentrierte biotinylierte Anti-Immunglobuline in PBS mit Carrierprotein und 0,09% Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Link Diluent - Label Alkaline Phosphatase Label: Konzentriert, mit alkalischem Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Label Diluent - Substrat-Chrmogen Fast Red Chromogen - Substrat-Puffer Naphtolphosphat
Material und Methoden
24
Antikörper für die Immuncytochemie
Antikörper Antikörperentität Bestellnummer Hersteller Anti-human CD24
Maus IgG2a, κ Katalog Nr: 311102, Clone: ML5; Workshop Nr: V CD24.5
BIOZOL, Eching, Deutschland
Polyklonaler Kaninchen Anti-Maus-AK
Polyklonaler Kaninchen Anti-Kaninchen, Immunoglobulin, mit Peroxidase konjugiert
Code Nr. P 0449 Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Bio
2.2. Methoden
2.2.1. Zellen und Zellkultur
Für die Gewinnung der MSCs wurde nach einem Protokoll von Haynesworth
vorgegangen, das von Nöth et. al. modifiziert wurde. Das Knochenmaterial
wurde dabei aus Hüftköpfen von 7 Patienten gewonnen, die im Zuge einer
Coxarthrose einen kompletten künstlichen Gelenkersatz (Totale Endoprothese,
TEP) der Hüfte erhielten (Haynesworth, Goshima et al. 1992; Noth, Osyczka et
al. 2002). Diese Patienten hatten am Operationstag ein Alter von 41 bis 59
Jahren (45 Jahre im Mittel), es waren 4 weibliche und 3 männliche Patienten.
Internistische Vorerkrankungen mit Einfluss auf den Knochenstoffwechsel oder
systemische Einnahme von Medikamenten, die den Knochenstoffwechsel
beeinflussen, konnten bei allen Patienten ausgeschlossen werden. Einzig die
Einnahme von NSAR (Nicht-steroidale Antirheumatika) zur Schmerztherapie
der Coxarthrose wurde angegeben. Nachfolgend werden die jeweils
unterschiedlichen Isolationsmethoden für die mhMSCs und die bhMSCs
beschrieben. Es sei schon hier darauf hingewiesen, dass für viele
Versuchsreihen nur Proben von 6 Patienten verwendet wurden.
Material und Methoden
25
mhMSCs:
Als Knochenmaterial für die mhMSC-Gewinnung wurden Knochenmark und
Spongiosa aus dem aufgefrästen Femurschaft sowie Knochenfragmente aus
den resezierten Hüftköpfen mit einer scharfen Bürette entnommen. Davon
wurden jeweils 20 ml in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gebracht, das
anschließend mit normalem Stammzellmedium (SZM: DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium)/ Ham’s F-12 mit L-Glutamin, 10% fetales Kälberserum
(FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 50 µg/ml L-Ascorbinsäure-
2-Phosphat) auf 50 ml aufgefüllt und schüttelnd durchmischt wurde. Die
Röhrchen wurden dann 5 Minuten lang bei 1200 x g zentrifugiert und der
Überstand abgesaugt, wieder mit SZM aufgefüllt und durch nochmaliges
Schütteln versucht die mhMSCs vom Knochen zu trennen. Im Anschluss ließ
man die schweren Sedimente am Grund der Röhrchen absetzen, der Inhalt
wurde durch ein Zellsieb von Knochenstückchen befreit, in ein neues
Zentrifugenröhrchen überführt und nochmals zentrifugiert. Nach Absaugen des
überstehenden Mediums wurde der Vorgang (Auffüllen, Schütteln,
Zentrifugieren, Absaugen) noch 4 Mal wiederholt um möglichst viele mhMSCs
zu mobilisieren. Nach dem erneuten vorsichtigen Absaugen des Überstandes
wurde das Zellsediment mit 30 ml normalem SZM aufgefüllt und wiederholt auf-
und abpipettiert. Aus der durchmischten Zellsuspension wurden anschließend
50 µl für die Auszählung in einer Zählkammer entnommen, mit 50 µl Trypanblau
(0,4%) gemischt und mit Phosphatpuffer (PBS) im Verhältnis 1:400 verdünnt.
Weiterhin wurden ca. 8x108 Zellen in Gewebekulturflaschen (175 cm2) ausgesät
und bei 37°C in feuchter Atmosphäre (95% Luft, 5% CO2) kultiviert. Danach
wurden die nicht adhärenten Zellen durch Aspiration der Zellsuspension
entfernt und die am Plastik adhärenten Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Im
weiteren Verlauf wurde das SZM alle drei Tage gewechselt bis nach ungefähr 2
Wochen unter mikroskopischer Kontrolle eine Konfluenz der adhärenten Zellen
von ca. 80% festgestellt wurde, sodass die Zellen abgeerntet werden konnten,
indem sie 5 Minuten lang mit PBS und weitere 2 Minuten mit 0,25% Trypsin/
EDTA bei 37°C inkubiert wurden. Eine anschließende Inaktivierung des
Trypsins wurde durch nochmalige Bedeckung der Zellen mit SZM erreicht.
Material und Methoden
26
bhMSCs:
Bei den bhMSCs handelt es sich um eine trabekuläre Subkultur der MSCs, die
an den Knochentrabekeln der Spongiosa haften. Mit der scharfen Bürette
wurden kleine Knochenblöcke aus den Hüftköpfen gewonnen, die in gebackene
Glasgefäße gebracht wurden, welche mit Nährmedium (DMEM/ F12 +
PenStrep) aufgefüllt wurden. Nach der Zerkleinerung der Knochenstücke in
sogenannte Bone Chips mit einer gebackenen Schere wurde der Überstand der
Suspension abgesaugt und anschließend wieder mit demselben Nährmedium
aufgefüllt, ein Vorgang der noch 3 Mal wiederholt wurde. Das am Grund der
Flasche abgesetzte Sediment wurde dann in ein Zentrifugenröhrchen gegeben,
das mit Nährmedium (DMEM/ F12 + PenStrep) gefüllt wurde unter Zugabe von
Kollagenasegemisch (5 mg Kollagenase XI, 5 ml DMEM/ F12+ PenStrep-
Medium) und Durchmischung der Suspension auf dem Rührfisch für eine
Stunde. Im weiteren Verlauf wurde der Überstand aus dem Röhrchen aspiriert
und mit PBS aufgefüllt und geschüttelt. Anschließend wurde erneut sämtlicher
Überstand bis auf einen klaren Rest abgesaugt und verworfen, wonach das
Zentrifugenröhrchen mit Ca2+-freiem SZM (normales SZM ohne Ca2+) gefüllt
und geschüttelt wurde. Dabei ergab sich eine Suspension, von der jeweils die
Hälfte zusammen mit je 23 ml Ca2+-freiem SZM in 2 Zellkulturflaschen (175
cm2) gefüllt wurde. Diese Zellen wurden dann bei 37°C unter feuchter
Atmosphäre (95% Luft, 5% CO2) kultiviert, wobei alle 3 Tage das Ca2+-freie
Medium gewechselt wurde. Nach ungefähr 2 Wochen konnte unter dem
Mikroskop ein Herauswachsen der bhMSCs aus den Bone Chips beobachtet
werden, die Zellkulturflaschen wurden dann vorsichtig geschüttelt um die Zellen
von den Knochentrabekeln zu lösen, welche anschließend entfernt wurden.
Nach Zugabe von normalem Ca2+-haltigen SZM konnte nach ungefähr 4
Wochen eine Konfluenz von ca. 80% der adhärenten Zellen auf dem Plastik der
Zellkulturflaschen beobachtet werden, sodass die Zellen nach dem gleichen
Verfahren wie die mhMSCs abgeerntet werden konnten.
Material und Methoden
27
2.2.2. RNA- Isolation mit dem Kit „Nucleospin RNA II“
Zur Vorbereitung der RNA-Ernte aus den Zellkulturen wurde vorerst das
Medium aus den Zellkulturflaschen aspiriert. In die Flaschen wurde dann 350 µl
RA1 (Lysispuffer aus dem Kit „Nucleospin RNA II“) und 3,5 µl Mercaptoethanol
durch Pipettierung zugegeben und die Zellen vom Plastikgrund abgekratzt.
Diese Zellsuspension wurde in ein Reaktionsgefäß abpipettiert. Eine Zerstörung
der Zellen wurde im Anschluss durch mehrmaliges Aufziehen durch eine 20
Gauge Nadel und Durchmischung erreicht. Die anschließende Verarbeitung der
RNA wurde mit dem Kit „Nucleospin RNA II“ durchgeführt. Vorerst befreite
man die lysierte Zellsuspension von groben Verunreinigungen mittels
Zentrifugation durch ein Filter-Röhrchen. Es fand dann eine Zentrifugation über
eine Silicatmembran statt, nachdem 350 µl 70% Ethanol zugegeben worden
waren, wobei eine optimale Bindung der RNA an die Membran durch den
Lysispuffer erreicht wurde. DNA-Reste wurden noch durch zusätzliche
Inkubation mit DNAse beseitigt und durch wiederholte Waschung und
Zentrifugation mit den Pufferlösungen aus dem Kit (1x RA2, 2x RA3) wurden
Salze, höhermolekulare Zellbestandteile und andere Protein-Rückstände von
der Silicatmembran entfernt, um nur noch RNA-Rückstände an der
Silicatmembran zu erhalten. Diese Membran wurde in ein Nuklease-freies
Reaktionsgefäß gelegt und die aufgereinigte RNA unter Zugabe von 60 µl
RNAse-freiem H2O aus dem Kit zentrifugiert und somit herausgelöst.
Anschließend wurde 1 µl RNA-Gemisch mit 49 µl HPLC-H2O in einer UV-
lichtdurchlässigen Küvette verdünnt und der RNA-Gehalt im Eppendorf
Biophotometer 6131 bei 260 nm bestimmt und mit einer Negativ-Probe aus
reinem HPLC-H2O verglichen, wobei jede Probe auch einer Messung bei den
Wellenlängen 230 nm und 280 nm unterzogen wurde, um Verunreinigungen der
RNA auszuschließen. Kohlenhydrat- und Peptidverunreinigungen absorbieren
nämlich Licht bei einer Wellenlänge von 230 nm, höhermolekulare
Proteinverunreinigungen hingegen bei 280 nm. Die Quotienten E260/E230 bzw.
E260/E280 sind dabei ein Maß für die Reinheit und sollen für E260/E230 Werte
Material und Methoden
28
größer als 2 bzw. zwischen 1,8 und 2 für E260/E280 ergeben. Die aufgereinigte
und quantifizierte RNA wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C tiefgefroren.
2.2.3. cDNA-Synthese
Die tiefgefrorene RNA wurde aus der -80°C-Tiefkühltruhe herausgenommen
und auf Eis langsam aufgetaut. Anhand der zuvor gemessenen RNA-
Konzentration wurde eine RNA-Menge von 2 µg errechnet und mit HLPC-H2O
und 1 µl Oligo-dT (50 pmol) als Primer auf 18 µl Volumen aufgefüllt. Zum
Auflösen von Sekundärstrukturen der RNA und zur Anlagerung des Primers
wurde die Probe für 5 Minuten auf 70°C erhitzt und anschließend auf Eis zum
Arretieren gebracht. Diesem Gemisch wurden 7 µl eines Mastermixes (5 µl
Transkriptionspuffer, 0,625 µl dNTP (20mM), 1 µl Reverse Transkriptase, 0,375
µl HLPC-H2O) zugegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert. Durch
60-minütige Inkubation bei 42°C wurde schließlich eine Elongation der cDNA-
Einzelstränge erreicht und die Reaktion wurde gestoppt durch Denaturierung
der Reversen Transkriptase bei 95°C für 10 Minuten. Dieses cDNA-Gemisch
wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C eingelagert.
2.2.4. Array-Analyse
Bei der Array-Analyse wurde mittles Agarose-Gel-Elektrophorese die Reinheit
der RNA in einem Gemisch aus 2µg RNA mit 5µl RNA Ladepuffer (0,25%
Bromphenolblau (w/v); 0,25% Xylencyanol (w/v); 30% Glycerin (w/v); 1mM
EDTA) überprüft. Anschließend schickte man 10 µg der RNA zu Herrn Priv.-
Doz. Dr. Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie, Uniklinikum Essen), der durch
einen Affymetrix GeneChip HG-U 133 Plus 2.0 (High Wycombe,
Großbritannien) die Genexpression der mhMSCs und bhMSCs analysierte,
nach den Angaben im Affymetrix GeneChip Expression Analysis Handbuch
(www.affymetrix.com). Dafür wurden aus dem gesamten RNA-Material
biotinylierte cRNA hergestellt und diese auf einem GeneChip mit mehr als
54.000 Oligonukleotiden, sogenannten Probesets, hybridisiert. Mit dem
Material und Methoden
29
Genechip konnten dadurch insgesamt 47.400 Transkripte und 38.500 Gene
durch ihr Hybridisierungsverhalten untersucht werden
(http://www.affymetrix.com/support/technical/datasheets/human_datasheet.pdf).
Die Signale bei der Hybridisierung wurden dabei mit einem Affymetrix
GeneChip Scanner 3000 erfasst und durch Affymetrix GeneChip Operating
Software 1.2 und Data Mining Tool 3.1 analysiert. Als Maß für die
Genexpression entstanden dabei unterschiedliche Signalstärken eines Gens
bzw. Transkripts, die jeweils für mhMSCs und bhMSCs gegenübergestellt
wurden. Die Transkriptmenge innerhalb der beiden Zellproben wurde mittels
„significance analysis of microarrays (SAM)“ (http://www-
stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) (Tusher, Tibshirani et al. 2001) bestimmt. Im
Verlauf fiel eine Kontamination der mhMSC-Zellkultur der Passage 0 mit
Plasmazellen auf, daher wurde ein weiterer Array mit Zellen aus der Passage 1
gerechnet, der keine Kontamination aufwies, aber unterschiedliche Ergebnisse
erbrachte (siehe Ergebnisse und Diskussion).
Die unterschiedlichen Expressionsmuster der mhMSC-Kultur vor und nach
Passagieren (P0 und P1) stellten wir graphisch in einer Heatmap dar. Dadurch
konnten wir größere Datenmengen anschaulich in einem Farbdiagramm
darstellen, in diesem Fall die Signalstärken einzelner Probesets aus dem
Microarray. Eine helle Rotfärbung zeigte eine starke Expression in der
Patientenprobe an, wohingegen eine helle Grünfärbung für sehr schwache
Expression stand. Die Daten der relevanten Probesets aus dem Array wurden
über die Internetplattform CARMAweb (Comprehensive R based Microarray
Analysis web service) eingelesen (Rainer, Sanchez-Cabo et al. 2006), woraus
sich die Abbildungen 7b und 7c ergaben.
2.2.5. RT-PCR
Oligonukleotide
Für einige Primer (Oligonukleotide) waren die Bedingungen für die Polymerase
Kettenreaktion (PCR) bekannt und wurden daher übernommen, bei anderen
Primern wurden die optimalen Bedingungen erst ausgetestet. Dabei wurden die
Material und Methoden
30
Primersequenz Produktgröße (bp)
Sequenz ID (NCBI)
Gen EF1-α1 (Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1)
235 NM_001402
sense: anitsense:
5’-AGGTGATTATCCTGAACCATCC-3’ 5’-AAAGGTGGATAGTCTGAGAAGC-3’
IBSP (integrin-binding sialoprotein) 467 NM_004967 sense: antisense:
5’-GCCTGTGCTTTCTCAA-3’ 5’-ACTTCTGCTTCGCTTT-3’
ALP (Alkaline Phosphatase) 454 NM_000478 sense: anitsense:
5’-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3’ 5’-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC -3’
OPN (Osteopontin, Secreted phosphoprotein 1) 483 NM_000582 sense: anitsense:
5’-ACGCCGACCAAGGAAAACTC-3’ 5’-GTCCATAAACCACACTATCAG-3’
Col1 (Kollagen1) 461 NM_000088 sense: anitsense:
5’-GGACACAATGGATTGCAAGG-3’ 5’-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3’
OC (Osteocalcin, Bone Gla protein) 293 NM_000711 sense: anitsense:
5’-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3’ 5’-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3’
Nid 1 (Nidogen 1) 427 NM_002508 sense: anitsense:
5’-CAACCCTCAGACAGACTTATACACCC-3’ 5’-GCTGCTCATTATCATCCACCAAAT-3’
Nid2 (Nidogen 2) 645 NM_007361 sense: anitsense:
5’-AGACGGTTCGTATCACTCAAA-3’ 5’-GCCGGTCATCTGCAAACTCA-3’
TPM1 (Tropomyosin 1) 257 NM_000366 sense: anitsense:
5’-GCCAATGATAGAGTCAACAGGAA-3’ 5’-GTGCCAATCAGAAAGGAATGGAAGT-3’
MLC1SA (MYL6B, Myosin Light Chain 6B) 147 NM_002475 sense: anitsense:
5’-AAGAACCGAGGCCAAGGCACATA-3’ 5’-GGTCTCCACCTCCTCCTCAGTCATCT-3’
MYOF (Myoferlin) 213 NM_013451 sense: anitsense:
5’-CTGTTCCTGCTTATCCTGCTGCTC-3’ 5’-GACATGGCGTAACCTGCTACTGG-3’
MyoD1 (Myogenic Differentiation 1) 765 NM_002478 sense: anitsense:
5’-CTGCACGTCGAGCAATCCAAACC-3’ 5’-CGAGAAGGGTGCTGCGTGGAAAA-3’
Myog (Myogenin, Myogenic Factor 4) 415 NM_002479 sense: anitsense:
5’-AGGGAGAAGCGCAGGCTCAAGAA-3’ 5’-AATCTCAGTTGGGCATGGTTTCAT-3’
Pax3 (Paired Box 3) 436 NM_013942 sense: anitsense:
5’-AGAGGAAGGAGGCAGAGGAAA-3’ 5’-GGAATAGATGTGGGCTGGTAA-3’
Pax7 (Paired Box 7) 188 NM_002584 sense: anitsense:
5’-CGTCTCCAAGATTCTTTGCCGCTA-3’ 5’-GGTCACAGTGCCCATCCTTCAGC-3’
CD24 230 NM_013230 sense: anitsense:
5’-AGGGCAATGATGAATGAGAAT -3’ 5’-CTGGGCGACAAAGTGAGA-3’
TRIB2 (tribbles homolog 2) 439 NM_021643 sense: anitsense:
5’-ACTTGTCGCATTGCGTTTCTTC-3’ 5’-GGCGTCTTCCAGGCTTTCC-3’
Abb. 1: Verwendete Gene mit Primersequenzen, Produktlänge und Sequenz-ID
Material und Methoden
31
Bedingungen, wenn möglich, so ausgewählt, dass die Primer verschiedene
Exons überspannten, um falsch positive Nachweise von Verunreinigungen aus
genomischer DNA in den RNA-Proben zu vermeiden. Alle Oligonukleotide
wurden von der Firma Biomers, Ulm bezogen. Gemäß Herstellerangaben
wurden die Oligonukleotide in HPLC-H2O gelöst und verdünnt. Die verwendeten
Gene und die für den Nachweis benutzten Primersequenzen sind in Abbildung
1 (Abb. 1) charakterisiert.
Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT -PCR)
Um die cDNA-Menge verschiedener Gene in den beiden Proben mengenmäßig
sichtbar zu machen, wurden unter Verwendung spezifischer Primer bestimmte
Gene im Sinne von RNA-Äquivalenten in den kultivierten Stammzellen durch
Polymerase Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt, wobei die Amplifikation mittels
hitzestabiler Taq-DNA-Polymerase durchgeführt wurde. Reverse Transkription
beschreibt dabei die Umwandlung der ursprünglichen RNA in komplementäre
DNA (cDNA). In der Abbildung 1 findet man eine Auflistung und Kennzeichnung
der verwendeten Primer, während die Abbildung 2 die jeweils unterschiedlichen
Bedingungen für die PCR darstellt, die in Versuchen ausgetestet wurden. Dabei
wurde für jede Versuchsanordnung ein Mastermix hergestellt: je 1 µl Primer
(sense + antisense, 25 pmol/µl), 5 µl 10xPuffer (blauer bzw. roter Puffer,
zusammen mit Taq-DNA-Polymerase geliefert), 1 µl dNTP (20 mM), 0,3 µl Taq
DNA Polymerase und je nach ausgetesteten Bedingungen für einige Primer
noch zusätzlich MgCl2. Der blaue Puffer sollte dabei eher ein spezifischeres
PCR-Produkt garantieren, der rote Puffer hingegen eine höhere
Produktausbeute. Allerdings wurde der rote Puffer aufgrund der vorherigen
Austestung im Nachhinein für keinen Ansatz verwendet. Dieser Mastermix
wurde dann durch HPLC-H2O so ergänzt, dass sich ein Volumen von 49 µl
ergab. Anschließend wurde noch 1 µl cDNA der jeweiligen Probe in das PCR-
Reaktionsgefäß beigemischt und eine Negativprobe ohne cDNA angefertigt um
ein Gesamtvolumen von je 50 µl in allen Proben zu erhalten. Diese wurden
dann im Thermcycler Primus nach unten aufgeführten Bedingungen
vervielfältigt.
Material und Methoden
32
Phasen der konventionellen RT- PCR:
94°C 4 min initiale Denaturierung der DNA-Doppelstränge
40x (wenn nicht anders angegeben)
94°C 30 sec Denaturierung
Annealing Temperatur 30 sec Anlagerung Primer
72°C 30 sec Elongation
72°C 10 min terminale Elongation
12°C Abkühlung
Dabei gab es Variationen sowohl der Annealing Temperatur als auch der
Anzahl der Zyklen (siehe Abb. 2).
Primer MgCl2 in µl Annealing Temperatur in °C
Anzahl der Zyklen Puffer
EF1α 0 54°C 40 blau ALP 0 51°C 40 blau IBSP 0 54°C 40 blau OPN 0 58°C 35 blau Col1 0 52°C 35 blau OC 0 60°C 35 blau Nid1 1 55°C 40 blau Nid2 1 55°C 35 blau TPM1 1 53°C 40 blau MLC1SA 1 57°C 32 blau MYOF 0 55°C 33 blau MyoD1 0 64°C 40 blau Myog 0 58°C 40 blau Pax3 0 56°C 40 blau Pax7 0 60°C 40 blau CD24 1 58°C 37 blau AHNAK 0 56°C 40 blau TRIB2 2 57°C 40 blau Abb. 2: PCR-Bedingungen der verwendeten Gene
Material und Methoden
33
2.2.6. Agarose-Gel-Elektrophorese
Zur optischen Darstellung der vervielfältigten cDNA wurde im Anschluss an jede
PCR eine Elektrophorese in Agarose-Gel durchgeführt. Zur Herstellung des 1%
Agarose-Gels wurde auf je 100 ml TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)
Borat EDTA Puffer (TBE) 1 g Agarose in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben
gemischt und bei 400 W ca. 3 min in einem Mikrowellenherd erhitzt.
Anschließend wurde Ethidiumbromid zugegeben, wobei sich eine Konzentration
von 10 µg/ml im Gel ergab. Ethidiumbromid vermag mit doppelsträngiger DNA
zu interkalieren und leuchtet anschließend unter UV-Bestrahlung. Dieses
flüssige Gel wurde dann auf einen Gelträger gegossen, in dem ein eingesetzter
Kamm während der Aushärtung des Gels Taschen zum späteren Einbringen
der amplifizierten DNA-Proben schaffte. Nach ca. 1 Stunde war das Gel bei
Raumtemperatur abgekühlt und ausgehärtet. Im Anschluss wurden je 10 µl der
PCR-Proben inklusive der Negativprobe nacheinander auf das Gel geladen,
wobei in die letzte Tasche ein 100 bp Marker zur anschließenden
Größenzuordnung der PCR-Banden eingebracht wurde. Bei manchen
Versuchen wurden auch zusätzlich PCR-Produkte aus hMSC-TERT analysiert
(Weber, Pohl et al. 2007): Mesenchymale Stammzellen, die mit Telomerase
Reverser Transkriptase immortalisiert wurden. Dann wurde in einem TBE-Bad
eine Spannung von ca. 90 V für ungefähr 40 - 60 min angelegt, wobei die
negativ geladene DNA entlang des elektrischen Feldes im Bad zum Plus-Pol
wanderte. Schließlich wurden die Gele unter UV-Bestrahlung auf einem
Leuchttisch in einer Dunkelkammer mit Foto-Dokumentation abgelichtet und
digital gespeichert.
2.2.7. Immuncytochemie
Eine unterschiedliche Expression des Oberflächenproteins CD24 in den
jeweiligen Zellkulturen sollte auch mittels Immuncytochemie veranschaulicht
werden. Dafür wurden je 5000 mhMSCs und bhMSCs aus Passage 1 auf
Objektträgern in Chamber-Slides (8 Well) ausgesät und 24 Stunden bei 37°C in
Material und Methoden
34
feuchter Atmosphäre von 95% Luft mit 5% CO2 inkubiert. Diese Zellen mussten
dann fixiert werden, indem das SZM entfernt wurde, die Zellen mit PBS
gewaschen und mit Ethanol und Aceton benetzt wurden, um abschließend noch
einmal mit PBS gewaschen zu werden. Somit konnten die Zellen in den
Zellkammern fixiert und bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Für
die Färbungen wurden jeweils Verdünnungen des Antikörpers bzw. des Maus-
Serums von 1:10, 1:50, 1:100 oder 1:200 miteinander verglichen und das
jeweils deutlichste Ergebnis verwendet.
Immuncytochemische Färbungen für CD24
Die in den Chamber-Slides auf Objektträgern fixierten Zellen wurden 20 min bei
Raumtemperatur aufgetaut und anschließend auf den Slides mit einem Fettstift
großzügig eingekreist. Für den im Versuch verwendeten Waschpuffer (1xTBS)
wurde die vorhandene 10xTBS-Stammlösung (10xTBS (0,5 M), pH 7,6: 60,6 g
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 87,66 g NaCl, in 1000 ml destilliertem
Wasser lösen, pH einstellen auf 7,6, autoklavieren) im Verhältnis 1:10 mit
destilliertem Wasser verdünnt. Initial wurden die Zellen kurz mit Waschpuffer
(1xTBS) gespült und 15 min lang mit 1xTBS rehydriert. Nach Abpipettieren des
Puffers wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit ca. 150 µl
Blockierungslösung (aus BSA und Pferdeserum: 1 g BSA (Bovines
Serumalbumin), 2,5 ml Pferdeserum, 47,5 ml 1xTBS) für 20 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit ca. 150 µl des
primären Antikörpers (CD24) in seiner jeweiligen Verdünnung (1:10, 1:50,
1:100, 1:200) über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Für die
Negativkontrolle wurde über Nacht unter gleichen Bedingungen mit Maus-
Serum inkubiert, das in einer Konzentration von 330 µg/ml vorrätig war und auf
die gleiche Konzentration wie die des Primärantikörpers eingestellt wurde.
Die Immuncytochemie wurde am folgenden Tag durchgeführt. Dafür wurde das
BioGenex Super SensitiveTM ICH Detection System verwendet, das aus Link,
Label, Substrat-Chromogen und Substrat-Puffer bestand: Link (MultiLink®
(Mouse, Rabbit: Konzentrierte biotinylierte Anti-Immunglobuline in PBS mit
Carrierprotein und 0,09% Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Link Diluent),
Material und Methoden
35
Label (Alkaline Phosphatase Label: Konzentriertes, mit alkalischer Phosphatase
konjugiertes Streptavidin in PBS mit Carrierprotein und 0,09% Natriumazid,
1:100 Verdünnung mit Label Diluent), Substrat-Chromogen (Fast Red
Chromogen) und Substrat-Puffer (Naphtolphosphat). Die Zellen wurden
anfangs 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen und dann mit 1 - 3 Tropfen Link pro
Objektträger überschichtet und 20 min in einer feuchten Kammer bei
Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurde das Fast Red
Chromogen mit dem Substrat-Puffer angesetzt und 3 Tropfen Levamisol
zugegeben, um die endogene Alkalische Phosphatase zu blockieren. Die Zellen
wurden 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen und im Anschluss daran mit 1 - 3
Tropfen Label für weitere 20 min bei Raumtemperatur in einer feuchten
Kammer inkubiert. Nach 3 erneuten Waschgängen mit Waschpuffer wurden die
Objektträger 3 - 5 min mit dem Fast Red Chromogen gefärbt. Dieser wurde in 3
Waschgängen mit destilliertem Wasser wieder entfernt, die Zellen ca. 1 min in
destilliertem Wasser belassen und anschließend mit Hämalaun (6 g
Hämatoxylin, 1 g Natriumiodid, 250 g Aluminiumkaliumsulfat, 250 g Chlorhydrat,
5 g Zitronensäure, 5 l destilliertes Wasser) 25 sec gegengefärbt. Nach erneuter
dreimaliger Waschung in destilliertem Wasser wurden die Objektträger kurz
unter Leitungswasser gebläut und mit wässrigem Eindeckmittel (Aquatex)
benetzt.
Im Anschluss wurden die eingedeckten Objektträger unter dem Mikroskop
analysiert und digital photographiert.
Ergebnisse
36
3. Ergebnisse
3.1. Array-Analysen
Für die Array-Analysen wurde die RNA aus der Zellkultur der Passage 0 isoliert.
Da nachträglich in der Analyse der RNA der mhMSCs der Passage 0 eine
Kontamination mit Plasmazellen auffiel, wurde nach Zellsplitting ein erneuter
zweiter Array mit RNA von Zellen der Passage 1 ausgewertet (Array Passage 0
mit RNA von 6 Spendern bzw. Passage 1 mit RNA von 4 mhMSC-Spendern).
Dabei ist zu erwähnen, dass für den Array der Passage 0 mhMSCs und
bhMSCs jeweils von den gleichen Spendern stammten, was sich für den
Passage 1-Array nicht mehr verwirklichen ließ.
Der Array wurde von Herrn PD Dr. Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie,
Universitätsklinikum Essen) angefertigt. Dafür wurden je 10 µg RNA aus den
Kulturen der mhMSCs und der bhMSCs jedes Patienten gewonnen und für den
Array nach Essen verschickt, wo die Genexpression beider Zellsorten durch
einen Affymetrix GeneChip HG-U 133 Plus 2.0 (High Wycombe,
Großbritannien) gemäß der Verfahrensanweisungen des Herstellers analysiert
wurde.
Die Ergebnisse des Microarrays wurden im Anschluss in einer SAM
(Significance Analysis of Microarrays) miteinander verrechnet, sodass mittlere
Werte für die Expressionsunterschiede entstanden, so genannte Fold Changes,
anhand derer bestimmte Gene genauer untersucht wurden (ein Fold Change
von 2 entspricht dabei beispielsweise einem 2-fachen Expressionsunterschied
zwischen mhMSCs und bhMSCs).
Array-Analysen (RNA Passage 0)
Im Array der Passage 0 zeigte sich eine differentielle Expression von 587
Probesets. Neben einem Signifikanzlevel unter 0,1 (q-value < 0,1) wurde
mindestens ein 2-facher Expressionsunterschied (Fold Change) gefordert,
wobei 394 Probesets in den mhMSCs stärker exprimiert waren (Fold Change >
2) und 193 eine erhöhte Expression in den bhMSCs aufwiesen (Fold Change <
Ergebnisse
37
Abb. 3: Passage 0 – allgemeine Expressionsunterschiede im Microarray
Ergebnisse
38
0,5). Einige Gene wurden anschließend bestimmten mesenchymalen Geweben
zugeteilt, wobei Markergene bzw. für die Differenzierung oder den Stoffwechsel
des jeweiligen Gewebes bedeutende Gene ausgewählt und graphisch
dargestellt wurden. Manche Probesets erfüllten zwar nur teilweise die
geforderten Kriterien, erschienen jedoch trotzdem interessant für weitere
Analysen zu sein. Anschließend wurde versucht diese Ergebnisse durch PCR
zu bestätigen, wobei cDNA aus derselben RNA Verwendung fand, die für den
Microarray eingeschickt wurde. In den graphischen Darstellungen wird
vereinfacht bei mhMSCs von MSCs und bei bhMSCs von BCs die Rede sein,
wobei die Nummer einem bestimmten Patientenindividuum entspricht.
Auffallend waren extreme Expressionsunterschiede für leichte und schwere
Immunglobulinketten, die ausschließlich von Plasmazellen synthetisiert werden.
Das Diagramm der Abbildung 3 zeigt dafür exemplarisch die 10 am stärksten
exprimierten Probesets des Microarrays der RNA aus Passage 0 sowie einige
myogene sowie osteogene Marker und zuletzt 3 Probesets, die auch im Array
der Passage 1 differentiell exprimiert waren. Der Fold Change, also das Maß für
den Expressionsunterschied zwischen mhMSCs und bhMSCs, ist dabei jeweils
farblich grün und rot gekennzeichnet, ein Fold Change von 2,0 im Array
beschreibt eine doppelt so hohe Expression eines Genes in den mhMSCs, ein
Fold Change von 0,5 eine doppelt so hohe Expression in den bhMSCs. Um
eine bessere Übersichtlichkeit zu gewährleisten und die Ergebnisse auf einen
Blick vergleichen zu können, wurden Fold Changes < 1 (stärkere Expression
durch bhMSCs) in den Kehrwert überführt; 0,5 entsprach also einem Fold
Change von 2. Je heller dabei der dargestellte Farbton, desto höher der
Expressionsunterschied. In der Abbildung wurde der im SAM errechnete
Mittelwert aller 6 Patientenproben (271, 281, 289, 290, 298, 299) verwendet,
um einen ungefähren Trend im Array dann in weiteren Versuchen bestätigen zu
können. Bei der genaueren Auswertung der einzelnen Patientenproben fielen
bei manchen Genen individuelle Unterschiede auf.
Ergebnisse
39
3.2. Bestätigung der Ergebnisse durch RT-PCR (Passa ge 0)
Nach Analyse der Ergebnisse des Arrays wurden einige Gene mittels RT-PCR
noch genauer untersucht, um dadurch die Ergebnisse des Arrays zu bestätigen.
Die Ergebnisse mit RNA aus Stammzellen der Passage 0 sind in der Abb. 4
gegenübergestellt, wobei jeweils für den Array als auch für die RT-PCR – wenn
nicht extra gekennzeichnet – die RNA derselben Spender (271, 281, 289, 290,
298, 299) benutzt wurde. Farblich mit grün oder rot hervorgehoben ist dabei
eine jeweils höhere Expression eines Gens innerhalb einer Stammzellgruppe
bei einem Patienten, und zwar dann, wenn das Ergebnis durch den Fold
Change im Array bestätigt wurde; waren alle mhMSCs (grün) bzw. bhMSCs
(rot) einer PCR beispielsweise in der jeweiligen Farbe umrandet, sprach dies für
eine vollständige Bestätigung der Erwartungen aus der vorherigen Analyse des
Arrays.
Zudem ist das PCR-Ergebnis von EF1α (Eukaryotischer Translations- und
Elongationsfaktor 1α) mit aufgeführt, das als so genanntes Housekeeping-Gen
in allen Körperzellen vorkommt und als Kontrolle für eine erfolgreiche cDNA-
Synthese dient. Es wurden hauptsächlich sogenannte Markergene der
Osteogenese und Myogenese ausgewählt, die für die Differenzierung in das
jeweilige Gewebe von Bedeutung sind bzw. für den Stoffwechsel oder die
Funktion differenzierter Zellen eine wichtige Rolle spielen. Außerdem wurden
solche Probesets ausgewählt, die anhand der Array-Analyse reguliert
erschienen, also entweder in den mhMSCs oder den bhMSCs mehrerer
Patientenproben eine höhere Expression zeigten. Es wiesen jedoch nicht alle
untersuchten Probesets im vorherigen Array einen mindestens zweifachen Fold
Change der Expression auf, wurden aber als wichtige Markergene der
Osteogenese bzw. Myogenese trotzdem untersucht. Vier weitere wichtige
Markergene der Myogenese (Pax3, Pax7, MyoD1, Myog), die im Array keine
Expression aufwiesen, konnten auch in der RT-PCR nicht nachgewiesen
werden, was sich auch für Array und PCR der Passage 1 bestätigte. Im
Allgemeinen wurden mindestens 4-6 PCRs für ein Gen durchgeführt, um
größere Aussagekraft der Ergebnisse zu gewährleisten.
Ergebnisse
40
Abb. 4: Ergebnisse aus der RT-PCR der RNA aus Passage 0 Zellen
Ergebnisse
41
3.3. Übereinstimmung von Array und PCR (Passage 0)
Aufgrund intensiver Analyse des Microarrays wurde versucht bestimmte Gene
mittels RT-PCR in den Zellproben nachzuweisen. Dabei ergaben sich im Mittel
relativ gute Übereinstimmungen der jeweiligen Ergebnisse. Bei größeren
Expressionsunterschieden (Fold Change > 1,5) zeigten sich hierbei relativ
kongruente Ergebnisse. Allerdings konnte auch die beschränkte Aussagekraft
des Arrays festgestellt werden. Wenn schon dort nur geringe Unterschiede
(Fold Change < 1,5) bescheinigt wurden, waren auch die Ergebnisse der PCR
oft sehr variabel von einem zum nächsten Individuum und somit nicht
aussagekräftig. Außerdem konnten individuell sehr hohe Signale in einzelnen
Patientenproben gefunden werden (z.B. IBSP-Signal in BC 271), die bei
geringer Probenzahl – zum Beispiel bei nur 6 Patientenproben – den mittleren
Fold Change als Maß für den Expressionsunterschied auf Kosten der
Repräsentativität deutlich beeinflussten.
Gene Fold Change Microarray RT-PCR
ALP (1557924_s_at) 7,0 ↑ ↑ ↑ ↑ ↔ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑
Col1 (202311_s_at) 1,0 ↓ (↓) ↑ ↓ ↑ (↑) ↔↔↔↔↔↔
OC (206956_at) 1,47 ↓ (↓) ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↔ ↓ ↓ ↓ ↓
OPN (209875_s_at) 1,12 ↓ (↑) ↑ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑
IBSP (236028_at) 1,88 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
Nid1 (202007_at) 1,29 ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↔↔ ↑
Nid2 (204114_at) 2,01 (↑) ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
MLC1SA (204173_at) 1,35 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↔ ↑ ↑ ↓ ↑
MYOF (211864_s_at) 1,20 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↔↔↔ ↓ ↓
TPM1 (206117_at) 1,17 ↑ ↑ ↑ (↓) ↓ ↑ ↑ ↔↔↔ ↓ ↔
CD24 (216379_x_at) 2,77 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↔
TRIB2 (202479_s_at) 1,58 ↓ ↔ ↓ ↓ (↑) ↓ ↓ * ↓ ↓ ↓ ↓
Abb. 5: Vergleich der Ergebnisse aus Microarray und RT-PCR der Patienten-RNA
Reihenfolge: 271, 281, 289, 290, 298, 299. ↑ Höhere Expression in MSC, ↓ höhere Expression in BC, (↑/↓) minimale Unterschiede, ↔ Keine sichtbaren Unterschiede in der PCR, Fold Change grün (MSC Expression erhöht), rot (BC Expression erhöht), * Probe 281 fehlt
Ergebnisse
42
Die Ergebnisse sind in der Abb. 5 gegenübergestellt, wobei stets der mittlere
Fold Change, die Individualergebnisse des Microarrays sowie die PCR-
Resultate miteinander verglichen wurden. Gute Übereinstimmung fand sich
dabei unter anderem für die Gene Nid2, CD24 und TRIB2. Auch die Ergebnisse
für die osteogenen Marker ALP, Col1, OC, OPN, IBSP und für Nid1 und
MLC1SA zeigten relativ gute Kongruenz. Deutliche Unterschiede im Array
bestätigten sich also in der Regel auch in der PCR. Im Umkehrschluss wurden
bei geringfügigen Abweichungen im Expressionsmuster und in der
Signalintensität zwischen mhMSCs und bhMSCs im Array sehr variable und
uneinheitliche Ergebnisse in der PCR hervorgebracht.
Abb. 6: Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Array und PCR von P0 und P1
Ergebnisse
43
3.4. Vergleich der Arrays aus Passage 0 und Passage 1
Nach einem erneuten Microarray mit Zellen der Passage 1 relativierten sich die
Expressionsunterschiede für sehr viele Gene. Drei viel versprechende
Ausnahmen (CD24, AHNAK, TRIB2) zeigten jedoch auch in diesem Array
deutliche Unterschiede auf und es wurden daher gesondert erneute RT-PCRs
mit RNA der Passage 1 für diese drei Gene durchgeführt und die Ergebnisse
anschließend mit denen aus Passage 0 verglichen (siehe Abb. 6). AHNAK
konnte dabei mit RT-PCR weder in der RNA der Passage 0 noch in der RNA
der Passage 1 nachgewiesen werden. Zumindest die Ergebnisse für CD24 und
TRIBR2 ließen sich jedoch bestätigen. Es sei anmerkend erwähnt, dass für den
erneuten Array der Passage 1, wie auch in der Abbildung gekennzeichnet,
mhMSCs von anderen Spendern als im vorherigen Array ausgewählt wurden
(276, 247, 295, 296).
Um eine komplette Übersicht zu ermöglichen, möchte ich in einer Tabelle (Abb.
7a) noch die SAM-Ergebnisse aus den beiden Arrays (Passage 0 und 1)
anhand der errechneten Fold Changes gegenüberstellen. Dabei zeigten sich für
manche Probesets relativ gute Übereinstimmungen, durch die Kontaminierung
wurden jedoch auch zahlreiche Ergebnisse entscheidend beeinflusst und somit
verfälscht.
Dies wird auch deutlich, wenn man sich die Heatmaps (Abb. 7b, c)
veranschaulicht, in denen die unterschiedlichen Signalintensitäten bzw.
Expressionsmuster aus den mhMSC-Arrays für Passage 0 und 1 graphisch
gegenübergestellt wurden. Hierbei wurde nur die ursprüngliche mhMSC-Kultur
(P0) mit der mhMSC-Kultur nach Passagieren und Beseitigung der
Kontamination (P1) verglichen. Abb. 7b stellt dabei alle Probesets mit einem
mindestens 2-fachen Expressionsunterschied bei einem q-value kleiner als 0,1
dar. In der folgenden Abb. (7c) wurde das Signifikanzniveau weniger streng
gesetzt (q-value < 0,2) und es konnten somit mehr Probesets verglichen
werden. Eine besonders helle Rotfärbung drückt eine gesteigerte Expression
der Probesets durch die mhMSCs aus, wohingegen eine hellere Grünfärbung
eine niedrigere Expression durch die mhMSCs darstellt. Bei Schwarzfärbung
Ergebnisse
44
bestanden keine Expressionsunterschiede. Zu beiden Abbildungen ist
zusätzlich eine Tabelle erstellt (siehe Abbildungsverzeichnis), in der die
Probesets noch einmal lesbar in der Reihenfolge wie in der Graphik aufgeführt
werden. Die ersten fünf Spalten (MSC P0) zeigen dabei kongruent völlig andere
Ergebnisse als die letzten fünf Spalten (MSC P1), wodurch sich nochmals sehr
übersichtlich darstellen ließ, welchen Einfluss die Kontamination durch
Plasmazellen auf das Expressionsmuster hatte. Außerdem zeigten sich
individuelle Unterschiede zwischen den einzelnen Patientenproben. Beispielhaft
lässt sich dies durch die Probesets in den Zeilen 2-6 (alle Probesets spezifisch
für Plasmazellen) in beiden Abbildungen veranschaulichen, wo an Position 10
(5. Patientenprobe aus dem P1-Array) im Vergleich zu den anderen Individuen
beinahe keine Expressionsunterschiede gefunden werden konnten.
Abb. 7a: Gegenüberstellung der Expressionsunterschiede der Arrays aus Passage 0 und 1
Ergebnisse
45
Abb. 7b: Heatmap 1
Gegenüberstellung des Expressionsmusters der mhMSC-Kulturen aus Passage 0 (Spalten 1-5) und Passage 1 (Spalten 6-10), p-value < 0,1
Ergebnisse
46
Abb. 7c: Heatmap 2
Gegenüberstellung des Expressionsmusters der
mhMSC-Kulturen aus Passage 0 (Spalten 1-5)
und Passage 1 (Spalten 6-10), p-value < 0,2
Ergebnisse
47
3.5. Immuncytochemie mit CD24
Die Immuncytochemie mit CD24 diente als zusätzliche, sehr anschauliche
Bestätigung der Ergebnisse des Microarrays. Auch dabei konnte eine sichtbar
erhöhte Expression in den bhMSCs festgestellt werden (Abb. 8). Die Zellen aus
der Passage 1 wurden – wie vorher beschrieben – in Chamber Slides ausgesät
und nach der anschließenden AK-Färbung digital fotografiert. Die Fotografien
zeigten dabei das für MSCs typische spindelförmige Wachstum. Sowohl
Cytoplasma als auch Zellkern wurden durch die Gegenfärbung mit Hämalaun
blau gefärbt. In den Negativproben, die mit Maus-Serum ohne CD24-AK
inkubiert wurden, ließ sich keine durch den Antikörper vermittelte Rotfärbung
erkennen. Eine sehr leichte Rotfärbung zeigte sich in den mhMSCs. Die
deutliche rote Färbung in den bhMSCs war – wie zu erwarten – gleichmäßig
verteilt, da CD24 ein Oberflächenmolekül der Zellmembran ist.
Abb. 8: Ergebnisse der Immuncytochemie
Diskussion
48
4. Diskussion
4.1. Versuchsauswertungen
Bei der Auswertung der gefunden Ergebnisse komme ich zu folgenden
grundsätzlichen Überlegungen. Aufgrund der Kontamination der mhMSC-Kultur
in Passage 0 kann für einige der vorgestellten Ergebnisse keine weitere
Verwendung gefunden werden. Trotzdem ergeben sich sinnvolle
Schlussfolgerungen, was den Stellenwert des Microarrays und die nachträglich
ausgeführten Versuche mit den Stammzellen aus Passage 1 betrifft.
4.1.1. Experimentelle Bestätigung des Microarrays
Microarrays ermöglichen heutzutage mit kleinem experimentellen Aufwand eine
sehr große Anzahl von Nukleinsäuren oder Proteinen aus einer geringen
Menge biologischen Materials zu analysieren. Der Affymetrix GeneChip HG-U
133 Plus 2.0 der Firma High Wycombe überprüfte 47.400 Transkripte und
38.500 Gene in dem eingeschickten Probenmaterial aus MSC-RNA. Diese
Ergebnisse sollten einen ersten Eindruck über die Transkriptionsrate innerhalb
der Zellkulturen vermitteln und Trends aufzeigen, die durch weitere
molekularbiologische Methoden dann zu bestätigen waren. Der RNA-Gehalt ist
dabei ein indirektes Maß dafür, welche Proteine ein Zelltyp verstärkt
synthetisiert, woraus man auf biologische Eigenschaften der Zelle schließen
kann. Das gängigste Verfahren zur Bestätigung von RNA-Microarrays ist die
RT-PCR, die auch in dieser Arbeit als Standardverfahren angewendet wurde.
Wie bereits erläutert, konnte gezeigt werden, dass der Microarray gut geeignet
ist eine Vorauswahl für zukünftige Nachweisverfahren zu liefern, die mit
gewissen Einschränkungen das Ergebnis des Arrays bestätigen konnten. Die
Aussagekraft war bei deutlichen Unterschieden (Fold Change > 1,5) besonders
groß und lieferte übereinstimmende Ergebnisse zwischen Array und PCR
(siehe 3.3.). Dies zeigte sich unter anderem bei den Ergebnissen für ALP, Nid2,
CD24 und TRIB2 besonders eindrücklich. Bei einer geringeren Probenzahl
Diskussion
49
schlugen sich extreme Abweichungen bei einem Individuum (IBSP-Signal in
BC271: 40.590, mittlere Signalstärke der BCs: 12.756, Median: 7154)
entsprechend im durchschnittlichen Fold Change (Fold Change 1,88 für BCs)
wieder und ließen somit nur begrenzt allgemeingültige Aussagen für die
gesamte Zellpopulation zu, wobei die Einzelproben kongruent zwischen PCR
und Array waren. In diesen Fällen wurde der Array zwar bestätigt, doch der
hohe Wert für ein Individuum ergab einen relativ zu hohen durchschnittlichen
Fold Change und täuschte somit eine übermäßige Expression in allen bhMSCs
vor. In jedem Fall sollten also nicht nur der Fold Change, sondern auch die
Einzelergebnisse überprüft werden. Immer dann, wenn der Array nur minimale
Unterschiede in der Expression zwischen mhMSCs und bhMSCs auftat, zeigte
sich eine schlechte Kongruenz in der PCR. Aus den Ergebnissen des erneuten
Microarrays aus RNA von Passage 1 Zellen ergaben sich schließlich nur noch
signifikante Unterschiede für CD24, AHNAK und TRIB2. Auch hier konnte die
PCR erneut das Ergebnis des Arrays untermauern, wobei AHNAK durch die
PCR nicht nachweisbar war. Werden die Resultate des Microarrays also unter
den richtigen Voraussetzungen und im Wissen um seine Einschränkungen
interpretiert, ist dieser bestens als Screening-Methode für eine große Anzahl
verschiedener Transkripte geeignet.
4.1.2. Kontamination der Zellkultur Passage 0
Die anfänglichen Auswertungen der SAM aus den Ergebnissen des Arrays aus
den Passage 0 Zellkulturen ergaben immense und auch signifikante
Unterschiede bei der Expression zahlreicher Gene, vor allem auch bei vielen
typischen Markergenen der Osteogenese, Chondrogenese und Myogenese.
Diese Erkenntnisse gaben Anlass zu großen Hoffnungen auf Unterschiede im
Expressionsmuster und in den Differenzierungseigenschaften beider
Stammzellpopulationen. Umso mehr weckte die bhMSC-Kultur unser Interesse,
als sich die Ergebnisse der SAM in der RT-PCR größtenteils bestätigen ließen.
Erst nach intensiveren Nachforschungen in der SAM fielen Ungereimtheiten
auf, nämlich eine überdurchschnittliche und nicht erklärbare Expression von
Diskussion
50
Immunglobulinketten (siehe Abb. 3, Abb. 7b/7c). Tatsächlich waren die 10 am
stärksten exprimierten Probesets in der mhMSC-Kultur solche, die nur in
differenzierten B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen exprimiert werden. Die einzig
logische Schlussfolgerung war eine Kontamination mit Plasmazellen während
der Zellkultur. Alle bisherigen Ergebnisse waren somit nicht mehr verwertbar.
Dieser Verdacht wurde noch weiter durch nachfolgende FACS-Analysen
erhärtet, in denen eine Kontamination der mhMSC-Kultur (Passage 0) mit
CD56+ NK-Zellen sowie CD138+ Plasmazellen nachgewiesen wurde (siehe
Abb. 9).
mhMSCs Passage 0 Passage 1
NK-Zellen
CD56+
10-50% 0,9%
Plasmazellen
CD138+
1,2% 0,5%
Leukozyten
CD45+
1,4%
Abb. 9: FACS-Analyse der mhMSC-Kulturen
(freundlicherweise von Jörg Arnholdt zur Verfügung gestellt)
Um dennoch die Populationen vergleichen zu können und aussagekräftige
Ergebnisse zu erlangen wurde ein weiterer Microarray einer mhMSC-Kultur aus
der Passage 1 der Zellkultur in einer SAM analysiert, ausgewertet und mit der
nicht kontaminierten bhMSC-Population verrechnet. Hierbei offenbarte sich ein
nahezu identisches Expressionsmuster im Vergleich der beiden Zellkulturen,
sodass festgestellt werden musste, dass die beiden beschriebenen Methoden
zur Gewinnung und Kultur der MSCs aus Bone Chips und Knochenmark eine
biologisch sehr ähnliche Zellpopulation hervorbringen. Das Ausmaß der
Expressionsunterschiede zwischen P0 und P1 Zellen der mhMSC-Kultur stellte
sich in den zusätzlichen Heatmaps sehr eindrücklich dar (siehe Abb. 7b/c).
Zumindest TRIB2 und CD24 wurden einer näheren Betrachtung unterzogen;
Diskussion
51
welche Schlüsse aus den Ergebnissen gezogen werden sollten, bleibt noch zu
klären.
Es gilt also in Zukunft SAM-Analysen genauestens zu überprüfen, bevor weitere
Versuchsreihen gestartet werden und immer dann kritische Überlegungen
anzustellen, wenn extreme Werte auffallen, die vorerst nicht erklärt werden
können.
4.1.3. Auswertung und Bedeutung der analysierten Ge ne
In den folgenden Abschnitten werden die Einzelergebnisse der analysierten
Gene noch einmal vorgestellt und ihre Bedeutung in den Kontext aktueller
Forschungen gestellt.
4.1.3.1. Osteogene Markergene
ALP (Alkalische Phosphatase)
Die ALP ist ein ubiquitäres Enzym, das im Knochenstoffwechsel eine zentrale
Rolle einnimmt. Es kommt dort in Matrixvesikeln vor und nimmt durch Hydrolyse
von Pyrophosphat eine essentielle Rolle in der Mineralisierung der
extrazellulären Knochenmatrix mit Hydroxylapatit, einer Calcium-
Phosphatverbindung, ein. Sie wirkt dabei im ausgeglichenen Wechselspiel mit
dem Natrium-Phosphat-Cotransporter und der Nucleotid Pyrophosphat
Phosphodiesterase 1. Erhöhte Serumwerte finden sich daher unter anderem bei
zahlreichen Krankheiten, die mit einem pathologischen Knochenstoffwechsel
einhergehen wie Osteomalazie, Morbus Paget oder Rachitis. Ein genetischer
Defekt der ALP führt zum Maximalbild der Hypophosphatasie, die durch stark
erniedrigte Serumwerte von ALP auffällt und erhebliche
Mineralisierungsstörungen der Knochenmatrix bedingt (Orimo 2010). Daher
wird die ALP seit Jahren als einer der wichtigsten osteogenen Marker in der
MSC-Forschung verwendet. In diesem Zusammenhang wird eine Expression
des Enzyms in MSCs als ein Zeichen für osteogenes Differenzierungspotenzial
verstanden (Pittenger, Mackay et al. 1999).
Diskussion
52
Die Ergebnisse des Microarrays deuteten eine gesteigerte Expression der ALP
durch die mhMSCs an, der jedoch beim Array der Passage 1 (P1) nicht mehr
signifikant war (Fold Change 1,68). Relativ kongruente Übereinstimmung
zwischen RT-PCR und Microarray mit Zellen der Passage 0 (P0) konnte jedoch
nachgewiesen werden.
Col1 (Kollagen 1)
Col1 ist ein Protein der extrazellulären Matrix vieler Binde- und Stützgewebe,
wo es durch seinen dreidimensionalen Aufbau in Fibrillen eine tragende Rolle
für die Mikroarchitektur und Stabilisierung des Gewebes gewährleistet. Auch
der Knochen ist reich an Kollagenfibrillen des Typs 1, und darüber hinaus sind
zahlreiche Signaltransduktionswege über Integrine beschrieben worden, zum
Beispiel über Integrin α2β1. Col1 steht also neben seiner Gewebe stützenden
Funktion in Interaktion mit anderen Gewebszellen und mit Molekülen der
Extrazellularmatrix. Somit wird der Erhalt einer stabilen Knochenmatrix
ermöglicht, doch auch für die Osteogenese ist eine physiologische Synthese
von Kollagenfibrillen essentiell. Erhöhte Expression von Col1 lässt sich in der
Ossifikationsphase der enchondralen Ossifikation nachweisen. Genetische
Mutationen des Col1 führen zu einer letalen Form der Osteogenesis imperfecta.
Vor diesem Hintergrund wird auch der Kontakt von MSCs mit extrazellulären
Matrixproteinen wie Col1, aber auch Fibronectin, Collagen 4, Vitronectin und
Laminin 1 als Schlüsselereignis einer osteogenen Differenzierung von MSCs
angesehen. Daher gilt es zu Recht als einer der wichtigsten osteogenen Marker
(Salasznyk, Williams et al. 2004).
Differentielle Expression von Col1 konnte weder bei P0-Zellen im Microarray
(Fold Change 1,0) noch in der RT-PCR gefunden werden, was sich auch im
Array der Passage 1 (Fold Change 1,1) bestätigte. Dabei zeigte sich stets eine
gleichmäßige Expression bei den Individuen der Zellpopulationen.
OC (Osteocalcin, BGLAP)
OC ist ein weiteres extrazelluläres Matrixprotein, das im Organismus von
Osteoblasten synthetisiert wird und erstmals bereits vor über 30 Jahren
Diskussion
53
beschrieben wurde. Aus seiner biochemischen Struktur, in der dreimal die
Aminosäure Glutamat mit einer Gamma-Carboxylgruppe vorkommt, rührt der
alternative Name Bone gamma-carboxyglutamate protein (Bone Gla protein,
BGLAP). Ähnlich wie bei Gerinnungsfaktoren, die Gamma-Carboxylgruppen
nachweisen, besitzt OC hohe Affinität zu den Calcium-Verbindungen der
Knochenmatrix und es wurde daher stets eine wichtige Bedeutung für
Mineralisierungsprozesse des Knochens unterstellt. Die genaue Funktion für
den Knochenstoffwechsel ist jedoch ungewiss, da sowohl aus dem Knock-out-
Mausmodell für OC als auch aus einer Überexpression keine pathologische
Knochenmineralisierung resultiert (Murshed, Schinke et al. 2004; Baldock
2011).
Aktuelle Untersuchungen legen nahe, dass OC den Energie- und
Glucosestoffwechsel beeinflusst bzw. dass der Knochen gar als endokrines
Organ durch Ausschüttung von OC aus Osteoblasten auf den Energiehaushalt
Einfluss nimmt. Auch wenn bislang kein Rezeptor für OC gefunden wurde,
erfüllt es zahlreiche Kriterien eines Hormons. So entsteht es aus einem Prä-
Pro-Molekül und wird parakrin ausgeschüttet sowie endokrin ins Blut
abgegeben, wo nur das reife Molekül nachweisbar ist. Zudem unterliegt es
einer zirkadianen Rhythmik bei der Sekretion. Der Phänotyp bei Knock-out-
Mäusen entspricht einem Diabetes mellitus Typ 2 mit verminderter
Insulinausschüttung, erhöhtem Glucosespiegel sowie verminderter
Glucosetoleranz und Insulinsensitivität (Baldock 2011). Die genauen
Zusammenhänge sind spannend und Gegenstand aktueller Forschung.
Schon im Microarray aus den Zellen der Passage 0 konnte für OC nur eine
schwache differentielle Expression (Fold Change 1,47) durch die bhMSCs
aufgezeigt werden, die auch in der RT-PCR ihre Bestätigung fand. Im erneuten
Array mit Zellen der Passage 1 zeigte sich dann nur noch ein Fold Change von
1,18.
OPN (Osteopontin, SPP1)
OPN wurde erstmals als extrazelluläres Protein der Knochenmatrix
beschrieben, wird aber auch als sezerniertes phosphoryliertes Glycoprotein
Diskussion
54
(SPP1) ans Blut abgegeben, wobei die Synthese sowohl durch Osteoblasten
als auch durch Osteoklasten beschrieben wurde. Es gehört zur Gruppe der
SIBLING (small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein) und besitzt
Bindungsstellen für Calcium und Heparin sowie für zahlreiche Integrine.
Dadurch findet eine Signalübermittlung an verschiedenste Körperzellen statt.
Der Kontakt zu Endothelzellen und glatter Muskulatur wirkt dabei einer ektopen
Kalzifikation entgegen und hat somit einen protektiven Einfluss auf die
Entwicklung einer Arteriosklerose. Als lösliches Zytokin wirkt OPN hingegen
regulierend auf das Immunsystem, indem es wechselseitig in Kontakt mit
Makrophagen, Dendritischen Zellen und T-Helfer-Zellen steht und zelluläre
Prozesse wie Adhäsion, Migration, Proliferation und somit die Immunantwort
steuert. In diesem Zusammenhang sind unter anderem der inhibitorische
Einfluss auf neoplastische Körperzellen und der proinflammatorische Effekt bei
Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn Gegenstand aktueller Forschung.
Am Knochen ist OPN das häufigste nicht-kollagene Matrixprotein, wo es an
Calcium-Ionen und Hydroxylapatit bindet und durch Hemmung einer
überschießenden Kalzifikation die Mineralisierung der Knochenmatrix reguliert.
Knock-out-Mäuse präsentieren eine übermäßige Mineralisierung des Knochens,
der jedoch bei gestörter Mikroarchitektur von geringer biomechanischer
Stabilität und Qualität ist. OPN begünstigt dabei die Migration von Osteoklasten
und hat daher fördernde Einflüsse auf die Knochenresorption. Die Vielzahl an
Interaktionen mit verschiedensten Körperzellen erklärt sich aus den zahlreichen
Isoformen, die durch posttranslationale Modifikationen entstehen (Lund,
Giachelli et al. 2009)
OPN konnte sowohl in den Microarrays als auch in der RT-PCR stets
nachgewiesen werden. Für die Passage 0 ergab sich kein signifikanter
Unterschied in der Expression (Fold Change 1,12), wobei auch das RT-PCR-
Ergebnis kongruent dazu war. Im zweiten Array (P1) fand sich zwar ein Fold
Change von 5,81 für die bhMSC-Population, jedoch bei einem p-Wert von 74,9.
Diskussion
55
IBSP (Integrin-binding sialoprotein)
BSP (Bone sialoprotein) ist wie OPN ein Protein der extrazellulären
Knochenmatrix, das auch zur Gruppe der SIBLING gehört, woher der Name
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) resultiert. Im Gegensatz zu OPN fördert
IBSP die Mineralisierung des Knochens mit Hydroxylapatit. Die Knochenbildung
wird dabei im Wachstum und bei der Frakturheilung begünstigt, was jeweils mit
einer verstärkten Expression von IBSP einhergeht. Knock-out-Mäuse zeigen
andererseits gravierende Störungen der Knochenbildung. Sie sind phänotypisch
von geringerer Statur, haben kürzere Knochen mit weniger Knochenmasse und
verminderter Mineralisierung durch Hydroxylapatit als Wildtypmäuse. Die
trabekuläre Struktur des Knochens bleibt dabei erhalten, jedoch lässt sich ein
verminderter Knochenumsatz aus Resorption und Neubildung feststellen. Die
Synthese von IBSP findet hauptsächlich in hypertrophen Chondrozyten,
Osteoblasten und Osteoklasten statt, wobei neben parakriner auch
mechanische Stimulation des Knochens die Expression von IBSP steigert. Auch
neoplastische Zellen demonstrieren bei einigen Entitäten IBSP-Expression, was
beim Brustkrebs das Auftreten von Mikrokristallen aus Hydroxylapatit erklärt.
Zusammenfassend scheint für einen physiologischen Knochenmetabolismus,
der in der Lage ist auf wechselnde Anforderungen adäquat zu reagieren, ein
funktionierendes Zusammenspiel der Mitglieder der SIBLING-Familie mit
anderen parakrinen und endokrinen Signalüberträgern unentbehrlich (Ganss,
Kim et al. 1999; Malaval, Wade-Gueye et al. 2008).
IBSP zeigte in beiden Populationen eine starke Signalintensität bei allen
Individuen im Array (Passage 0 und 1). Aus dem ersten Microarray (P0) ergab
sich ein Fold Change von 1,88 für die bhMSCs mit relativ guter Entsprechung in
der RT-PCR, der zwar im zweiten Array noch stärker ausgeprägt war (Fold
Change 3,47), jedoch in Verbindung mit einem p-Wert von 69,9 als nicht
signifikant zu bewerten war.
Diskussion
56
4.1.3.2. Myogene Markergene
Nid1 (Nidogen 1) und Nid2 (Nidogen 2)
Obwohl die beiden Nidogene Nid1 und Nid2 – Synonym Entactine – als
ubiquitäre Proteine der Basalmembran und nicht als myogene Marker im
klassischen Sinne bezeichnet werden können, soll ihre Beschreibung an dieser
Stelle stattfinden, kommt ihnen doch eine gewisse Bedeutung bei der
Myogenese zu.
Die Basalmembran ist eine Leitstruktur für den Aufbau zahlreicher Gewebe und
steht in engem Zusammenhang mit dem Wachstum und der Regeneration nach
Gewebsverletzungen. Sie besteht aus extrazellulären Proteinen wie Kollagen 4,
Perlecan, Laminin und Heparansulfat-Proteoglycanen und steht in regem
Kontakt zu den umliegenden Gewebs- und Stammzellen des jeweiligen
Gewebes (Boonen and Post 2008). Vor allem die Interaktion von Nid1 zu
Laminin scheint für eine physiologische Biologie und Stabilität der
Basalmembran von besonderer Wichtigkeit zu sein (Mokkapati, Fleger-
Weckmann et al. 2011). Im Muskel garantiert Nid1 als Verankerungsprotein
über Integrine den Kontakt des Zytoskeletts zu Satellitenzellen und wirkt somit
als Stabilisator der Stammzellnische der Satellitenzellen; es ist somit ein
wichtiger Faktor bei der Regeneration von verletztem Muskelgewebe (Boonen
and Post 2008; Ten Broek, Grefte et al. 2010).
Untersuchungen zur Expression der Nidogene bei der myogenen
Differenzierung legen Hinweise für unterschiedliche Funktionen der beiden
Isoformen nahe. Die myogene Differenzierung von Myoblasten zu Myofibrillen
induzierte nämlich eine deutlich verstärkte Expression von Nid2, die vor allem
nach ca. 24 Stunden beobachtet werden konnte; Nid2 reguliert daher
wahrscheinlich die frühe Phase der Myogenese. Hohe Expression von Nid1
ging hingegen mit hoher Proliferationsrate von Myoblasten einher, wobei
Marker der myogenen Differenzierung wie Myogenin und Myosin Heavy Chain
vermindert exprimiert wurden (Neu, Adams et al. 2006).
Da sich für Nid2 bei der Untersuchung des ersten Microarrays (P0) eine
differentielle Expression durch die mhMSCs darstellte (Fold Change 2,01),
Diskussion
57
wurden beide Nidogene anschließend auch mittels RT-PCR untersucht und die
Ergebnisse des Arrays konnten hierbei bestätigt werden. Die Analyse von Nid1
ergab aber weder im Array (Fold Change 1,29 für mhMSCs) noch in der PCR
eine signifikant gesteigerte Expression in einer der beiden Zellpopulationen. Im
P1-Microarray konnte dann überhaupt keine unterschiedliche Expression der
Nidogene in den mhMSCs und bhMSCs mehr gefunden werden.
MLC1SA (Myosin light chain 1 slow a)
Myosin, und zwar dessen Isoform Myosin 2, gehört zu den grundlegenden
Muskelproteinen und ist als solches direkt an der elektromechanischen
Kopplung, nämlich der Umwandlung eines elektrischen Gradienten an der
Zellmembran der Muskelzelle in kinetische Energie, beteiligt. Bei der
Muskelkontraktion gleiten Aktin- und Myosinfilamente durch wiederholte
wechselseitige Bindungen ineinander, wodurch sich die Muskelfaser verkürzt.
Motor und Energieträger dieser Bewegung ist ATP (Adenosintriphosphat),
dessen Hydrolyse zu ADP (Adenosintriphosphat) und Phosphat eine
Konformationsänderung bzw. ein Einknicken des Myosins bewirkt und somit die
Filamente ineinander schiebt (Geeves 1991).
Das Myosin 2 Protein ist ein Hexamer aus je zwei schweren und vier leichten
Ketten. Von den leichten Myosinketten (MLC) existieren zahlreiche Isoformen.
MLC1 ist dabei ein Subtyp, der jeweils als Bestandteil von schnell (fast/MLC1F)
und langsam (slow/MLC1S) kontrahierenden Muskelfasern unterteilt werden
kann. MLC1S kommt wiederum in 2 Formen vor, nämlich MLC1SA und
MLC1SB. MLC1SA ist also ein Bestandteil differenzierten Muskelgewebes, aber
es wird auch in Myoblasten exprimiert, wobei deren myogene Differenzierung
eine zusätzliche Induktion von MLC1SA nach sich zieht; während der
Myogenese nimmt die Expression also zu (Hailstones and Gunning 1990;
Reiser and Bicer 2006; Eddinger and Meer 2007).
Was die Ergebnisse des Microarray für MLC1SA angeht, so ergaben sich
weder im ersten (P0: Fold Change 1,35 für mhMSCs) noch im zweiten (P1: Fold
Change 1,32 für mhMSCs) Array signifikante differentielle Unterschiede. Die
RT-PCR der P0-Zellen konnte in diesem Zusammenhang das Ergebnis des
Diskussion
58
Arrays einer verstärkten Expression in den mhMSCs bestätigen, auch wenn
dieses nicht als signifikant gewertet werden kann.
TPM1 (Tropomyosin 1)
Ein weiteres Strukturprotein der Myofibrillen in der Muskulatur ist Tropomyosin,
das als helikaler Strang Aktinfilamente (F-Aktin) umgibt und mit diesen durch
seine dem F-Aktin angepasste Form nicht-kovalent verbunden ist. Außerdem
steht es über Troponin T mit dem Troponin-Komplex in Verbindung. Bei
niedrigem intrazellulären Ca2+-Spiegel versperrt der Troponin-Tropomyosin-
Komplex die Bindungsstelle am F-Aktin, während ein Anstieg des intrazellulären
Ca2+ zu einer Konformationsänderung am Tropomyosin führt und die
Bindungsstelle für Myosin am Aktinfilament freigibt (Li, Tobacman et al. 2011).
TPM1 ist eine von 4 Isoformen des Tropomyosins und scheint neben seiner
Funktion als Strukturprotein der Muskelzelle auch Eigenschaften eines
Tumorsuppressors aufzuweisen, indem es Micro-RNA (miR-21) des MIR21-
Gens bindet, die in Tumorzellen überexprimiert ist (Zhu, Si et al. 2007).
Mutationen im TPM1-Gen können zudem zu familiären oder ideopathischen
Formen der Dilatativen Kardiomyopathie führen (Hershberger, Norton et al.
2010).
Obwohl im P0-Microarray eine minimal ausgeprägte differentielle Expression
durch die mhMSCs gefunden werden konnte, entsprach das insgesamt nur
einem mittlerem Fold Change von 1,17. Daher zeigte auch die RT-PCR dem
Array (P0) entsprechend keine deutlichen Unterschiede auf; TPM1 konnte
jedoch durchwegs nachgewiesen werden. Im P1-Array zeigte sich noch weniger
eine differentielle Expression (Fold Change 1,04).
MYOF (Myoferlin)
MYOF gehört wie Dysferlin zur Familie der Ferlin-Proteine, welche essentielle
Schritte der Myogenese ermöglichen. Beide Proteine sind während der
Myogenese stark exprimiert. Wie Dysferlin bindet MYOF Ca2+ und
Phospholipide und garantiert somit ein Verschmelzen von Membranvesikeln mit
der Zellmembran. Dies ist ein essentieller Prozess bei der Entstehung von
Diskussion
59
Muskelfasern, bei dem zahlreiche Myoblasten miteinander verschmelzen und
vielzellige Muskelfasern entstehen lassen. Knock-out-Mäuse sind daher nicht in
der Lage Muskelfasern von normaler Größe auszubilden, was insgesamt auch
zu geringerer Muskelmasse bei den Individuen führt. Neben der Myogenese
steht aber auch die physiologische Regenerationsfähigkeit der Muskulatur nach
Trauma im ausgewachsenen Organismus in engem Zusammenhang mit MYOF
(Doherty, Cave et al. 2005; Demonbreun, Lapidos et al. 2010).
Aus dem Vergleich der beiden Microarrays ergaben sich annähernd gleiche
Ergebnisse und es zeigte sich nur eine geringe und nicht signifikante
differentielle Expression von MYOF durch die bhMSCs (P0: Fold Change 1,20,
P1: Fold Change 1,26). Die RT-PCR konnte dies bestätigen und erbrachte eine
gleichmäßige Expression von MYOF in beiden Zellpopulationen.
4.1.3.3. Sonstige untersuchte Gene
CD24 (Cluster of Differentiation Antigen 24, Nectad rin)
CD24 gehört zur Gruppe der Oberflächenantigene und ist auf verschiedensten
Zellen wie B-Lymphozyten, Granulozyten, Keratinozyten, Neuronen und
Nierentubuli anzutreffen. CD24 spielt eine Rolle im Signalweg von Ral-
GTPasen, die wichtige Mediatoren bei der Entstehung von Neoplasien sind.
Seine genaue Funktion ist aber noch nicht bis ins Einzelne entschlüsselt
worden. Bekannt ist, dass es als alternativer Ligand für P-Selectin die
Zelladhäsion am Endothel ermöglicht und in diesem Zusammenhang die
Metastasierung von Tumoren zu begünstigen scheint. Zudem erhöht es die
Zelladhäsion an extrazellulären Matrixproteinen wie Kollagen, Laminin und
Fibronectin, wodurch metastatische Zellen im Gewebe stabilisiert werden
können. Seit einiger Zeit wird CD24 als Oberflächenmarker von zahlreichen
bösartigen Tumorentitäten wie Ovarial-, Mamma-, Prostata-, Blasen-,
Nierenzell- und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom beschrieben und wird
daher neben CD44 und CD133 als allgemeiner Oberflächemarker für
Krebsstammzellen (Cancer Stem Cells/ CSC) diskutiert (Lee, Choe et al. 2010;
Jaggupilli and Elkord 2012; Yu, Pestell et al. 2012).
Diskussion
60
Interessante Versuche konnten CD24 auch als Markerantigen für neuronale
Differenzierung aus embryonalen Stammzellen identifizieren. Mittels FACS
wurden aus embryonalen Stammzellkulturen solche Subpopulationen mit
starker Expression von CD24 isoliert. Diese hatten ein fortgeschrittenes
neuronales Differenzierungsstadium erreicht, wohingegen Populationen mit
niedriger Expression des Oberflächenantigens früheren und gemischten
neuronalen Vorläuferstadien entsprachen (Pruszak, Ludwig et al. 2009). Da
CD24 andererseits in Vorläuferzellen anderer Gewebe hoch exprimiert ist, was
für die Brustdrüse (Shackleton, Vaillant et al. 2006) und das Pankreas
nachgewiesen wurde, betiteln immer mehr Wissenschaftler CD24 heute als
allgemeinen Oberflächenmarker von Stammzellen (Jiang, Sui et al. 2011).
In der Muskulatur des adulten Organismus konnte CD24 vor allem im Bereich
der motorischen Endplatte nachgewiesen werden und ist dort für eine
ungestörte Signalübertragung verantwortlich. Genetische Mutationen führen zu
einer mangelhaften Signalübertragung, die genetischen Defekten des NCAM
(Neural Cell Adhesion Molecule) gleichen, was ähnliche physiologische
Funktionen der beiden Proteine vermuten lässt (Jevsek, Jaworski et al. 2006).
Die Microarrays gaben zu weiteren Untersuchungen Anlass, da eine
differentielle Expression des Proteins durch die bhMSCs sowohl im P0-Array
(Fold Change 2,77) als auch im P1-Array (Fold Change 6,56) auffiel. Deswegen
wurden RT-PCRs sowohl für P0-Zellen als auch für P1-Zellen ausgeführt, die in
Kongruenz zum Microarray standen. Darüber hinaus ließ sich CD24 ebenso
mittels immuncytochemischer AK-Färbung auf den bhMSCs nachweisen. In
diesem Fall konnte also die Kontamination durch Plasmazellen als mögliche
Ursache der Expressionsunterschiede zwischen mhMSCs und bhMSCs
ausgeschlossen werden.
TRIB2 (Tribbles homolog 2)
Die Proteinfamilie der Tribbles, die vor einigen Jahren erstmals in der
Fruchtfliege Drosophilia entdeckt wurden, umfasst drei Isoformen, die jeweils
als Pseudokinasen bei zahlreichen zellulären Prozessen eingreifen und unter
anderem auch den MAPK-Signalweg (Mitogen-activated protein kinase) und
Diskussion
61
somit Proliferation, Zellwachstum und Differenzierung beeinflussen.
Entsprechend ihrer Funktionen kommen sie sowohl im Cytoplasma als auch im
Zellkern vor, wo sie Transkriptionsfaktoren und Genpromotoren regulieren.
TRIB2 fördert den Abbau von Transkriptionsfaktoren der C/EBP-Familie
(CCAAT/Enhancer-binding protein) in Proteasomen. Dadurch wird
beispielsweise eine myeloische Differenzierung zu Monozyten angestoßen, die
bei Immundefizienz in eine Akute Myeloische Leukämie gipfeln kann. Auch bei
nicht-hämatologischen Neoplasien wie dem Malignen Melanom scheint TRIB2
eine Rolle zu spielen, indem es den Transkriptionsfaktor FOXO3 (Forkhead-
Box-Protein O3) herunterreguliert, was das Tumorwachstum beschleunigt.
Allerdings kann aus dieser Wirkung auf FOXO3 die Proliferationsrate von
Hautzellen und somit die Wundheilung auch positiv beeinflusst werden. TRIB2
ist außerdem beim Bronchial-, Mamma-, Ösophagus- und Kolonkarzinom
vermehrt exprimiert und zeigt somit onkogene Eigenschaften. Im Gegensatz
dazu vermögen Tribbles aber auch über eine Hemmung von Januskinasen das
Tumorwachstum einzudämmen. Genauer untersucht ist auch die inhibitorische
Wirkung von TRIB2 auf die Adipogenese. Gefäßplaques unterliegen bei
steigender Expression von TRIB2, die mit einer proinflammatorischen Tendenz
durch verminderte IL-10-Spiegel einhergeht, erhöhter Gefahr für eine Ruptur mit
resultierenden ischämischen Ereignissen.
Die Funktionen der Tribbles-Proteinfamilie legen also große Rätsel auf, wirken
sie doch als Onkogen oder Tumorsuppressor, hemmen den Zellzyklus oder
stoßen ihn an, blockieren oder fördern Zellteilung, Wachstum und Apoptose.
Diese paradoxen Wirkungen können dabei nur teilweise auf gewebespezifische
Funktionen zurückgeführt werden (Yokoyama and Nakamura 2011; Dobens
and Bouyain 2012).
Neben CD24 war TRIB2 ein weiteres Gen, das auch im zweiten Microarray (P1)
noch differentiell exprimiert war, wobei sich eine höhere Expression in den
bhMSCs zeigte (P0: Fold Change 1,58, P1: Fold Change 2,32). Auch dieses
Ergebnis ließ sich anschaulich durch RT-PCR von P0-Zellen und P1-Zellen
bestätigen.
Diskussion
62
4.2. Stellenwert der bhMSCs in der adulten Stammzel lforschung im
Hinblick auf Expressionsunterschiede
Um eines allgemeinen Urteils bei der Auswertung gerecht zu werden,
veranlassen die Ergebnisse in ihrer Zusammenschau nicht zur Annahme, dass
mhMSCs und bhMSCs sich in ihrem Differenzierungspotential deutlich
unterscheiden. Wenn es sich also überhaupt um unterschiedliche
Subpopulationen handelt, so scheinen die Expressionsunterschiede nur sehr
gering zu sein. Zu gering, als dass der höhere Aufwand bei der Gewinnung von
bhMSCs gerechtfertigt wäre. Diese Schlussfolgerung drängt sich vor allem nach
Analyse der Ergebnisse des P1-Microarrays auf, der anhand der gemessenen
Fold Changes und auch nach Beurteilung der Einzelergebnisse viel geringere
bzw. nahezu überhaupt keine Expressionsunterschiede offenbarte. Die
Unterschiede, die auch zuletzt noch nachgewiesen wurden, lassen sich eher als
individuelle Unterschiede zwischen einzelnen Patienten interpretieren und sind
nicht als repräsentativ anzusehen.
Zumindest für TRIB2 und CD24 konnte eine Regulierung bestätigt werden,
welcher Stellenwert sich allerdings aus der höheren Expression in den bhMSCs
ableiten lässt, ist schwierig zu beantworten. Beide Proteine spielen zwar nach
aktuellem Stand der Forschung sicherlich eine Rolle in der Biologie
Mesenchymaler Stammzellen, doch erlaubt die Zusammenschau bisheriger
Untersuchungen zu deren Funktion (siehe 4.1.3.) bisher keine Rückschlüsse
darüber, ob eine gesteigerte Expression für eine homogenere
Stammzellpopulation bzw. bessere Differenzierungseigenschaften spricht.
Eine mögliche Erklärung rückt CD24 erneut in den Fokus der Tumorbiologie
und Metastasierung. CD24 wird nachgewiesenermaßen von Krebszellen
synthetisiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung bzw. bei der
Stabilisierung von osteoblastischen Knochenmetastasen bei bösartigen
Tumoren oder bei primären Knochentumoren (Tang, Cai et al. 2012). Da
bhMSCs in noch engerer biologischer Beziehung zu Osteoblasten stehen als
mhMSCs bzw. selbst als dedifferenzierte Osteoblasten anzusehen sind,
verwundert eine stärkere Expression in bhMSCs im Hinblick auf die Biologie
Diskussion
63
von Knochenmetastasen also nicht. Die Expressionsunterschiede zwischen
mhMSCs und bhMSCs für CD24 könnten in diesem Zusammenhang erklärt
werden.
Die Gewinnung von bhMSCs aus Knochentrabekeln lässt auf eine enge
Beziehung dieser Zellen zum Knochengewebe schließen. Dass es sich bei
bhMSCs wahrscheinlich um eine homogenere Zellpopulation handelt als bei
mhMSCs, kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die Zellen in engem
räumlichen und somit auch biologischen Kontakt mit gewebsständigen
Osteoblasten stehen und somit nach vorherigem Kollagenaseverdau der
Zellkultur einzig dem Osteoid entstammen. Tatsächlich werden sie auch
osteoblastische (Progenitor-)Zellen genannt. Es handelt sich demnach am
ehesten um dedifferenzierte Osteozyten, die einen partiellen
Stammzellcharakter wiedererlangt haben. Wie mhMSCs können sie durch
folgende Oberflächenmarker identifiziert werden: CD73+, STRO-1+, CD105+,
CD34–, CD45–, CD144– (Robey 1995; Noth, Osyczka et al. 2002; Osyczka,
Noth et al. 2002; Tuli, Tuli et al. 2003).
Die Bedeutung von bhMSCs in der künftigen Stammzellforschung ist aber in der
Zusammenschau wohl eher als untergeordnet einzustufen.
4.3. Stammzellcharakter der MSCs
Der Begriff der „Mesenchymalen Stammzelle“ ist omnipräsent in der Literatur
der letzten 20 Jahre anzutreffen und suggeriert die Existenz einer
gemeinsamen adulten Stammzelle für alle nicht-hämotopoietischen
Abkömmlinge des Mesoderms, also sowohl für Binde-, Stütz- (Knorpel,
Knochen) und Fettgewebe als auch für die Muskulatur. Der heutige
Wissensstand berechtigt aber nach wie vor oder mehr denn je das Vorkommen
solcher Stammzellen anzuzweifeln.
Nach Bianco (Bianco 2011) baut die Hypothese einer gemeinsamen myogenen
und osteogenen Stammzelle auf falschen Schlussfolgerungen. Beobachtungen
aus In-vitro-Assays werden oftmals einfach unkritisch auf den lebenden
Organismus übertragen bzw. der Nachweis einiger myogener Marker in MSCs
Diskussion
64
verleitet zu der Vermutung sie könne zur Muskelzelle differenzieren. Dass eine
myogene Zelle unter Stimulierung mit BMPs Osteoblasten generieren kann, ist
wahrscheinlich vielmehr in einer fundamentalen Fähigkeit zur
Reprogrammierung zahlreicher Körperzellen begründet und sicherlich nicht nur
für myogene Zellen nachweisbar und hebt die myogene Zelle nicht
zwangsläufig auf eine Ebene mit einer Stammzelle, die auch ohne BMP-
Stimulation Osteoblasten generieren kann. Während der Embryogenese
beschränkt sich das myogene Differenzierungspotenzial örtlich auf Somiten,
wohingegen osteogenes Potential im lateralen und axialen Mesoderm
anzutreffen ist. Im ausgewachsenen Organismus gelten Satellitenzellen als
lokales Reservoir für die Geweberegeneration der Skelettmuskulatur. Welchen
Ursprung eine gemeinsame myogene und osteogene MSC haben soll, bleibt
also nach wie vor unklar (Bianco 2011). In aktuellen Versuchsreihen konnten
ortsständige MSCs aus der Subkutis zu Muskelzellen differenzieren. Eine
ausgeprägte myogene Differenzierung wurde dabei vor allem durch
Nachahmung der äußeren Stimuli im Muskelgewebe erreicht, nämlich durch
mechanische Reize analog zur Muskelkontraktion. Dadurch wird erneut die
Bedeutung der Mikroumgebung und deren Stimuli für die Differenzierung
hervorgehoben. Diese Ergebnisse könnten den Verdacht erhärten, dass das
Fettgewebe als Reservoir für Subkulturen myogener Progenitorzellen bzw.
pluripotenter MSCs dient. Jedoch scheint auch für diese Zellen die direkte
Umgebung entscheidend (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).
CD146 (MCAM) sowie ALP konnten zur Identifikation von osteogenen
Vorläuferzellen in der Umgebung von kleinsten Blutgefäßen nachgewiesen
werden (Perizyten). Zudem können mittels FACS CD146+ perivaskuläre
Vorläuferzellen anderer Gewebe, also auch des Muskels, aus dem Organismus
rekrutiert werden. Bei diesen Zelltypen handelt es sich aber eher um
gewebespezifische (Knochen, Knorpel, Muskel) Vorläuferzellen, die in vivo nur
einen ähnlichen Phänotyp besitzen und jeweils nur in das örtliche Gewebe zu
differenzieren vermögen, myogene Perizyten also in Myoblasten und nicht in
Osteoblasten. Dabei scheinen unterschiedliche Populationen von
Diskussion
65
Vorläuferzellen trotzdem einige Oberflächenmerkmale wie CD146 gemeinsam
zu haben (Shih 1999; Sacchetti, Funari et al. 2007; Bianco 2011).
Die Mesenchymale Stammzelle aus dem Knochenmark ist daher am ehesten
als Skelettale Stammzelle bzw. osteogene Vorläuferzelle anzusehen. Kürzlich
verdichtete sich das Augenmerk auf die stabilisierenden Faktoren osteogener
Progenitorzellen auf die Mikroumgebung von Stammzell-Nischen und
Förderung der Angiogenese und der Gefäßregeneration. Es soll nur die
Interaktion zu Endothelzellen und die Produktion von Angiopoietin an dieser
Stelle erwähnt werden. Eine grundsätzliche Voraussetzung für eine
Geweberegeneration ist nämlich stets ein vaskuläres Remodelling und die
Wiederherstellung einer homöostatischen Mikroumgebung im geschädigten
Gewebe. Sind es also die Differenzierungseigenschaften von MSCs, die eine
Regeneration ermöglichen oder eher trophische und immunmodulatorische
Effekte, die ein geeignetes physiologisches Milieu schaffen? Oder trifft beides
zu? In Zukunft wird diese neue Sichtweise die Forschung an MSCs bestimmen
und unser Verständnis weiter verbessern (Bianco 2011; Bianco 2011; Bianco,
Sacchetti et al. 2011).
4.4. Zusammenfassende Schlussfolgerungen
Nur sehr selten führen geniale und meist zufällige Beobachtungen innerhalb
kürzester Zeit zu Bahn brechenden Neuerungen in der naturwissenschaftlichen
Forschungswelt. Fast immer sind es unzählige Puzzlesteine, die in jahrelanger
Kleinstarbeit – oftmals von vielen Rückschlägen und Hindernissen begleitet –
eines Tages ein schlüssiges Gesamtbild ergeben. Dabei ist es nicht untypisch,
dass immer wieder Phasen von überschwänglicher Euphorie von solchen
abgelöst werden, in denen aktuelle Versuchsergebnisse die entstehenden
Erwartungen und Hoffnungen nicht erfüllen können. Oftmals entpuppt sich ein
fertig geglaubtes Puzzle lediglich als neues Puzzlestück in einem viel größeren
Kontext oder es erscheint unmöglich die letzten Puzzleteile zu finden. Trotzdem
herrscht niemals Stillstand oder Resignation und es tun sich immer neue Wege
auf, die den Weg der künftigen Forschung vorgeben. Auch die Forschung an
Diskussion
66
adulten Stammzellen ist ein stetiges Auf und Ab von nützlichen und
zukunftsweisenden Erkenntnissen und herben Rückschlägen. Doch gerade
diese Rückschläge zeigen uns oft ein etwas kompletteres Gesamtbild auf. Im
Besonderen gilt eine solche Sichtweise für Mesenchymale Stammzellen. Nach
wie vor ist der eigentliche Stammzellcharakter, die Beschaffenheit und
Lokalisation ihrer Nische, die Differenzierungseigenschaften und viele
biologische Funktionen dieser Zellen mit vielen Unsicherheiten behaftet.
Gerade diese Unsicherheiten, für die sich nach und nach Erklärungsmodelle
entwickeln bzw. entwickeln werden, machen die Mesenchymale Stammzelle zu
einem der spannendsten und immer noch viel versprechendsten Werkzeuge in
der modernen Molekularbiologie und im Zeitalter des Tissue Engineering. Die
Definition einer Stammzelle ist nach wie vor gültig, nämlich ihre Fähigkeit zur
unerschöpflichen Selbsterneuerung und zur Differenzierung in verschiedene
Zelltypen. Doch es wird gerade bei vielen Versuchsanordnungen in vitro
vorschnell eine Beweisführung konstruiert, die nicht immer dieser Definition
gerecht wird. So gilt die Langzeit-Kultur von MSCs in vitro als Beweis für ihre
Fähigkeit zur unerschöpflichen Selbsterneuerung und die Expression einiger
Markergene und ein ähnlicher Phänotyp als Beweis für das
Differenzierungspotential in ein bestimmtes Gewebe. Doch biologische Gewebe
sind hochkomplexe dreidimensionale Gebilde, und Knochen, Knorpel und
Muskel konnten in dieser Struktur noch nicht in vitro imitiert werden (Bianco
2011). Eine neue Sichtweise ist somit viel umfassender und führt weg von der
multipotenten Stammzelle hin zur Gewebszelle, die unter gewissen Stimuli
dedifferenzieren und Eigenschaften einer Stammzelle übernehmen kann. Dass
MSCs aus unterschiedlichen Geweben in vitro unter identischen Bedingungen
vielfach ähnliche biologische Phänotypen mit gleichen Oberflächenmarkern
hervorbringen, liegt somit womöglich auch an den Bedingungen in vitro, unter
denen diese einem bestimmten Differenzierungsweg zugeführt werden. Oder in
anderen Worten ausgedrückt, nicht die MSC-Population sondern das
Stammzellmedium und andere physikalische und chemische Reize garantieren
den Differenzierungsweg. Nach dieser Sichtweise erklären sich auch sämtliche
Gemeinsamkeiten, die mhMSCs und bhMSCs in unseren Versuchsreihen zu
Diskussion
67
Tage führten. In Zukunft wird also sicherlich die Nische der Stammzellen als
essentielles Milieu noch stärker in den Vordergrund rücken. Nicht nur die
Identifikation bzw. Gewinnung von MSCs aus dem Gewebe alleine ist somit der
Schlüssel, sondern auch ein umfassendes Verständnis um das physiologische
Milieu, in dem sich diese entfalten können. Wenig Zweifel besteht indes
darüber, dass MSCs einen bzw. den entscheidende Beitrag zur Stabilisierung
der Stammzell-Nische leisten. In Zukunft werden MSCs von noch größerer
Bedeutung sein, wenn im Zuge des Tissue Engineering sinnvolle Lösungen und
Therapiekonzepte zur Regeneration von erkranktem und degeneriertem
Gewebe gefunden werden müssen.
Zusammenfassung
68
5. Zusammenfassung
Technische Neuerungen und steigende Ansprüche an die Gesundheit stellen
die moderne Medizin immer wieder vor neue Herausforderungen und führen zur
Entwicklung von neuen Therapiekonzepten wie dem Tissue Engineering.
Vielfach kommen dabei adulte Stammzellen zum Einsatz, die anders als
omnipotente Embryonale Stammzellen (ESCs) als multipotent anzusehen sind.
Bei der Regeneration mesenchymalen Gewebes wie Knochen, Knorpel und
Muskulatur leisten Mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen entscheidenden
Beitrag. Diese lassen sich aus allen mesenchymalen Geweben des Körpers
gewinnen und stellen daher zwar keine homogene Zellpopulation dar, doch sie
lassen sich aufgrund phänotypischer und molekularbiologischer
Gemeinsamkeiten charakterisieren.
In großer Zahl lassen sich MSCs aus dem Knochenmark gewinnen und werden
als stromale MSCs bzw. mhMSCs (marrow-derived human MSCs) bezeichnet.
Auf der Suche nach homogenen Subpopulationen von MSCs wurde in dieser
Arbeit eine Zellpopulation aus Knochentrabekeln gewonnen, sogenannte
bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), und anhand ihrer Genexpression mit
mhMSCs verglichen. Dafür wurde RNA aus beiden Populationen in einem
Microarray mit anschließender SAM (significance analysis of microarrays)
analysiert um unterschiedliche Expressionsmuster zwischen mhMSCs und
bhMSCs aufzuzeigen. Diese Ergebnisse wurden durch konventionelle Reverse
Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) bestätigt, wobei das
Augenmerk vor allem auf solche Gene gerichtet wurde, die differentiell
exprimiert waren und zudem als Markergene ein Differenzierungspotential in
bestimmte Gewebe wie Muskel und Knochen vorhersagen. Dabei konnte
sowohl eine gute Übereinstimmung zwischen Microarray und RT-PCR
demonstriert als auch die Hoffnung auf eine homogene (trabekuläre) MSC-
Population mit anderen Differenzierungseigenschaften geweckt werden.
Im Verlauf weitergehender Untersuchungen der SAM fiel eine unerklärlich hohe
Expression von Immunglobulinketten in der mhMSC-Kultur (Passage 0) auf, die
letztlich auf eine Kontamination der Zellkultur mit Plasmazellen schließen ließ.
Zusammenfassung
69
Da die Ergebnisse des Microarrays (Passage 0 Kultur) somit zu hinterfragen
waren, wurde die Kontamination der Plasmazellen durch Passagieren der
mhMSC-Zellkultur (Passage 1) beseitigt und erneut ein Microarray mit SAM
durchgeführt. Dabei relativierten sich fast alle Expressionsunterschiede, die
somit auf die Kontamination der Plasmazellen zurückgeführt werden mussten.
Einzig drei Gene (CD24, TRIB2, AHNAK) wurden in diesem zweiten Array
differentiell exprimiert, was sich bei CD24 und TRIB2 auch durch RT-PCR
untermauern ließ.
Es lässt sich also schlussfolgern, dass bhMSCs wahrscheinlich in der Zukunft
des Tissue Engineering keinen Stellenwert haben werden, zumal ihre
Gewinnung im Vergleich zu mhMSC deutlich aufwendiger ist.
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Abbildungsverzeichnis
77
7. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Verwendete Gene mit Primersequenzen,
Produktlänge und Sequenz-ID ......................................................................... 30
Abb. 2: PCR-Bedingungen der verwendeten Gene......................................... 32
Abb. 3: Passage 0 – allgemeine Expressionsunterschiede im Microarray ...... 37
Abb. 4: Ergebnisse aus der RT-PCR der RNA aus Passage 0 Zellen............. 40
Abb. 5: Vergleich der Ergebnisse aus Microarray und RT-PCR
der Patienten-RNA ........................................................................................... 41
Abb. 6: Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Array und PCR
von P0 und P1.................................................................................................. 42
Abb. 7a: Gegenüberstellung der Expressionsunterschiede der Arrays aus
Passage 0 und 1 .............................................................................................. 44
Abb. 7b: Heatmap 1 ........................................................................................ 45
Abb. 7c: Heatmap 2......................................................................................... 46
Abb. 8: Ergebnisse der Immuncytochemie ...................................................... 47
Abb. 9: FACS-Analyse der mhMSC-Kulturen .................................................. 50
Zu 7b: Auflistung der Probesets zur Heatmap 1
Gene ID Gene Name 215176_x_at LOC651629 217022_s_at IGHA1 /// IGHA2 215379_x_at IGL@ /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 214677_x_at F13B /// IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 211430_s_at IFI6 /// IGH@ /// IGHG1 /// IGHG2 /// IGHG3 /// IGHM 209138_x_at F13B 215121_x_at IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 205959_at MMP13 214669_x_at IGKC 221651_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 221671_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 224795_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 214836_x_at IGKC /// IGKV1-5 1560425_s_at PTPRD 213479_at NPTX2 204845_s_at ENPEP 221796_at NTRK2 32128_at CCL18 229839_at SCARA5
Abbildungsverzeichnis
78
1562836_at --- 213502_x_at LOC91316 211124_s_at KITLG 209616_s_at CES1 205375_at MDFI 211401_s_at FGFR2 214043_at PTPRD 235281_x_at AHNAK 221558_s_at LEF1 215101_s_at CXCL5 1568646_x_at ZNF208 1562111_at BRE 226145_s_at FRAS1 229896_at GTF2I 209168_at GPM6B 220532_s_at LR8 202917_s_at S100A8 213994_s_at SPON1 242206_at --- 1558019_at --- 238271_x_at KIAA0182 213839_at KIAA0500 207017_at RAB27B /// SH3BGR 205098_at CCR1 204897_at PTGER4 211205_x_at PIP5K1A 202037_s_at SFRP1 232706_s_at TRABD 203936_s_at MMP9 204044_at QPRT 205681_at BCL2A1 218559_s_at MAFB 228988_at ZNF711 220022_at ZNF334 1557286_at --- 205032_at ITGA2 218934_s_at HSPB7 219778_at ZFPM2 206170_at ADRB2 203910_at ARHGAP29 201596_x_at KRT18 1554960_at C1orf110 229151_at SLC14A1
Abbildungsverzeichnis
79
Zu 7c: Auflistung der Probesets zur Heatmap 2
Gene ID Gene Name 215176_x_at LOC651629 217022_s_at IGHA1 /// IGHA2 215379_x_at IGL@ /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 214677_x_at F13B /// IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 211430_s_at IFI6 /// IGH@ /// IGHG1 /// IGHG2 /// IGHG3 /// IGHM 209138_x_at F13B 215121_x_at IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 205959_at MMP13 212592_at IGJ 214669_x_at IGKC 221651_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 221671_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 224795_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 214836_x_at IGKC /// IGKV1-5 1560425_s_at PTPRD 213479_at NPTX2 204845_s_at ENPEP 216207_x_at IGKV1D-13 /// LOC649876 221796_at NTRK2 215214_at IGL@ 217157_x_at --- 32128_at CCL18 209170_s_at GPM6B 215946_x_at CTA-246H3.1 229839_at SCARA5 223343_at MS4A7 204939_s_at PLN 1562836_at --- 213502_x_at LOC91316 211124_s_at KITLG 209616_s_at CES1 217428_s_at COL10A1 205375_at MDFI 204591_at CHL1 211401_s_at FGFR2 214043_at PTPRD 235281_x_at AHNAK 224435_at C10orf58 221558_s_at LEF1 209167_at GPM6B 215101_s_at CXCL5 210643_at TNFSF11 242899_at --- 1568646_x_at ZNF208 1562111_at BRE 226145_s_at FRAS1 211194_s_at TP73L 214608_s_at EYA1 1568644_at ZNF208 244190_at THAP5 229896_at GTF2I 206134_at ADAMDEC1 204638_at ACP5
Abbildungsverzeichnis
80
209168_at GPM6B 204220_at GMFG 220532_s_at LR8 209772_s_at CD24 219304_s_at PDGFD 202917_s_at S100A8 204642_at EDG1 205941_s_at COL10A1 205403_at IL1R2 228155_at C10orf58 215648_at NUDCD3 205712_at PTPRD 204456_s_at GAS1 233510_s_at PARVG 213994_s_at SPON1 205822_s_at HMGCS1 242206_at --- 1558019_at --- 215193_x_at HLA-DRB1 203680_at PRKAR2B 238271_x_at KIAA0182 207029_at KITLG 213839_at KIAA0500 207017_at RAB27B /// SH3BGR 241670_x_at --- 235343_at --- 209312_x_at HLA-DRB1 205098_at CCR1 213362_at PTPRD 210997_at HGF 204897_at PTGER4 219064_at ITIH5 214974_x_at CXCL5 211205_x_at PIP5K1A 202037_s_at SFRP1 206496_at FMO3 232706_s_at TRABD 1566624_at SLC1A3 202350_s_at MATN2 209960_at HGF 203936_s_at MMP9 204044_at QPRT 210998_s_at HGF 204670_x_at HLA-DRB1 243689_s_at MGC72104 205681_at BCL2A1 207018_s_at RAB27B /// SH3BGR 208306_x_at HLA-DRB1 40665_at FMO3 218559_s_at MAFB 218404_at SNX10 1570482_at SLC22A3 228988_at ZNF711 221933_at NLGN4X 209652_s_at PGF 210755_at HGF 215552_s_at ESR1 205655_at MDM4
Abbildungsverzeichnis
81
220022_at ZNF334 1557286_at --- 214767_s_at HSPB6 226864_at PKIA 217744_s_at PERP 231986_at RIMS1 206382_s_at BDNF 219308_s_at AK5 207733_x_at PSG9 219956_at GALNT6 227145_at LOXL4 204933_s_at TNFRSF11B 218451_at CDCP1 230869_at --- 222392_x_at PERP 222862_s_at AK5 211892_s_at PTGIS 210121_at B3GALT2 226789_at --- 223796_at CNTNAP3 /// CNTNAP3B /// LOC642342 /// LOC642373 /// FLJ37512 244623_at --- 1554685_a_at KIAA1199 201860_s_at PLAT 205032_at ITGA2 239262_at PRSS23 218934_s_at HSPB7 219778_at ZFPM2 206702_at TEK 244065_at CNTNAP3B /// LOC642373 /// FLJ37512 226071_at ADAMTSL4 215856_at CD33L3 205715_at BST1 205302_at IGFBP1 239066_at --- 214265_at ITGA8 227314_at --- 209594_x_at PSG9 209738_x_at PSG6 206170_at ADRB2 204339_s_at RGS4 204602_at DKK1 204337_at RGS4 229121_at --- 203888_at THBD 237435_at --- 205856_at SLC14A1 203910_at ARHGAP29 201596_x_at KRT18 1554960_at C1orf110 215704_at FLG 1555929_s_at --- 204830_x_at PSG5 224022_x_at WNT16 229151_at SLC14A1 1558280_s_at ARHGAP29 210432_s_at SCN3A
Abbildungsverzeichnis
82
8. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ACI Autologe Chondrozytenimplantation
ADP Adenosintriphosphat
AK Antikörper
ALP Alkalische Phosphatase
ATP Adenosintriphosphat
BC Bone chip – Kurzform für bhMSC
BGLAP Bone gamma-carboxyglutamate protein
bhMSC Trabecular bone-derived human mesenchymal stem cell
BMP-2/ -4 Bone morphogenetic protein 2/ 4
bp Basenpaar
BSA Bovines Serumalbumin
BSP Bone sialoprotein
bzw. beziehungsweise
Ca2+ Calcium ionisiert
CCAAT CCAAT-Box (Cytidin-Cytidin-Adenosin-Adenosin-Thymin)
CD Cluster of differentiation (z.B. CD24)
cDNA komplementäre DNA
CDX-2 Caudal type homebox 2
C/EBP CCAAT/Enhancer-binding protein
CFU Colony-forming unit – Kolonie bildende Einheit
CFU-F Colony-forming unit Fibroblasten
Col1 Kollagen 1
cRNA komplementäre RNA
CSC Cancer Stem Cells
CXCR4 CXC Chemokin Rezeptor 2
DMEM Dulbecco’s modified eagle medium
dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat
DNA Deoxyribonucleic acid – Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat
Abbildungsverzeichnis
83
EF1α Eukaryotischer Translations- und Elongationsfaktor 1alpha
EMT Epitheliale Mesenchymale Transition
EOMES Eomesodermin
ESC Embryonic Stem Cell – Embryonale Stammzelle
FBS Fetales Kälberserum
FACS Fluorescence-activated cell sorting (Durchflusszytometrie)
FGF8 Fibroblast growth factor 8
FOXO3 Forkhead-Box-Protein O3
G-CSF Colony-stimulating factor Granulozyten
GM-CSF Colony-stimulating factor Granulozyten Makrophagen
GTP Guanosintriphosphat
h human – menschlich (z.B. hESC)
HLA-DR Human Leukocyte Antigen Typ DR
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HSC Haematopoietic Stem Cell – Hämatopoietische Stammzelle
hSM-MSC Human synovial membrane Mesenchymal Stem Cell
IBSP Integrin-binding sialoprotein
Ig Immunglobulin
IL Interleukin (z.B. IL-10)
INFγ Interferon gamma
LIF Leukemia inhibitory factor
LNGFR Low-affinity nerve growth factor receptor
LPL Lipoproteinlipase
m murine – mäusespezifisch, Maus-
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MCAM Melanoma cell adhesion molecule
MET Mesenchymale Epitheliale Transition
MgCl2 Magnesiumchlorid
mhMSC Marrow-derived human mesenchymal stem cell
miR-21 Micro-RNA des Gens MIR21
MLC1SA Myosin light chain 1 slow a
MSC Mesenchymal Stem Cell – Mesenchymale Stammzelle
Abbildungsverzeichnis
84
MyoD1 Myogenic Differentiation 1
MYOF Myoferlin
Myog Myogenin
NCAM Neural cell adhesion molecule
NeuN Neuronales Nucleus Protein
NF-M Neurofilament M
Nid1/ 2 Nidogen 1/ 2
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
NSAR Nicht-steroidale Antirheumatika
NSE Neuronen Spezifische Enolase
OC Osteocalcin
Oct4 Octamer binding transcription factor 4
Oligo-dT Kurze Sequenz aus Desoxy-Thymin-Nukleotiden
OPN Osteopontin
P Passage (z.B. P0: Passage 0)
Pax3 /7 Paired Box 3/ 7
PBS Phosphatpuffer
PCR Polymerase Kettenreaktion
POU5F1 POU class 5 homeobox 1
PPARg2 Peroxisome proliferation-activated receptor g2
Ral-GTPase Ras-like GTPase
RNA Ribunucleic acid – Ribonukleinsäure
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion
SAM Significance analysis of microarrays
SDF-1 Stromal Cell-derived factor
SH2/ 3 Src-homology 2/ 3
SIBLING Small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein
Sox2 Sex determining region Y (SRY) box 2
SPP1 Secreted phosphoprotein 1
SSEA-3/ -4 Stage-specific embryonic antigens 3/ 4
STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
SZM Stammzellmedium
Abbildungsverzeichnis
85
Taq Thermus aquaticus (Bakterium)
TBE TRIS Borat EDTA Puffer
TBS Tris Buffered Saline
TERT Telomerase Reverse Transkriptase
TGFβ Transforming growth factor beta
TLR Toll-like Rezeptoren
TNFα Tumor Nekrose Faktor alpha
TPM1 Tropomyosin 1
TRIB2 Tribbles homolog 2
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
TrkA High affinity nerve growth factor receptor
UV ultraviolett
z.B. zum Beispiel
Danksagung
Mein Dank gilt allen Personen, die mir bei der Erstellung dieser Arbeit auf sehr
unterschiedliche Weise zur Seite standen und ohne deren Unterstützung ich mein
Ziel nicht erreicht hätte.
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater Franz Jakob danken, der mir
freundlich und konsequent den richtigen Weg aufzeigte und mit interessanten
Anregungen den erfolgreichen Fortgang dieser Arbeit stets im Blick hatte. Für die
kritische Einschätzung der Arbeit möchte ich ihm zudem herzlich danken.
In besonderem Maße danke ich Regina Ebert für die nette und fruchtbare Betreuung.
Zu jedem Zeitpunkt stand sie mir zur Seite, ob mit Erklärungen zur Thematik oder
Verbesserungsvorschlägen. Immer hatte sie ein Auge auf die experimentellen
Ergebnisse und unterstützte mich auch beim Verfassen in regem Email-Kontakt, als
ich in der Assistenzzeit Würzburg schon den Rücken gekehrt hatte.
Als ebenso wichtig und angenehm empfand ich die freundliche Arbeitsatmosphäre im
Osteologie-Labor. Von allen Mitarbeitern wurde ich immer selbstverständlich an die
verschieden molekularbiologischen Methoden herangeführt. Ohne ihre Unterstützung
hätte ich mich in die Thematik nicht einfinden können.
Ich danke Torsten Blunk für die kritische Prüfung und die Erstellung des
Zweitgutachtens.
Außerdem danke ich Jörg Arnholdt, der durch seine Dissertation wichtige Vorarbeit
geleistet hatte.
Bei Ulrich Goschenhofer möchte ich mich für das sorgfältige Korrekturlesen sowohl
auf sprachlicher als auch auf fachlicher Ebene bedanken.
An letzter und entscheidender Stelle gebührt mein Dank meinen Eltern, die mir das
Studium ermöglichten. Sie konnten mein Interesse und meine tiefe Begeisterung für
die Medizin wecken und standen mir ausnahmslos während des gesamten
Bildungsweges nicht nur mit fachlichem Rat zur Seite. Ohne euch hätte ich den Weg
nicht gehen können. Danke!
Lebenslauf Persönliche D aten: Name: Maximilian Heitmann
Adresse:
Mobiltelefon:
Email:
Geburtstag: 10.07.1984, Wiesbaden
Nationalität: Deutschland
Ausbildung und Weiterbildung
01/2015 Promotion: Universität Würzburg, Deutschland
seit 05/2013 2. Ausbildungsabschnitt Unfallchirurgie und Orthopädie Vivantes Humboldt Klinikum Berlin, Deutschland
10/2011 - 11/2012 1. Ausbildungsabschnitt Chirurgie/ Common Trunk: Allgemeinchirurgie, Ospedale Regionale di Mendrisio, Schweiz
05/2011 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Staatsexamen) und Approbation Universität Würzburg, Deutschland
02/2010 - 01/2011 Praktisches Jahr: Rotation in Allgemeinchirurgie: Kantonsspital Luzern, Schweiz Innere Medizin: Ospedale Regionale Mendrisio, Schweiz Orthopädie: König-Ludwig-Haus Würzburg, Deutschland
02/2009 - 06/2009 Erasmus Praktikumssemester: Universität Porto, Portugal Klinische Praktika: Innere Medizin, Pädiatrie, Allgemeinmedizin, Plastische Chirurgie
10/2004 - 01/2010 Medizinstudium: Universität Würzburg, Deutschland Wahlfächer/ Famulaturen: Orthopädie, Plastische Chirurgie, Innere Medizin, Herz- und Gefäßchirurgie, Allgemeinmedizin, Radiologie, EKG-Analyse
09/2003 - 06/2004 Zivildienst: Haßberg-Kliniken, Hofheim/ Ufr., Deutschland Stationsdienst auf der internistischen Pflegestation
06/2003 Abitur Regiomontanus Gymnasium, Haßfurt, Deutschland; Abschlussnote 1,9 Maximilian Heitmann
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