bİr bİyoreaktÖrde glİkoz derİŞİmİ kontrolu zeynep...
Post on 07-Sep-2019
17 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU
Zeynep YILMAZER
Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı
Haziran 2009
-
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU
Zeynep YILMAZER
KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2009
Her Hakkı Saklıdır
-
TEZ ONAYI
Zeynep YILMAZER tarafından hazırlanan “ Bir Biyoreaktörde Glikoz Derişimi Kontrolu ” adlı tez çalışması --/--/2009 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Danışman : Doç. Dr. Bülent AKAY
,
Jüri Üyeleri :
Başkan: Doç. Dr. Bülent AKAY
Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü
Üye : Prof. Dr. Hale HAPOĞLU
Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü
Üye : Doç. Dr. Ayla ALTINTEN
Gazi Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü
Yukarıdaki sonucu onaylarım.
Prof.Dr.Orhan ATAKOL
Enstitü Müdürü
-
i
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
BİR BİYOREAKTÖRDE GLİKOZ DERİŞİMİ KONTROLU
Zeynep YILMAZER
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Bülent AKAY
Bu çalışmada, havalı koşullarda Saccharomyces cerevisiae çoğaltılan kesikli ve yarı-kesikli bir biyoreaktörün çoğalma ortamının glikoz derişiminin dinamik analizi ve kontrolü gerçekleştirilmiştir. Biyoreaktörde maksimum mikroorganizma çoğalmasını sağlamak için pH, sıcaklık, DO, karıştırma hızı ve substrat derişimi gibi parametrelerin optimum değerlerinde işletilmesi gerekmektedir. Ekmek mayası üretim prosesinde kontrol edilmesi gereken en önemli parametrelerden biri de substrat derişimidir. Substrat derişiminin fazla olması, mikroorganizma çoğalmasının inhibe olmasına neden olmaktadır. Biyotepkime ortamında, karbon kaynağı olarak kullanılan substratın bulunmaması veya az olması mikroorganizma derişiminin düşük olmasına, fazla olması ise mikroorganizma çoğalmasını inhibe ederek mikroorganizma derişiminin düşük olmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, çalışmada substrat olarak kullanılan glikoz kontrol edilen değişken, ayarlanabilen değişken olarak da glikoz akış hızı seçilmiştir. Bu tez kapsamında, kontrol çalışmalarından önce kesikli tepkime kaplarında başlangıç substrat derişiminin mikroorganizma çoğalmasına etkisi incelenmiş ve 20 g/L glikoz derişiminde maksimum çoğalmanın gerçekleştiği görülmüştür. Kontrol çalışmalarında kullanılacak olan 5L çalışma hacmine sahip biyoreaktörün dinamik davranışı incelenmiş ve sistem tanımlama yöntemi ile biyoreaktörü en iyi tanımlayan model elde edilmiştir. Sistem tanımlama ve kontrol algoritmasında biyoreaktör modeli olarak Auto Regressive Moving Average with eXogenous (ARMAX) kullanılmıştır. ARMAX Model parametreleri Yinelemeli En Küçük Kareler Metodu (YEKK) kullanılarak hesaplanmıştır ve sistemin üçüncü mertebeden modele uyduğu bulunmuştur. Elde edilen model parametreleri, MATLAB programlama dilinde yazılan Genelleştirilmiş Minimum Varyans (GMV) kontrol algoritmasında kullanılarak farklı set noktası değişimleri için teorik glikoz kontrolü başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ayrıca prosesin birinci mertebeden ölü zamanlı modeli oluşturularak ve MATLAB paket programı kullanılarak farklı sabit set noktalarında PID kontrolü gerçekleştirilmiştir. Haziran 2009, 142 sayfa Anahtar Kelimeler: Ekmek Mayası, Glikoz Derişim Kontrolü, Genelleştirilmiş Minimum Varyans Kontrol, Sistem Tanımlama
-
ii
ABSTRACT
Master Thesis
GLUCOSE CONCENTRATION CONTROL IN A BIOREAKTOR
Zeynep YILMAZER
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Bülent AKAY
In this work, glucose concentration of batch and fed-batch bioreactor in which Saccharomyces cerevisiae growth at aerobic conditions was dynamic analysed and controled. In the bioreactor to reach the maximum growth rate, the parameters like pH, temprature, dissolved oxygen concentration, mixing rate and substrate concentration’s optimum values has to be found. In baker’s yeast production the most important controlled parameter is substrate concentration. High substrate concentrations may inhibate the microorganism growth. In bioreaction, if the substrate which is used as carbon source does not exist or not enough microorganism concentration will be low. If it is high it causes the microorganism concentration to be low by inhibitating the microorganism growth. For this reason glucose used as substrate is chosen as controlled variable and glucose flow rate as the manipulated variable. In this study, before the control applications the effect of initial substrate concentration on microorganism growth in a batch reactor is investigated and maximum growth was observed in 20 g/L glucose concentration. Dynamic behaviour of the bioreactor used in control applications which has 5L of working volume was analised and by system identification method the best model that determines the bioreactor was obtained. Auto Regressive Moving Average with eXogenous (ARMAX) was used as bioreactor model in system identification and control algorithm. In this study ARMAX Model parameters were evaluated by Recursive Least Square Method (RLSM) and the system was estimated as third degree model. Model parameters obtained, is used in generalised minimum variance control which was written in MATLAB and for different set point variances theoric glucose control was performed successfully. In addition to this PID control on different constant set points was performed by generating first order dead time model of the process and using MATLAB.
June 2009, 142 pages Keywords: Baker’s Yeast, Glucose Concentration Control, Generalised Minimum Variance Control, System Identification
-
iii
ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR
Yüksek lisansıma başladığım, çalışmak istediğim konuda dahi kararsız olduğum
günlerde tavsiye ve yol göstermeleriyle proses kontrol dünyasına adım atmamı sağlayan
ve sonuna yaklaştığım çalışmalarım süresince yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen,
karşılaştığım sorunlarda bilgi ve deneyimleriyle bana çözüm yolları bulan danışmanım
değerli hocam sayın Doç. Dr. Bülent AKAY’a (Ank. Üni. Kim. Müh.) teşekkürü bir
borç bilirim.
Bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım çalışmalarımın her aşamasında varlıklarını
hissettiğim değerli hocalarım Prof. Dr. Mustafa ALPBAZ (Ank. Üni. Kim. Müh.) ve
Prof. Dr. Hale HAPOĞLU’na (Ank. Üni. Kim. Müh.) teşekkür ederim.
Bitmek tükenmek bilmeyen pozitif enerjisi, yüzünden eksik olmayan gülümsemesi ve
sonsuz sabrıyla çalışmalarım süresince gece gündüz demeden her an yanımda olan,
bilime ve bilgiye ulaşmamda yol gösteren, bütün öğrencilerine olduğu gibi bana da
anne şefkati ile yaklaşarak en sıkıntılı anlarımda bile beni rahatlatan canım hocam Dr.
Suna ERTUNÇ’a (Ank. Üni. Kim. Müh.) ve Havva BOYACIOĞLU’na sonsuz
teşekkür ederim.
Tüm içtenlikleri ve huzur veren sevgileriyle her anlamda yanımda olan Berçem
ELDELEKLİOĞLU ve Emrah DÜZOL’a ve tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Benim için dünyayı anlamlı kılan, çalışmalarım süresince maddi manevi desteklerini
esirgemeyen, başarılarımla mutlu olup, üzüldüğümde hüzünlenen şu an bu aşamaya
gelmiş olmamda büyük emekleri olan Canım Babam, Annem, Ablam ve tüm aileme
minnettarım, sizleri seviyorum.
Zeynep YILMAZER
Ankara, Haziran 2009
-
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET. ................................................................................................................................ i
ABSTRACT ....................................................................................................................... ii
ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR ................................................................................................. iii
SİMGELER DİZİNİ ......................................................................................................... viii
ŞEKİLLER DİZİNİ .......................................................................................................... xi
ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................... xv
1. GİRİŞ ............................................................................................................................. 1
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ......................................................................................... 5
3. KURAMSAL TEMELLER .......................................................................................... 11
3.1 Mikroorganizmaların Sınıflandırılması .................................................................... 11
3.2 Mayanın Tarihçesi ...................................................................................................... 11
3.3 Maya Hücresi .............................................................................................................. 12
3.4 Ekmek Mayası. ............................................................................................................ 13
3.4.1 Maya gelişimini düzenleyici etkiler. ....................................................................... 15
3.4.2 Maya aktivitesini etkileyen etkenler ....................................................................... 16
3.4.2.1 Besin maddelerinin etkisi. .................................................................................... 16
3.4.2.2 Sıcaklığın etkisi. ..................................................................................................... 17
3.4.2.3 Oksijen etkisi. ........................................................................................................ 17
3.4.2.4 pH etkisi. ................................................................................................................ 18
3.4.2.5 Metabolizma ürünlerinin etkisi. .......................................................................... 18
3.5 Biyoreaktörler ............................................................................................................. 18
3.5.1 Biyoreaktör işletim türleri ...................................................................................... 19
3.6 Proses Gözleme ve Kontrol ........................................................................................ 20
3.6.1 pH kontrol ................................................................................................................. 20
3.6.2 Çözünmüş oksijen derişiminin kontrolü ................................................................ 20
3.6.3 Sıcaklık kontrol ........................................................................................................ 21
3.6.4 Basınç kontrolü ........................................................................................................ 21
3.6.5 Köpük kontrolü ........................................................................................................ 22
3.6.6 Substrat derişiminin kontrolü. ............................................................................... 22
3.6.6.1 Solunum oranı (‘Respirartory Quotient’, RQ ). ................................................ 23
-
v
3.7 Sistem Tanımlama. ..................................................................................................... 23
3.7.1 Modelleme. ................................................................................................................ 24
3.7.2 Sistem tanımlamanın uygulanması ........................................................................ 26
3.7.2.1 Sistem tanımlama için kullanılan parametrik yöntemler. ................................ 26
3.7.2.2 Sistem Tanımlamada Kullanılan Sinyaller ......................................................... 27
3.7.2.3 Sistem Modelleri .................................................................................................... 28
3.7.2.3.1 Sinyal modelleri. ................................................................................................. 28
3.7.2.3.2 Model parametrelerinin hesaplanması. ........................................................... 32
3.7.2.3.2.1 En küçük kareler yöntemi (EKK). ................................................................ 32
3.7.2.3.2.2 Yinelemeli en küçük kareler yöntemi (YEKK). ........................................... 35
3.8 Filtreleme. .................................................................................................................... 40
3.9 Çeşitli Proseslerin Kontrolü. ...................................................................................... 42
3.9.1 Kontrol yöntemleri. .................................................................................................. 42
3.9.1.1 Biyoreaktörde substrat derişiminin genelleştirilmiş minimum. .......................
varyans (GMV) yöntemi ile kontrolü. ................................................................ 43
3.9.1.1.1 GMV yöntemi ..................................................................................................... 43
3.9.1.1.2 Sistem modeli. ..................................................................................................... 45
3.9.1.1.3 Pseudo Random Binary Sequence (PRBS) etki. .............................................. 47
3.9.1.2 Ticari yazılımlar. ................................................................................................... 48
4. MATERYAL ve YÖNTEM ......................................................................................... 50
4.1 Mikroorganizma Çoğaltılması. .................................................................................. 50
4.2 Besi Ortamları. ............................................................................................................ 50
4.2.1 Katı besi ortamı. ....................................................................................................... 51
4.2.2 Sıvı besi ortamı ......................................................................................................... 52
4.3 Deney Sistemi .............................................................................................................. 52
4.3.1 Biyoreaktörde on-line ölçülen değişkenler. ........................................................... 55
4.3.2 Glikoz kontrolü. ....................................................................................................... 55
4.4 Deney Yöntemi. ........................................................................................................... 56
4.4.1 Optimum biyoreaktör işletim parametreleri. ........................................................ 57
4.4.2 Kalibrasyon çalışmaları. .......................................................................................... 57
4.4.3 Mayada canlı hücre sayımı. .................................................................................... 57
4.4.4 Yatışkın koşulun belirlenmesi. ................................................................................ 58
-
vi
4.4.5 Dinamik deneyler. .................................................................................................... 58
5. ARAŞTIRMA BULGULARI. ...................................................................................... 59
5.1 Optimum biyoreaktör işletim parametreleri. ........................................................... 59
5.1.1 Başlangıç substrat (glikoz) derişiminin mikroorganizma. ...................................
çoğalmasına etkisi. ................................................................................................... 59
5.2 Kalibrasyon Çalışmaları. ........................................................................................... 61
5.2.1 pH probu kalibrasyonu. .......................................................................................... 62
5.2.2 Pompa kalibrasyonları. ........................................................................................... 62
5.2.3 CO2 probu kalibrasyonu. ........................................................................................ 64
5.2.4 Glikoz ölçer cihazının kalibrasyonu. ...................................................................... 64
5.2.5 Etanol ölçer cihazının kalibrasyonu. ...................................................................... 67
5.3 Biyoreaktörde Dinamik Çalışmalar. ......................................................................... 68
5.3.1 Açık hat biyoreaktör işletimi. ................................................................................. 68
5.3.2 Yarı kesikli deney. .................................................................................................... 72
5.3.3 Yatışkın koşulun belirlenmesi. ................................................................................ 75
5.3.4 Dinamik analiz. ........................................................................................................ 76
5.3.4.1 Basamak etki durumunda (altında) girdi-çıktı ilişkisi. ..................................... 76
5.3.4.2 Proses özelliklerinin belirlenmesi. ....................................................................... 77
5.3.5 Sistemin matematiksel modelinin belirlenmesi. .................................................... 78
5.3.6 Sistemin parametrik modelinin belirlenmesi. ....................................................... 84
5.3.6.1 Kovaryans matrisin başlangıç değerinin etkisi. ................................................. 84
5.3.6.2 Unutma çarpanının etkisi. .................................................................................... 87
5.3.6.3 Parametrik modelin mertebesinin belirlenmesi. ................................................ 88
5.4 Biyoreaktörde Kontrol Çalışmaları. ......................................................................... 89
5.4.1 PID kontrol çalışmaları. .......................................................................................... 89
5.4.2 Teorik PID kontrol çalışmaları. .............................................................................. 92
5.4.3 GMV kontrol çalışmaları. ....................................................................................... 98
5.4.3.1 Teorik GMV kontrol çalışmaları. ........................................................................ 98
5.4.3.2 Deneysel GMV kontrol çalışmaları. .................................................................... 105
6. TARTIŞMA VE SONUÇLAR. .................................................................................... 108
KAYNAKLAR. ................................................................................................................. 115
EKLER ............................................................................................................................... 119
-
vii
EK 1 Mikroorganizma Kalibrasyonu ............................................................................. 120
EK 2 Teorik Sistem Tanımlama için MATLAB Programı. .......................................... 121
EK 3 Teorik PID Kontrolu için MATLAB Programı. .................................................. 123
EK 4 Teorik GMV Kontrolu için MATLAB Programı................................................. 126
EK 5 Deneysel GMV Kontrolu için VISIDAQ Programı. ............................................ 130
ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................... 142
-
viii
SİMGELER DİZİNİ
A....R Kesikli zaman girdi/çıktı modelde yer alan polinomlar
a Genlik seviyesi
Cs Substrat derişimi (g substrat/L)
CS0 Başlangıç substrat derişimi (g substrat/L)
Cx Mikroorganizma derişimi (g kuru hücre/L)
e(t) Gürültü
E Ardışık fark vektörü
EA Aktivasyon enerjisi (kmol/J)
FO2 Hava akış hızı (ml/dk)
Fs Substrat akış hızı (ml/dk)
H Henry sabiti
J GMV Yöntemi için maliyet fonksiyonu
K Yatışkın hal kazancı
Kc Oransal sabit
KM Monod sabiti (g substrat/L)
N PRBS girdi sinyali periyodu
Nmin,max Minimum ve maksimum karıştırıcı hızları (devir/dk)
NO Oksijen molar akısı
P(t) Kovaryans matris
Qe Hata sinyali
Qo Kontrol çıkış sinyali
r Set noktası
ro Mikroorganizma özgül oksijen aktarım hızı
rx Mikroorganizma çoğalma hızı (g kuru hücre/L st)
R Evrensel gaz sabiti
s(t) t anında sisteme etki eden sinyal
t Zaman (s, dk veya st)
td Kesikli zaman
T Sıcaklık
Tsw Kare dalga periyodu
-
ix
Tp PRBS girdi sinyali toplam periyodu
u(t) Ayarlanabilen değişken (Glikoz akış hızı, L/dk)
uc(t) Sürekli zaman girdi sinyali
ud(t) Kesikli zaman girdi sinyali
V Maliyet fonksiyonu
VR Reaktör hacmi (L)
x(t) Ara değişken
y(t) Çıktı değişkeni (Çözünmüş oksijen derişimi, mg/L)
)t(ŷ Modelden elde edilen çıkış değişkeni
Y Ardışık veri vektörü
SXY Substrat verim katsayısı
2OXY Oksijen verim katsayısı
zi Çoğalma ortamındaki bir iyonun gücü
Yunan Alfabesi
∆ Fark işleci (∆=1-q-1)
Φ Pse output (yalancı çıktı)
)t(ε Gerçek çıkış değişkeni ile model çıkış değişkeni arasındaki fark
θ Parametre vektörü
λ Unutma çarpanı
µ Mikroorganizma özgül çoğalma hızı (h-1)
maxµ Mikroorganizma özgül çoğalma hızı (h-1)
τ Zaman sabiti
Dτ Türevsel zaman sabiti
Iτ İntegral zaman sabiti
rτ Yükselme zamanı
ϕ Veri vektörü
Tϕ Veri vektörünün transpozu
-
x
φ Ardışık veri vektörü
Tφ Ardışık veri vektörünün transpozu
Kısaltmalar
ARMAX Auto Regressive Moving Average with Exogenous
CARMA Controlled Auto Regressive Moving Average
CPR Karbondioksit tüketim hızı
DO Çözünmüş oksijen derişimi
EKK En Küçük Kareler Yöntemi
GMV Genelleştirilmiş Minimum Varyans Kontrol
IAE Hata mutlak değeri integrali
ISE Hata karesi integrali
MV Minimum Varyans Kontrol
OAH Oksijen aktarım hızı
OHH Oksijen harcanma hızı
OUR Oksijen tüketim hızı
PID Oransal-İntegral-Türevsel Kontrol
RQ Solunum oranı
YEKK Yinelemeli En Küçük Kareler Yöntemi
-
xi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 3.1 Mikroorganizmaların sınıflandırılması ................................................................ 11
Şekil 3.2 t anında giriş değişkeni u(t), çıkış değişkeni y(t) ve gürültü e(t). ........................
içeren bir dinamik sistem . .................................................................................. 23
Şekil 3.3 Sistem tanımlama akış diyagramı. ....................................................................... 27
Şekil 3.4 Bir sistemde bulunabilecek girdi ve gürültüler. ...................................................... 30
Şekil 3.5 Yinelemeli parametre hesaplama yönteminin şematik gösterimi. ....................... 36
Şekil 3.6 Sistem yalancı-çıktısının blok diyagramı. ........................................................... 45
Şekil 3.7 PRBS sinyalinin şematik gösterimi ..................................................................... 48
Şekil 4.1 Deney sistemi. ...................................................................................................... 54
Şekil 4.2 On-line RQ ile glikoz kontrol sistemi. ................................................................. 55
Şekil 4.3 Glikoz ölçer ile glikoz kontrol sistemi. ................................................................ 56
Şekil 4.4 t=4 anında mikroorganizmaların görünüşü. ......................................................... 58
Şekil 5.1 Glikoz başlangıç derişiminin mikroorganizma çoğalmasına etkisi. .................... 60
Şekil 5.2 Başlangıç substrat derişimi ile özgül çoğalma hızının ve 7. saatin sonunda. ......
elde edilen mikroorganizma derişiminin değişimi ............................................... 61
Şekil 5.3 pH değerine karşı bilgisayar sinyali değişimi ...................................................... 62
Şekil 5.4 Glikoz besleme pompası için gösterge değerine karşı akış hızının değişimi ...... 63
Şekil 5.5 Glikoz pompası için gösterge değerine karşı akış hızının değişimi .................... 63
Şekil 5.6 CO2 probu için multisensör gösterge değerine karşı bilgisayar sinyali. ..............
değişimi. .............................................................................................................. 64
Şekil 5.7 Glikoz ölçer cihazının kalibrasyonu .................................................................... 65
Şekil 5.8 Eklenen mikroorganizma hacminin glikoz ölçer sinyali ile değişimi. ................ 65
Şekil 5.9 Mikroorganizmasız glikoz çözeltisi ile deriştirilen ve steril saf su. ....................
ile seyreltilen ortamların glikoz ölçer sinyali ile değişimi.. ................................ 66
Şekil 5.10 Mikroorganizmalı ortamdaki glikoz derişiminin glikoz ölçer sinyali. ..............
ile değişimi. ....................................................................................................... 66
Şekil 5.11 Etanol gösterge değerine karşılık etanol derişimi (%v/v) değeri. ...................... 67
Şekil 5.12 Kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi......... 69
Şekil 5.13 Kesikli tepkime kabında çözünmüş oksijen derişiminin zamanla değişimi. ..... 69
Şekil 5.14 Kesikli tepkime kabında etanol derişiminin zamanla değişimi. ........................ 70
-
xii
Şekil 5.15 Kesikli tepkime kabında sıcaklık ve pH’ın zamanla değişimi.. ......................... 71
Şekil 5.16 Kesikli tepkime kabında glikoz derişiminin zamanla değişimi. ........................ 71
Şekil 5.17 Yarı- kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla . .............
değişimi. ............................................................................................................. 72
Şekil 5.18 Yarı- kesikli tepkime kabında çözünmüş oksijen derişiminin. ..........................
zamanla değişimi. .............................................................................................. 73
Şekil 5.19 Yarı- kesikli tepkime kabında etanol derişiminin zamanla değişimi. ................ 73
Şekil 5.20 Yarı- kesikli tepkime kabında glikoz derişiminin zamanla değişimi. ............... 74
Şekil 5.21 Yarı- kesikli tepkime kabında gaz faz CO2 nin zamanla değişimi. ................... 74
Şekil 5.22 Yarı- kesikli tepkime kabında pH’ın zamanla değişimi. .................................. 75
Şekil 5.23 Yatışkın koşul. ................................................................................................... 75
Şekil 5.24 Glikoz akış hızına 4.4 ml/dk’dan 84 ml/dk’ya pozitif basamak etki. ................
verilmesi. ........................................................................................................... 77
Şekil 5.25 Glikoz akış hızına 4.4 ml/dk’dan 84 ml/dk’ya pozitif basamak. .......................
etki verildiğinde substrat derişiminin zamanla değişimi. .............................. 77
Şekil 5.26 Doğrusal regresyon yöntemi. ............................................................................. 78
Şekil 5.27 Kesikli tepkime kabında teorik mikroorganizma derişiminin. ..........................
zamanla değişimi. .............................................................................................. 79
Şekil 5.28 Kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla değişimi. ........... 79
Şekil 5.29 Kesikli tepkime kabında teorik çözünmüş oksijen derişiminin. ........................
zamanla değişimi. .............................................................................................. 80
Şekil 5.30 Kesikli tepkime kabında mikroorganizma derişiminin zamanla değişimi......... 80
Şekil 5.31 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik mikroorgaznizma derişiminin. .................
zamanla değişimi. .............................................................................................. 81
Şekil 5.32 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla. ..................
değişimi. ............................................................................................................ 81
Şekil 5.33 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik DO derişiminin zamanla değişimi. .......... 82
Şekil 5.34 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik mikroorganizma derişiminin. ...................
zamanla değişimi. .............................................................................................. 82
Şekil 5.35 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik substrat derişiminin zamanla . .................
değişimi. ............................................................................................................ 83
Şekil 5.36 Yarı-kesikli tepkime kabında teorik DO derişiminin zamanla değişimi. .......... 83
-
xiii
Şekil 5.37 na=2 nb=2 lamda=1 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ......................... 85
Şekil 5.38 na=2 nb=2 lamda=0.9 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ...................... 85
Şekil 5.39 na=3 nb=2 lamda=1 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ......................... 86
Şekil 5.40 na=3 nb=2 lamda=0.9 için kovaryans matris değişiminin etkisi. ...................... 86
Şekil 5.41 na=2 nb=2 α =1000 için lamda değişiminin etkisi. ........................................... 87
Şekil 5.42 na=3 nb=2 α =1000 için lamda değişiminin etkisi. ........................................... 88
Şekil 5.43 Simulink kapalı devre diyagramı. ...................................................................... 90
Şekil 5.44 Set noktasına 2 g/L’den 20 g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde. ..............
sistemin PID kontrolu. ...................................................................................... 91
Şekil 5.45 0 g/L’den 0.07g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde sistemin . ...................
PID kontrolu. ..................................................................................................... 91
Şekil 5.46 0 g/L’den 0.5g/L’ye pozitif basamak etki verildiğinde sistemin. ......................
PID kontrolu. ..................................................................................................... 92
Şekil 5.47 Sabit set noktalı gürültüsü e=0.005 olan Teorik PID Kontrol sonuçları. .......... 93
Şekil 5.48 Sabit set noktalı gürültüsü e=0.005 olan Teorik PID Kontrol sonuçları. .......... 94
Şekil 5.49 Set noktası değişimi olarak kare dalganın kullanıldığı Teorik PID. ..................
Kontrol sonuçları. .............................................................................................. 95
Şekil 5.50 Set noktası değişimi olarak sabit genlikli rastgele etkinin kullanıldığı. ............
Teorik PID Kontrol sonuçları. ........................................................................... 96
Şekil 5.51 Set noktası değişimi olarak değişken genlikli rastgele etkinin. .........................
kullanıldığı Teorik PID Kontrol sonuçları. ....................................................... 97
Şekil 5.52 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit set noktasında Teorik. ....................................
GMV kontrol (e=0.005). .................................................................................. 99
Şekil 5.53 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit set noktasında Teorik. ....................................
GMV kontrol sonuçları (e=0.015). ................................................................... 100
Şekil 5.54 Yarı-kesikli biyoreaktörün set noktası değişimi olarak kare. ............................
dalganın kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 102
Şekil 5.55 Yarı-kesikli biyoreaktörün sabit periyotta rastgele set noktası. .........................
değişimi kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 103
Şekil 5.56 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası. ..................
değişimi kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 104
Şekil 5.57 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası. ..................
-
xiv
değişimi kullanıldığı Deneysel GMV kontrol sonuçları. .................................. 106
Şekil 5.58 Yarı-kesikli biyoreaktörün değişken periyotta rastgele set noktası
değişimi kullanıldığı Teorik GMV kontrol sonuçları. ...................................... 107
-
xv
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Proseslerin kontrolü ......................................................................................... 42
Çizelge 4.1 Katı besi ortamı bileşimi. ................................................................................. 51
Çizelge 4.2 Sıvı besi ortamı bileşimi. ................................................................................. 52
Çizelge 5.1 Sistem giriş değişkenine verilen etkiler deneyi için biyoreaktörün. ................
işletim koşulları ............................................................................................... 76
Çizelge 5.2 Kovaryans matrisin unutma çarpanı ve mertebe ile değişimi. ......................... 84
Çizelge 5.3 Unutma çarpanının mertebe ile değişimi. ........................................................ 87
Çizelge 5.4 Proses reaksiyon eğrisi için doğrusal regresyonla hesaplanan. ......................
parametre değerleri. ......................................................................................... 90
Çizelge 5.5 Farklı yöntemlerle hesaplanan PID parametreleri. .......................................... 90
Çizelge 5.6 Verilen etkilere göre Teorik PID ve Teorik GMV Kontrolun. ........................
karşılaştırılması. .............................................................................................. 105
Çizelge 5.7 Verilen etkilere göre Teorik PID ve GMV Kontrolun karşılaştırılması. ......... 107
-
1
1. GİRİŞ Endüstride “ekmek mayası” olarak bilinen ve etanol, gliserol, ekmek mayası, β -
glukan ve invertaz enzimi üretiminde kullanılan S.cerevisiae ile, havalı koşullarda
çoğaltıldığında maya, havasız koşullarda çoğaltıldığında ise etanol üretilir. Prosesin
ekonomisi açısından mikroorganizma çoğaltma basamağında yüksek hacimsel hücre
verimliliği elde etmek gerekir. Biyokatalizör olarak kullanılan mikroorganizmaların en
yüksek derişimde üretildiği ve içerdiği enzimlerin aktivitelerinin en fazla olduğu pH,
sıcaklık, çözünmüş oksijen derişimi, hava akış hızı, karıştırma hızı, substrat derişimi vb.
işletim parametreleri vardır. Bu biyoreaktör işletim parametreleri dikkatli seçilmeli ve
optimum değerlerinde kontrol edilmelidir.
Substrat derişimi bu parametrelerin en önemlilerinden biridir. Besi ortamının
bileşiminin ve derişiminin mikroorganizma çoğalması üzerinde etkisi oldukça fazladır.
Substrat derişiminin fazla olması, mikroorganizma çoğalmasının inhibe olmasına neden
olabilmektedir. Aynı koşul, havasız koşullarda çoğalma oluyormuşçasına etanol
üretimine yol açar. Bu durum “Crabtree Etkisi” olarak bilinmektedir. Amaç
mikroorganizma üretmek olduğundan bu durum istenmez. Substratların çoğalmayı
engelleyici seviyeleri hücrelerin ve substratın tipine çok bağlıdır. Maya üretiminde
glikozun 200 g/L üzerindeki derişimi, inhibe edicidir. Bu belirtilen nedenlerle glikoz
kontrolünün önemli olduğu görülmektedir.
Yapılan çalışmada literatürde optimum glikoz derişimi için verilen değerlerin geçerliliği
test edilmiştir. Kontrol çalışmalarına başlamadan önce ayarlanabilen giriş değişkeni ile
kontrollü değişken arasındaki ilişkinin belirlenmesinin hedeflendiği dinamik
incelemeler gerçekleştirilmiştir.
Tez kapsamında biyoreaktör işletim parametrelerinin önemi ve biyoreaktörlerin
kontrolu ile ilgili genel bilgiler verilmiştir. Biyoreaktörlerde kullanılan ticari kontrol
ediciler ve ölçüm elemanları tanıtılmıştır. Proseste ayarlanabilen ve kontrol edilen
değişkenler arasındaki ilişki sistem tanımlama ile belirlenmiştir. Ürün verimliliğini
-
2
arttırmak üzere havalı ortamda yarı kesikli işletilen biyoreaktörde besi ortamındaki
glikoz derişiminin Genelleştirilmiş Minimum Varyans (GMV) ve PID algoritmaları ile
kontrolu üzerine yapılan çalışmalar sunulmuştur.
Yapılan çalışmada, yarı-kesikli olarak işletilen, 5L hacminde, laboratuvar ölçekli, ısıtma
ceketli bir biyoreaktör kullanılarak ekmek mayası üretimi boyunca glikoz derişiminin
kontrolu, kendinden ayarlamalı kontrol yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Girdi-
çıktı değişkeni verileri yardımıyla biyorektör parametrik modellerle tanımlanmış ve
farklı parametre hesaplama yöntemleriyle parametreler belirlenmiştir. Deneylerde,
biyotepkime ortamının glikoz derişimi glikoz ölçer cihazı ile ölçülerek, sisteme on-line
bağlı bilgisayara gönderilmiştir. Bilgisayardaki kendinden ayarlamalı kontrol
algoritması, glikoz derişimini istenen değerde tutmak üzere sisteme gönderilmesi
gereken besleme akış hızını hesaplamış ve gerekli sinyali pompaya göndermiştir.
Mikroorganizma çoğalmasına etki eden ve bu tez kapsamında kontrol edilen parametre
olan glikoz derişiminin en uygun değerinin bulunarak biyoreaktörün bu derişimde
işletilmesi ve kontrol edilmesi ürün verimi açısından oldukça önemlidir. Bu nedenle
glikoz derişiminin kontrolüne yönelik çalışmalara ilk olarak kesikli biyoreaktörde
optimum biyoreaktör işletim parametrelerinin bulunması ile başlanmıştır. Kesikli
işletilen biyorektörlerde farklı başlangıç substrat derişimlerinde mikroorganizma
çoğaltılarak elde edilen mikroorganizma derişim profillerinden en yüksek
mikroorganizma derişiminin en kısa zamanda elde edildiği glikoz derişimi olan 20 g/L
değeri optimum glikoz derişimi olarak belirlenmiştir. Bu sonuca hem mikroorganizma
çoğalması boyunca UV spektrofotometre yardımıyla belirlenen mikroorganizma
derişimlerinin hem de mikroskop ve Thoma lamı kullanılarak belirlenen canlı
mikroorganizma sayılarının zamanla değişimi incelenerek ulaşılmıştır. Gerçekleştirilen
deneyler sonucunda çoğalmanın Monod kinetiğine uygun olarak gerçekleştiği
belirlenmiştir.
Optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra sistemin dinamik davranışını incelemek
amacıyla sistem tanımlama çalışmalarına geçilmiştir. Bu amaçla açık hat biyoreaktör
-
3
işletimi ile kontrol edilmesi gerektiği sonucuna ulaşılan glikoz derişiminin, çoğalma
boyunca sabit tutulmasının mikroorganizma derişiminde, etanol derişiminde ve CO2(g)
oluşumunda nasıl bir değişime yol açtığı incelenmiştir. Biyoreaktörden belirli zaman
aralıklarında alınan örnekler mikroorganizma derişiminin belirlenmesi için
spektroskopik yöntemle analizlenmiştir. Çoğalma boyunca DO probu ile çözünmüş
oksijen derişimi (DO), etanol probu ile etanol derişimi ve multisensör ölçüm cihazıyla
üretilen gaz faz CO2 ve gaz faz O2 derişimlerinin de zamanla değişimi gözlenmiştir.
Böylece gerçekleştirilen dinamik deneyler ile mikroorganizmanın çoğalması boyunca
biyoreaktörde zamanla mikroorganizma derişimi, glikoz derişimi, etanol derişimi, gaz
faz CO2 derişimi ve çözünmüş oksijen derişiminin (DO) değişimi incelenmiştir.
Biyoreaktöre steril koşullarda besi ortamı beslenerek mikroorganizmanın optimum
çoğalma koşulları sağlanmıştır. Bu amaçla pH=5 değerinde tutulup, 2 L/dk akış hızında
hava beslenerek, ceketten ısıtma suyu uygun sıcaklık ve akış hızında geçirilerek besi
ortamının 32 0C’de yatışkın hale gelmesi sağlanmıştır. Steril koşullarda
mikroorganizma aktarımından sonra çoğalma boyunca pH, sıcaklık, glikoz derişimi,
DO, etanol derişimi Visidaq paket programında yazılan programla on-line olarak
kaydedilmiş ve gözlenmiştir.
S. cerevisiae mikroorganizmasının havalı koşullarda kesikli ve yarı kesikli bir
biyoreaktörde glikozun karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı kültür ortamındaki
dinamiğini ifade etmek için kütle korunum denklemleri oluşturulmuştur. Bu denklem
sistemleri MATLAB programlama dilinde kodlanarak mikroorganizma çoğalması
boyunca teorik olarak mikroorganizma, glikoz ve çözünmüş oksijen derişimleri ile
reaktör sıcaklığının zamanla değişimleri elde edilmiştir. Elde edilen sonuçlar deneysel
çalışmalardan elde edilenlerle karşılaştırılmıştır. Yarı kesikli işletimde kesikli işletime
göre mikroorganizma derişiminin %10 arttığı belirlenmiştir.
Biyoreaktörde gerçekleştirilen dinamik çalışmalar kapsamında ayarlanabilen giriş
değikeni olan glikoz akış hızına verilen pozitif basamak etkiye prosesin cevabı ve
kontrollu değişken olan glikoz derişiminin zamanla değişimi verileri elde edilmiştir. Bu
çalışmalar mikroorganizmalı ortamda gerçekleştirilmiştir. Bu incelemelerde glikoz
derişiminin çoğalmayı inhibe edici olduğu derişim değerlerinin üzerine çıkılmamasına
-
4
dikkat edilerek, istenilen işletim şartlarında en uygun glikoz akış hızının belirlenmesine
çalışılmıştır. PID kontrol parametrelerinin belirlenmesi amacıyla prosesin birinci
mertebeden ölü zamanlı modeli de “Doğrusal Regresyon” yöntemi ile belirlenmiştir.
Prosesin girdi-çıktı verileri yardımıyla sistemi tanımlayan doğrusal ARMAX tipi bir
girdi-çıktı modeli elde edilmiştir. Model parametrelerinin hesaplanmasında YEKK
Yöntemi kullanılmıştır. Sistemi ifade eden en uygun parametrik modelin bulunması
amacıyla farklı kovaryans matrisin başlangıç değeri, unutma çarpanı değeri ve
mertebeler için çalışmalar yapılmıştır.
S. cerevisiae mikroorganizmasının çoğaltıldığı kesikli ve yarı kesikli işletilen
biyoreaktörde glikoz derişiminin kontrolüne yönelik olarak “teorik” ve “deneysel”
kontrol çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Teorik kontrol çalışmaları MATLAB
programlama dilinde hazırlanan GMV ve PID kontrol yöntemlerinin başarısı farklı
glikoz derişimi set değerleri için ISE değerlerine göre karşılaştırılmıştır. Sisteme on-line
bağlı bilgisayardaki Visidaq paket programında Visual Basic dilinde kodlanan GMV
kontrol algoritması ile glikoz derişiminin deneysel kontrolu da gerçekleştirilmiştir.
PID kontrol parametreleri Cohen-Coon parametre hesaplama yöntemi ile
hesaplanmıştır. Ancak MATLAB paket programında yazılan YEKK algoritması
kullanan PID kontrol algoritması Cohen-Coon parametre hesaplama yöntemi ile
bulunan parametreler ile sistemin kontrolunu sağlayamamıştır. Bu nedenle PID
parametrelerinin sisteme en uygun değerleri deneme-yanılma yöntemiyle bulunmuştur.
PID kontrol parametreleri ile S. cerevisiae mikroorganizması çoğaltılan yarı kesikli
işletilen biyorektörde glikoz derişiminin teorik PID kontrolu gerçekleştirilmiştir.
-
5
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI Suzuki et al. (1986), uçucu karbon kaynağı olan etanol beslemesi ve çözünmüş oksijen
(DO) seviyesinin kontrolu için bir geri beslemeli kontrol sistemini ve otomatik kontrol
stratejilerini geliştirmişlerdir. Mikrobiyal çoğalma için optimum etanol derişimini
korumak üzere çıkış gazındaki karbondioksit derişimi, etanol beslemesinin basamak
tarzında kontrolu için kullanılmıştır. Ayrıca hataları düzeltmek üzere oransal-türevsel
(PD) kontrol programı kullanılmıştır. Basamak tarzında kontrolun katsayıları
stokiyometrik olarak hesaplanmıştır ve PD parametreleri deneysel olarak önceden set
edilerek çoğalma boyunca değiştirilmemiştir. DO ve giriş gazındaki oksijen kısmi
basıncı sırasıyla çıkış gazındaki karbondioksit derişimine dayalı ve oksijen tüketim
hızına bağlı olarak hazırlanmış basamak tarzında bir program ile değiştirilmiştir.
Basamak tarzında kontrolun katsayıları stokiyometri ve moleküler oksijen için madde
denkliğinden tahmin edilmiştir. PD kontrol programı DO seviyesindeki değişimleri
düzeltmek üzere karıştırma hızını ayarlamak üzere kullanılmıştır. Çoğalma boyunca
parametrelerin değiştirilmesine gerek olmamıştır. Bu ileri kontrol programları
kullanılarak Candida Brassica’nın yarı-kesikli çoğalması boyunca etanol derişimi ve
DO seviyesi sırasıyla 3.4-3.7 g/L ve 2.2-2.8 ppm’de kontrol edilmiştir. Elle işletime
gerek duyulmayan bu çoğalmada mikroorganizma derişimi 80 g/L’ye ulaşmıştır.
Williams et al. (1986), adaptif kontrol tekniğinin bir fermentasyon prosesine
uygulanmasının uygunluğunu incelemişlerdir. Bir fermentasyon prosesinin doğrusal
olmayan zamanla değişen parametreleri, doğrusallaştırılmış matrisler olarak on-line
olarak tahmin edilmiştir. Denemeler on-line, gerçek zaman adaptif kontrol paketi ile
küçük ölçekli bir fermentörde gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar hem tek hem de çok
değişkenli kontrol için sunulmuş ve maya hücre çoğalmasının kontrolunun başarılı
olduğunu göstermiştir.
Ringbom et al. (1996), biyoproseslerde anahtar hal değişkenlerini kestiren bir dinamik
model, yarı-kesikli ekmek mayası üretiminin kontrolu çin kullanılmıştır. Hal
kestirimleri on-line ölçümler ile kütle denklikleri birleştirilerek yapılmıştır. Kontrol
stratejisinin amacı, etanol ve asetik asit gibi metabolik ürünler oluşmaksızın, mümkün
-
6
olan en yüksek hücre çoğalmasnı sğlayacak ve tümüyle hücrelerin solunumla
tüketebilecekleri mümkün olan en yüksek glikoz akışını sağlayacak ve tümüyle
hücrelerin solunumla tüketebilecekleri mümkün olan bu yüksek glikoz akışını
sağlamaktır. Kontrol algoritmasının basamak tarzında ilerleyişi istenmeyen tersinmez
metabolik yol izlerinden kaçınmak üzere bir strateji bulmak amacıyla geliştirilmiştir.
Son algoritmada, metabolizmadaki böyle istenmeyen değişimler, hücre içi
karbonhidratların birikiminin kestiriminden tahmin edilmiştir. Genelleştirilen kontrol
stratejisi ile laboratuar ölçekli S. cerevisiae çoğalmasında maksimum verimde, mümkün
olan en yüksek çoğalma hızına yakın bir değer elde edilmiştir.
Zigova (2000), S. cerevisiae BT150 ile çözünebilen insan N-deglyglycosylated
rekombinant β-1,4 galaktosiltransferaz (NdrGal-T) nin rekombinant üretimi için geri
beslemeli RQ kontrolu yarı-kesikli proses için incelemişlerdir. Optimum NdrGal-T
üretmi için birçok ‘solunum oranı, RQ’ değerini denemişlerdir. Hem biyokütle hem de
enzim üretimi için en iyi RQ değeri 1.0 olarak belirlenmiştir. RQ’nun 1.0 değerinde
elde edilen hacimsel aktivitesi diğer tüm RQ değerlerinde elde edilenden (8 µL-1) dört
kat daha fazladır (32 µL-1). Ön kültürdeki optimum glikoz derişimi 25 g/L’dir. Ön
kültürdeki yüksek glikoz derişimlerinde düşük glikoz derişimlerine göre etanol üretimi
artmakta ancak bu durumun biyokütle ve enzim üretimi üzerine pozitif bir katkısı
olmadığı bulunmuştur. Düşük glikoz derişimleri sadece etanolü azaltmamakta aynı
zamnada biyokütle oluşum (1.69 g/h’den 0.81 g/h’e ve enzim toplam verimliliği de
(2.24 µh-1’den 0.81 µh-1’e ) azalmaktadır.
Serio et al. (2001), bu çalışmada bütün reaktör çeşitlerinde (kesikli,yarı-kesikli,sürekli)
ekmek mayası çoğalmasını tanımlamak için genel sibernetik model geliştirilmiştir.
Kütle aktarımı oksijen limitini de dikkate alan model, literatürdeki sürekli işletimli
farklı havalandırma gaz bileşimleriyle test edilmiştir. Ulaşılan sonuçlar, modelin
yetersiz havalandırma koşullarında bile S.cerevisiae çoğalmasını tanımladığını
göstermiştir. Böylece bu çalışma endüstriyel biyoreaktörlerin optimizasyonu ve
modellemsi için yararlı olmuştur.
-
7
Akesson et al. (2001), günümüzde çeşitli proteinlerin üretiminde genetiği oynanmış
Escherichia coli bakterisi kullanılmaktadır. E. coli kültürlemesinde yan ürün asetatın
birikiminden kaçınılmalıdır. Asetat oluşumu, özgül glikoz tüketimi kritik değeri
geçtiğinde ortaya çıkmaktadır ve uygun besleme stratejisi ile bu durumdan kaçınılabilir.
Bu durumdaki zorluk kritik glikoz tüketiminin iyi bilinmemesinden kaynaklanmaktadır.
Bu çalışmada glikoz beslemesinin kontrolu için eski verilere ihtiyaç duymaksızın
beslemeyi kritik glikoz tüketiminde sağlayacak bir yaklaşım analiz edilmiştir.
Valentinotti et al. (2003), S. cereivisiae’nin yarı-kesikli fermantasyonda maksimum
biyokütle üretimi analizlenmiştir. Sıklıkla sınırlı oksijen kapasitesine dayandırılan
metabolik darboğaz yüzünden, biyokütle verimliliğini düşüren substrat derişiminin
kritik değerinin üzerinde olması ile etanol oluşmaktadır. Böylece biyokütle üretimini
maksimize edebilmek için substrat derişimi kritik değerde tutmalıdır. Ancak, bu değer
bilinmemekte ve deneyden deneye de değişebilmektedir. Bu zorluğun üstesinden
gelebilmek için hücrelerin çok az miktarda etanol üretimine izin verilmektedir. Bu
yolla, maksimum biyokütle üretim problemi, etanol derişiminin ayarlanmasına dönüşür.
Adaptif kontrol yöntemi etanolu istenen set noktasında tutabilmek için kullanılmıştır.
Sadece tek bir parametrenin on-line olarak tahmini gereklidir.
Miskiewicz et al. (2005), yarı-kesikli ekmek mayası prosesinin optimizasyonunda
biyokütle verimini maksimize etmek için gereken besleme profilinin, bu prosesin
optimizasyonunda özgül çoğalma hızını maksimize etmek için kullanılan besleme
profilinden farklı olduğu görülmüştür. Her iki profil de F(t)=a/(1+b.exp(-c.t)) şeklinde
bir fonksiyon ile tanımlanabilir. Burada F8t), t anında biyoreaktöre giren glikoz
beslemesini, ve a,b ve c eşitliğin sabitlerini göstermektedir. Optimizasyon amacına göre
parametreler farklı değerler almaktadır. Aynı zamanda biyokütle veriminin maksimize
edilmesi ve özgül çoğalma hızının maksimize edilmesi şeklindeki iki amacın birbiriyle
çeliştiği gösterilmiştir.
-
8
Arndt et al. (2005), hücre dışı fitaz üreten Escherichia coli rekombinanının
kesikli/yarı-kesikli kültürlemede besleme fazı için kontrol edici geliştirilmiştir. Kalman
filtresi tarafından kestirilen proses değişkenlerine dayalı fitaz üretimini maksimize
etmek ve asetat üretimini minimize etmek amacıyla ileribeslemeli ve geri beslemeli
kontrol edici uygulanmıştır. Kalman filtresi glikoz ölçümlerinin gürültüsünü düşürmek
ve ileri besleme kontrol edicisinin yardımını hesaplamada kullanılan biyokütle
derişiminin, substrat (glikoz) derişiminin, maksimum özgül çoğalma hızının ve de
reaksiyon hacminin kestirimi için kullanılmıştır. PI kontrol edici glikoz derişimini
istenen set noktası olan 0.2 gL-1 e ayarlayabilmek için uygulanmıştır. Ortam içine fitaz
salgısı asetat üretiminin azaldığı düşük glikoz derişimlerinde artmaktadır. Kontrol edici
tarafından kullanılan tek ölçülen değişken olan glikoz derişimi akış injeksiyon analizi
(FIA) kullanılarak belirlenmiştir. Kontrol edicinin işlemi ayrıca onun E. coli
kültürlemesindeki uygulaması verilmiştir. Standat sapması 0.0666 gL-1 olan averaj on-
line ölçülen glikoz derişimi 0.208 gL-1 ‘dir. Kültürleme boyunca ölçüm sisteminde hata
meydana gelmiştir. Bu hata ile kontrol edici sisteminin yanıtımı ayrıtıda tartışılmıştır.
Oksijen ölçümüne dayalı kontrol edici karşılaştırılmıştır. Fitazın verimi verilen
sistemele aynıdır.
Wang et al. (2007), etanol derişimi ve solunum oranındaki değişime (RQ) bağlı olarak,
yüksek hücre yoğunluğuna sahip S. cerevisiae çoğalması ile glutathion (GSH) üretimi
için glikoz besleme hızının kontrolu çalışılmıştır. GSH verimi ve kuru kütle ağırlığı 52
saat çoğalmadan sonra sırasıyla, 1620 mg/L ve 140 mg/L’ye ulaşmıştır. Buna ek olarak,
“precursor “aminoasitlerin tek seferlik eklenmesinin optimizasyonu ile 38 saat
çoğaltmadan sonra GSH verimi 2020 mg/L’ye ulaşmıştır. GSH’ın verim ve verimliliği
sırasıyla %25 ve %70 artmıştır. Ayrıca, çoğalma süresi 38 saate düşmüştür ve
“precursor” aminoasit eklenmemiş sonuçlarla da karşılaştırılmıştır.
-
9
Velut et al. (2007), bu makale biyoreaktörlerin maksimum oksijen transfer kapasitesine
yakın işletimi için yarı kesikli fermentasyon tekniğini sunar. Metod, kesikli “probing”
besleme stratejisinin ve sıcaklık kontrollu yarı kesikli tekniğin avantajlarını
kapsamaktadır. Reaktör maksimum oksijen transfer kapasitesine ulaştığında sıcaklık,
oksijen ihtiyacını azaltmak için düşürülmektedir. Çözünmüş oksijen derişiminin iyi
kontrolünü sağlamak için “mid-ranging” kontrol edici, karıştırma hızı ve sıcaklığı
ayarlamak üzere kullanılmaktadır. Besleme stratejisi analizlenmiş ve hem deney hem de
benzetimlerle açıklanmıştır.
Kasperski et al. (2008), bu çalışmada amaç, çözünmüş oksijen derişimindeki salınımsal
değişikliklere göre parçalı olarak beslemenin yapıldığı ekmek mayası üretiminde,
besleme giriş hızını optimize etmektir. Optimizasyon kriteri biyokütütle verimi ve özgül
çoğalma hıznın eş anlı maksimize edilmesidir. Böyle bir kriterin maksimize edilmesi
besi ortamındaki glikoz derişiminin kritik glikoz seviyesinden yüksek olmasını
gerektirir. Ayrıca parçalı olarak beslemenin büyüklüğü de solunum oranının set değeri
tarafından kısıtlanmaktadır. Optimizasyon prosesinde solunum oranınının set değeri ve
parçalı olarak beslemenin hacmindeki dinamik değişimlerin önemli iki faktör olduğu
bulunmuştur. Solunum oranının set değeri olan 1.1’in altında olduğundaki parçalı
beslemeler ve bu beslemenin +-%10 aralığındaki değişimleri optimum olarak
değerlendirilmiştir. Parçalı besleme büyüklüğünün +_%10 ve solunum oranı set
değerinin 1.1 değerinde ulaşılan biyokütle verimi 0.55 gg-1 ve özgül çoğalma hızı
0.14 h-1’tir. Başalngıç biyokütle derişimi de besin girişinin optimizasyonunda büyük bir
öneme sahiptir. Başlangıç biyokütle derişimindeki artış havalı fermantasyonu teşvik
ederek biyokütle verimi ve özgül çoğalma hızında azalmaya sebep olur
Klockow et al. (2008), Saccharomyces cerevisiae’nın yarı kesikli çoğaltılması için
modele dayalı substrat kontrol sistemi sunulmuştur. Amaç proses boyunca substrat olan
glikoz derişiminin sabit set noktasında tutulabilmesidir. Hücreler glikoz derişimine göre
metabolizmalarını “saf oksidatif”ten “oksidatif-reductive”’e doğru değiştirebildiğinden
set noktaları 0.07 gL-1 ve 0.5 gL-1 seçilmiştir. On-line ölçüm sistemindeki gürültü ve en
az 6 dk olan ölü zaman nedeniyle çoğalma boyunca glikoz derişiminin doğru kontrolu
-
10
için problem teşkil etmektedir. Bu etkileri ortadan kaldırmak için basit FIA sistemine
dayalı glikoz ölçümleri, genişletilmiş Kalman filtresi kullanılarak kontrol sistemi
tamamlanmıştır. Kalman filtresi prosesin dinamiği ile tam anlamıyla baş
edebilmektedir. Glikoz ölçümüne dayalı olarak her üç dakikada bir biyokütle ve glikoz
derişimini hatta çoğalma hızı faktörü ve besi ortamı hacmini kestirmiştir. Glikoz
derişimini istenen set değerlerinde tutabilmek için proses değişkenlerinin kestirilen
değerlerinin kullanıldığı bir ileri beslemeli kontrol edici, PI kontrol edici ile
tamamlanmıştır. Kontrol boyunca set noktaları olan 0.07 ve 0.5 gL-1 için ölçümlerin
standart sapmaları sırasıyla 0.002 gL-1 ve 0.022 gL-1.
-
11
3. KURAMSAL TEMELLER
3.1 Mikroorganizmaların Sınıflandırılması
Mikroorganizmalar Şekil 3.1’den görülebileceği gibi iki ana grupta incelenmektedir.
Bunlar; prokaryotlar ve ökaryotlardır. Her iki grubunda alt grupları bulunmaktadır.
Prokaryotlar; bakteriler ve mavi-yeşil algler olmak üzere iki ana alt grupta, ökaryotlar
ise; mantarlar, algler ve protozoa olmak üzere üç alt grupta incelenmektedir.
Şekil 3.1 Mikroorganizmaların sınıflandırılması (Pekin 1979)
3.2 Mayanın Tarihçesi Biyoteknolojinin gelişimi tarihsel olarak dört evrede incelenmektedir (Keuler 1993).
Birinci evre olarak eski çağlarda yapılan fermantasyon uygulamaları kabul
edilmektedir. İlk biyoteknolojik prosesler, alkol fermantasyonları (şarap,bira) ve süt
ürünlerinin fermantasyonudur. Sümerlerin alkol fermantasyonunu bildikleri, yapılan
tarihsel kazılardan bilinmektedir. Daha sonra Mısırlılar ekmek üretiminde mayayı
kullanmışlardır.
-
12
İkinci evre mikrobiyolojinin gelişmesi ile başlamıştır. 1867’de Lois Pasteur’ün
fermantasyonlardan mayanın sorumlu olduğunu gösteren kitabı basılmıştır. Robert
Koch ve Emil Christian Hansen’in ilk endüstriyel biyoteknolojik çalışmayı yapmıştır.
Üçüncü evre fermantasyon teknolojisinde gerçekleştirilen ilerlemeleri içerir. Bu evre
1940’larda penisilin üretimi ve büyük fermantörlerin geliştirilmesi ile başlar. Daha
sonra sürekli fermantasyon, immobilize enzim ve hücre proseslerinin geliştirilmesi ile
devam eder.
Dördüncü evre rekombinant DNA teknolojisi olarak adlandırılır. Bu teknoloji ile maya
hücresinin iç yapısında saklı olan biyolojik bilgiler ve organizmanın genetik
özelliklerinin değiştirilmesine çalışılmaktadır. Aynı dönemde bilgisayar teknolojisinin
biyoteknolojide yoğun olarak kullanılmasına başlanmıştır.
3.3 Maya Hücresi
Maya hücresi kompleks bir mikroorganizmadır. Bakterilere göre hacimleri daha
büyüktür. Mayanın çoğalması uç verme veya hücre bölünmesi şeklinde geçekleşir
(Bailey and Ollis 1986). Çok gelişmiş bir organizma olan maya hücresinin hücre duvarı,
hücre ağırlığının %25 ini oluşturur ve mayayı dış etkenlerden korumakla birlikte pek
çok enzime de sahiptir. Hücre çekirdeği, DNA’ları içerir. Hücre içinde fazla miktarda
mitokondri bulunur ve bunlar hücre içinde enerji sağlanmasında kullanılır. Hücre içi
diğer metabolik olaylar sitoplazmada gerçekleşir. Depo parçacıklarında ise glikoz ve
yağlar stoklanmaktadır.
Maya hücresi glikoliz ve etanol oluşumu olmak üzere iki önemli metabolik faaliyet
gerçekleştirir. Biyokütle oluşumunu sağlamak üzere gerçekleşen reaksiyonlarda eberji
gerekir. Bu enerji ortamda bulunan bazı maddelerin indirgenmesi ile sağlanır. Maya
hücresi tarafından hem karbon hem de enerji kaynağı olarak kullanılan şeker, enerji
-
13
üretiminde ve hücre içi yapıtaşlarının oluşumunda görev alır. Şekerin parçalanması ile
hücreyi oluşturan yağlar, polisakkaritler ve proteinler oluşur.
İçerisinde şekerin sukroz olarak bulunduğu melas, endüstriyel ekmek mayası üretiminde
şeker kaynağı olarak kullanılır. Melas içerisindeki sukroz, hücre içinde fruktoz ve
glikoza dönüşür. Daha sonra glikozun oksijenle yakılmasıyla piruvat elde edilir. Oluşan
piruvat, hücrenin oksijen kapasitesine ve ortamdaki oksijen miktarına bağlı olarak
alkole veya oksijeni kullanarak enerji ve biyokütleye dönüşür.
3.4 Ekmek Mayası
Mikroorganizma olarak adlandırılan ve çoğunlukla tek hücreli olan küçük canlılar insan
yaşamını pek çok şekilde etkiler. Bu küçük canlılar insan, hayvan, bitki hastalıklarına
ve besin maddelerinin bozulmalarına neden oldukları için zararlı görünmelerine karşın
besin, ilaç ve kimya sanayinde birçok maddenin üretilmesinde ve yeryüzündeki canlı
hayatının devamını etkileyen kritik faaliyetlerin yerine getirilmesinde insanlık yararına
önemli rol oynarlar. Maya, hiç şüphesiz insanlık tarihi boyunca güvenle tüketilen en
önemli mikroorganizmalardan biridir.
Çok sayıda maya çeşidi bulunmaktadır. Bu çalışmada Sacchoromyces cerevisiae mayası
esas alınmıştır. Sacchoromyces cerevisiae, endüstride ticari anlamda; ekmek mayası
alkollü içecekler ve son yıllarda benzine karıştırılarak motorlu taşıtlarda kullanılan
teknik alkol üretiminde kullanılmaktadır (Beşli et al. 1995).
Sacchoromyces cerevisiae mayası ökaryotik mikroorganizmadır. Besin kaynağı olarak
glikoz, fruktoz, sukroz ve maltoz gibi şekerlerin yanında laktik, tartarik, suksinik, asetik
asitleri ve etanolü kullanır. Bundan dolayı heterotrof mikroorganizmadır. Havalı ve
havasız ortamda üreyebilir. Gelişmesi için en uygun sıcaklık aralığı 27-30 οC ve, en
düşük ve en yüksek sıcaklıklar ise sırasıyla 1-3 οC ve 40 οC dir. pH değeri ise 4-5
aralığında maksimum çoğalma sağlar.
-
14
Başlangıçta çok düşük verimliliği ile alkol fermantasyonunun bir kopyası olan ekmek
mayası prosesinde 19.yy’ın ikinci yarısında, mikrobiyolojinin gelişmesi ile birlikte
büyük ilerlemeler olmuştur. Daha sonra 1886 yıllarında İngiltere’de sürekli
havalandırma yöntemi uygulanmıştır. En fazla ilerleme 1920’lerde saf kültürlerin
kullanılması ve ucuz şekerli çözelti eldesi için hububat değişiminin yapılması ile
sağlanmıştır. Bu tarihten sonra maya üretim prosesi daha ayrıntılı bir şekilde ele
alınmıştır.
Son zamanlarda prosesin otomatik kontrolü üzerinde durulmaktadır. Bu konudaki
sorunlardan birisi prosesi yüksek verimlilikte tutacak şekilde substrat beslemesini
kontrol etmektir.
Maya hücresinin gelişebilmesi için besine ve enerjiye ihtiyacı vardır. Maya hücresi
gerekli besini ve enerjiyi sağlayabilmek amacıyla şeker (glikoz veya maltoz) kullanılır.
Bunun yanı sıra kullandığı diğer maddeler vitaminler ve minerallerdir. Temel
gereksinimlerinden bir diğeri ise oksijendir. Maya hücresi etanol üretimi olmaksızın
büyümek için şeker ile birlikte oksijeni kullanır. Bira ve şarap üretiminde olduğu gibi,
eğer ortamda yeterli oksijen yoksa maya etanol üreterek çoğalmaya devam eder.
Mayanın istenilen şekilde üretilebilmesi için ortamdaki oksijen ve şeker aktarımının iyi,
etanol oluşumunun az olması gerekmektedir. Bunlardan da anlaşılacağı gibi yüksek
etanol derişimi maya hücreleri için toksik etkiye sahiptir. Etanolün kendisi de bir
karbon kaynağı olduğundan maya hücresi büyümek için etanolü de kullanabilir. Etanol
toksik olduğundan maya gelişebilmek için şekeri etanole tercih eder. Büyüme sırasında
maya hücresi karbondioksit üretir. Maya hücresi etanol üretirken oksijen
kullanmadığından mayanın durumunu tanımlayabilecek bir başka güvenilir değişken
karbondioksit üretim hızının (CPR), oksijen tüketim hızına (OUR) oranıdır. Bu oran
solunum katsayısı, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’, RQ) olarak
adlandırılmaktadır.
Sacchoromyces cerevisiae mayasının üretiminde, besi ortamındaki mayanın gelişerek
üreyebilmesi, maya için gerekli besi maddelerini ve enerji kaynağını içeren besi
-
15
ortamının oluşturulması, gelişmeyi engelleyici maddelerin ortamda bulunmaması ve
pH, sıcaklık gibi işletim koşullarının maya için uygun olması gerekmektedir.
3.4.1 Maya gelişimini düzenleyici etkiler
Maya üremesi sırasında söz konusu olabilecek önemli etkiler aşağıda açıklanmıştır.
Pasteur etkisi: Solunum ile fermantatif aktivitenin bastırılması mayada keşfedilen ilk
düzenleyici etkidir. Enerji metabolizması ile bağlantısı çok iyi belirlenmiştir ancak
biyolojik ayrıntılar ile bunların gözlenen gelişme kinetiği ve diğer düzenleyici
sistemlerle olan ilişkisi halen tartışma düzeyindedir (Bellgardt and Yuan 1991).
Crabtree etkisi: oksijen ve şeker fazlalığı altında solunumlu- fermantatif metabolizma
olarak tanımlanır. ‘Crabtree’ etkisi, orijinal olarak solunum enzimlerinin ‘Pasteur’
etkisinin tersi gibidir. Her ikisi de ekmek mayası üretiminin kontrolü için önemlidir,
çünkü oksidatif metabolizmanın sınırlı kapasitesine göre fazla miktarda şekerin
sağlanması (ya doygunluk, ‘Crabtree’ etkisi; yada dış oksijen temini ‘Pasteur’ etkisi ile)
hücre kütlesinin düşük verimde fermantatif gelişmesine sebep olur.
Glikoz Etkisi: Tüketim sistemlerinin tutuklanması veya glikozun yüksek derişimlerde
bulunduğu durumlarda diğer substratların kullanılabilmesi için gerekli olan yol izleridir.
Bu tutuklanma sonucunda, ortamda yüksek derişimlerde başka substratlar bulunsa bile
başlangıç katabolizması için tercih edilen substrat glikoz olur. Bu, ortamda oluşan
etanolün neden tercih edilmediğinin de açıklamasıdır.
-
16
3.4.2 Maya aktivitesini etkileyen etkenler
3.4.2.1 Besin maddelerinin etkisi
a) Melas: Şeker kamışı veya pancarı melasları ekmek mayası üretiminin ana
hammaddesi ve ana karbon kaynağıdır. Melas içindeki sakaroz maya hücrelerine
glikoz ve fruktoz olarak taşınır. Melasın bileşimi, şeker rafinasyon teknolojisi ve
tarım-iklim koşullarına göre değişiklik arz eder. Bu değişiklikler ekmek mayası
üretiminde problem teşkil eder.
b) Azot: azot maya hücreleri için önemli bir elementtir. Ortama amanyok, amonyak
tuzları ve üre formunda ilave edilir.
c) Oksijen: Maya üretimi için çok önemli bir başka hammadde oksijendir. Oksijen
kaynağı olarak hava kullanılır. Oksijensiz ortamda maya ürün katsayısı (YX/S) çok
düşük seviyelerde iken, oksijenli ortamda bu katsayı çok daha yüksektir. Üretimde
amaç en yüksek ürün verimliliğini elde etmektir. Bu da reaktördeki şeker seviyesini
çok düşük seviyede tutacak oksijen girdisini sağlayarak temin edilir. Oksijen
‘aerobik’ fermantasyonda temel besindir. Diğer besinlere nazaran da suda
çözünürlüğü çok düşük olması sebebiyle de temini en güç olanıdır.
d) Vitaminler ve iz elementler: Üretimde; canlı hücrenin ırkı, kullanılan melas ve
suyun içeriği bakımından kalitesi olmak üzere üç temel faktöre bağlı olarak ortama,
özel vitamin ve tuz ilave tuzların katılmasına gerek duyulur (Kristiansen 1994).
Büyüme ortamına eklenen birkaç vitamin hücre büyümesine pozitif etkiler. Biotin,
pantothenate ve inositol ekmek mayası için gerekli vitaminlerdendir. İz elementleri
ekleme hakkında bilimsel literatürdeki bilgi belirsizdir. Bunun nicel ve nitel
açıklamaları zordur. Kültür ortamına eklenen Cu, Zn, Fe, Mo ve Mn ürün miktarını
ve fermantasyon başarısını arttırır.
-
17
e) Tuzlar: Azotun yanında, ortama mineral tuzlar olarak fosfor, magnezyum ve
kalsiyum ilave edilir.
f) Köpük önleyici: Reaktör içinde karıştırmanın da etkisiyle oluşabilecek köpürmeyi
önlemek için gerektiğinde ortama katılır.
3.4.2.2 Sıcaklığın etkisi
Mayalar için sıcaklık, diğer organizmalarda olduğu gibi gelişmeyi sınırlandıran bir
etkendir. Mayaların gelişmeleri ve çoğalmaları genellikle 0-45 οC arasında olmaktadır.
En uygun çalışma sıcaklığı ise 20-30 οC arasında değişir. Yüksek sıcaklık zehirli
metabolik atıkların artmasına neden olmaktadır. Ayrıca yüksek sıcaklık mayanın
parçalanma yeteneğini arttırır ve hücre bölünmesinin daha erken olmasını sağlayarak
hücre yapısını geriletir. Yüksek sıcaklık nedeniyle fermantasyon sırasında yüksek
miktarda alkol oluşmaktadır.
3.4.2.3 Oksijen etkisi
Mayalar havalı veya havasız ortamda üreyebilirler. Mayanın uygun besi ortamında
havalı koşullarda üreyebilmesi ile ortamda karbondioksit ve su oluşur. Havasız ortamda
ise etil alkol ve karbondioksit gelişimi olur. Etil alkol fermantasyonunda çeşitli
indirgenme ve yükseltgenme tepkimeleri sonucu glikoz önce pirüvik aside, sonra
asetaldehide ve en son olarak da etil alkole dönüşür.
Havalı ortamda:
KcalOHCOOOHC 688666 2226126 ++→+ (3.1)
Havasız ortamda;
KcalCOOHHCOHC 5662 2526126 ++→ (3.2)
-
18
Havalı ortamda açığa çıkan enerji, havasız ortama kıyasla 12 kat fazladır. Bu tür
fermantasyonlarda reaktöre verilen hava içindeki oksijen, gaz fazından sıvı faza geçerek
ortamda mikroorganizmalar tarafından tüketilir. Amaç maya üretimi yapmak ise havalı,
alkol üretimi yapmak ise havasız ortamda çalışmak gerekmektedir.
3.4.2.4 pH etkisi
Ortam pH’sının mayaların gelişimi üzerine etkisi vardır. Mayalar hafif asidik ortamda
çoğalıp gelişirler. Genel olarak uygun pH, 4-5 arasında değişir.
3.4.2.5 Metabolizma ürünlerinin etkisi
Etil alkol mayalar için en önemli metabolizma ürünü olmakla birlikte mayalar için
inhibe edici bir özellik taşır. %2’lik etil alkol derişimi maya çoğalmasını yavaşlatır, etil
alkol derişimi %10 olduğunda ise durur (Köşker 1980). Sacchoromyces cerevisiae
mayası için ortamdaki etil alkol derişiminin etkisi Wilke (1981) tarafından incelenmiş
ve yaklaşık 93 g/L etil alkol derişiminde maya üreme ve etanol üretim hızının sıfır
olduğu bulunmuştur. Diğer bir metabolizma ürünü olan karbondioksitin maya
üzerindeki etkisi oldukça azdır. Ancak 8 atm’lik karbondioksit basıncı fermantasyonu
durdurabilir. Bu da fermantasyon reaktörü için mümkün olmayan bir basınçtır.
3.5 Biyoreaktörler
Bitki, hayvan ve insan hücrelerini veya başlı başsına enzimleri kullanarak
hammaddeleri biyolojik olarak özel ürünlere dönüştürmek için kullanılan reaktörlerdir.
Biyoreaktörlerde; sıcaklık, pH, substrat, tuzlar, vitaminler, oksijen derişimi ayarlanarak
hücre büyümesi için optimum koşullar sağlanır.
-
19
3.5.1 Biyoreaktör işletim türleri
Biyoreaktörler işletim şekillerine göre kesikli, yarı kesikli ve sürekli olmak üzere
sınıflandırılabilirler.
• Kesikli işletim (‘Batch’): endüstriyel biyoreaktörler genellikle kesikli işletim ile
çalıştırılırlar. Kesikli işletimde, biyoreaktör ilk önce fermantasyon sıvısı ile doldurulur,
hücreler ortama aşılanır ve hücrelerin üremeleri için belli bir süre beklenir. Bu süre
sonunda hücre yoğunluğunun veya ürün derişiminin belli bir değere ulaşması öngörülür.
Bu süre sonunda reaktör boşaltılır ve yeni bir işlem için hazırlanır.
Kesikli işletimde, reaktör hazırlama, hücre üremesi, reaktör boşaltma ve temizleme
olmak üzere dört evre söz konusudur. Fermantasyon işlemi boyunca herhangi bir
besleme veya ürün uzaklaştırma işlemi yapılmaz. Sadece havalı fermantasyon için hava
beslemesi yapılır. Reaksiyon süresince substrat ve biyokütle derişimi değişir. Reaksiyon
boyunca substrat derişimi azalırken, biyokütle derişimi artar.
• Yarı kesikli işletim (‘Fed-batch’): Yarı kesikli işletimde, biyoreaktöre
fermantasyon boyunca substrat beslemesi yapılır. Reaktörden alınan örnekler dışında
herhangi bir ürün uzaklaştırması söz konusu değildir. Sürekli substrat beslemesi
yapılması ve ürün uzaklaştırılmaması nedeniyle toplam reaksiyon hacmi zamanla artar.
Yarı kesikli işletim, girdi beslemesi yapılarak kesikli işletimin devamı olarak
çalıştırılabileceği gibi hücre büyüme ve çoğalma evreleri ayrı fazlar olarak kontrol
edilebilir. Bunun yanında yarı kesikli işletimde farklı besleme şekilleri ile farklı kontrol
metotları uygulanabilir. Bu işletimde yüksek derişimde biyokütle ve ürün elde edilir.
• Sürekli işletim (‘Continuous’): Sürekli işletimde, bir taraftan reaktöre substrat
beslemesi yapılırken, diğer taraftan da ürün uzaklaştırılır. Besleme ve uzaklaştırma
hızları reaktör hacmi sabit kalacak şekilde yapılır.
-
20
Sürekli işletimle çalışan reaktörlerde, reaksiyon başladıktan kısa bir süre sonra sistem
yatışkın hale ulaşır. Bu işletim şekli arıtma endüstrisinde ve diğer bazı endüstrilerde
kullanılır. Ayrıca laboratuar çalışmalarında, organizmaların üreme kinetiklerinin ve
enzim reaksiyon kinetiklerinin belirlenmesinde kullanılır.
3.6 Proses Gözleme ve Kontrol
3.6.1 pH kontrol
pH kontrol ürün verimliliği açısından önemli bir parametredir. Amaç istenen metabolik
etkiye ulaşmaktır. Ortama uygun asit baz eklemesi ile kontrol sağlanır. Asit veya baz
kültür ortamında çabuk dağılır, fakat pH elektrotu kültür ortamının sembolik bir
örneğini ölçer. pH kontrol, ayarlanan ‘set noktası’ ve pH’ın gerçek değeri arasında
karşılaştırma yapar. pH ölçümü gerçekte sadece sterillenebilir elektrotlar (genelde,
‘Mettler-Toledo’ elektrotları) kullanılarak yapılır.
Set noktası ayarı, pHmin ve pHmax dan oluşur. Eğer pH ayarlanan set noktası arasında
kalırsa olumsuz etkiler oluşmaz. pH hassasiyeti belirtilmelidir (± 0.02 pH).
3.6.2 Çözünmüş oksijen derişiminin kontrolü
Antibiyotik ve organik asitlerin üretiminde önemlidir. Çözünmüş oksijen derişimi, kütle
aktarım katsayısını hesaplamada önemli rol oynar. DO ölçüm ve kontrolü ürün
verimliliği ve seçimliliği açısından çok önemli bir parametredir. DO kontrol
fermantasyon prosesleri için karakteristiktir.
Çözünmüş oksijen derişimini kontrol etmek için farklı DO kontrol yöntemleri vardır.
Karıştırıcı devir hızı (N), hava giriş hızı ( Qhava), gaz karışımı içerisindeki oksijen
derişimi (QO2) ve karıştırıcı devir hızıyla beraber hava giriş hızı birleştirilerek
değiştirilebilir.
-
21
Çözünmüş oksijen derişimi ayarı, % veya derişim cinsinden ölçülür. DO kontrolünde
önemli parametreler karıştırıcı hızının limitleri Nmin ve Nmax ‘dır. Karıştırıcı hızının
limitlerinin seçimi için bir çok kriter vardır;
Minimum karıştırıcı hızının seçim kriteri; kısmen de olsa türbülent akış rejiminin
korunması ve kabarcık dağılımının sağlanmasıdır.
Maksimum karıştırıcı hızının seçim kriteri; yoğun köpük oluşum noktası hücrelerde
telafisi olmayan deformasyonların oluşum noktası, aşırı yüzey gerilimi ve
buharlaşmadır.
3.6.3 Sıcaklık kontrol
Sıcaklık ölçüm ve kontrolü sadece kültüre olan etkisinden değil, diğer sensörlere olan
etkisinden dolayı da önemlidir. Sıcaklık ölçümleri için, paslanmaz çelik Pt 100 sensörü
kullanılır. Sıcaklık fermantasyon prosesleri için çok önemli bir parametredir. Çünkü
biyosentez verimliliği ve çoğalması sıcaklıktaki iki derecelik değişimle önemli oranda
değişir. Çoğalma ortamı sıcaklığı yaygın olarak ±0.5 0C doğrulukta ölçülür.
Laboratuvar biyoreaktörlerinde sıcaklık kontrolü termoçiftin biyoreaktör içine
daldırılması ve soğutma/ısıtma suyunun ceketten gönderilmesiyle sağlanır.
Sıcaklık kontrol proseslerinde iyi performans alınamamasının nedeni PID
parametrelerinin seçimidir. Bu durum, sıcaklıkta salınımlara neden olur. Sıcaklık
kontrolündeki zorluklardan biri de ortam reolojisi ve ısı aktarım alanıdır.
3.6.4 Basınç kontrolü
Basınç burbon tüpü basınç ölçerlerle ölçülür. Sensör yerleştirilmesinde, mikrobiyal
gelişim boyunca çatlakların bulunmamasına veya diğer katıların yığın oluşturmamasına
dikkat edilmelidir.
-
22
3.6.5 Köpük kontrolü
Köpük oluşumu istenmeyen bir durumdur. Köpük oluşumu fermantasyon ortamını
kaybetmeye neden olur. Köpüklenme durumunda yüksek doğrulukta analiz ve ölçümler
yapılamaz.
Köpük seviyesi mekanik olarak kontrol edilebilir. Disk tipi özel bir köpük kırıcı
biyoreaktörün üst kapağına monte edilir. Eğer yoğun köpük oluşumu olursa bu çok
fazla işe yaramayacaktır. Köpük kırıcı ilave edilmelidir.
3.6.6 Substrat derişiminin kontrolü
Besi ortamının yapısı ve derişiminin mikroorganizmanın çoğalması üzerinde etkisi
oldukça fazladır. Substrat derişiminin fazla olması mikroorganizmaların inhibe
olmasına neden olur. Çalışmada kullanılan S. cerevisiae mikroorganizması için bu
durum daha da önem kazanmaktadır. Çünkü bu mikroorganizmanın çoğaltıldığı
ortamlarda substrat derişiminin fazla olması –havalı ortamda da olsa- havasız koşullarda
çoğalma oluyormuşçasına etanol üretimi gerçekleşir. Bu duruma ‘Crabtree Etkisi’ denir
(Frukawa 1983). Amaç mikroorganizma üretmek ise bu durum istenmez. Substratların
çoğalmayı engelleyici seviyeleri hücrelerin ve substratın tipine çok bağlıdır. Maya
üretiminde glikozun 200 g/L üzerindeki derişimi, sudaki indirgenme aktivitesi
nedeniyle, inhibe edicidir (Shuler and Kargi 1992).
Mayanın istenilen şekilde üretilebilmesi için ortamdaki oksijen ve şeker aktarımının iyi,
etanol oluşumunun az olması gerekmektedir. Bunlardan da anlaşılacağı gibi yüksek
etanol derişimi maya hücreleri için toksik etkiye sahiptir. Etanolün kendisi de bir
karbon kaynağı olduğundan maya hücresi büyümek için etanolü de kullanabilir. Etanol
toksik olduğundan maya gelişebilmek için şekeri etanole tercih eder. Büyüme sırasında
maya hücresi karbondioksit üretir. Maya hücresi etanol üretirken oksijen
kullanmadığından mayanın durumunu tanımlayabilecek bir başka güvenilir değişken
karbondioksit üretim hızının (CPR), oksijen tüketim hızına (OUR) oranıdır. Bu oran
-
23
solunum katsayısı, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’,RQ) olarak
adlandırılmaktadır. Glikoz kontrolü, solunum oranı (‘Respiratory Quotient’,RQ) ile
sağlanabilir.
3.6.6.1 Solunum oranı (‘Respirartory Quotient’, RQ )
Solunum oranı; üretilen karbondioksitin tüketilen oksijeni oranıdır;
2
2
tüketilenO
olusanCORQ = (3.3)
Solunum oranı ölçümü mikroorganizmanın tükettiği substrat miktarını verir.
3.7 Sistem Tanımlama
Sistem tanımlama (System identification) kontrol algoritmasında yer alan oldukça
önemli ve zaman alan bir işlevdir. Şekil 3.2’deki gibi verilen bir dinamik sistem
deneysel verilerden yararlanılarak modellenir. Sistem fiziksel özelliklerini en iyi
yansıtan matematiksel model bulunmaya çalışılır.
Şekil 3.2 t anında giriş değişkeni u(t), çıkış değişkeni y(t) ve gürültü e(t) içeren bir dinamik sistem
Sistemlerin modellenmesi değişik yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Giriş değişkenine
birim basamak etki verildiğinde elde edilecek çıkış değişkeni değerlerinin grafiksel
olarak değerlendirilmesi buna bir örnektir. Diğer bir yol matematiksel model
kullanmaktır. Bunun için diferansiyel ve fark eşitliklerinden yararlanılır. Bu tür
Sistem Çıkış değişkeni
y(t)
Giriş değişkeni
u(t)
Gürültü, e(t)
-
24
modeller sistemin dinamik davranışını yeterince tanımlamaktadır. Matematiksel
modeller birçok alanda ve uygulamada oldukça yararlıdır. Matematiksel model
oluşturmanın basitçe iki yolu vardır.
1. Modelleme: bir analitik yaklaşımdır. Basit fizik kanunları, kütle-enerji dengeleri bir
prosesi tanımlamak için kullanılır.
2. Sistem tanımlama: bu bir deneysel yaklaşımdır. Sistemde bazı deneyler
gerçekleştirilir. Kaydedilen veriler kullanılarak modelin deneysel verilerle
uygunluğu araştırılır.
Bir çok durumda prosesler oldukça karmaşıktır. Klasik fizik kanunları, kütle-enerji
dengeleri vb. ifadeler, kullanılabilir bir modelin elde edilmesi için yeterli olmayabilir.
Bu gibi durumlarda sistem tanımlama yöntemleri uygulanır. Yüksek dereceli sistemlerin
modelleri, fizik yasaları kullanılarak bulunan modellere göre daha kolay elde edilebilir.
3.7.1 Modelleme
S. cerevisiae mikroorganizmasının havalı koşullarda yarı kesikli bir biyoreaktörde
glikozun karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı kültür ortamındaki dinamiğini
ifade etmek için kütle korunum denklikleri geliştirilmiştir.
Kesikli bir biyoreaktörde hücrelerin çoğalma hızı Eşitlik 3.4’te verilmiştir;
Xdt
dxµ= (3.4)
Monod kinetinğine göre (3.5),
SKS
Sx
+= maxµ
µ (3.5)
-
25
ise, yarı kesikli bir biyoreaktör için mikroorganizma çoğalma hızı Eşitlik 3.6’da
verilmiştir,
)( 0max xx
V
F
KS
Sx
dt
dx
RS
−++
=µ
(3.6)
Burada F hacimsel akış hızını(mL/min), VR reaktördeki toplam hacmi(mL), x0 başlangıç
mikroorganizma derişimini, S substrat derişimini (g/L) temsil etmektedir.
Substrat tüketim hızı Eşitlik 3.7 ile ifade edilmiştir.
)(1
0max
/
SSV
F
KS
Sx
Ydt
dS
RSSX
−++
−=
µ (3.7)
Burada ise SXY / substrat verim katsayısını, S0 başlangıç substrat derişimini (g/L)
göstermektedir.
Eşitlik 3.8 ve 3.9’da ise özgül çoğalma hızı ve biyoreaktör hacminin zamanla değişimi
görülmektedir.
0=dt
dµ (3.8)
Fdt
dV= (3.9
top related