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Chromatine et Mécanismes Epigénétiques
Frédérique Peronnet
8 juin 2009
1) Epigénétique 2) La chromatine 3) Les mécanismes épigénétiques
- Les modifications des histones - La méthylation de l'ADN - Epigénétique et cancer - Epigénétique et cellules souches
4) Méthodes d'étude des modifications épigénétiques
1) Epigénétique : définition(s)
Waddington, 1942
"Étude des processus par lesquels le génotype, l'ensemble des gènes, engendre le phénotype, les caractéristiques de l'organisme"
Définition "fourre-tout"
"Est considéré comme épigénétique ce qui ne relève pas de la génétique"
Epigenetic mechanisms of gene regulation, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996
"Étude des changements dans l'expression des gènes qui sont héritables lors de la mitose et/ou de la méïose, et qui ne résultent
pas de modifications de la séquence de l'ADN "
Paysage épigénétique
Epigénétique : définition(s)
Etude des caractères, tels que l'état de transcription des gènes, qui sont héritables au cours des divisions cellulaires mais qui n’impliquent aucun changement de la séquence d’ADN.
Ces caractères sont en général réversibles ("reprogrammables") (selon le type cellulaire) et sont portés par des modifications dites épigénétiques.
Génotype Séquence ou ensemble de séquences d’ADN correspondant à un caractère héréditaire donné (phénotype).
Epigénotype Ensemble des modifications épigénétiques conduisant à l'état de transcription d’un gène (expression ou répression).
L'information épigénétique est donc une extension de l'information génétique
Silencing du locus du type sexuel chez la levure
Inactivation du chromosome X chez les mammifères
Empreinte génomique parentale
ARN interférence
Quelques exemples de Processus Épigénétiques
Deux phénotypes pour un même génotype
Deux "espèces" du genre Lunaria
Aucune différence génétique Hérédité épigénétique
Epimutation Altération directe et anormale des modifications épigénétiques, sans modification de séquence de l’ADN Maintien stable
Hérédité non mendélienne
Les souris Agouti (Avy)
Un seul génotype
Diversité de phénotypes liée à une variation de l'expression d'Avy
Variations épigénétiques établies in utero
Génétique versus Épigénétique Modifications génétiques
Mutation : Altération de la séquence nucléotidique
Irréversible ! Héritable !
Modifications post-traductionnelles des histones
(code histone)
Modifications épigénétiques
Aucune altération de la séquence nucléotidique
CHROMATINE ADN
Méthylation de l’ADN (îlots CpG)
Modification de l’activité transcriptionnelle des gènes
Réversible ! Héritable !
2) La chromatine
Dans les cellules eucaryotes, l'ADN est complexé à des protéines. Cette association ADN/protéines est appelée chromatine.
2 types de protéines sont associées à l'ADN les histones: H2A, H2B, H3, H4, H1 6.107 molécules/cellule, compaction de l'ADN, régulation de la transcription les protéines non-histones: 104 molécules/cellule, réplication, transcription
Compaction de l’ADN dans le noyau
20 Km de fil de fer fin 1 balle de tennis
Compaction
X 400.000
ADN Noyau
http://www.geneticengineering.org
ADN
Nucléosome
Fibre de 30nm
Boucles I
Boucles II
Chromosome mitotique
Les différents niveaux de compaction de la chromatine
Le nucléosome : Unité de base de la chromatine
Octamère d’histones : (H2A, H2B, H3, H4)2
Caractéristiques des histones : petites protéines, très conservées, basiques
Luger et al., 1997
Structure du nucléosome
Enroulement de l'ADN autour des histones (fibre de 10nm)
H2a, H2b,H3, H4
Double hélice d’ADN entourée 2 fois autour de l’octamère L'histone H1 pince l'ensemble
3) Les mécanismes épigénétiques
Modifications post-traductionnelles des histones: méthylation,
acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, polyADP-
ribosylation
Méthylation de l'ADN: par l'ADN méthyl-tranférase, chez la plupart
des eucaryotes (sauf S.cerevisiae, C.elegans, peu chez
D.melanogaster), liée à la répression des gènes
Utilisation de variants d'histones: isoformes non allèliques des
histones conventionnelles, présentes en très faible quantité
(macroH2A…)
Résidus modifiés
Modifications Les extrémités NH2-terminales des histones
Zhang & Reinberg, 2001
Les différentes modifications
Acétylation (K) Méthylation (K/R) Phosphorylation (S/T) Ubiquitination (K) Sumoylation (K) ADP-ribosylation Glycosylation Biotinylation Carbonylation …?
= Marques épigénétiques
Ces modifications ont des conséquences sur la structure de la chromatine et par conséquent sur l'expression des gènes
La compaction de la chromatine empêche la
transcription
Différents états de la chromatine
Hétérochromatine transcriptionnellement inactive
Euchromatine compatible avec la transcription
Hypothèse de l'existence du code histone
(Strahl & Allis, 2000)
La combinaison des modifications post-
traductionnelles des queues des histones
constituerait un code spécifiquement reconnu par
des complexes protéiques :
Notion de "writer" et "reader"
Marque épigénétique apposée par les "writers" Ex:
Protéines à domaine SET méthylation des histones
(H3K4me3, H3K27me3 etc...)
Marque épigénétique lue par des "readers" Ex:
HP1 (protéine à chromodomaine) (H3K9me3)
Polycomb (protéine à chromodomaine) (H3K27me3)
BPTF (hNURF) (protéine à PHD finger) (H3K4me3)
Modifications de la structure de la chromatine (remodelage de la
chromatine), en conséquence de l'expression des gènes
Notions de "writers" et "readers"
Décoder le code histone : l'exemple de l'extrémité NH2-ter de l'histone H3
Transitions chromatiniennes
Allis et al., 2007
Effet en cis
Effet en trans
Remplacement des histones
Remodelage de la chromatine
Kingston & Tamkun, 2007
Remodelage de la chromatine Le complexe SWI/SNF
Rôle du complexe SWI/SNF transfert des nucléosomes en trans, transfert en cis (glissement), formation de structures cruciformes (superenroulement), relâchement de l'interaction ADN/nucléosomes
Les complexes SWI/SNF
Kingston & Tamkun, 2007
Modifications des histones
acétylation
méthylation
phosphorylation
ubiquitination
Acétylation des histones
Chromatine « fermée » Non permissive pour la transcription
Chromatine « ouverte » Permissive pour la transcription
Histone Acétyl
Transférase
Histone DéAcétylase
Recrutement de facteurs de transcription par des histones acétylées
Kouzarides & Berger, 2007
Réversibilité de l'acétylation des histones : Transition chromatine active/chromatine fermée
Méthylation des histones
Protéines à domaine SET = "WRITERS" Su(var)3.9 (H3K9me3) EZH2 (H3K27me3, H1K26me3) Trx/MLL (H3K4me3)
A - Marque épigénétique (mono-, di- ou tri-méthylation) apposée sur un résidu spécifique des histones par une Histone Méthyl Transférase (HMTase):
B - Marque épigénétique (mono-, di- ou tri-méthylation) lue par d'autres protéines chromatiniennes = "READERS"
HP1 (protéine à chromodomaine) (H3K9me3)
Polycomb (protéine à chromodomaine) (H3K27me3)
BPTF (hNURF) (protéine à PHD finger) (H3K4me3)
H3K9me3, H3K27me3 sont associées à la répression de la transcription
H3K4me3 est associée à l'activation de la transcription
Mono-, di- ou tri-méthylation
Zhang, Y. and D. Reinberg (2001) Genes Dev 15(18): 2343-60.
Kouzarides & Berger, 2007
Recrutement de facteurs de transcription par des histones méthylées
Immunomarquage des chromosomes polytènes de glandes salivaires de larves de 3ème stade de Drosophila melanogaster
Centrosome (hétérochromatine)
Bras des chromosomes
Méthylations différentielles de l'hétérochromatine et de l'euchromatine
H3K9me / hétérochromatine : gènes OFF H3K4me / interbandes de l'euchromatine : gènes ON
D.Allis Lab
La méthylation de l'arginine 3 de l'histone H4 est enrichie dans certains puffs développementaux
Immunomarquage des chromosomes polytènes de glandes salivaires de larves de 3ème stade de Drosophila melanogaster
H4R3me DAPI Merge
D.Allis Lab
H4 SGRGKGGKGLGL---------
me
Déméthylation des histones
Kouzarides & Berger, 2007
Phosphorylation de la sérine 10 de l'histone H3 par les kinases Snf1 et Aurora lors de l'activation de la transcription ou de la condensation des chromosomes mitotiques
Phosphorylation de la sérine 129 de l'histone H2A par Mec1 en réponse à certains dommages à l’ADN chez la levure
Phosphorylation de la sérine 139 du variant H2A.X par la kinase ATM/ATR en réponse à certains dommages à l’ADN chez les mammifères
Phosporylation de la sérine 14 de H2B dans les cellules en apoptose
Phosphorylation de la sérine 28 de H3, de la sérine 1 de H4 et H2A etc...
Phosphorylations des histones
H3S10p (mitoses)
Exemples de phosphorylations
H3S10p (activation des gènes de heat-shock), Corces lab
Dapi H2B-S14p
Cellules HL-60 en apoptose
Ubiquitination des histones
Kouzarides & Berger, 2007
Activation versus Répression: langage croisé entre marques épigénétiques
ARTK4QTARK9STGGK14APRKQLATKAAK27S28A H3 NH2-
CH3
Trx/MLL HMTase
Complexe TAC1
CH3 CH3
Complexe PRC2
Eed
E(Z) HMTase
CH3 CH3
CH3
Psc PH PC
Complexe PRC1
BPTF (hNURF)
BAP Osa
Moira BRM Complexe
BRM (remodelage de la chromatine ATP-dépedant) ?
Répression
NuRD HDAC
P
?
Exemple: PcG / TrxG
HAT
Ac
Activation
Ac Ac Ac
Exemple : les complexes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) et le maintien de l'expression des gènes Hox
Hox genes
Facteurs de Transcription du développement précoce
Initiation
Hox
Hox gene réprimé
Hox
H3K27 H3K27
deAc
H3K27me3 PC
Hox gene exprimé
Hox
H3K4 H3K4
Ac
H3K4me3 BPTF
Maintien
PcG TrxG
Comment ces modifications des histones sont-elles reproduites lors de la
réplication de la chromatine?
Nucléosome parental
Nucléosome néosynthétisé
mK
+
Hémi-nucléosome parental
Hémi-nucléosome néosynthétisé
mK
mK
mK
mK
Modèle conservatif Modèle semi-conservatif
La Méthylation de l’ADN
Effecteurs DNA methyl-transferase (DNMTs)
Localisation Îlots CpG
Héritage Semi-conservative lors de la réplication
Techniques d’études • Séquençage bi-sulfite • Enzymes de restriction sensibles à la
méthylation de l’ADN • Immunoprécipitation de l’ADN
méthylé (MeDIP)
Modification très stable Dynamique
Effet Associé à la répression de la transcription
Méthylation des cytosines
Li & Bird, 2007
Les effecteurs de la méthylation de l'ADN
DNA methyl transferase (DNMTs)
Donneur: S-adénosyl-méthionine (SAM)
Famille de protéines très hétérogène
Mammifères 2 méthyltransférases de novo:
DNMT3a DNMT3b
1 méthyltransférase de maintien DNMT1
Protéines à motif MBD (methyl-CpG binding domain)
ECRITURE
LECTURE
INTERPRÉTATION Répression de la transcription
Localisation des méthylations de l'ADN
Régions riches en CG qui chevauchent les régions promotrices et le premier exon de nombreux gènes
Îlots CpG
Ilot CpG
CDS intron promoter CDS 3’ UTR
Ilot CpG
PREdictor
EVX-1 A2 A1 A3 A5 A6 A7 A9 A4 A10 A13 A11
Bloyer, S and Robertson, G.A, Vancouver Genome Science Center, British Columbia, Canada
ADN non méthylé ADN méthylé
DNMT3a DNMT3b
Méthylation de l’ADN Les méthyltransférases de novo
Les méthyltransférases de maintien: mécanisme post-réplicatif
ADN hémi-méthylé ADN méthylé
DNMT1
Comment la méthylation de l'ADN est-elle héritée ?
Semi-conservatif
ADN non méthylé
ADN méthylé
ADN hémi-méthylé
réplication
ADN hémi-méthylé
ADN méthylé
ADN méthylé
Méthylation de novo
Méthylation de maintien
Déméthylation passive de l’ADN
ADN méthylé
ADN hémi-méthylé
ADN hémi-méthylé + ADN non-méthylé
Réplication 1
Réplication 2
Réplication 3
Réplication n
Dilution, puis perte de la méthylation au cours des divisions cellulaires successives
Pas d’activité méthyltransférase de maintien
Déméthylation active de l'ADN
ADN méthylé ADN hémi-méthylé
Par des déméthylases
DNdMTase ? DNdMTase ?
ADN non-méthylé
énergie énergie
Par des glycosylases
ADN méthylé ADN hémiméthylé
Glycosylase
Réparation du nucléotide endommagé
?
Clivage de la base azotée en laissant le squelette sucre-phosphate intact
Thermodynamiquement défavorable
?
Déméthylation active de l'ADN
Par des nucléases
ADN méthylé ADN hémiméthylé
Nucléase
Réparation du nucléotide endommagé
Clivage du squelette sucre-phosphate
La méthylation de l’ADN est associée à la répression de la transcription
Le groupement méthyl prend place dans le grand sillon de l’ADN
Les liaisons Watson-Crick ne sont pas perturbées
Les propriétés des liaisons protéines/ADN sont modifiées:
o Perte de l’affinité de fixation de certains facteurs de
transcription
o Fixation de protéines à domaine MBD qui répriment la
transcription via le recrutement de complexes
enzymatiques contenant des HMT et des HDAC qui
modifient les histones
Relation méthylation des histones /méthylation de l'ADN
Relation méthylation de l'ADN / désacétylation des histones
Recrutement du complexe répresseur Sin3A par une "Me-CpG-binding" protein
Li & Bird, 2007
Différents rôles du code histone
Code histone Méthylation
de l’ADN
Remodelage de la chromatine (SWI/SNF)
ARN interférence
Compartimentation nucléaire
Dépôt et échange de variants d’histones
Contrôle de l'expression des gènes
La mémoire épigénétique
FT1
FT2
FT3
FT1
Mémoire épigénétique FT1
FT3
Mémoire épigénétique FT3
Mémoire épigénétique FT2
Cellules différenciées de type 2
Cellules différenciées de type 3
Cellules différenciées de type 1
Cellules souches
Cellule souche pluripotente
Implication des mécanismes épigénétiques
Maintien du patron d’expression des gènes (PcG et trxG) Inactivation du chromosome X (mammifères - PcG) Contrôle du cycle cellulaire (H3Ps10) Maladies chroniques liées au vieillissement Clonage animal 3R (Réplication, Réparation, Recombinaison) Silencing du locus du "mating-type" chez la levure Empreinte génomique parentale Organisation des territoires nucléaires Structure de la chromatine (euchromatine / hétérochromatine) Voies de signalisation Nombreuses maladies génétiques Cancers etc...
Epigénétique & cancers
Méthylation de l'ADN et Cancer: Hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeurs
Ringrose & Paro, Development 134, 223-232 (2007)
Cellules souches et cancer
EPIGENOME
Comparison profile of H3K4me3 and H3K27me3 ES cells
Differentiated cells
Neuroblasts Fibroblasts
Domaines bivalents = H3K27me3 + H3K4me3
Domaines monovalents = H3K27me3 (répression)
Domaines monovalents = H3K4me3 (activation)
Non méthylé
ACTIVATION
RÉPRESSION
H3K4
H3K27
Type cellulaire A (ex. fibroblastes)
Les domaines bivalents des cellules souches ACTIVATION RÉPRESSION
H3K4 H3K27 =
ACTIVATION
RÉPRESSION
H3K27
H3K4
Type cellulaire B (ex. neuroblastes)
Cellules souches embryonnaires
Différenciation
Auto- renouvellement
4) Les méthodes d'analyse des modifications épigénétiques
Globales: imagerie cellulaire, western-blot
Dirigées: analyse d'une région définie par XChIP ou
MeDIP
Exhaustives: analyse de l'épigénome (ChIP-on-chip,
MeDIP, ChIP-Seq)
XChIP, une méthode d’analyse des marques épigénétiques
Cross linked Chromatine Immuno- Precipitation
ANALYSE
Southern blot quantitatif
PCR semi-quantitative
PCR quantitative
Analyse épigénomique globale ChIP on chip
= EPIGENOME
Séquençage global = ChIP-Seq
(454, Solexa etc..)
ChIP-on-chip, analyse de l'Epigénome
De très nombreux anticorps sont disponibles...
contre les histones: H1, H2A.X, H2A.Z, H2B, H3, H4,
Htz1, CENP-A, H3.3, H2A1 etc...
contre les enzymes de modifications des histones:
DNMT, HAT, HDAC, HDM, HMT etc...
contre les histones modifiées: H3K27me2, H3K27me3
etc etc etc ...
contre l'ADN méthylé
Techniques d’étude de la méthylation de l’ADN
Séquençage après traitement au Na bisulfite
Enzymes de restriction sensibles à la méthylation de l’ADN
(AgeI, ClaI, HpaII, MluI, NotI, PmlI, PvuI, SacII, SalI, SmaI etc …)
Immunoprécipitation de l’ADN méthylé: MeDIP
(ChIP-on-chip, CGH arrays)
Séquençage après traitement au Na bisulfite
C T
MeDIP = Methylated DNA IP
Mécanismes épigénétiques et Evolution
Merci de votre attention !!!!
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