clase 13- adn.pptx
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Curso: Biología Celular y Molecular
Oscar Nolasco Cárdenas MSc.oscarnol@hotmail.com
Noviembre 2012
DNA
DNA - historia
1866 Gregor Mendel Publico sus resultados sobre los factores de la herencia.
1868 descubrimiento de la nucleina (DNA) Friedrich Miescher
1902 Walter Sutton Interrelaciona la citología y el Mendelismo (morfología & herencia). Cromosomas son unidades hereditarias. Esta teoría también fue desarrollada por Theodor Boveri
1928 Fred Griffith Propuso la existencia de un principio transformante en sus ensayos con diplococos.
1944 Oswald Avery,Colin MacLeod,Maclyn McCarty. Reportaron que el principio transformante de Griffith era el DNA.
live S strain
Neumococos R vivos inoculados junto con neumococos S inactivados por calor producían la muerte del ratón
Oswald Avery
Colin McLeod
Maclyn McCarty
1950 Erwin Chargaff Determino que los organismos vivos presentan una razon constante entre Adeninas con Timinas y Guaninas con Citocinas.
1951 Rosalind Franklin Obtuvo las fotografias de difraccion de rayos X del DNA
Rosalind Franklin
Maurice Wilkins
1952 Martha Chase y Alfred Hershey empleando bacteriofagos marcados con 35S y 32P demostraron que el DNA es una molécula hereditaria
1953 Francis Crick y James Watson resolvieron la estructura tridimensional del DNA.
1958 Matthew Meselson y Frank Stahl empleando isotopos demostraron la propiedad semiconservativa de la replicación del DNA.
1958 Arthur Kornberg Purifico la DNA polimerasa I de E. coli, La primera enzima que sintetisa DNA en un tubo de ensayo
1966 Marshall Nirenberg, H. Gobind Khorana Led descifran el código genético determinan que los codones (tripletes de nucleotidos de mRNA) son específicos para un aminoácido.
1970 Hamilton Smith Kent Wilcox Aislo la primera enzima de restricción, HindII: que corta el DNA en un sitio de reconocimiento especifico.
1977 Fred Sanger Desarrolla el método del nucleotido terminador para el secuenciamiento de DNA.
1978 Somatostatin es la primera hormona humana en producirse por la tecnologia del DNA recombinante.
1983 Kary B. Mullis Propuso el método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar DNA
1988 - 2003 Se desarrolla el proyecto genoma Humano
2007 DNA de J Watson secuenciado en 2 meses 454 Life sciences (ROCHE)
EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
Proteína
RNA
DNA
transcripción
traducción
CCTGAGCCAACTATTGATGAA
PEPTIDE
CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA
Replicación
Reversa
.
Componentes de un nucleótido:base N + pentosa + fosfato
Acido Nucléico: polímero de nucleótidos
Componentes de un nucleósido:base N + pentosa
DNA
Azúcares de los ácidos nucléicos
RNA
(DNA)
Bases nitrogenadas de los ácidos nucléicos
(RNA)
Nomenclatura de nucleótidos y nucleósidos
BASE Nucleósido Nucleótido Acido nucleico
Purinas
Adenina Adenosina Adenilato RNA
Desoxiadenosina Desoxiadenilato DNA
Guanina Guanosina Guanilato RNA
Desoxiguanosina Desoxiguanilato DNA
Pirimidinas
Citocina Citidina Citidilato DNADeoxicitidina Deoxicitidilato DNA
Timina Timidina o Timidilato o DNAdeoxitimidina deoxitimidilato
Uracilo Uridina Uridilato RNA
Características de los Nucleótidos
Los nucleótidos en el DNA se unen mediante enlace fosfodiester
Las bases nitrogenadas se unen al azúcar por enlace B glucosidico
Apareamiento de bases en el DNA: Puentes de hidrogeno
A T
C G
DNA: Dos hebras antiparalelas forman la doble hélice de DNA
A Vista del enlace de las bases
B Vista de inicio a fin de las cadenas
Formas de DNA
La forma B es referida a la de Watson – Crick
Z alternancia de G y C, presente como segmentos en eucariotes y procariotes, con funcion quizas regulatoria de expresión
Forma A Forma B Forma Z
Sentido de la helice
Hacia la derecha
Hacia la derecha
Hacia la izquierda
Diametro aprox 26 Å aprox 20 Å aprox 18 Å
Bases por torcion 11 10.5 12
Distancia entre pares de bases 2.6 Å 3.4 Å 3.7 Å
El DNA puede disociarse o asociarse por la complementaridad de su secuencia nucleotidica: Denaturación reversible del DNA
La renaturación permite hacer análisis de hibridación cuando se mezclan dos hebras de DNA que comparten cierto grado de similaridad en su secuencia
La denaturación esta relacionada al % de GC.
Organismos que presentan mayor % de GC en su secuencia genómica soportan temperaturas altas
Una secuencia con mayor % de GC presentara un tm mayor que una secuencia con alto contenido de AT (El tm es la Temperatura media de Melting o de disociación en el que la denaturacion de las hebras de ADN es del 50%)
Debido a las bases nitrogenadas el DNA absorbe luz ultravioleta.El efecto denominado hipercromicidad se da al denaturar el DNA, así las bases están expuestas y puede absorber mayor cantidad de luz ultravioleta
Replicación de DNA
Replicación del DNA según Watson y Crick
La replicación
Ocurre en un origen de replicación único en DNA circulares (plasmidos)
En eucariotes es complejo y se da en varios origenes de replicación
La síntesis de la nueva hebra es en sentido 5’ a 3’
La síntesis de DNA en E. coli, Empieza con la unión de proteínas dnaA a la secuencia de origen (ori)
5’3’
3’5’
Secuencia Ori
Unión de proteínas de dnaA
A A A
La región rica en A T es denaturada y hexameros de DnaB (helicasa) se unen al DNA en colaboración con DnaA
Iniciación de la síntesis de DNA en E. coli origen (ori)
5’3’
3’5’
Secuencia Ori
Unión de proteínas dnaA
A A A
Inducción de la denaturación del DNApor las proteínas de dnaA
AA
AA
A
A
AA
AA
A
A B C
Las proteínas dnaB y dnaC se unen al single-stranded DNA
dnaB desenrrolla el DNA
A
A
A
AA
A B C
dnaB desenrrolla las hélices, desplazando a las dnaA
GSe une la dnaG (primase)
A
A
A
AA
AB C
G
...y se sintetiza un cebador RNA primer
RNA primer
B C
G
5’ 3’DNA molde (template strand)
RNA primer(~5 nucleotidos)
Primasoma dna B (helicasa) dna C dna G (primasa)
OH3’ 5’
• DNA girasa es una topoisomerasa II, que rompe el DNA e introduce superocoil negativo a la cabeza de la horquilla de replicación
• Fluoroquinolona inhibe DNA girasas en muchas bacteras gram-negativas: ciprofloxacina y levofloxacina (Levaquin)
Telomeros y edad
Metaphase chromosome
centromero telomero telomero
telomero estructura
Edad joven
Edad senil
Telomeros son capuchones protectivos“caps” sobre elextremo de los cromosomas y consisten de repeticiones cortas en tandem de 5-8 bpde una secuencia rica en GC,Previenen desde fusiones Cromosomas y rearreglos del kariotipo.
(TTAGGG)muchos
(TTAGGG)poco
• telomerasa (una enzima) requerida para mantener la longitud de las células germinales
• La mayoría de las células somaticas disminuye el nivel de la actividad de la telomerasaevels of telomerase y asi sus cromosomas se acortan en cada división
<1 to >12 kb
32
Mecanismo de duplicación en el DNA mitocondrial
La duplicacion se inicia en el loop D
Duplicación en el proceso de conjugación bacteriana.
Transferencia del pili F (plasmido sexual)
Organización común de las DNA polimerasa
Los nucleótidos adicionados son nucleótidos trifosfatos
El mecanismo involucra iones Mg que coordinan con el grupo fosfato y tres residuos Asp de
La enzima DNA polimerasa
Las enzimas polimeras tienen un mecanismo de relectura o de proofreading (actividad exonucleasa 3’ a 5’)
Evita la mala incorporación de un nucleotido
La DNA polimerasa controla la fidelidad de la replicación
Sistemas de reparación corrigen el daño en el DNA
El sistema de excision de nucleotido NER repara los daños provocados por radiación ultravioleta:Puede ocurrir la reparación en forma global o acoplada a la transcripción
El sistema de reparación excision de base BER, repara daños de deaminacion o rupturas en una sola cadena
El sistema de reparación por recombinación homologa HR y de unión de extremos EJ, reparan la ruptura de las cadenas de DNA
Sistema de reparación de una mala incorporación o mal apareamiento MMR
Cambios tautoméricos durante la replicación
Cromosomas
El DNA es altamente comprimido en todos los tipos de genomas
En el bacteriofago En bacterias
En mamiferos
Los cromosomas están divididos en distintas regiones.
Un bandeo característico se da por facilidad de coloración de algunas regiones, se desconoce el porque solo se conoce que las regiones decoloradas contienen mas cantidad de GC
• En eucariotas, el DNA se encuentra empaquetado con proteinas histonas dentro de la cromatina.
• Las unidades básicas de la cromatina son los nucleosomas.
Organización del DNA en el cromosoma
Estructura de los nucleosomas
• Nucleosoma• 146 pb de DNA alrededor
de 8 moléculas de histonas
• Cinco tipos de histonas 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el núcleo octaméricoH1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma 2 vueltas adicionales de DNA 200pb
Modificaciones covalentes de lashistonas regulan la funcionalidad
del DNA
• Los eventos epigenéticos son aquellas variaciones en la expresión de un gen que no se acompañan de cambios en la secuencia de DNA.
• Las cadenas laterales de las histonas sufren modificaciones.
• Modificaciones postraduccionales:– Acetilación– Fosforilación– Metilación(más estable)– Otras…
HISTONAS
Acetilación de histonas
• Se produce en residuos de lisina y es reversible.
• Las histonas acetiladas están asociadas a la cromatina transcripcionalmente activa y las histonas desacetiladas a la cromatina inactiva.
• La acetilación neutraliza la carga positiva de las lisinas.
HATs
• Histona acetiltransferasas.• Estas modificaciones ocurren en el
extremo amino terminal de las histonas.• La primera familia de las HATs es la
superfamilia GNAT, que incluye las proteínas que envuelven, unen e inician la transcripción como la Gcn5 y PCAF, elongación como Elp3.
HDACs
• Están asociados a complejos proteicos.• Se han encontrado deacetilasas en
subunidades de complejos polipeptídicos que actúan como correpresores y silenciadores de genes.
• La Rpd3 y Hda1eliminan grupos acetil críticos de las histonas, empaquetando la cromatina en una forma inactiva (heterocromatina).
• La formación de la heterocromatina es mediado por proteínas Sir2, Sir3 y Sir4, estudios recientes han encontrado que Sir2 presentan un Nad dependiente de la actividad HDAC.
• También se ha visto que la desacetilación de la lisina 16 de H4 es importante para la interacción de Sir3 y Sir4.
Metilacion de Histonas
•Es uno de los mecanismos de regulación que pta diversas funciones asociadas a la activación o a la represión de un gen.
•HMTs
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