elettroforesi separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, acidi...

Elettroforesi

Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.

Forza elettrica : Fel = q · EForza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )

Quando le forze si bilanciano:

q ·E = f ·v

q v = — · E

f

v qmobilità elettroforetica : = — = — E f

Principio:

Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:

V = R I

W = R I2

Operare a I costante

Dissipare l’eccesso di calore

Acidi nucleici

ELETTROFORESI SU SUPPORTOELETTROFORESI SU SUPPORTO

su cartasu carta su gelsu gel

Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale

Formazione di un gel di poliacrilammideFormazione di un gel di poliacrilammide

CH2

• Acrilamide, bisacrilamide monomeri

• Ione perossodisolfato iniziatore

• TEMED catalizzatore

• L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

• La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera

• Effetto setaccio del supporto di separazione

• Grafico di Ferguson: – Mobilità elettroforetica in funzione della

concentrazione del gel

Effetto “setaccio” in un gel uniforme

MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”

Se q L, in assenza di gel e’

pressoché indipendente dalle

dimensioni molecolari

Migrazione Migrazione

di proteine di proteine

e DNA in e DNA in

gel di varia gel di varia

porosita’porosita’

Visualizzazione del DNA: etidio bromuro luce UV

Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto

pozzetti

distanza in cm dai pozzetti

-20-10-7.0

x

1

2

3

4

5

6

7

8

Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruireuna curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del pesomolecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare approssimativo

Log kb

0 1 2 3 4 5 6

1.301.000.800.690.600.470.300.200.00-0.15-0.3

X

Distanza in cm dal pozzetto

X=log10 0,54

100,54= Kb 3,46

kb

2010754321,610.70,5

SDS-PAGESDS-PAGE

(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

SDS-PAGE : elettroforesi discontinuaSDS-PAGE : elettroforesi discontinua

Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] > [proteina-SDS] > [glicinato].

Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.

Colorazione con Coomassie

Colorazione con nitrato di Ag

Si possono effettuare valutazioniquantitative delle bande proteichecol densitometro: misurazione dellaluce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato.Si hanno picchi di assorbimento di cui si puòcalcolare l’area che è proporzionalealla quantità di proteina

Applicazioni della SDS-PAGE

• Purezza del campione

• Determinazione del PM

• Western blot

• Purificazione della proteina

Applicazioni dell’SDS-PAGEDeterminazione del PM

Western blotting

Elettroforesi delle proteine plasmatiche