fernandez lorenzo. biofilm

CONTROL DE LA FORMACION DE BIOFILMS SOBRE BIOMATERRALES

V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL

DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

9, 10 y 11 de octubre de 2012

Mónica Fernández Lorenzo

INIFTA. CONICET, UNLP

Facultad de Ingeniería, UNLP

INFECCIONES ASOCIADAS A LA FORMACIÓN DE

BIOFILMS

Clinical Pharmacology & Therapeutics 82, 204-209,2007

Catéter

intravascular

Válvula

cardíaca

Marcapasos

Cable en

endocarditis

Stent en vena cava Stent urinario Prótesis de cadera Catéter Peritoneal Stent biliar

Implante de

mama

modified from

LONGEVIDAD Y OBESIDAD INCREMENTO DE DEMANDA DE

PRÓTESIS ORTOPÉDICAS

INCREMENTO DE INFECCIONES ASOCIADAS A BIOFILMS

•Reemplazo de articulaciones totales

Incremento de la demanda de prótesis de cadera 2030: 174%

Incremento de la demanda de prótesis de rodilla 2030: 673%

Biofilm de Staphylococcus sobre una

prótesis metálica

Biofilms mixtos y de una única especie

Biofilms mixtos: prótesis dental dental

Banda de ortodoncia

Biofilms de una especie única:

No-móviles:

Staphylococcus aureus

Móviles:

Pseudomonas aeruginosa

Microorganismos que están asociados a la formación de

biofilms sobre prótesis

Datos de 242 pacientes

Prótesis de

cadera y rodillaElementos de fijación

externa

Interacciones del biofilm con biomateriales y

células durante el tratamiento antimicrobiano

Antimicrobial

Agent

Biomaterial

Células

Biofilm

Agente

antimicrobiano

¿Por qué es dificil controlar las infecciones

asociadas a la formación de biofilms?

La estructura tridimensional del biofilm juega un importante papelresistivo en:

Protección de las células internas del ambiente agresivo y de la defensa contra elsistema inmune.

Creación de barreras difusionales para macromoléculas y secuestro de sustanciasantibacterianas.

Inducción de gradientes de oxígeno

dentro del biofilm

Reducción del metabolismo en las

células internas.

Generación de fenotipos heterogéneos

dentro de la estructura del biofilm

Adhesión

reversible

Adhesión irreversibleAcumulación en

colonias 3D con

matriz polimérica

Desprendimient

o de bacterias

Ej: Staphylococcus aureus

modified from

Etapas de formación de biofilms de bacterias no-móviles

Colonización de la superficie

Dispersión de bacterias plactónicas

Formación de un biofilm de bacterias móviles

Adhesión

reversible

Adhesión irreversible y

movimiento superficial.

Microcolonias 2D

Matriz

extracelular

Maduración

Dispersión

Bacterias

planctónicas

dispersas

¿Cómo inhibir la formación de un biofilm?

Adhesión

reversible Adhesión irreversible y

movimiento superficial.

Microcolonias 2D

Matriz

extracelular

Maduración

Dispersión

Bacterias

planctónicas

dispersas

Limitar los mecanismos

que conducen a la forma

sésil

Limitar la adhesión

e interacción

Limitar la movilidad superficial

y el crecimiento 3D

Las bacterias se unen entre ellas y al sustrato mediante el MPE

Estrategia: limitar la agregación microbiana

Pseudomonas sp

Staphylococcus sp

Estrategias de inhibición de las etapas

tempranas del crecimiento del biofilm

Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)

Superficies con propiedades químicas antiadherentes (AA)

Superficies microestructuradas (MS)

Estrategia combinada: AT + MS +

Estrategias de inhibición de las etapas

tempranas del crecimiento del biofilm

Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)

Superficies con propiedades físicoquímicasantiadherentes (AA)

Superficies microestructuradas (MS)

Estrategia combinada: A + MS +

Efecto del tratamiento con antibióticos (AT) sobre bacterias

plactónicas y sobre el biofilm

0 1mg/L 2mg/L 4mg/L

105

CF

U

101

Células planctónicas

Minimim Inhibitory concentration MIC=4mg/L

Minimum biocidal concentration MBC=8mg/L

Biofilms on NS

Más de 104/cm2 bacteria

permanecen vivas con

4mg/L ST

Streptomycin (ST)

Nanopartículas de ZnO como agentes antimicrobianos

en periimplantitis

Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bacteriostática

para distintas concentraciones de nanopartículas de

Ag, CuO, Cu2O, ZnO, WO3, TiO2, Ag+CuO, Ag+ZnO

Estrategias de inhibición de las etapas

tempranas del crecimiento del biofilm

Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)

Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)

Superficies microestructuradas (MS)

Estrategia combinada: A + MS +

Efecto del ZnO agregado al PVC

(catéteres)

Formación de monocapas autoensambladas (películas de

moléculas ordenadas y ensambladas) derivatizadas con gramicidina

Adhesión de bacterias Gram positivas a superficies sin y con gramicidina

Listeria ivanovii

Bacterias vivas en verde

Bacterias muertas en rojo

Con

gramicidina

Sin

gramicidina

Reducción de las bacterias adheridas sobre

películas poliméricas con clorhexidina

Cortizo et al, J of Dentistry, 2012

PBA: Polybenzyl acrilato

Composición de las superficies

Uso de coberturas con heparina como anticoagulante

(en los catéteres). Aumento de adhesión bacteriana

Formación de biofilms se S. aureus sobre PVC con

y sin coberturas que contengan heparina

(1000U/mL)

Modificación de las superficies de los biomateriales: Superficies antiadherentes

con nanotubos con y sin monocapas de PTES.

Cambio de hidrofilicidad

NT: film de nanotubos

NTS: con monocapa de 2H-perfluorooctyl

triethoxisilane (PTES)

TiS: Ti + PTES

NT

NTS TiS

NT-2h

TiS-2h

NTS-

4h

NTS-2h

NT-4h

TiS-4h

Sésiles Planctónicas

Superficies con tratamientos de PTES con y sin nanotubos de TiO2

PTES=2H-perfluorooctyl triethoxisilane

2h

4h

Estrategias de inhibición de las etapas

tempranas del crecimiento del biofilm

Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)

Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)

Superficies microestructuradas (MS)

Estrategia combinada: A + MS +

Variación de la adhesión de S. aureus con el tiempo

en sustratos lisos y rugosos

0 2 7 14 21 días

S. aureus

S. Aureus

dificultad en la remoción

P. Aeruginosa

Discontinuidad debilita la fuerza de adherencia

P. aeruginosa

Posible interpretación

Liso

Fácil

remoción

Rugoso

Difícil

remoción

Retención de bacterias

aisladas

Rugoso

Fácil

remoción

Liso

Difícil

remoción

S. aureus

P. aeruginosa

Sustratos lisos y microestructurados

0 2.5 5.0 7.5 10.0

0-20.0

20.0

m

nm

(II)

0 2.5 5.0 7.5 10.0

0-70.0

70.0

mnm

Au evaporated, 200 nm thickness,

Cr-coated glass.

Grains: 50-100 nm, w=2-3 nm

Wave length 100-200 nm

Wide= 750 nm + 550nm

deep = 120 nm

Long de onda 250 nm y 20 nm

de amplitud.

Ripples: ancho= 40 nm

profundidad=4 nm

0 2.5 5.0 7.5 10.0

0-100

100

m

nm

control (NS) Microstruturado (MS)

Sustratos:

Oro

Polyisobutilcianoacrilato(PBCA)

Cobre

Canales de ancho similar al díámetro de las bacterias

Staphylococcus aureus (AFM images)

Redes 2D Bacterias aisladas atrapadas

Se inhibe la formación de agregados

Bacterias no-móviles

NS: Redes 2D

4 m4 m

Colonización bacteriana de bacterias móviles sobre

sustratos lisos y microestructurados (MS)

MS:Bacterias aisladas

2 m 2 m

(a) (b)

Pseudomonas fluorescens

Lisos= agregados 2D (rafts) MS= Bacterias atrapadas

NS MS

Rafts de bacterias más

largasMS: Bacterias atrapadas en

los canales

5 m

5 m

Bacterias Móviles (Pseudomonas)

flagelo

flagelo

Adhesión 6 veces

menor

NS MS

Biofilms de Pseudomonas sobre NS and MS

Las superficies MS disminuyen la

adhesión, independientemente de

su composición

Oro

Polyisobutylcyanoacrilate(PBCA)

Cobre

MOVIMIENTO SUPERFICIAL DE LAS BACTERIAS:

COLONIZACIÓN DE SUPERFICIES LISAS POR

BACTERIAS SÉSILES (swarming)

Frente de

avance

Colonización

del sustrato

Colonización bacteriana oro liso

Distribuciones de tamaños de bacterias en el frente de

avance según el rol de las bacterias

•10% de las células: tamaños

mayores a 2,5 micras.

•87% de las células: tamaños

mayores a 2,5 micras

Densidad superficial der

bacterias sobre

superficies lisas y con

canales

Imágenes de AFM y microscopía de epifluorescencia de sustratos

lisos y MS

LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Green, live bacteria

Efecto de la microestructura

superficial

Las microestructuras superficiales cuyas

dimensiones características son similares

al diámetro de las bacterias:

Inhiben la formación de agregados bacterianos

Disminuyen el desplazamiento de las bacterias

móviles

Inhiben la colonización bacteriana de la

superficie

Estrategias de inhibición de las etapas

tempranas del crecimiento del biofilm

Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)

Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)

Superficies microestructuradas (MS)

Estrategia combinada: A + MS +

Efecto del tratamiento con antibióticos sobre las bacterias

planctónicas y sobre los biofilms formados sobre superficies

lisas NS

0 1mg/L 2mg/L 4mg/L

105

CF

U

101

Biofilms on NS

Más de 104/cm2 bacterias

permanecen vivas con

4mg/L ST

Streptomycin (ST)

Importantes agregados

microbianos Débil

efecto de los

antibióticos

Agregados pequeños

Mayor efecto de los

antibióticos sobre las

superficies MS

(a) Number of viable bacteria after AA on NS and MS substrates (area: 0.25 cm2).

Epifluorescence image (Live/Dead kit) of P. fluorescens on

(b,c) NS substrate

(d,e) MS substrate after 2 h of ST. Green: live bacteria; red: dead bacteria

1mg/L 2mg/L 4mg/L

105

CF

U

101

Tratamiento con antibióticos de superficies lisas y MS

LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Verdes:vivas, rojas: muertas

Imágenes de microscopía de epifluorescencia de biofilms de bacterias móviles y

no móviles sobre sustratos lisos (NS) y microestructurados (MS) tratados con

antibióticos (AT). Importante efecto MS + AT

1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L

AT: Streptomycin

CF

U

Pf Sa Pf Sa Pf Sa

NS

MS

Número de bacterias viables (Pseudomonas y Staphylococcus) después del

tratamiento con estreptomicina sobre superficies MS y lisas

CFU, colony-forming units.

Without AT

Pf Sa

CFU

MS AT MS+AT

SM

AT

De

cre

ase

in s

urv

iva

l ce

lls

AT

Efecto sinérgico MS+A.

+

Estrategias y su efecto

MS (decrecimiento de 1 orden en el número de bacterias

A Decrecimiento de 2 órdenes en el número de bacterias

Estrategia combinada MS + AT : decrecimiento de 5 ordenes en el número

de bacterias

MS

contr

ol N

S MS+

AT

MS

Efecto

sinérgico

Efecto del tratamiento con antibióticos sobre bacterias

en agregados de sustratos lisos y sobre sustratos MS

NS MS

Incremento de la rugosidad

Incremento de la rugosidad en la membrana

celular MS+AT

Interacciones del biofilm con biomateriales y

células durante el tratamiento antimicrobiano

Antimicrobial

Agent

Biomaterial

Células

Biofilm

Agente

antimicrobiano

Disminución de la supervivencia celular y de la actividad fosfatasa

alcalina

Cortizo et al, J of Dentistry, 2012

Influencia de la liberación de antibióticos desde películas

poliméricas sobre el metabolismo celular

Efecto

antibacteriano

Efecto sobre

las células

Efecto de la liberación de agentes antimicrobianos sobre

las células aledañas

Control células Ti Ti - PBA

Ti – PBA – CLH 0,35% Ti – PBA – CLH 0,7% Ti – PBA – CLH 1,4%

Dosis creciente de clorhexidina

Cortizo et al, J of Dentistry, 2012

La adecuada modificación de las características del sustrato (fisicoquímica y microestructural) puede ser una estrategia efectiva para inhibir la adherencia de bacterias.

Las superficies microestructuradas con patrones de dimensión similar al diámetro de las bacterias inhiben la adhesión de microorganismos y evitan la formación de agregados microbianos y la colonización de superficies.

La acción antibiótica aumenta si las bacterias están aisladas.

Efecto sinérgico: Antibiótico + MS para bacterias móviles (P. aeruginosa and P. fluorescens) and non-móviles (S. aereus).

La estrategia combinada es adecuada para aumentar el efecto antimicrobiano con una reducción de 5 órdenes en el número de bacterias adheridas al biomaterial

Lás células de tejidos aledaños pueden ser afectadas por los agentes antimicrobianos y debe determinarse la concentración máxima de antibiótico en las películas para liberación controlada de agentes antimicrobianos.

Conclusiones:

Tejido

Antibiótico

Biofilm

Biomaterial

Dra. Carolina Díaz

Dr. Alejandro Miñán

Dra. Patricia Schilardi

Dra Cecilia Cortizo

Acknowledgements

S1 S2

Comparación de la colonización sobre:

• Sustratos lisos

• Sustratos con MS orientación paralela

• Sustratos con MS orientación perpendicular

GLIDING

SWARMING

Oro

liso

Orientación bacteriana sobre sustratos con

canales paralelos a la dirección del

desplazamiento

Agregados celulares

en forma oblicua a la

dirección de la

submicro-estructura

• Avance bacteriano oblicuo con respecto a la dirección de la microestructura

superficial evita que las bacterias queden atrapadas.

• Las bacterias oblicuas empujan a las que están atrapadas; gran demanda de

energía.

Estrategias de colonización superficies MS

Alargamiento de

células

fimbrias

Duplicación

Material

polim. extrac

y surfactantes

Flagelos orientadosBacterias deformadas por

empuje y salida de los

canales

Orientación bacteriana sobre superficies con

canales perpendiculares a la dirección de avance

Las orientaciones de

las bacterias no son

aleatorias, dependen

de la posición y de la

dirección de la

submicro-estructura

Influencia de la orientación del sustrato sobre la

longitud y dirección de las bacterias

Pe

Pe

Pa

Pa

Longitud

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,50

3

6

9

12

15

18(a)

Rela

tive

frequ

ency

(%)

Size ( m)

Liso

Angulo

Antibióticos, macrófagos y biofilms

d

c

b

a

d. Las enzimas fagocíticas dañan los

tejidos circundantes y se liberan

bacterias desde el biofilm

c. Los fagocitos son atraídos por el

biofilm

b. Las bacterias de los biofilms son

resistentes a los antibióticos

a.Las bacterias planctónicas pueden

ser fagocitadas por los fagocitos y

son sensibles a los antibióticos