fernandez lorenzo. biofilm
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CONTROL DE LA FORMACION DE BIOFILMS SOBRE BIOMATERRALES
V JORNADAS DE MICROBIOLOGIA CLINICA, INDUSTRIAL Y AMBIENTAL
DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES
9, 10 y 11 de octubre de 2012
Mónica Fernández Lorenzo
INIFTA. CONICET, UNLP
Facultad de Ingeniería, UNLP
INFECCIONES ASOCIADAS A LA FORMACIÓN DE
BIOFILMS
Clinical Pharmacology & Therapeutics 82, 204-209,2007
Catéter
intravascular
Válvula
cardíaca
Marcapasos
Cable en
endocarditis
Stent en vena cava Stent urinario Prótesis de cadera Catéter Peritoneal Stent biliar
Implante de
mama
modified from
LONGEVIDAD Y OBESIDAD INCREMENTO DE DEMANDA DE
PRÓTESIS ORTOPÉDICAS
INCREMENTO DE INFECCIONES ASOCIADAS A BIOFILMS
•Reemplazo de articulaciones totales
Incremento de la demanda de prótesis de cadera 2030: 174%
Incremento de la demanda de prótesis de rodilla 2030: 673%
Biofilm de Staphylococcus sobre una
prótesis metálica
Biofilms mixtos y de una única especie
Biofilms mixtos: prótesis dental dental
Banda de ortodoncia
Biofilms de una especie única:
No-móviles:
Staphylococcus aureus
Móviles:
Pseudomonas aeruginosa
Microorganismos que están asociados a la formación de
biofilms sobre prótesis
Datos de 242 pacientes
Prótesis de
cadera y rodillaElementos de fijación
externa
Interacciones del biofilm con biomateriales y
células durante el tratamiento antimicrobiano
Antimicrobial
Agent
Biomaterial
Células
Biofilm
Agente
antimicrobiano
¿Por qué es dificil controlar las infecciones
asociadas a la formación de biofilms?
La estructura tridimensional del biofilm juega un importante papelresistivo en:
Protección de las células internas del ambiente agresivo y de la defensa contra elsistema inmune.
Creación de barreras difusionales para macromoléculas y secuestro de sustanciasantibacterianas.
Inducción de gradientes de oxígeno
dentro del biofilm
Reducción del metabolismo en las
células internas.
Generación de fenotipos heterogéneos
dentro de la estructura del biofilm
Adhesión
reversible
Adhesión irreversibleAcumulación en
colonias 3D con
matriz polimérica
Desprendimient
o de bacterias
Ej: Staphylococcus aureus
modified from
Etapas de formación de biofilms de bacterias no-móviles
Colonización de la superficie
Dispersión de bacterias plactónicas
Formación de un biofilm de bacterias móviles
Adhesión
reversible
Adhesión irreversible y
movimiento superficial.
Microcolonias 2D
Matriz
extracelular
Maduración
Dispersión
Bacterias
planctónicas
dispersas
¿Cómo inhibir la formación de un biofilm?
Adhesión
reversible Adhesión irreversible y
movimiento superficial.
Microcolonias 2D
Matriz
extracelular
Maduración
Dispersión
Bacterias
planctónicas
dispersas
Limitar los mecanismos
que conducen a la forma
sésil
Limitar la adhesión
e interacción
Limitar la movilidad superficial
y el crecimiento 3D
Las bacterias se unen entre ellas y al sustrato mediante el MPE
Estrategia: limitar la agregación microbiana
Pseudomonas sp
Staphylococcus sp
Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
Superficies con propiedades químicas antiadherentes (AA)
Superficies microestructuradas (MS)
Estrategia combinada: AT + MS +
Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
Superficies con propiedades físicoquímicasantiadherentes (AA)
Superficies microestructuradas (MS)
Estrategia combinada: A + MS +
Efecto del tratamiento con antibióticos (AT) sobre bacterias
plactónicas y sobre el biofilm
0 1mg/L 2mg/L 4mg/L
105
CF
U
101
Células planctónicas
Minimim Inhibitory concentration MIC=4mg/L
Minimum biocidal concentration MBC=8mg/L
Biofilms on NS
Más de 104/cm2 bacteria
permanecen vivas con
4mg/L ST
Streptomycin (ST)
Nanopartículas de ZnO como agentes antimicrobianos
en periimplantitis
Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bacteriostática
para distintas concentraciones de nanopartículas de
Ag, CuO, Cu2O, ZnO, WO3, TiO2, Ag+CuO, Ag+ZnO
Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)
Superficies microestructuradas (MS)
Estrategia combinada: A + MS +
Efecto del ZnO agregado al PVC
(catéteres)
Formación de monocapas autoensambladas (películas de
moléculas ordenadas y ensambladas) derivatizadas con gramicidina
Adhesión de bacterias Gram positivas a superficies sin y con gramicidina
Listeria ivanovii
Bacterias vivas en verde
Bacterias muertas en rojo
Con
gramicidina
Sin
gramicidina
Reducción de las bacterias adheridas sobre
películas poliméricas con clorhexidina
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
PBA: Polybenzyl acrilato
Composición de las superficies
Uso de coberturas con heparina como anticoagulante
(en los catéteres). Aumento de adhesión bacteriana
Formación de biofilms se S. aureus sobre PVC con
y sin coberturas que contengan heparina
(1000U/mL)
Modificación de las superficies de los biomateriales: Superficies antiadherentes
con nanotubos con y sin monocapas de PTES.
Cambio de hidrofilicidad
NT: film de nanotubos
NTS: con monocapa de 2H-perfluorooctyl
triethoxisilane (PTES)
TiS: Ti + PTES
NT
NTS TiS
NT-2h
TiS-2h
NTS-
4h
NTS-2h
NT-4h
TiS-4h
Sésiles Planctónicas
Superficies con tratamientos de PTES con y sin nanotubos de TiO2
PTES=2H-perfluorooctyl triethoxisilane
2h
4h
Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)
Superficies microestructuradas (MS)
Estrategia combinada: A + MS +
Variación de la adhesión de S. aureus con el tiempo
en sustratos lisos y rugosos
0 2 7 14 21 días
S. aureus
S. Aureus
dificultad en la remoción
P. Aeruginosa
Discontinuidad debilita la fuerza de adherencia
P. aeruginosa
Posible interpretación
Liso
Fácil
remoción
Rugoso
Difícil
remoción
Retención de bacterias
aisladas
Rugoso
Fácil
remoción
Liso
Difícil
remoción
S. aureus
P. aeruginosa
Sustratos lisos y microestructurados
0 2.5 5.0 7.5 10.0
0-20.0
20.0
m
nm
(II)
0 2.5 5.0 7.5 10.0
0-70.0
70.0
mnm
Au evaporated, 200 nm thickness,
Cr-coated glass.
Grains: 50-100 nm, w=2-3 nm
Wave length 100-200 nm
Wide= 750 nm + 550nm
deep = 120 nm
Long de onda 250 nm y 20 nm
de amplitud.
Ripples: ancho= 40 nm
profundidad=4 nm
0 2.5 5.0 7.5 10.0
0-100
100
m
nm
control (NS) Microstruturado (MS)
Sustratos:
Oro
Polyisobutilcianoacrilato(PBCA)
Cobre
Canales de ancho similar al díámetro de las bacterias
Staphylococcus aureus (AFM images)
Redes 2D Bacterias aisladas atrapadas
Se inhibe la formación de agregados
Bacterias no-móviles
NS: Redes 2D
4 m4 m
Colonización bacteriana de bacterias móviles sobre
sustratos lisos y microestructurados (MS)
MS:Bacterias aisladas
2 m 2 m
(a) (b)
Pseudomonas fluorescens
Lisos= agregados 2D (rafts) MS= Bacterias atrapadas
NS MS
Rafts de bacterias más
largasMS: Bacterias atrapadas en
los canales
5 m
5 m
Bacterias Móviles (Pseudomonas)
flagelo
flagelo
Adhesión 6 veces
menor
NS MS
Biofilms de Pseudomonas sobre NS and MS
Las superficies MS disminuyen la
adhesión, independientemente de
su composición
Oro
Polyisobutylcyanoacrilate(PBCA)
Cobre
MOVIMIENTO SUPERFICIAL DE LAS BACTERIAS:
COLONIZACIÓN DE SUPERFICIES LISAS POR
BACTERIAS SÉSILES (swarming)
Frente de
avance
Colonización
del sustrato
Colonización bacteriana oro liso
Distribuciones de tamaños de bacterias en el frente de
avance según el rol de las bacterias
•10% de las células: tamaños
mayores a 2,5 micras.
•87% de las células: tamaños
mayores a 2,5 micras
Densidad superficial der
bacterias sobre
superficies lisas y con
canales
Imágenes de AFM y microscopía de epifluorescencia de sustratos
lisos y MS
LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Green, live bacteria
Efecto de la microestructura
superficial
Las microestructuras superficiales cuyas
dimensiones características son similares
al diámetro de las bacterias:
Inhiben la formación de agregados bacterianos
Disminuyen el desplazamiento de las bacterias
móviles
Inhiben la colonización bacteriana de la
superficie
Estrategias de inhibición de las etapas
tempranas del crecimiento del biofilm
Tratamiento con agentes antimicrobianos (A)
Superficies con propiedades fisicoquímicas antiadherentes (AA)
Superficies microestructuradas (MS)
Estrategia combinada: A + MS +
Efecto del tratamiento con antibióticos sobre las bacterias
planctónicas y sobre los biofilms formados sobre superficies
lisas NS
0 1mg/L 2mg/L 4mg/L
105
CF
U
101
Biofilms on NS
Más de 104/cm2 bacterias
permanecen vivas con
4mg/L ST
Streptomycin (ST)
Importantes agregados
microbianos Débil
efecto de los
antibióticos
Agregados pequeños
Mayor efecto de los
antibióticos sobre las
superficies MS
(a) Number of viable bacteria after AA on NS and MS substrates (area: 0.25 cm2).
Epifluorescence image (Live/Dead kit) of P. fluorescens on
(b,c) NS substrate
(d,e) MS substrate after 2 h of ST. Green: live bacteria; red: dead bacteria
1mg/L 2mg/L 4mg/L
105
CF
U
101
Tratamiento con antibióticos de superficies lisas y MS
LIVE/DEAD BacLightTM Viability Kit. Verdes:vivas, rojas: muertas
Imágenes de microscopía de epifluorescencia de biofilms de bacterias móviles y
no móviles sobre sustratos lisos (NS) y microestructurados (MS) tratados con
antibióticos (AT). Importante efecto MS + AT
1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L
AT: Streptomycin
CF
U
Pf Sa Pf Sa Pf Sa
NS
MS
Número de bacterias viables (Pseudomonas y Staphylococcus) después del
tratamiento con estreptomicina sobre superficies MS y lisas
CFU, colony-forming units.
Without AT
Pf Sa
CFU
MS AT MS+AT
SM
AT
De
cre
ase
in s
urv
iva
l ce
lls
AT
Efecto sinérgico MS+A.
+
Estrategias y su efecto
MS (decrecimiento de 1 orden en el número de bacterias
A Decrecimiento de 2 órdenes en el número de bacterias
Estrategia combinada MS + AT : decrecimiento de 5 ordenes en el número
de bacterias
MS
contr
ol N
S MS+
AT
MS
Efecto
sinérgico
Efecto del tratamiento con antibióticos sobre bacterias
en agregados de sustratos lisos y sobre sustratos MS
NS MS
Incremento de la rugosidad
Incremento de la rugosidad en la membrana
celular MS+AT
Interacciones del biofilm con biomateriales y
células durante el tratamiento antimicrobiano
Antimicrobial
Agent
Biomaterial
Células
Biofilm
Agente
antimicrobiano
Disminución de la supervivencia celular y de la actividad fosfatasa
alcalina
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
Influencia de la liberación de antibióticos desde películas
poliméricas sobre el metabolismo celular
Efecto
antibacteriano
Efecto sobre
las células
Efecto de la liberación de agentes antimicrobianos sobre
las células aledañas
Control células Ti Ti - PBA
Ti – PBA – CLH 0,35% Ti – PBA – CLH 0,7% Ti – PBA – CLH 1,4%
Dosis creciente de clorhexidina
Cortizo et al, J of Dentistry, 2012
La adecuada modificación de las características del sustrato (fisicoquímica y microestructural) puede ser una estrategia efectiva para inhibir la adherencia de bacterias.
Las superficies microestructuradas con patrones de dimensión similar al diámetro de las bacterias inhiben la adhesión de microorganismos y evitan la formación de agregados microbianos y la colonización de superficies.
La acción antibiótica aumenta si las bacterias están aisladas.
Efecto sinérgico: Antibiótico + MS para bacterias móviles (P. aeruginosa and P. fluorescens) and non-móviles (S. aereus).
La estrategia combinada es adecuada para aumentar el efecto antimicrobiano con una reducción de 5 órdenes en el número de bacterias adheridas al biomaterial
Lás células de tejidos aledaños pueden ser afectadas por los agentes antimicrobianos y debe determinarse la concentración máxima de antibiótico en las películas para liberación controlada de agentes antimicrobianos.
Conclusiones:
Tejido
Antibiótico
Biofilm
Biomaterial
Dra. Carolina Díaz
Dr. Alejandro Miñán
Dra. Patricia Schilardi
Dra Cecilia Cortizo
Acknowledgements
S1 S2
Comparación de la colonización sobre:
• Sustratos lisos
• Sustratos con MS orientación paralela
• Sustratos con MS orientación perpendicular
GLIDING
SWARMING
Oro
liso
Orientación bacteriana sobre sustratos con
canales paralelos a la dirección del
desplazamiento
Agregados celulares
en forma oblicua a la
dirección de la
submicro-estructura
• Avance bacteriano oblicuo con respecto a la dirección de la microestructura
superficial evita que las bacterias queden atrapadas.
• Las bacterias oblicuas empujan a las que están atrapadas; gran demanda de
energía.
Estrategias de colonización superficies MS
Alargamiento de
células
fimbrias
Duplicación
Material
polim. extrac
y surfactantes
Flagelos orientadosBacterias deformadas por
empuje y salida de los
canales
Orientación bacteriana sobre superficies con
canales perpendiculares a la dirección de avance
Las orientaciones de
las bacterias no son
aleatorias, dependen
de la posición y de la
dirección de la
submicro-estructura
Influencia de la orientación del sustrato sobre la
longitud y dirección de las bacterias
Pe
Pe
Pa
Pa
Longitud
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,50
3
6
9
12
15
18(a)
Rela
tive
frequ
ency
(%)
Size ( m)
Liso
Angulo
Antibióticos, macrófagos y biofilms
d
c
b
a
d. Las enzimas fagocíticas dañan los
tejidos circundantes y se liberan
bacterias desde el biofilm
c. Los fagocitos son atraídos por el
biofilm
b. Las bacterias de los biofilms son
resistentes a los antibióticos
a.Las bacterias planctónicas pueden
ser fagocitadas por los fagocitos y
son sensibles a los antibióticos