genotoksİk maddelerİn bİtkİler Üzerİne...

GENOTOKSİK MADDELERİN

BİTKİLER ÜZERİNE ETKİLERİ

Doç. Dr. Cüneyt AKI

ÇOMÜ FEN EDEBİYAT FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

MOLEKÜLER BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI

cuneytaki@comu.edu.tr

Lise Öğretmenleri

Fizik, Kimya, Biyoloji, Matematik

Proje Danışmanlığı Eğitimi Çalıştayı LİSE-2 (Çalıştay 2012)

İÇERİK 1. Giriş

2. Genotoksik Maddeler ve Genotoksisite

3. Bitkisel Organizmalarda Genotoksisiteyi

Belirlemede Kullanılan Bazı Testler

3.1. Kök ucu hücreleri testi

3.1.1. Mitotik Analiz

3.1.2. Mitotik Aktivitenin Hesaplanması

3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi

3.3. Stamen tüyü analizi

4. Sonuçlar

5. Kaynaklar

1. GİRİŞ

Yeryüzünde yaşayan bütün canlılar, yaşamsal

ihtiyaçlarının karşılandığı ‘çevre’ ile sürekli etkileşim

halindedir.

Bunun bir gereği olarak da, canlılar ile çevre arasında

ekolojik bir dengenin olması kaçınılmazdır.

Yeryüzünde bulunan tüm canlıların hayatta

kalabilmesi; temel ihtiyaçlarının karşılanabilmesi için

yaşadığı çevre ile uyum halinde olması gerekir.

İnsan da dahil olmak üzere birçok canlı türüne ev sahipliği yapan çevrede, canlılığı etkileyen olumlu faktörlerin yanı sıra pek çok olumsuz faktörün de varlığından söz etmek mümkündür.

Çağımızın en önemli sorunlarından biri hiç kuşkusuz,

tüm canlıları, özellikle de insanı olumsuz yönde

etkileyen çevresel tehlikelerin her geçen gün

artmasıdır.

Günümüzde artan insan nüfusu ile birlikte

sanayileşme,

endüstriyel faaliyetler,

tarımsal faaliyetlerde kullanılan kimyasallar, yakıt ve

benzeri amaçlarla kullanılan zehirli gazlar,

gıda ürünlerinde kullanılan her türlü katkı maddeleri

ve

doğaya bırakılan atık maddelerinin gittikçe artması,

başta insan sağlığı olmak üzere her türlü

organizmanın doğal dengesinin bozulmasına

neden olmaktadır.

İnsan’ın ön plana çıktığı ve aktif olarak yer aldığı bir çevrede ise, bu etmenlerden etkilenmesi kaçınılmazdır.

Yapılan araştırmalar, doğal çevremize bulaştırdığımız birçok kimyasal maddenin, kanserojenik, mutajenik ve teratojenik etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır.

Tüm bu nedenlerden dolayı, çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri henüz bilinmeyen birçok sentetik ve doğal maddenin insan sağlığı açısından kanser oluşturma potansiyellerinin de test edilmesi gerekmektedir.

Bu maddelerin kullanım amaçları, etki yolları ve süreleri göz önüne alınarak toksisite testleri dizayn edilmektedir.

Muhtemel toksik etkiler ise;

in vivo koşullarda deney hayvanlarında veya

in vitro koşullarda hücre kültürlerinde araştırılmaktadır (Saygı, 2003).

Fakat, laboratuvar hayvanlarıyla yapılan kanser oluşturmaya yönelik deneylerin çok zaman almaları ve çok pahalı olmaları nedeniyle uygulaması zordur.

Bu nedenle, kimyasal maddelerin kanserojenik potansiyellerini ölçebilmek için bazı in vitro test sistemleri geliştirilmiştir.

Genotoksik etkiler için kısa zamanlı testler olarak bilinen bu testlerle kimyasal maddelerin belirli genetik sistemlerde belirli sonuçlar verip vermedikleri ölçülmekte ve elde edilen sonuçlarla maddelerin kanserojenik potansiyelleri arasında ilişki kurulmaktadır.

2. GENOTOKSİK MADDELER VE

GENOTOKSİSİTE

Sözcük anlamı zehir bilimi olan toksikoloji, kimyasallarla biyolojik sistem arasındaki etkileşimleri zararlı sonuçları yönünden incelemektedir (Başaran, 2004 ).

Toksikoloji: Kimyasalların zararsızlık limitlerini (sınırlarını) inceleyen bilim dalıdır ve inceleme alanlarına göre çeşitli alt dallara ayrılmaktadır.

Bizim toksikoloji bilimi içinde ilgilendiğimiz alt dal ise; genotoksikolojidir.

Genotoksikoloji; çeşitli hücre genetiği teknikleriyle elde edilen kromozomlar üzerine kimyasalların etkilerini inceleyen bilim dalıdır.

DNA ile toksik ajanların etkileşmesi sonucu genlerde ortaya çıkan ve gelecek nesillere taşınan toksisite ‘genotoksisite’ olarak adlandırılmaktadır (Başaran,2004 ).

Genotoksisiteye neden olan tüm maddeler ise ‘genotoksik maddeler’dir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE

Toksik potansiyele sahip olan maddeler:

tüm ilaçlar,

temizlik ve kozmetik maddeleri,

pestisitler,

besin katkı maddeleri ve

sanayide kullanıldığında insanların maruz kalabileceği kimyasal maddeler olarak sıralanabilir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE

Bir maddenin potansiyel mutajen olup olmadığının

belirlenmesi için, kromozomal anormalliklere (anomali)

neden olup olmadığına bakılmaktadır.

Genotoksisite çalışmalarında; etkisi araştırılan

kimyasal için

çok sayıda kromozom preparatlarının hazırlanması,

anormallik oranlarının farklı doz ve süreler için

belirlenmesi,

bu aşamada yüzlerce hücrenin mikroskopta

sayılması, incelenmesi ve istatistiksel

hesaplamalarla sonuca gidilmesi gerekmektedir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE

Genotoksik potansiyel durumu kısa zamanlı testlerle ;

mutasyon,

kardeş kromatid değişimleri,

kromozom anomalileri frekansları gibi değerlerle

ölçülebilmektedir.

Genotoksik potansiyeli belirlemek amacıyla kullanılan

testler arasında, özellikle gen mutasyonlarının

belirlenmesinde: bakteriler, funguslar, Drosophila sp.,

memeli hücreleri, bitkiler ve memelilerin kullanıldığı

testler yer almaktadır (Akı ve Karabay, 2004).

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE

Son dönemde, çeşitli bitkiler iyi birer monitör sistem

olmaları nedeni ile genotoksik potansiyellerinin

saptanması için sıkça kullanılmaktadır.

Bitki biyoanalizlerinde; moleküler sitogenetik

yaklaşımlar ile bitki genotoksisitesi araştırmaları

gerçekleştirilmektedir.

DNA zararlarının ve onların moleküler şekillerinin

biyolojik sonuçlarını anlamak için, çevrenin neden

olduğu DNA değişikliklerini önlemek oldukça önemlidir.

GENOTOKSİK MADDELER VE GENOTOKSİSİTE

3. BİTKİSEL ORGANİZMALARDA GENOTOKSİSİTEYİ

BELİRLEMEDE KULLANILAN BAZI TESTLER

3.1. Kök ucu hücreleri testi

3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi

3.3. Stamen tüyü analizi

3.1. Kök ucu hücreleri testi Soğan veya bakla gibi bitkisel organizmaların kök ucu

hücreleri testinde

kromozom anormalliklerinin ve

mitotik aktivitenin belirlenmesi gerekmektedir.

Bu nedenle, mitotik analiz yöntemi uygulanmaktadır.

Kök ucu hücreleri testinin avantajları şunlardır;

1. Kök uçları ile uğraşmak kolaydır.

2. Kök meristemi bölünen bir çok hücre içerir.

3. Kök uçları, konsantrasyonu ayarlanabilen kimyasallarla doğrudan etkileştirilebilir.

4. Soğan, bütün sene kolay ve ucuz elde edilebilir.

5. Soğanın kromozomları sayıca az; fakat yapı bakımından büyüktür.

3.1.1. Mitotik Analiz

Mitoz bölünme, bitkinin tüm yaşamı boyunca

bölünebilme yeteneğinde olan meristematik dokularda

incelenebilir.

Bitkilerde mitoz bölünme incelemesi için en çok;

kök ucundan,

genç yapraklardan,

küçük çiçek tomurcuklarının

petal yapraklarından yararlanılmaktadır.

Kromozom sayımı yapabilmek için kullanılan materyalde mitotik indeks yüksek olmalıdır.

Yani, bölünmekte olan hücrelerin oranı yüksek olmalıdır.

Bazı bitkilerde, mitozun periyodik değişim gösterdiği saptanmıştır.

Bu bitkilerde, günün belirli saatlerinde mitotik indeksin daha yüksek olduğu bulunmuştur.

3.1.2. Mitotik Aktivite (indeks)nin Hesaplanması

Meristematik hücrelerdeki mitotik safhaların sitolojik olarak gözlenmesi ile mitotik aktivite (indeks) hesaplanabilmektedir.

Mitotik aktivite, bölünen hücrelerin bölünmeyen meristematik hücrelere göre oranıdır.

Genellikle kromozom sayımı çalışmalarında ve toksikolojik çalışmalarda kullanılmaktadır.

Eğer, bir kimyasal madde ile uygulama varsa, maddenin bölünme oranı üzerinde ne şekilde etkili olduğu konusunda bilgi vermektedir.

Mitotik indeks % olarak şu formül ile hesaplanmaktadır;

100Sayisi Hücre Toplam

Sayisi HücreBölünen (%) indeksMitotik x

Mitotik indeks dışında ayrıca, M/T+A oranı da

hesaplanmaktadır.

Bu katsayının yüksek değerde olması (yani 1’ den büyük

olması) ve anafaz + telofaz frekansının azalması,

karyokinetik iğ ipliklerinin inaktive olduğunu

göstermektedir.

Allium cepa L. Mitoz Bölünme Kontrol Fotoğrafları;

a. mitotik profaz safhası (kontrol grubu) b. mitotik profaz safhası (kontrol grubu)

c. mitotik profaz ve metafaz safhası (kontrol grubu) d. mitotik metafaz ve telofaz safhası (kontrol grubu)

Kutup Kayması

Anafazda Kutup kayması Anafazda kutup kayması

Telofazda kutup kayması

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Metafazda tabla kayması

Metafazda tabla kayması Metafazda tabla kayması

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Anafazda tetrapolar oluşumu Anafazda tripolar oluşumu

Multipolar kutup oluşumu

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Kalgın Kromozom

Anafazda kalgın kromozom ve

kutup kayması

Anafazda kalgın kromozom

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Çördük, 2006).

Anafazda köprü oluşumu

Anafazda kalgın kromozom, Kutup kayması ve

köprü oluşumu

Anafazda köprü oluşumu Anafazda köprü oluşumu

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Kromozom Kırıkları

Anafazda Kromozom kırıkları Anafazda kromozom kırıkları

Düzensiz kromozom ve

kromozom kırıkları

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Telofazda Enine Bölünme

Telofazda enine bölünme

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

Anafazda kromozom kırığı ve

metafazda halka kromozom oluşumu

Poliploidi

Allium cepa L. türünün kromozom sayısı 2n=16’dır.

Allium cepa L. kök ucu mitotik anormalliklerinden bazılarının ışık mikroskobu ile yapılan

çekimleri aşağıda verilmiştir (Güneysu, 2004; Çördük, 2006).

3.2. Mikronükleus oluşumu ve analizi

Mikronükleuslar (MN): hücrenin mitoz bölünmesi

sırasında metafaz safhasından anafaz safhasına geçiş

aşamasında oluşmaktadır.

Esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom ya da

asentrik kromozom parçacıklarından köken alan

oluşumlardır.

Mikronükleus, oluşumu için hücre bölünmesine

gereksinim duymaktadır.

Mikronükleus tekniğinin uygulanabilmesi için sitokinezi

blok metodu kullanılmaktadır.

Sitokinezi blok metodu: Cytochalasin-B (Cyt-B) ile, mitoz

geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına

dayanmaktadır.

Heddle ve Countryman’in (1976) kriterlerine göre:

1. Mikronükleusun çapının, esas çekirdeğin 1/3’ünden

küçük olması;

2. Boya alma yoğunluğunun, esas çekirdek ile aynı

olması gerekmektedir.

MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde

oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom

düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak

değerlendirilmektedir.

Anöploidiyi uyaran ajanlar,

sentromer bölünme hatalarına ve

iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol

açarak;

klastojenler ise, kromozom kırıkları oluşturarak MN

oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar.

Bu tür belirlemeler aynı şekilde bitkilerde polen ana

hücrelerinde de kolaylıkla yapılabilmektedir.

Mikronukleuslar, Tradescantia bitkisinde de polen ana

hücrelerinde mayoz bölünmenin erken tetrad safhasında

görülmektedir.

Analizi için, farklı uygulama metodları kullanılarak çeşitli

kimyasalların ya da zararlı ışınların genotoksik

potansiyelleri hakkında bilgiler elde edilebilmektedir.

Tradescantia’da mayoz bölünmenin tetrad safhasındaki mikronukleuslar (Ma ve diğ., 1994b).

Mikronükleus testi sitogenetik hasarın tespitinde

kromozom analizine göre;

kolay uygulanabilmesi,

daha fazla sayıda hücre sayılması ve

istatistiksel yönden daha anlamlı sonuçlar elde

edilmesi gibi avantajları sağlamasıyla yaygın kullanım

alanı bulan bir teknik olmuştur .

Tradescantia pallida H. bitkisinde gerçekleştirilen

mikronükleus analizinde Brilliant Black maddesinin dört

farklı konsantrasyonu uygulanmıştır (İlhan ve Akı, 2009).

Mikronükleusların, mayoz bölünmenin erken tetrad

safhasında oluştuğu görülmüştür.

Uygulanan maddelerin konsantrasyon artışlarına bağlı

olarak mikronükleusların artış gösterme eğilimine sahip

olduğu belirlenmiştir.

3.3. Stamen Tüyü Analizi Kimyasalların genotoksisitesini test etmede kullanılan, bitkilerde

özel lokus mutasyon analizleri bulunmaktadır.

Bunlar bir ya da iki lokusta heterozigot olan özel oluşturulmuş test strainleri veya klonlar üzerine temellenir.

Bu durum, test bileşiklerinin uygulanmasından kısa bir süre sonra somatik mutasyonların ortaya çıkmasına neden olur.

Somatik mutasyonlar;

yapraklar (soya fasülyesi, tütün, yonca, mısır),

çiçek petalleri,

stamen tüyleri (Tradescantia) üzerindeki farklı renklerdeki doku bölgeleri olarak ifade edilir (Akı ve Karabay, 2004).

Stamen tüyü analizinde ‘somatik resesif mutasyonların’

varlığı, pembe renkli mitotik hücrelerin oluşumu ile

ortaya çıkmaktadır.

Tradescantia pallida H. Stamen tüyü hücrelerinde mutasyon (Ma ve diğ., 1994a).

Kontrol gruplarını ve Sunset Yellow boya maddesinin dört

farklı konsantrasyonunun uygulandığı uygulama

gruplarını içeren Tradescantia pallida H. bitkisinin stamen

tüyü analizi sonuçlarına bakıldığında, stamen tüyü

hücrelerinde pembe renkli somatik mutasyonların

oluştuğu gözlenmiştir (İlhan ve Akı, 2009).

Mutasyonların oluşma frekansı ise, uygulanan boya

maddesinin konsantrasyonuna bağlı olarak artış

göstermiştir.

Tradescantia pallida H. stamen tüyü kontrol grubu fotoğrafları

(İlhan ve Akı,2009).

a. b. c.

Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow

uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009) .

a. 10 ppm’lik uygulama b. 200 ppm’lik uygulama

a. b.

Tradescantia pallida H. stamen tüyü Sunset Yellow

uygulama grubu fotoğrafları (İlhan ve Akı,2009) .

c. 1000 ppm’lik uygulama d. 2000 ppm’lik uygulama

c. d.

SONUÇLAR

İnsanların da bulunduğu canlılar içerisinde, doğal ya da

insan kaynaklı olarak bulunan ve ekolojik dengeler

üzerinde potansiyel tehlike niteliğindeki tüm genotoksik

maddeler üzerinde gerçekleştirilen ve gerçekleştirilecek

olan araştırmalar sayesinde; bu maddelerin genotoksik

potansiyelleri ve canlı sistemlerde meydana getirmiş

olduğu genetik hasarların bazıları saptanmış, bazılarının

etkileri ise halen saptanmayı beklemektedir.

Bilimsel araştırmalarda model organizma olarak

genellikle bitkisel ya da hayvansal organizmalar

kullanılmaktadır.

Günümüze kadar yapılan çalışmalar sonucunda

bitkisel ve hayvansal organizmalardan elde edilen

veriler göz önüne alınarak insan sağlığı ile ilgili

bağlantılı çalışmaların yapılması konuyu daha anlamlı

hale getirecektir.

Bu doğrultuda, kullanılan genotoksik potansiyele sahip

olan maddelerin;

Diğer ülkelerde olduğu gibi insanları doğrudan

etkileyen gıda ve gıda bağlantılı sektörlerde

kontrollerinin daha iyi şekilde yapılması,

İnsan sağlığını tehdit etmeyecek düzeyde uygun

miktarlarda kullanılabilmesi,

Canlı sistemleri üzerinde genotoksik ve kanserojenik

etkileri ispatlanmış olanların tamamen yasaklanması

yönünde girişimlerde bulunulması düşünülmektedir.

KAYNAKLAR Akı C., Güneysu E., Acar O. 2009. Effects of Industrial Wastewater on Total Protein and the Peroxidase

Activity in Plants.African Journal of Biotechnology. Vol. 8 (20), pp. 5545-5548.

Akı,C., Karabay Ü. 2004. Genetik Laboratuvarı Uygulama Kitabı. Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

Yayınları, No.38, Çanakkale.

Başaran, A. A. 2004. Farmakognozide tek hücre jel elektroforezi uygulamaları. 14. Bitkisel

İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds.K.H.C.Başer ve N.Kırımer, ISBN

975-94077-2-8.

Çördük. N., Akı C., 2006. Çanakkale Kanyak Fabrikası Atık Suyunun Vicia faba L. Kök Ucu Mitozu Üzerine

Etkisi ve Total Protein Değişimleri. 26-30 Haziran 2006 XVIII. Ulusal Biyoloji Kongresi Kuşadası-AYDIN.(Poster

bildiri).

Gönüz A., Kesercioğlu T., Akı C. 2009. Sitotaksonomide Temel İlkeler Çanakkale Onsekiz Mart Üniv.

Yayınları No:93,ISBN 978-975-8100-99-6.

Ilhan D., Aki C. 2010. Mutagenicity of Sunset Yellow and Brilliant Black in Vicia faba L. and Allium cepa L.

Fresenius Environmental Bulletin, Vol.19, No:5, pp 769-772.

İlhan D., 2006, Bazı Genotoksik Bileşiklerin Bitkilerde Genetiksel Etkilerinin Belirlenmesi, Çanakkale Onsekiz

Mart Üniversitesi.

İlhan D., Akı C. Evaluation of Genetic Effects of Some Genotoxic Compounds in Tradescantia pallida H. With

Micronucleus and Stamen-Hair Mutation Test. Fresenius Environmental Bulletin, Vol.18, No:10, pp. 1828-1831.

Kırımlı R., Akı C. Bazı Fungusit ve İnsektisitlerin Vicia faba L. ve Capsicum Annuum L. türlerinin kök ucu

mitozu üzerine etkileri

Sık L, Acar O, Akı C. 2009 Genotoxic Effects of Industrial Wastewater on Allium cepa L. African Journal of

Biotechnology, Vol. 8 (9), pp. 1919-1923,

Topaktaş M, Rencüzoğulları E, 2010. Sitogenetik. Genişletilmiş ve Düzeltilmiş 2. Baskı. Nobel Bilim ve

Araştırma Merkezi Yayınları, No: 99, 176 s.