hvorfor velge kromatografi som metodikk ingeborg amundsen

Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk

Ingeborg Amundsen

4. februar 2015

Agenda

• Kromatografiske metoder

• Ny analysemetode- viktige spørsmål

• Screening/bekreftelse

• Ny analysemetode-hvor starter vi

• Metodevalidering

Kromatografi- en svært anvendelig analyse metodikk

• Miljøgifter (mat og luft)

• Oljer, gasser og aromastoffer

• Proteiner og aminosyrer

• Gener

• Vitaminer og hormoner

• Legemidler og narkotiske stoffer

Kromatografiske metoder

• Kromatografisk separasjon

– Gasskromatografi

– Væskekromatografi

• Spesifikk detektor

– Massespektrometri

Prinsipp for Kromatografi (separasjon av stoffer) Eksempel: Væskeromatografi (LC) Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere) Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm

A B

Buffer Organisk løsningsmiddel (metanol)

Kolonne (5-10 cm)

Ectasy Amfetamin Morfin

Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet

og føres med væskestrømmen gjennom kolonna

Kromatografi;

Separerer stoffer fra hverandre ved at de vandrer med forskjellig hastighet i et system med en mobil- og en stasjonær fase

Prinsipp for Massespektrometri (MS)

• Danner og analyserer ioner

• Stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer)

• Analyserer i vakuum (gassfase)

• Måler masse over ladning, m/z

Svært spesifikk teknikk

Vi veier ioner! Derav navnet massespektrometri

Ny analysemetode –

Viktige spørsmål • Hvor mange komponenter skal være med i

metoden

• Kvalitativ/kvantitativ

• Hva skal prøveresultatene brukes til

• Hvor mange prøver skal analyseres

• Hva slags prøvemateriale

• Hvor mye prøvemateriale

Viktige spørsmål forts.

• Skal metoden brukes til rutinedrift

• Skal metoden publiseres

• Hva er publisert tidligere

• Analyttenes egenskaper: pKa verdi, polaritet, LogP verdi

• Tilgjengelige instrumenter

• Høydoserte/lavdoserte stoffer

Hva er viktigst

• Lav deteksjonsgrense

• Pålitelige resultater

• God separasjon

• Rene prøveekstrakter

• Rask kromatografi

• Lite løsemiddelforbruk

• Lite forbruk av matriks

• Ergonomi

IS-13

• Prøveresultatet benyttes kun til behandling og diagnostikk

• Medisinske analyser

• Analysen trenger ikke å være spesifikk

• En screeninganalyse

– Positiv prøve – 1 metode og 1 uttak

Screening metode

• Positive/negative prøver

• Prøveopparbeidelse som tar høyde for at alle komponenter ekstraheres

• UPLC-MS/MS: Benytter 1 MRM overgang for stoffene

• Mest fokus rund påvisningsgrensen

IS-14

• Prøveresultatet kan danne grunnlag for alvorlige sanksjoner

• Rettstoksikologiske analyser

• Et positivt resultat skal alltid bekreftes med nytt uttak fra prøven med en spesifikk teknikk

– Positiv prøve – 2 metoder og 2 uttak

Mottak Registrering

Screening Bekreftelse Vurdering

påvist stoff(er)

Ikke påvist Ikke påvist

negativ negativ

pos pos

Bekreftelsesmetode

• Ønsker metoder for komponenter med noenlunde samme kjemiske egenskaper

• Spesifikk prøveopparbeidelse

• Separasjonsprinsippet i UPLC forskjellig fra screeningen

• 2 MRM overganger

• Konsentrasjonsområde for komponentene

Eksempler på komponenter som kan ekstraheres sammen

Mianserin pKa 8,3

MW 264,16

C18H20N2

Mirtazapin pKa 7,1

MW 265,16

C17H19N3

Nortriptylin pKa 9,9

MW 263,17

C19H21N

Paroxetin pKa 9,9

MW 329,14

C19H20FNO3

Trimipramin pKa 9,8

MW 294,21

C20H26N2

Sertralin pKa 9,48

MW 305,07

C17H17Cl2N

Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS

• Finne MRM-overganger til komponentene

NH

m/z 208 Mianserin m/z 265

Mirtazapin m/z 266

NH N

m/z 195

Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS

• Finne MRM-overganger til komponentene

• Finne aktuelle internstandarder

Intern standard

• Et kjemisk stoff som tilsettes i en konstant mengde til prøver, de blanke kontroller og kalibreringsstandarder

• Korrigerer for tap av analytt under prøveopparbeidelse

• Korrigerer for matrikseffekter

• Gjerne deuteriummerket analytt

Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS

• Finne MRM-overganger til komponentene

• Finne aktuelle internstandarder

• Teste ulike kolonner og mobilfaser

TIC for BEH Fenyl kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 8 og MeOH

TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumacetatbuffer pH 5 og ACN

TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og MeOH

TIC for BEH C18 kolonne med mobilfase bestående av 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 og ACN

Sammenligning av retensjonsrekkefølge med ulike separasjonssystemer

Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS

• Finne MRM-overganger til komponentene

• Finne aktuelle internstandarder

• Teste ulike kolonner og mobilfaser.

• Prøveopparbeidelse

Prøveopparbeidelse

“Opparbeidelses teknikk avhenger mye av matriks” BLOD (utfordring: fosfolipider, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, ACN-felling + fosfolipid-removal kolonne (96 format) URIN (utfordring: salter, overdrag, ioneundertrykkelse) - SPE, LLE, Fortynning (96 format), Fortynning + filtrering (96 format) SPYTT (utfordring: prøvetakingsbuffer + diverse tilsetningstoffer, overdrag, ioneundertrykkelse) - LLE LLE = væske-væske ekstraksjon, SPE = fast fase ekstraksjon

Sammenligning av EtG respons i blod med ulike filtreringsplater og utfellingsreagenser

0

5000

10000

15000

20000

25000

ACN (EtG)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

ACN:MeOH(85:15) (EtG)

Oppstart analysemetode UPLC-MS/MS

• Finne MRM-overganger til komponentene

• Finne aktuelle internstandarder

• Teste ulike kolonner og mobilfaser.

• Prøveopparbeidelse

• Validering av metoden!

Metodevalidering

• Robusthetstesting og retensjonstids stabilitet

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

pH 10ionestyrke

2,5 mM

pH 10,4ionestyrke

2,5 mM

pH 10ionestyrke

7,5 mM

pH 10,4ionestyrke

7,5 mM

pH 10,2ionestyrke

5,0 mM

9-OH Risperidon

Risperidon

Propranolol

Klozapin

Hydroxyzin

Aripiprazol

Metodevalidering

• Standardkurve, lineært konsentrasjonsområde Klonazepam Diazepam

Metodevalidering

• Matrikseffekter: Forhold i prøven som gjør at MS-responsen for en spesiell analytt forandres fordi en matriks er tilstede

• Exogene stoffer(andre legemidler/narkotika)

• Endogene stoffer (proteiner, lipider, karbohydrater og salter)

• MS-responsen kan forsterkes eller undertrykkes

Ioneundertrykking

0,211 0,266 0,369

Fosfolipider

• Felling kontra LLE

90 % MeOH 98 % MeOH

5 % MeOH

Fosfolipid bakgrunn v/ PPT

Fosfolipid bakgrunn v/ LLE

Fosfolipider- ulike fosfolipidfjerningsplater

Metodevalidering

• MDK= minste detekterbare konsentrasjon

• MKK= minste kvantifiserbare konsentrasjon

• Metodens presisjon og nøyaktighet

• Metodens reproduserbarhet og nøyaktighet

Metodevalidering

• Spesifisitet:

Metodens evne til å bestemme analytten nøyaktig i nærvær av andre komponenter i prøven

• Prøveopparbeidelsen, kromatografisk separasjon og valg av detektor har betydning for metodens spesifisitet

NH

O OHOCH3

N

OH OHO

CH3

N

OH OO

CH3

Hydromorfon C17H19NO3 MV= 285,34

Norkodein C17H19NO3 MV= 285,34

Morfin C17H19NO3 MV= 285,34

God Spesifisitet

NH

O OHOCH3

N

OH OHO

CH3

N

OH OO

CH3

MS/MS

m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260

%

0

100

268

121

105 118

225181165

137

132

155153

141

175

215

193

187

209

207 219 243236

226

253

257269

Norkodein

m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260

%

0

100185

157

153128

123100 145129

183

171

165

161

227

199

187

211

201 225

229

243

240 268258255

271

Hydromorfon

m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260

%

0

100

201

183165

155

145

123121

107141131

157

161

173

181

185

193

229211

209

227219

268

237 239255

269

Morfin

UPLC

Metodevalidering

• Ekstraksjonsutbytte:

Hvor mye av analytten går over fra matriks til organisk løsningsmiddel under ekstraksjonen

Metodevalidering

• Holdbarhet: • Standard- og kontroll-løsningene

• Stoffene i matriks før ekstraksjon

• Ekstrakter etter ekstraksjon

Metodevalidering

• Sammenligne resultater • Screening/bekreftelse

• Gammel bekreftelse/ny bekreftelse

Ulik reløsning-ulik respons

1) 10% ACN og 90% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 2) 30% ACN og 70% 5 mM ammoniumbikarbonatbuffer pH 10,2 3) 25% ACN og 75% 5 mM ammoniumacatatbuffer pH 5.

Sammenligning ny og gammel metode

(EtG)

«Krav» til positiv prøve

• Over påvisningsgrensen (cut-off)

• Riktig retensjonstid/relativ retensjonstid

• OK internstandard (høyde, retensjonstid)

• Krav til ioneratio (MS)

Kromatografiske metoder

Ulemper:

• Vi finner kun de stoffene som er inkludert i metoden (MRM-metoder)

• Til dels arbeidskrevende og dyr instrumentering

Fordeler:

• Sikrere identifikasjon siden denne gjøres på stoffnivå med krav til retensjonstid, ioneratio og intern standard

• Kvantitativ, kan si noe om påvirkning

• Kan raskt ta inn nye stoffer i metoden

Analytiske utfordringer

• Nye stoffer – mangler renstoff

• Lave konsentrasjoner

• Veldig like stoffer

– Tilstrekkelig separasjon

– Isobare stoffer

JWH-073, MW 327,42 JWH-015, MW 327,42

Oppsummering

• Kromatografiske metoder

– Sikker identifikasjon av stoff

– Kvantitativ

– Ser kun etter de stoff som er lagt inn i metoden

• Metodevalidering

– Grundig, for å vite at du har en robust analysemetode som du kjenner svakhetene til!