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Il ruolo del sistema maggiore di istocompatibilità:

dal laboratorio alla clinica dal laboratorio alla clinica

Marco AndreaniLIBT - Roma

• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

Variabilità nella Genetica UmanaCosa ci rende unici

La variabilità inter-individuale in 3 miliardi di bp nel genoma umano è dello 0.5%

Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Copy Number Variations (CNV)

Variabilità nella Genetica UmanaCosa ci rende unici

• 0.1% of inter-individual variability

• 30 x 106 SNP are known• 1% are functional (3x105)

• 0.4% of inter-individual variability

• Insertion, Deletion, Inversion, Duplication

Sistemi genetici polimorficiRuolo Biologico e Clinico

Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica

Geni HLA class I e II classici

• Presentazione dell’antigene• Alloreattività• Immunità Innata• Evoluzione

• Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive• Gravidanza

Geni HLA non classici (HLA-G)

Tolleranza Immunologica • Trapianti• Gravidanza

Antigeni Minori di Alloreattività • TrapiantiAntigeni Minori di Istocompatibilità

Alloreattività • Trapianti• Gravidanza

Natural Killer Receptors(KIR)

Immunità Innata • Trapianti• Malattie Infettive

Geni delle citochine e dei loro recettori

Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive

Gruppi sanguigni Immunità Naturale • Medicina Trasfusionale

Molecole di Adesione (CTLA-4)

Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive

Altri (PTX3, PTTN2, etc.) • Attivazione cellulare • Trasduzione del Segnale

• Autoimmunità• Malattie Infettive

• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocom patibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

Regione HLA

Cromosoma 6

HLA di Classe I (A,B C)

HLA di Classe II (DR, DQ, DP)

Insieme di proteine di membrana che consente ai linfociti di riconoscere le cellule come proprie (self) oppure come estranee

HLA Classe I (A, B, C)

Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class I molecules

Exon 2

α1 α2

Exon 4

α3

Exon 1

Leader

Exon 3

HLA Classe II (DRB1, DQB1, DPB1)

Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class II molecules

Exon 2

β1/α1 β2/α2

Exon 1

Leader

Exon 3

Processazione e presentazione dell’antigene

Antigeni endogeniper HLA classe I

Insieme dei processi che hanno come risultato:

• frammentazione delle proteine antigeniche• associazione dei frammenti proteici (peptidi) alle m olecole MHC• trasporto del complesso peptide-MHC sulla superficie cellulare dove può essere riconosciuto dal recettore dei linfociti

Antigeni esogeniper HLA classe II

Presentazione dell’antigene da parte di molecole HLA

Riconoscimento diretto e indiretto

Antigen Presentation

Maturazione ed espansionedelle cellule T

Attivazionedelle celluleB

Interazione tra HLA e cellule NK

Diversità allelica

Caratteristica del sitema HLA

Sequenze di alcuni alleli HLA*A

Annual Increase of the Number of HLA Antigens/Alleles

http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png

Per contrastare la flessibilità degli agenti patogeni

Più di un tipo di molecola MHC in ciascun individuo Sistema POLIGENICO

Obiettivo: protezione della popolazione dall’estinzione, utilizzando due strategie:

Sistema POLIGENICO

Estese differenze nelle molecole HLA tra individuiSistema POLIMORFICO

HLA-A10HLA-B12HLA-Cw5

HLA-A26HLA-B8

HLA-Cw5

HLA-A25HLA-B40HLA-Cw2

HLA-A11HLA-B16HLA-Cw8

HLA-A23HLA-B12HLA-Cw1

HLA-A3HLA-B5

HLA-Cw7

The classical HLA class Ia molecules are highly polymorphic

Difference from class I HLA molecule

HLA-A2HLA-B27HLA-Cw6

HLA-A24HLA-B8

HLA-Cw4

HLA-A25HLA-B12HLA-Cw1

HLA-A19HLA-B15HLA-Cw2

HLA-A19HLA-B14HLA-Cw8

HLA-A28HLA-B17HLA-Cw5

• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

Variazioni HLA nelle popolazioni

L’alto grado del polimorfismo del sistema HLA fornisce strumenti per lo studio della diversità

nelle varie popolazioni:

• Storia• Migrazioni• Evoluzione• Genetica• Suscettibilità o resistenza alle malattie

Variazioni HLA nelle popolazioni

The Hardy -Weinberg Equilibrium

Utilizzarono l’algebra per spiegare come le frequenze allelichepossono predire le frequenze genotipiche e fenotipiche

Una popolazione resta in equilibrio solo se in essa si verificano alcune condizioni restrittive: • non devono verificarsi mutazioni• non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l´interno• non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l´interno

della popolazione (immigrazione) o verso l´esterno (emigrazione)• la popolazione deve essere ampia (teoricamente infinita)• non si deve verificare selezione naturale, vale a dire tutti i genotipi

devono possedere le stesse capacità adattative e riproduttive

Two Allele Model

Alleles Frequency

A a

B b

A B

A a*a a*b

B a*b b*b

Phenotypes Frequency

A a*a

AB 2*a*b

B b*b

Formularono indipendentemente questa formula matematica

Software packages

• Arlequin• Gene[rate]• Pypop• http://hla-net.eu• www.allelefrequencies.net• www.allelefrequencies.net

HLA population data storage and analysis

• Software should be able to handle ambiguous data, e.g. Gene[rate]

Variazioni HLA nelle popolazioni

Progetto IME Formidabile opportunità di studio

Possibilità di studio della segregazione aplotipica in quanto disponiamo di dati relativi all’intera famiglia

Variazioni HLA nelle popolazioni

Variazioni HLA nelle popolazioni

SYRIA 0.61%

Confronto tra la frequenza dell’allele HLA-B*53 in diverse popolazioni

IRAQI KURDISTAN

NIGERIA

2.1%

16.9%

Global Distribution of Frequent African HLA-B Alleles

Image from Solberg et al.(2008) see www.pypop.org/popdata for more info

Uno studio su bambini in Africa condotto da Hill A (Nature 1991) ha mostrato che gli alleli

erano più frequenti in popolazioni provenienti dall’Africa

HLA-B53 DRB1*1302-DQB1*0501

Variazioni HLA nelle popolazioni

erano più frequenti in popolazioni provenienti dall’Africa Occidentale rispetto a quanto osservato in altri etnie; variabili indipendentemente associate alla protezione nei confronti della Malaria

Entrambi questi alleli sono frequenti nella popolazione Nigeriana

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

*07

*08

*13

*14

*15

*18

*27

*35

*37

*38

*39

*40

*41

*42

NIGERIA HLA-B Frequency

Variazioni HLA nelle popolazioni

*42

*44

*45

*46

*47

*48

*49

*50

*51

*52

*53

*54

*55

*56

*57

*58

*59

*67

*73

*78

*81

*82

*83

NIGERIA HLA-DRB1 Frequency

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

*01

*15

*16

*03

*04

*11

*12

*13

*14

*07

*08

*09

*10

• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

Il laboratorio di Immunogenetica ha il compito di i ndividuare un donatore HLA compatibile per un paziente proposto a l trapianto

HLA-A: 01:01 29:01 HLA-A: 02:05 03:01

HLA-B: 08:01 35:03 HLA-B: 08:01 40:01

HLA-Cw: 07:01 04:01 HLA-Cw: 03:03 07:02

Mother Father

Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

Tipizzazione HLA ad alta risoluzione di una famiglia dove è possibile evidenziare HLA-DRB1*: 07:01 03:01 HLA-DRB1*: 13:01 08:01

HLA-DQA1*: 02:01 05:01 HLA-DQA1*: 01:03 04:01

HLA-DQB1*: 03:03 02:01 HLA-DQB1*: 06:03 04:02

HLA-DPB1*: 09:01 04:01 HLA-DPB1*: 04:01 15:01

1 2 3 4

HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 03:01 HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 02:05

HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 40:01 HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 08:01

HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 07:02 HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 03:03

HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 08:01 HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 13:01

HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 04:01 HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 01:03

HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 04:02 HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 06:03

HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 15:01 HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 04:01

2 4 1 4 2 4 1 3

Child 1 Child 2 Child 3 Child 4

dove è possibile evidenziare la segregazione aplotipica

Ambiguità

� Alleliche

� Genotipiche

Ambiguità

� Alleliche : Dovute a polimorfismi che si trovano fuori della regione analizzata

HLA ambiguity results from the amplification and Sa nger sequencing based typing (SBT) of partial genes

Allele ambiguity

A*01:01:01:01 vs A*01:01:01:02N (Intron 2)

•DRB1*12:01 vs DRB1*12:06 (Exon 3)

Exon 2 Intron 2

Ambiguità

� Genotipiche: Dovute a combinazioni uguali di alleli diversi (cis-trans) in campioni eterozigoti

Genotype ambiguity - results from an inability to establish phase (cis/trans

ambiguity) between closely linked polymorphisms identified by the typing system

HLA ambiguity results from heterozygoussequencing by Sanger SBT

A*01:01:01:01+24:02:01:01 ------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS

A*01:14 + 24:46 ------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS

A*24:02:01:01 -------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------AC

A*24:46 -------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------CG

Sample: 702-11TReference: IMGT/B 3.3.0 2011-01-14

Summary

The allele pairs listed below are compatible with the consensus sequence.

B*18:01:01 B*44:02:01:01B*18:01:01 B*44:02:01:02SB*18:01:01 B*44:19N Exon 1B*18:09 B*44:09 Exon 2B*18:12 B*44:12 Exon 2

Ambiguità Genotipiche o Cis/Trans

B*18:17N B*44:02:01:01 Exon 1B*18:17N B*44:02:01:02SExon 1B*18:17N B*44:19N Exon 1B*18:20 B*44:51 Exon 3B*18:43 B*44:55 Exon 2

Allele 1 Allele 2A*0201 A*0301Allele 1 Allele 2A*02010101 A*03010101A*0226 A*0307A*0234 A*0308A*02010101 A*03010102NA*02010102L A*03010101A*02010102L A*03010102N

Allele 1 Allele 2A*02010101 A*03010101A*0226 A*0307A*0234 A*0308A*02010101 A*03010102NA*02010102L A*03010101A*02010102L A*03010102N

Allele 1 Allele 2A*02:01:01:01 A*03:01:01:01A*02:26 A*03:07A*02:34 A*03:08A*02:01:01:01 A*03:01:01:02NA*02:01:01:02L A*03:01:01:01A*02:01:01:02L A*03:01:01:02N

Year IMGT Release2000 1.5Year IMGT Release2005 2.8Year IMGT Release2010 2.28Year IMGT Release2011 3.3.0

The discovery of new HLA alleles has resulted in an increase in heterozygous allele combinations that ar e

identical in the commonly sequenced regions

Year IMGT Release2013 3.9.01A*02010101 A*03010103

A*02010102L A*03010103A*02010101 A*03010103A*02010102L A*03010103A*0224 A*0317A*0290 A*0309A*02010103 A*03010101A*02010103 A*03010102NA*02010103 A*03010103A*020102 A*030112A*0323 A*9295

A*02:01:01:02L A*03:01:01:02NA*02:01:01:01 A*03:01:01:03A*02:01:01:02L A*03:01:01:03A*02:24:01 A*03:17A*02:90 A*03:09A*02:01:01:03 A*03:01:01:01A*02:01:01:03 A*03:01:01:02NA*02:01:01:03 A*03:01:01:03A*02:01:02 A*03:01:12A*03:23:01 A*02:195A*02:01:52 A*03:01:03A*02:35:01 A*03:108A*02:237 A*03:05

2013 3.9.01

550 combinations (ex2+3)

20 combinations (ex2-4)

Ambiguità Genotipiche attesein base alla frequenza allelica

• HLA-A: 62 %

Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

• HLA-B: 58 %

• HLA-C: 58 %

• HLA-DPB1: 56 %

• HLA-DQB1: 25 %

• HLA-DRB1: 60 %

Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

The updated CWD catalogue

designates 1122 alleles atthe HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1and -DPB1 loci as being CWD, and

represents 14.3% of the HLArepresents 14.3% of the HLAalleles in IMGT/HLA Databaserelease 3.9.0.

In particular, we identified 415 ofthese alleles as being ‘common’(having known frequencies) and

707 as being ‘well-documented ’ on the basis of ̃140,000 sequence-based typing observations andavailable HLA haplotype data.

Nuove tecnologie

Luminex 500 beadsNext Generation Sequencing

ILLUMINASEQUENZIAMENTOPER SINTESI

THERMO FISHERION TORRENTION SEMICONDUCTORSEQUENCING

Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

Rilevanza della compatibilità HLA

3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors

Early Stage

P<0.001

Intermediate Stage

P<0.001

Late Stage

P=0.02

Rilevanza della compatibilità HLA

(Lee, Blood 2007)

3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors

Early Stage

P<0.001

Intermediate Stage

P<0.001

Late Stage

P=0.02

Rilevanza della compatibilità HLA

(Lee, Blood 2007)

3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors

Early Stage

P<0.001

Intermediate Stage

P<0.001

Late Stage

P=0.02

Rilevanza della compatibilità HLA

(Lee, Blood 2007)

Rilevanza della compatibilità HLA

Immunol Res (2008) 41:56–78Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplant ation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genesJohn A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin

Rilevanza della compatibilità HLA

Immunol Res (2008) 41:56–78Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplant ation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genesJohn A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin

T Cell Epitope Matching in Unrelated HSCTStructural versus Functional

Structural Matching Functional Matching

TCR / MHC

• Nucleotide Sequencing

• Allelic Matching or Disparity

• Sequence Identity for A,B,C,DRB1 (8/8)

• Classical Approach for SCT

• Shared T cell epitopes (TCE)

• TCE matching or disparity

• Functional Identity for TCE groups

• In use for Solid Organ TX

• Innovative for SCT

Combinazioni alleliche permissive

Rilevanza della compatibilità HLA

Combinazioni alleliche permissive

Kawase, Blood, 2007 - October 1:110(7)

Combinazioni alleliche permissive

Identification of a permissible HLA mismatch in hematopoietic stem cell transplantationMarcelo A. Fernandez-Viña et al.

Key Points

Mismatches in alleles C*03:03/C*03:04 were most frequent (68.7%) among the transplants with a single allele level mismatch in HLA-C

The 7/8 C*03:03/C*03:04 mismatch group was not significantly differentfrom the 8/8 HLA matched transplants in any transplant outcome.

Blood ; 2014 Feb 20: 123(8)

Impatto del DPB1 sul trapianto di cellule staminali

ematopoietiche

Combinazioni alleliche permissive

Combinazioni alleliche permissive

Others

TCE3 Grouping

The Algorithm: 60% permissive40% non-perm.40% non-perm.

Zino, Blood 2004

The DPB TCE Webtool

Anthony Nolan Registry

Analisi retrospettiva su 5428 UD -HSCT (10/10)

Fleishhauer Lancet Oncol 2012:13(4): 366-74

Non-permissiveTCE Mismatch

PermissiveTCE Match

DPB1 AlleleMismatched

Allelic DPB1 Match

NRM

Compatibilità DPB1 e andamento del trapianto di CSE nella talassemia

La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!

Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica

Geni HLA class I e II classici • Presentazione dell’antigene• Alloreattività• Immunità Innata• Evoluzione

• Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive• Gravidanza

Geni HLA non classici (HLA-G)

Tolleranza Immunologica • Trapianti• Gravidanza

Antigeni Minori di Alloreattività • Trapianti

La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!

Antigeni Minori di Istocompatibilità

Alloreattività • Trapianti• Gravidanza

Natural Killer Receptors (KIR)

Immunità Innata • Trapianti• Malattie Infettive

Geni delle citochinee dei loro recettori

Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive

Gruppi sanguigni Immunità Naturale • Medicina Trasfusionale

Molecole di Adesione (CTLA-4)

Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive

Altri (PTX3, PTTN2, etc.) • Attivazione cellulare • Trasduzione del Segnale

• Autoimmunità• Malattie Infettive

Quante variabili genetiche si evidenzianosequenziando con NGS le 3.5x106 bp dellaregione MHC di un paziente e di un suopotenziale MUD HLA 10/10 compatible..?

La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!

3025 posizioni diverse (patziente vs. donatore)• 1492 in regioni intergeniche• 1173 in introni• 360 in esoni (59 genes)

Pröll et al. DNA Res. 2011; 18: 201

GENOME WIDE ANALYSIS SNP genotypingAffimetrix Genome-wide, Human SNP 6.0 array

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12

13

14

15

16

18

19

20

21

22

17

Allele BAT2 Allele BAT3

BAT2/BAT3 Haplotypes AC 9/30 (30.0) 5/190 (2.6) 1.15 x10 -8 0.007

GC 0/30 (0.0) 1/190 (0.50) 0.690 1.000

GT 21/30 (70.0) 184/190 (96.8) 5.94 x10-8 0.037

Trapianto da donatore correlato HLA identicoTrapianto da donatore non correlato HLA identico

Trapianto da donatore correlato aploidenticoUtilizzo di cellule T regolatorie

La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!

Utilizzo di cellule T regolatorieUtilizzo di nuovi protocolli di condizionamento

Take Home messages

L’impatto della compatibilità HLA sull’andamento del trapianto restaun elemento di grande rilevanza, anche se diversi elementi, come adesempio la progressione della malattia, devono essere consideratinella scelta della strategia trapiantologica

E’ già possibile definire una compatibilità permissiva, attraverso ilconcetto di “ epitope matching ” , con valore predittivo, per il DPB1concetto di “ epitope matching ” , con valore predittivo, per il DPB1in un contesto 10/10 (9/10)

Valore predittivo per altri alleli (DRB1, DQB1 e di classe I) sono statiin parte già evidenziati, ma certamente dovranno essere approfonditiin futuro

La possibilità di esplorare regioni genetiche fino ad ora non coinvoltenella “compatibilità” è elemento nuovo e stimolante per il futuro