introdução à biotecnologia

Introdução à Biotecnologia

Prof. Dr. Marcelo Lancellotti

Biotecnologia

Conjunto de conhecimentos/técnicas para produção de bens com natureza Biológica.

Biotecnologia

Técnicas / Bens

Genética, Bioquímica, Biologia Celular, Biologia Molecular,Genômica

Tecnologia de Processos Nanotecnologia Bioinformática Robotica

HISTÓRICO

6000 – 2000 aC – panificação e bebidas fermentadas por egípcios,sumérios, babilônicos e gregos

1875 dC – Louis Pasteur : queda da Teoria da Geração Espontânea e início dos processos de fermentação/esterilização.

HISTÓRICO

Processos fermentativos e produção de antibióticos em larga escala

Áreas

Tecnologia do DNA recombinante

Professor Doutor Marcelo Lancellotti

Histórico 1928 – Experimentos de transformação

no pneumococo 1953 – descoberta da estrutura do DNA Década de 70 e 80 avanços na

tecnologia do DNA (Paul Berg, Stanley N. Cohen, Herbert

Boyer) Técnicas de clonagem, expressão de

genes sequenciamento genômico

Histórico

Descoberta e utilização de exonucleases de restrição (enzimas de restrição)

(endonucleases do tipo II BamHI, EcoRI, SmaI, NotI)

Descoberta e utilização das ligases (T4 DNA ligase por exemplo)

Técnicas de Manipulação de DNA

Clonagem e expressão de Genes Vetores de clonagem e expressão Vetores virais (cosmídios e fagos) Vetores cromossômicos

Vetores de Clonagem

Vetores Plasmidiais

Vetores Plasmidiais

Fragmentos de até 15000 pb Necessidade de inserção em

linhagens bacterianas para replicação do inserto clonado no plasmídio

Preparação de receptores competentes

pBR322

Seleção por perda de resistência

Insertos de maiores tamanhos (cerca de até 5Kb)

Réplicas de placas (sistema de transferência com o veludo)

pUC18/19

Seleção por perda de coloração das colônias com plasmídios contendo o inserto de interesse

Fragmentos de até 3kb (perda de eficiência da ligação)

Facilidade em sequenciar os fragmentos clonados

Vetores de expressão

Inserção do gene de interesse sobre o controle de um promotor forte (expressão da proteína alvo);

Fusão do gene alvo com genes reporters, sequências protéicas (lacZ, gfp, his-tag)

Vetores de Expressão

Vetores de natureza viral

Cosmídios e Fagos

Vetores Virais

Insertos maiores que em plasmídios (até 23000 pb para fagos)

Empacotamento do fago in vitro

Head Tail

Rec

cIII

N

cIcro

cII

AWbcNu3DEFiFiiZU V G Thmlki J att int xis cIII N cI cro cII O P Q SR

empacotamento

Fago

Fago 48,514 kb

Head Tail Recombinação Regulação Replicação Lise

OP

Q

SR

Cosmídios

Derivados principalmente do fago λ; Clonagem de grandes fragmentos

cromossômicos ou de DNA (45000pb);

Empacotamento in vitro (região cos) Pode ser inserido em bactérias por

transformação ou indução de ciclo lítico (fago)

cosRegião cos : empacotamento das pastículas virais

Ciclo Lítico necessário

Região de polylinker

cos

Genes de seleção por resistência à antibióticos

Utilização em bactéria e fago (shuttle)

Ap

ori

Cosmídios

Clonagem gênica em plantas

Plasmídios Ti de Agrobacterium tumefasciens Genes de resistência à pragas Genes codificantes para

imunoglobulinas Epítopos antigênicos de patógenos

A.tumefasciens - patogênica

Formação do Tumor em A. tumefasciens

Vetores Cromossômicos

YAC (Yeast Artificial Chromosomes)

BAC (bacterial artificial chromosomes)

PAC (plant artificial chromosomes)

Vetores Cromossômicos

Clonagem de maiores fragmentos de DNA

Possibilidade de glicosilação após transcrição da proteína alvo

Existência de vetores shuttle antre bactérias (Escherichia coli)

YAC’s

YAC’s

BAC’s

pGEMT Easy Clone

Southern Blot

Southern Blot