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ISH法を用いたEBV感染細胞同定の試み

留萌市立病院 病理診断科

仙北雅代 大西啓之 佐々木大輔 池田英之

目的 留萌市立病院 病理診断科では、これまでに組織免疫染色を樹立、さらに細胞診免疫染色を試み、樹立してきた。

このような新たな検査を、院内で行うことで、周辺技術の進歩と、様々な診断に応用してきた(次スライドにまとめあり)。

今回、新たにEBER-ISH法を、院内で樹立することにより、病理診断領域の拡大を目指した。

2年間の細胞診免疫染色のまとめ

標本番号 材料名 免疫染色抗体名 診断

10C0250 腹水 CK7、CA125（+）CK20、CDX-2、Synaptophysin（-）D2-40（判定保留）

細胞：腹腔原発漿液性腺癌 組織：胸壁腫瘍・腸骨より同様所見

10C0369 心嚢液 CK7、HMWK、CA125（+）、CK20、（-） Ber-EP4、Calretinin（判定保留）

細胞：腹腔原発漿液性腺癌 組織：対比組織診なし

10C0764 嚢胞穿刺液 CK7（+）、CK20（-）、CEA（判定保留） ※膵癌術後

細胞：腺癌転移（膵癌転移疑い） 組織：大学にて肝転移（膵癌転移）

11C0074 腹水 CEA、CK20（+）、CK7、Calretinin（-） 細胞：大腸由来腺癌 組織：盲腸生検Group5、muc、tub1

11C0314 胸水 （セルブロック）

AE1/AE3、Vimentin、CD68（+）、CK7（+/-） MIB-I（10%+）、PE10、TTF-1、Calretinin、Ber-EP4, LCA、CD3、CD20、CD79a（-）

細胞：大細胞癌、滑膜肉腫2相型、疑い 組織：対比組織診なし

11C1765 リンパ節 （セルブロック）

CK7(+)、CK20(-） HMWK、TTF-1、PE10、ER、PgR（判定保留）

細胞：腺癌転移（乳癌・甲状腺癌・肺癌） 組織：非小細胞癌転移（肺癌原発）

11C2230 腸腰筋 CD34（+）Vimentin、MIB-I（判定保留） ※組織診免疫染色の結果より

細胞：CD34（+）非上皮性腫瘍 組織：C-kit（-）CD34（+）GIST、SFT疑い ※大学で腸腰筋・S状結腸：高分化脂肪肉腫

12C0791 胸水 CA125（+）、PE10、Calretinin（-） TTF-1（判定保留）

細胞：胸腔原発腺癌 組織：対比組織診なし

12C0877 乳腺 CEA（+） ※血清CEA高値の結果より

細胞：乳頭腺管癌・充実腺管癌 組織：充実腺管癌

12C0910 胸水 （セルブロック）

CEA、CK7、TTF-1（+）HMWK（-/+）PE10、CK20、Calretinin、Synaptophysin、CD56、CGA（-）

細胞：肺原発低分化腺癌 組織：対比組織診なし

今回の実験に用いた方法

1. PNAプローブ*を用いたEBER (EBV-encoded small RNA) in situ hybridization (EBER-ISH)法に、検出感度増感法(CSAⅡ法)を追加して施行(DAKO)。発色は通常のDAB法を用いた。

2. 過去にEBウィルス関連疾患を疑い外注してEBER-ISH陽性であったものを対照として比較した。

3. 実験に用いる一次抗体の濃度、CSAII法の増感度を検討した。

*PNAプローブは、ペプチド骨格に核酸塩基を持つ、ペプチド核酸(PNA)による合成プローブ。DNA, RNAと塩基配列特異的に2-3本鎖を形成し、PNA/RNAは(従来ISH用に用いられて来た)DNA/RNAよりも安定。

EBER in situ hybridization（ISH）法 反応原理

FITC標識PNAプローブをhybridize

EBER

EBER PNAﾌﾟﾛｰﾌﾞ/FITC

ブロッキング試薬１

ブロッキング試薬2

一次抗体（抗FITC抗体）

ﾍﾟﾙｵｷｼﾀﾞｰｾﾞ標識二次抗体

増幅試薬 （FITC標識ﾀｲﾗﾏｲﾄﾞ）

ﾍﾟﾙｵｷｼﾀﾞｰｾﾞ標識抗FITC抗体

DAB

内因性ペルオキシダーゼﾞのブロッキング

非特異的タンパクのブロッキング

一次抗体の反応

二次抗体の反応

ペルオキシダーゼ標識抗FITC抗体の反応

増幅試薬（FITC標識タイラマイド）の反応

発色基質溶液（DAB）の反応

1日目

2日目

Hybridization

院外、院内の検査の流れ

外注の場合

各科からの依頼

標本作製

診断

外注先へ標本ブロック郵送

EBウィルス検出染色

外注先からの返送

診断・報告

院内の場合

各科からの依頼

標本作製

診断

EBウィルス検出染色

診断・報告

＜4-6日間＞ ＜2日間＞

クリーンベンチで実験中の発表者

症例(11B888)

82歳、男性

臨床診断：リンパ腫疑い

現症：微熱の持続。CTにて、縦隔および頚部に多発リンパ節腫大を認める。

既往歴：胃癌(2007年)

リンパ腫疑いにて右頚部リンパ節を生検。

[その他検討した症例は、盲腸のB細胞性リンパ腫(11B979)]

リンパ節 (HEx100, 200), H-RS細胞++

診断 Hodgkinリンパ腫 所見：HEで、大型H-RS細胞を散見する。H-RS細胞はCD30陽性、CD20-/+ JH遺伝子再構成陰性 血清EBV抗体高値、EBER-ISHを検討した。

検査項目 結果値 基準値

EB-抗VCA-IｇM（EIA） 0.0（－） 0 - 0.5

EB-抗VCA-IgA（FA） ＜10.0 0 - 10

EB-抗EBNA（FA） 20.0 0 - 10

EB-抗VCA-IgG（FA） 80.0 0 - 10

可溶性IL-2R 6370 145 - 519

〔結果1〕 EBER-ISH

x100

外注

院内

CD30 x100

〔結果2〕 EBER-ISH

x200

外注

院内

結果と考察 1. 院内EBER-ISH法を施行、リンパ腫疑いの症例においてH-RS細胞を同定した。 2. CSAII法は、極めて高感度であった。暫定的に一次抗体濃度を決定した。 一次抗体濃度：1000倍希釈 増感度：1000/25=40倍以上 3. 非特異的染色(back)が強く、条件決めの追加実験が必要と考えた。

考察2 EBウィルス(Epstein-Bar virus)とは?

1.ヒトヘルペスウィルス科に属する2本鎖DNAを持つウィルス 2.初感染は、通常乳幼児期で、不顕性感染が多い。成人日本人の95％以上が既感染者 3.関連疾患として伝染性単核球症、リンパ腫、鼻咽頭癌、胃癌など、多岐にわたる(次のスライドにまとめあり)

EBウィルス関連疾患

EBウィルス関連疾患

急性感染症 伝染性単核球症、急性肝炎、リンパ節炎

慢性～重症感染症 慢性活動性EBV感染症、血球貪食症候群（EBV-HLH）、 NKリンパ増殖症

免疫不全関連疾患 ダンカン病（XLP）、移植後リンパ増殖症、Chediak・東症候群（accelerated phase）

悪性腫瘍 バーキットリンパ腫、鼻性NK/Tリンパ腫、血管免疫芽球型T細胞リンパ腫（AILT）、ホジキンリンパ腫 膿胸関連リンパ腫（PAL）、原発性滲出性リンパ腫（PEL）、上咽頭癌、胸腺癌、胃癌、肝細胞癌

血液疾患 顆粒リンパ球増多症、特発性血症板減少性紫斑病

その他 1. 2011年度のEBER-ISH検査数：4件 (VCA-IgG高値症例は対象となるか？) 2.保険収載はされていない。一回あたりのcostは5500円、G-labでは1検体/1万円

参考文献

1.病理と臨床、臨時増刊号vol29, p21, p217, p222. 2.http://pathol.umin.ac.jp/fukayama/EBVaGC.htm

謝辞 今回の発表におきまして、症例をご提供い ただいた内科、外科の皆様に感謝いたしま す。