kinetika enzima

ENZIMSKA KINETIKAENZIMSKA KINETIKA

ENZIMIENZIMI

katalitička moć specifičnost regulacija aktivnosti transformacija raznih oblika energije

osobine enzima:osobine enzima:

biološki katalizatori

Na koji način enzimi ubrzavaju kemijsku reakciju?Na koji način enzimi ubrzavaju kemijsku reakciju?

brzina reakcije prema naprijed ovisi o temperaturi i o razlici slobodne (∆G) energije između A i B

kemijske reakcije odvijaju se uz prijelazno stanje, koje ima višu energiju i od supstrata i od produkta

S X‡ P

A B10-4 s-1

10-6 s-1

enzimi ne mijenjaju ravnotežu kemijske reakcije

K = = = = 100c(B) k1 10-4

c(A) k-1 10-6

Gibbsova slobodna energija aktivacije, Gibbsova slobodna energija aktivacije, ∆G‡

razlika u slobodnoj energiji između prijelaznog stanja i supstrata

∆G‡ = GX‡ - GS

enzimi ubrzavaju kemijsku reakciju smanjenjem aktivacijske barijere

G , NEKATALIZIRANA

G , KATALIZIRANA

SLO

BO

DN

A E

NER

GIJ

A, G

PRIJELAZNO STANJE(KATALIZIRANA

REAKCIJA)

PROSJEČNA SLOBODNA ENERGIJA REAKTANTA A

PROSJEČNA SLOBODNA ENERGIJA PRODUKTA B

PRIJELAZNO STANJE(NEKATALIZIRANA REAKCIJA)

Dijagram promjene slobodne energije kemijske reakcijeDijagram promjene slobodne energije kemijske reakcije

KINETIČKA SVOJSTVA ENZIMAKINETIČKA SVOJSTVA ENZIMAMichaelis-MentenMichaelis-Menten-ičin -ičin modelmodel

Pretpostavke u izvođenju Michaelis-Menten kenetike:

1. konc. E zanemariva je u odnosu na konc. S (velika katalitička moć)

2. mjeri se inicijalna brzina (V = v0) – brzina nastajanja nekoliko prvih postotaka produkta (t 0)

u tim su uvjetima promjene konc. reagensa obično linearne s vremenom.

Michaelis – Menten kinetički modelMichaelis – Menten kinetički model

E + SE + S ES E + P ES E + P kk11 k k22

kk-1-1

V = k2 [ES]

brzina nastajanja ES = k1 [E] [S]

brzina razgradnje ES = (k-1+k2) [ES]

k1 [E] [S] = (k-1+k2) [ES]

u ustaljenom (“steady – state”) stanju:

koncentracije međuprodukata ostaju jednake,

a, mijenjaju se koncentracije početnih tvari i produkata

to se događa kada su brzine nastajanja i razgradnje

ES kompleksa jednake:

k-1+k2 [E] [S]

[ES]k1

=

= KM

k-1+k2

k1

[E] [S][ES] =

KM

Uvođenje Michaelis-ove konstante, KM

slijedi:

KM - je ona koncentracija supstrata pri kojoj se postiže polovica maksimalne brzine (Vmax/2)

ako [E] <<< [S], tada je koncentracija nevezanog supstrata približno jednaka ukupnoj [S], a konc. nevezanog enzima:

[E] = [ET] - [ES]

gdje [ET] = ukupna koncentracija enzima.

[ES] =([ET] - [ES]) [S]

KM

[ES] = [ET] [S] / KM

1 + [S] / KM

tj.

ili

[ES] = [ET] [S]

[S] + KM

supstitucijom izraza za [ES] u V = k2 [ES]:

V = k2 [ET]

[S]

[S] + KM

pri maksimalnoj brzini (Vmax) sva enzimska mjesta su zasićena supstratom,

tj. [S] >>> KM, a omjer ([S] / [S] + KM) ~ 1. Tada je:

Vmax= k2 [ET]

Supstitucijom u prethodni izraz dobijemo MICHAELIS – MENTEN jednadžbu:

V = Vmax

[S]

[S] + KM

uz nisku [S] ([S] <<< KM)

tj. brzina je direktno proporcionalna koncentraciji supstrata

pri visokoj [S] ([S] >>> KM) V = Vmax

tj. brzina je neovisna o koncentraciji supstrata.

ako je [S] = KM V = Vmax/2

tj. KM je jednaka onoj koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina rekcije jednaka polovici njene maksimalne vrijednosti.

V = [S] Vmax

KM

Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije Dijagram ovisnosti brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstratao koncentraciji supstrata

BR

ZI N

A R

EA

KC

I JE (V

0)

KONCENTRACIJA SUPSTRATA [S]

V = Vmax

[S]

[S] + KM

KKMM koncentracija S kod koje je V = VV = Vmaxmax/2 /2

tj. pola aktivnih mjesta enzima je popunjeno supstratom

KKMM je mjera jačine ES kompleksa

Vmax pokazuje prometni broj enzima kk22 ili kkcatcat, ukoliko je poznata koncentracija aktivnih mjesta [ET]

VVmaxmax = k = kcatcat [E [ETT]]

Prometni brojPrometni broj (kk22 ili k kcat cat ) ) enzima je onaj broj molekula supstrata pretvorenih u molekule produkta po molu enzima, u jedinici vremena, kada je enzim potpuno zasićen supstratom

kkcatcat / K / KMM = mjera za kinetičko savršenstvo enzimske reakcije tj. mjera katalitičke učinkovitosi

vrijednost kcat / KM stanovitog broja enzima poput Acetilkolinesteraze, Karboanhidraze i Triozafosfat-izomeraze su između 101088 i 10 i 1099 mol mol-1-1 L s L s-1-1, što ukazuje da su postigli kinetičko savršenstvo

njihovu brzinu katalize ograničava samo brzina kojom susreću supstrat u otopini

KKMM vrijednost većine enzima je između 10 vrijednost većine enzima je između 10-1-1 i 10 i 10-6-6 M M

kk22 većine enzima je 1-10 većine enzima je 1-1044 sec sec-1-1

LLineweaverineweaver - B - Burkurk-ov-ovdvostruko recipročni dijagramdvostruko recipročni dijagram

1V

1 [S]

PRESJECIŠTE S OSI y = 1

Vmax

NAGIB = KM

Vmax

PRESJECIŠTE S OSI x = – 1

KM

1 V

KM

Vmax

1 [S]

1 Vmax

= +

0

INHIBICIJA ENZIMAINHIBICIJA ENZIMA

Ireverzibilna inhibicijaIreverzibilna inhibicija

Reverzibilna inhibicija Reverzibilna inhibicija

kompetitivnakompetitivna

nekompetitivnanekompetitivna

KOMPETITIVNAINHIBICIJA

NEKOMPETITIVNAINHIBICIJA

E

E

E

S

S

S

I

I

I

I

REVERZIBILNA INHIBICIJAREVERZIBILNA INHIBICIJA

Kompetitivna inhibicija Kompetitivna inhibicija

Ki - Konstanta disocijacije inhibitora (manji Ki, jači inhibitor)

1v

KM

Vmax

1 [S]

1 Vmax

= +1 + [ I ] Ki

Kompetitivna inhibicija Kompetitivna inhibicija

Nekompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija

Nekompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija

Jedinice enzimske aktivnostiJedinice enzimske aktivnosti

1 INTERNACIONALNA JEDINICA 1 INTERNACIONALNA JEDINICA (1 U)(1 U) = količina enzima koja prevede u produkt 1 μmol1 μmol supstrata u 1 min 1 min (pod određenim uvijetima)

1 KATAL (1 KAT)1 KATAL (1 KAT) = = količina enzima koja prevede u produkt 1 mol1 mol supstrata u 1 s 1 s (pod određenim uvijetima)

SPECIFIČNA AKTIVNOST = AKTIVNOST/mg PROTEINA

1. KM za enzimsku hidrolizu spoja S iznosi 25 µM. Maksimalna brzina ove reakcije je 75µmol/L. Odredi kojom će se brzinom odvijati ova enzimska reakcija uz koncentraciju S:

a) c(S) = 25µM

b) c(S) = 50µM

a) v = 75 * 25 / 25 + 25 = 37,5 µmol/L

b) v = 75 * 50 / 25 + 50 = 50 µmol/L

V = Vmax

[S]

[S] + KM

2. U kakvom su odnosu c(S) i KM kada se enzimska reakcija odvija brzinom koja je jednaka 80% maksimalne brzine.

V = Vmax

[S]

[S] + KM

V = 0,8 Vmax

0,8 ([S] + KM) = [S]

0,8 [S] + 0,8 KM = [S]

0,8 KM = [S] - 0,8 [S]

0,8 KM = 0,2 [S]

S = 4 KM

0,8 Vmax = Vmax

[S]

[S] + KM

4. Ako koncetraciju enzima u reakcijskoj smjesi, koja sadrži velik višak supstrata povećamo za faktor 2, posljedica će biti:

a) KM će se smanjiti za 50% b) KM će se povećati za faktor 2 c) vmax ce se smanjiti za 50% d) vmax će se povećati za faktor 2 e) povećat će se i KM i vmax

5. Koncetracija supstrata u nekoj reakcijskoj smjesi bila je jednaka KM, a koncetracija enzima bila je c. Ako koncetraciju supstrata povećamo za faktor 2, posljedica će biti:

a) brzina reakcije (v) postat će vmax

b) v će se smanjiti c) v će se povećati za faktor koji je manji od 2 d) v se neće mijenjati e) v će se povećati za faktor veći od 2

6. Enzim arginin-tRNA sinteza ima tri supstrata,s pripadajućim vrijednostima KM

Arginin 3 μM tRNA 0,4 μM ATP 3 μM

Na osnovu navedenih podataka može se zaključiti: a) najveći afinitet enzim ima za arginin b) najveći afinitet enzim ima za tRNA c) najveći afinitet enzim ima za ATP d) afinitet enzima je isti za sva tri supstrata e) afinitet enzima je isti za tRNA i ATP

7. Glicin se normalno nalazi u jetri u koncentraciji 0,1 mM. KM za glicin u detoksifikacijskom mehanizmu:

BenzoilCoA + glicin → CoA + hipurna kiselinaBenzoilCoA + glicin → CoA + hipurna kiselina

7. iznosi 0,5 mM. Primjena glicina u dnevnoj dozi od 5 g povećava njegovu koncentraciju u jetri na 1mM. Za koji će se faktor povećati brzina enzima koji katalizira reakciju (uz pretpostavku da se ne mjenja koncentracija benzoil CoA)?

V = Vmax

[S]

[S] + KM

V2

Vmax[S2]

[S2] + KM

V1 Vmax[S1]

[S1] + KM

=

V2

1

1 + 0,5

V1 0,1

0,1 + 0,5

= = 4

8. Odredite koliko ima enzima u sirovom enzimskom preparatu ukoliko 150 mg proteina sirovog enzimskog preparata pokazuje aktivnost od 150 µmol/min, a specifična aktivnost čistog enzima iznosi 15 µmol/min*mg.

c(proteina) = 150 mg

Aktivnost = 150 µmol/min

Specifična aktivnost = 15 µmol/min*mg

Specifična aktivnost = Aktivnost / mg prot.

mg prot. = Aktivnost / Specifična aktivnost

mg prot. = 150 µmol/min / 15 µmol/min*mg = 10 mg

9. Skicirajte odgovarajuće dijagrame za katalizu enzimom koji slijedi Michaelis-Menteninu kinetiku:

a) V u ovisnosti o [S]

b) V u ovisnosti o [E]

c) [ES] u ovisnosti o t

d) [S] u ovisnosti o t

e) [P] u ovisnosti o t

ako su vrijednosti ostalih varijabli u svakom pojedinačnom slučaju konstantne

Prikaz V u ovisnosti o [S] je obični Michaelis-Menten dijagram.

a)

Vmax=k2[ET].

Ako se ostale varijable u jednadžbi ne mijenjaju ([S] konst., kao i fizički uvjeti reakcije), tada je V proporcionalna s Vmax, pa tako i s [ET]. Stoga je dijagram ovisnosti V o [ET] pravac koji prolazi kroz ishodište (jer je logično pretpostaviti da se velika većina biokemijskih reakcija u odsutnosti enzima ([ET]=0) ne odvija zamjetnom brzinom (V=0).

b) V u ovisnosti o [E]

c) [ES] u ovisnosti o t

Michaelis-Menten model pretpostavlja da je reakcija katalizirana enzimom u ustaljenom stanju: brzina nastanka kompleksa ES je jednaka brzini njegova nestanka. Stoga se u uvjetima u kojima je ovaj model primjenjiv koncentracija [ES] ne mijenja s vremenom. (Sam početak grafa prikazuje razdoblje potrebno za uspostavu ustaljene koncentracije [ES], tzv. predustaljeno stanje. Trajanje ovog razdoblja je reda veličine ms, dok je trajanje ustaljenog stanja u većinislučajeva reda veličine sekundi ili minuta, ponekad i sati.)

d) [S] u ovisnosti o t

e) [P] u ovisnosti o t

Na početku reakcije katalizirane enzimom (t = 0) u reakcijskoj smjesi nema produkta ([P] = 0). Za t → ∞ reakcija će se približavati ravnoteži, a koncentracija P nekoj ravnotežnoj koncentraciji [P]eq

Na početku reakcije katalizirane enzimom (t = 0) u reakcijskoj smjesi prisutna je početna koncentracija supstrata [S]0. Teoretski, za t → ∞ reakcija će se približavati ravnoteži, a koncentracija S nekoj ravnotežnoj koncentraciji [S]eq.

10. Za reakciju kataliziranu enzimom dobivene su slijedeće vrijednosti:

a) Odredite KM i Vm grafički po Lineweaveru i Burku.

b) Uz pretpostavku da je enzim prisutan u koncentraciji 10-6 mol dm-3

izračunajte njegov obrtni (prometni) broj.

11. Enzim katalizira pretvorbu: A ↔B. Poznata je kcat enzima koja iznosi 600 s-1. Poznato je također da pri [ET] = 20 nmol dm-3 i [S] = 40 µmol dm-3 početna brzina reakcije V = 9,6 µmol dm-3 s-1. Izračunajte KM enzima za supstrat A.

12. Aminokiselina asparagin potrebna je za rast tumorskih stanica. Tretiranjem pacijenata s enzimom asparaginazom, jedan je od postupaka kemoterapije. Popratni dijagram pokazuje aktivnosti dva pripravka asparaginaze. Koji bi pripravak bio bolji kemoterapeutik?

Pripravak 1. ima veću Vm, ali pripravak 2. ima veću aktivnost kod koncentracija supstrata koji su u okolišu. Kod koncentracija koje su u okolišu enzim 2. ima veću aktivnost budući da enzim 2. ima manju KM za supstrat i za koncentracije koje su manje od KM1, enzim 2 već postiže svoju Vm i razgrađuje asparagin konstantnom brzinom dok to enzim 1. još dugo neće moći postići.

13. Napravljena je kinetika monosupstratnog enzima pri čemu su korištene tri različite koncentracije enzima, a koncentracije istog supstrata u sva tri mjerenja bile su identične. Koji od navedenih dijagrama (Lineweaver –Burk) opisuje gore navedenu kinetiku?

Dijagram b).

Identičan je enzim pa su KM vrijednosti jednake za tri različite koncentracije enzima.

Kako je Vm= k2[ET], jasno je da će i Vm za različite koncentracije biti različite.

14. Za reakciju kataliziranu enzimom u odsutnosti i prisutnosti nekog inhibitora prikupljeni su slijedeći podaci:

a) Koristeći Lineweaver-Burkov prikaz odredite tip inhibicije.

b) Veže li se inhibitor na E, na kompleks ES ili na oba?

15. Maksimalna brzina enzimske reakcije nekog enzima u prisustvu 200 M supstrata i 500 M inhibitora iznosi Vmax = 22 mol/L min, uz Km od 47 M. Izračunaj % inhibicije u slučaju :

a) kompetitivne inhibicije

b) nekompetitivne inhibicije

Za oba slučaja KI iznosi 300 M.

Kompetitivna inhibicija

Nekompetitivna inhibicija

16.

b)