laporan mikro fiiiiiixxx.docx
Post on 06-Feb-2016
249 Views
Preview:
TRANSCRIPT
LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )
Laporan pewarnaan gram
A. Tujuan
Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
a. Mahasiswa mampu membuat sediaan untuk pewarnaan sederhana
b. Melakukan proses pewarnaan sederhana
c. Mengamati bentuk bakteri pada preparat di bawah mikroskop
B. Dasar Teori
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut
juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkain pengecetan. (Jimmo, 2008) Zat warna
dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri
dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam
atau basa
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna
khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal
terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion
positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer,
1998).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang
mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat,
intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang
sudah menyerap zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna
terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi
suatu spesies (dwidjoeseputro, 1994)
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi DUA, yaitu :
1. Pewarnaan negatif
Pada pewarnaan ini merupakan pewarnaan tidak langsung karena yang
di warnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakerinya sendiri tidak
mengalami pewarnaan. Zat warna yang di gunakan adalah nigrosin.
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua
jenis pewarnaan.
a. pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina.
3. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu
di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
4. Pewaranaan spora/ flagel
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan
diri terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang
sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba
dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua mikroorganisme itu
berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak
menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh
dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh
semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu
membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi
sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya,
terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di
maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:
1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan
sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran)
protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah
terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik
atau dengan bahan kimia.
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih
mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan
lebih sukar dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa
tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat,
lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat
warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel
asidofil, basodill dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat
kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif
karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas
dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan
yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah
mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan
zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan
warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat
warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk
memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama
(Sutedjo, 1991).
PEMBAHASAN
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan
pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan
pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di
antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia
seperti sabun, formalin, fenol.
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada
praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah
ini.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda
tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas
dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang
berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.
Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme
pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes
sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas
gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan
(fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air
sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya
bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri
dijaga agar tidak terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine
pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh
bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan
hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar
pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada
pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu
mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak
berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%
gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil,
protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine
tidak tercuci)
gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar,
protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-
iodine tercuci)
Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30
detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur
secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.
Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya,
selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades
hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke
pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat
warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam
waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke
yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat
(efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap
akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air
bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak
tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah
pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop.
Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan
jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri
gram negatif.
Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan
Tabel prosedur pewarnaan gram
(Pradhika, 2008)
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu
ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan
negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri
karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan
inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat
dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat
pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah
methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada
umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya
mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel
sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi,
2010).
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.
Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram
negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya
yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa
atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).
Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri
sampel A memiliki warna merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B
memilki warna ungu (gram positif).
1. Escherichia coli
Gambar E. coli dengan perbesaran 1000 x
Klasifikasi ilmiah
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : E. coli
Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada air
WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada
saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang berarti bahwa bakteri ini
bersifat gram negatif.
Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli
hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem
pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada
strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan
penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus),
infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada
level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan
dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk
menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena
bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam
penanganannya (Fajriana, 2008).
Infeksi E.coli O157:H7 yang patogen pada manusia yaitu yang bersifat
verotoksigenik yang telah menyebabkan 16.000 kasus penyakit melalui
makanan (Food Born Diseases) dan 900 orang meninggal per tahun di AS,
dengan perkiraan annual cost $ 200,000 hingga $ 600,000. Kejadian wabah
tunggal pada tahun 1993 di Western AS telah menyebabkan 700 orang
menderita sakit dan 4 orang meninggal (Sartika, 2005).
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan.
Berbagai macan tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromotofiknya bermuatan positif).
Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Pewarnaan
dasar dengan kromogen (zat warna) muatan positif disarankan selama asam
nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang
menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen perlu diperhatikan
lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarnaan yang digunakan.
Misalnya metilen blue terserap selama 2-3 menit, dengan demikian bakteri yang
terdapat pada sampel akan menyerap zat warna yang diberikan. Pengecetan
sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel
dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba
itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya
warna Kristal Violet.
Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang
berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.
Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme
pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat
pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran
zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol
memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut
kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas
dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik
yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen
dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.
Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau
bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga
warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel
berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna
lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna
tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk
mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan
reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,
gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna
ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna
merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh –
Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna
tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan
penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan
permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung
pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun
oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol
95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan
dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur
pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat
warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang
dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang
mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya
dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh
terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut
tampak biru (Hadioetomo, 1993)
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil pengamatan
Tabel hasil pengamatan pewarnaan dan cara-cara pewarnaan
No
Pewarnaan
Keterangan
1.
Pewarnaan sederhana
- Perbesaran 40 x 10
- Bentuk sel seperti batang yang biasa disebut basil
- Berwarna ungu
2.
Pewarnaan negative
- Perbesaran 40 x 10
- Bentuk sel seperti batang atau sering disebut basil.
- Berwarna ungu kemerah-merahan.
3.
Pewarnaan gram
- Perbesaran 40 x 10
- Bentuknya batang yang sering du sebut dengan basil.
- Berwarna merah dan sekitarnya berwarna orange.
4.
Pewarnaan spora
- Perbesaran 40 x 10
- Bentuk bakteri basil
- Sporanya berwarna hijau
- Mikrobannya berwarna orange
4.2 Pembahasan
Macam-macam pewarnaan yang di lakukan dalam praktikum tentang
cara-cara pewarnaan antara lain :
a. Pewarnaan sederhana
Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri
dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini hanya
menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih
dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna
yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau
safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam
(Sutedjo, 1991).
b. Pewarnaan Negatif
Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba
dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah
cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan
spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di
gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar
belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada
pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat
bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri,
karena bakteri praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan
lain, pewarnaan negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak
jelas. Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna
skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna
utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar,
2007).
c. Pewarnaan Gram
Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi
bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk
pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-
bakteri yang bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama
kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.
Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)
dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai
lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak
berwarna ungu.
Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna
utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai
oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri
tampak berwarna merah. Fungsi zat warna:
Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada
membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid
acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan
alkohol.
Lugol’s ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-
Ribonuclead acid.
Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.
Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks
mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif
(Pelczar, 2007).
d. Pewarnaan Spora
Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada
pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri
dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan
mengembangkan lapisan luar spora sehingga brwarna hijau. Melalui
pendinginan utama akan terperangkap didalam spora dengan pencucian zat
warna utama yang da pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan
yang kedua(safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna
malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi
kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).
Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang diamati
bulat lonjong memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini
identik dengan bakteri garam positif sebab bakteri yang di lihat dominan violet,
di dalam kolono ini juga terdapat spora yang berwarna hijau. Bakteri garam
positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat
sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat
warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.
Contoh bakteri garam positif yaitu: Bacillus subtilis, Stepcoccus sp lactis;
Staphylococcus aureus. Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya
mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur
dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop
sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Contoh bakteri garam negatif:
Corynebacterium diphteri,Eschercia coli dan Salmanela thypora (Sutedjo,1991).
Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif:
Bakteri garam negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
crystal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah
jika diamati dengan mikroskop. Disisi lain bakteri garam negatif seperti
Eschercia coli memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya
diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel
tebal berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan luarnya,
bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme
inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada
dinding gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan
lapis atau endotoksin). Disisi lain, bakteri gram positif akan berwarna ungu
perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang
berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram. Bakteri gram
negatif seperti Staphylococcus aureus (bakteri pathogen yang umumnya pada
manusia) hanya memiliki membrane plasma tunggal yang dikelilingi membrane
plasma tebal berupa peptidoglika sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun
atas peptidoglika sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikoat
(Pelczar, 2007).
Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi
kedalam endospora.
Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan
adapun faktor kesalahan sebagai berikut: Fiksasi yang kurang tepat dapat
mengakibatkan bakteri mati, Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat
memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan memperlambat proses
pengamatan, Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri
dapat menganggu struktur bakteri.
Percobaan praktikum kali ini menggunakan bakteri sebagai objek dalam
pewarnaan gram yaitu E. coli.Prosedur pewarnaan gram untuk bakteriE. coli
secara umum yaitu sampel ditaruh pada preparat dan difiksasi dengan pembakar
spirtus. Pemfiksasian dengan pembakar spirtus ini bertujuan untuk mematikan
tanpa mengubah struktur bakteri tersebut. Sedangkan untuk langkah
selanjutnya, preparat diberi larutan Gram A(kristal violet / ungu) dan didiamkan
selama 60 detik. Pemberian Gram A ini bertujuan untuk menguatkan warna
yang nantinya ditimbulkanbakteri. Selanjutnya, preparat diberi Gram B (Kalium
Iodida) dan didiamkan selama 60 detik. Didiamkan selama kurang lebih 60
detik mempunyai maksud agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih
kuat. Pemberian Gram B ini menyebabkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri semikn tinggi. Setelah kering, langkah yang selanjutnya, preparat diberi
larutan alkohol 95% dengan tujuan sebagai peluntur dan membuka pori - pori.
Langkah yang selanjutnya, preparat ditetesi safranin dan dibiarkan selama 45
detik. Pemberian safranin (Gram D) bertujuan untuk memperjelas pewarnaan
jika sel gram negatif maka menjadi warna merah tetapi jika sel gram positif
menjadi warna biru.Dibiarkan selama 45 detik agar bakteri yang catnya telah
luntur dapat terwarnai. Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat
dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar
warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna
sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru.Setelah semuanya selesai,
terakhir preparat diamati dibawah mikroskop(Pelczar, dkk, 1958).
Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa, Escherischia
colipada pewarnaan gram menghasilkan warna merah. Sehingga bakteri ini
termasuk dalam Gram negatif. Bakteri Escherichia coli berbentuk coccus
(bulat). Koloninya tersusun seperti rantai memanjang (Harley dan
Presscot,2002).
E.coli termasuk dalam famili Enterobacteriaceae yang masuk bakteri Gram
negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. Colimemiliki bentuk yang
bervariasi dari bulat hingga batang pendek. Bakteri ini ada yang soliter, namun
ada juga yang tampak berkumpul atau berpasangan.E. coli hidup dalam jumlah
besar di usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi, pada saat strain baru dari
E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan
sindrome diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada
level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. E.coli banyak digunakan dalam teknologi
rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-
gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki
pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Radji,2012).
Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tebal dan
ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding sel bakteri Gram
negatif akan menyerap zat warna tersebut namun ketika diberi alkohol, kristal
violet pada Gram negatif menjadi luntur disebabkan struktur dinding selnya
yang sebagian besar tersususun oleh lipid, sehingga ketika diberi zat warna,
kedua dinding sel bakteri Gram negatif akan menyerapnya kembali sehingga
hasil pewarnaan bakteri Gram negatif berwarna merah (Radji,2012).
Karakteristik
Gram positif
Gram negative
Dinding sel
Homogen dan tebal (20-80 nm serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan.
Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.
Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya membran
luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida
Bentuk sel
Bulat, batang atau filament
Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau filamen;
beberapa mempunyai selubung atau kapsul
Reproduksi
Pembelahan biner
Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
Metabolisme
Kemoorganoheterotrof
Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
Motilitas
Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus
(petritrichous)
Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus
(lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
Anggota tubuh (apendase)
Biasanya tidak memiliki apendase
Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Endospora
Beberapa grup dapat membentuk endspora
Tidak dapat membentuk endospore
Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan
(mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh
alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap
mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak
terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol
dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Bakteri
gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan
kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol
sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif
mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan
bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek(Isro, 2008).
Hasil pewarnaan pada koloni bakteri yaitu berwarna merah karena merupakan
koloni gram negatif.Dan bakteri yang terbukti berwarna ungu karena tergolong
ke dalam koloni gram positif (Isro, 2008).
KESIMPULAN1. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram
negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri
b. Fiksasi
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
2. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan
dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika
diamati di bawah mikroskop.
4. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan
dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di
bawah mikroskop.
B. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna
merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan
gram positif.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D,1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Irawan, 2008. Teknik pewarnaan. Mikroba.http://wordbiology.wordpress.com.
Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11
November 2010
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-
positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :
Gramedia.
Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I.
Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok,
Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam
untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html.
11 November 2010.
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium
Mikrobiologi UNS.
Diposkan 25th October 2013 oleh Alex Kimia
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.
Dwijosapoetra, D. 1984. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta
Harley dan Presscot.2002.Laboratory Exercise in Microbiology.McGraw-Hill
Publisher.USA
Isroi. 2008. Aspergillus. http://gambar.mirasites.com/aspergillus.html. diakses
tanggal 4 april 2013
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di laboratorium.PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta
Novak, A et al. 2002. Characterization Candida albicans colony morfology
mutans and their hybrids vol 48. Departemen of microbiology university of
pecs. Hungary
Pelczar, M.J, and E.C.S, Chan. 1958. Microbiolgy. Mc Graw Hill Book
Company. New York
Radji, Maksum. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Fakultas
Farmasi Universitas Indonesia. Depok
Rahayu, Winiati Pudji. 2000. Aktivitas Antimikroba Bumbu Masakan
Tradisional Hasil Olahan Industri terhadap Bakteri Patogen dan
Perusak.Buletin Teknologi dan Industri Pangan, Vol. XI, No. 2.IPB
Sumarsih, Sri. 2003.Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Faperta UPN “Veteran”
Yogyakarta
Suryawina, A. 1986. Microbiology Air. Penerbit Alumni. Bandung
Syamsuri., I. 2000. Biologi 2000. Erlangga. Jakarta
top related