lekciju saraksts

Makromolekulu telpiskā struktūra un tās paredzēšana. DNS topoloģija. Proteīnu

struktūras paredzēšana, modelēšana un pielietojums farmakoloģijā

Lekciju saraksts

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 2

N.p.k. Datums Lekcijas temats

1. 15.09.2011Ievadlekcija. Prasības kursa apgūšanai un literatūras avoti. Bioinformātikas jēdziens. Kas ir bioinformātika un kāpēc tā biologiem vajadzīga? Bioloģija, statistika, informācijas tehnoloģijas un programmēšana kā bioinformātikas pamatelementi

2. 22.09.2011 Bioloģiskās informācijas veidi un apjoms. Genomu organizācija. Modernās genomu analīzes metodes3. 29.09.2011 Genomu evolūcija. Salīdzinošā genomika 4. 06.10.2011 Bioloģiskās informācijas datubāzes. Informācijas meklēšanas un iegūšanas sistēmas 5. 13.10.2011 Dažādu bioloģiskās informācijas datubāžu izmantošanas piemēri

6. 20.10.2011 Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču līdzības pamatprincipi. Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču pāru salīdzināšana. BLAST veidi

7. 27.10.2011 Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču līdzības pamatprincipi. Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču pāru salīdzināšana. BLAST veidi

8 03.11.2011 Nukleīnskābju un proteīnu daudzkārtējās salīdzināšanas metodes, to priekšrocības un pielietošanas nosacījumi. Datorprogrammas nukleīnskābju un proteīnu sekvenču daudzkārtējai salīdzināšanai

9 10.11.2011 Filoģenētika. Klāsteru un kladistiskās metodes filoģenētisko koku rekonstruēšanā Datorprogrammas nukleīnskābju un proteīnu sekvenču filoģenētiskajai analīzei

10. 17.11.2011 Seminārs un uzdevumu pārbaude par tēmām, kas saistītas ar informācijas meklēšanu datu bāzēs un sekvenču homoloģijas meklēšanu

11. 24.11.2011 Makromolekulu telpiskā struktūra un tās paredzēšana. DNS topoloģija. Proteīnu struktūras paredzēšana, modelēšana un pielietojums farmakoloģijā

12. 01.12.2011 Proteīnu struktūras paredzēšana, modelēšana un pielietojums farmakoloģijā. Genoma ekspresijas analīze. Transkriptomika. DNS čipi genomu polimorfisma analīzē. Gēnu ekspresijas ģenētika

13. 08.12.2011 Proteomika un sistēmu bioloģija. Tīklveida struktūras kā bioloģisko sistēmu dabiska sastāvdaļa.

14. 15.12.2011Seminārs un uzdevumu pārbaude par tēmām, kas saistītas ar filoģenētisko analīzi un proteīnu sekundārās struktūras paredzēšanu. Bioinformātikas perspektīvas. Bioinformātika kā priekšnosacījums modernās bioloģijas apgūšanai

15. 22.12.2011 Eksāmens

Ko mēs varam apskatīt šajā kursā?

• Vienkārša proteīnu primārās un sekundārās struktūras analīze, proteīnu lokalizācija šūnā un transporta signāli

• Terciārās struktūras paredzēšana, homoloģijas modelēšana un struktūru salīdzināšana šajā kursā apskatīti netiks

• Meklējiet, piemēram, http://www.expasy.ch/ (Expert Protein Analysis System, Šveices bioinformātikas institūts)

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 3

EMBOSS Pepinfo/Pepwindow/Pepstats

• http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/pepinfo/• Pepinfo – grafiski attēlo dažādu aminoskābju grupu

izvietojumu proteīnu molekulā un hidropātijas profilus • Pepwindow – Kyte-Doolittle hidropātijas profils • Pepstats – informācija par molekulmasu, izoelektrisko

punktu, lādiņu, aminoskābju statistika un sadalījums grupās

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 4

Pepinfo/Pepwindow/Pepstats demonstrācija

• http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/pepinfo/ • Cilvēka kolagēna alfa 1 (IX) izoforma NP_001842

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 5

Struktūras paredzēšana

• Proteīnu datu bāzes (Swiss Institute of Bioinformatics Prosite, UniProt, ProDom, NCBI CDD u.c.)

• Proteīnu struktūras analīzes rīki (Scan Prosite, TMPred, Phobius, TargetP)

• Integrēti struktūras paredzēšanas saiti (PredictProtein, JPred3)

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 6

PredictProtein

• http://www.predictprotein.org/ • Interneta serveris proteīnu struktūras analīzei (nepieciešama

reģistrācija) • Rezultāti ietver daudzkārtēju sekvenču salīdzinājumu,

PROSITE sekvenču motīvus, kodola lokalizācijas signālus, paredzētu sekundāro struktūru, transmembrānu spirāles, disulfīdu saites, iekššūnas lokalizāciju u.c.

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 7

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 8

PredictProtein rezultātu piemērs

• Proteīna statistika • Paredzētā sekundārā struktūra • Paredzētie transmembrānu rajoni • Zemas kompleksitātes rajoni • Proteīna lokalizācija • Disulfīdsaišu veidošana • PSI-BLAST rezultāts

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 9

PROF sekundārā struktūra

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 10

PROF sekundārā struktūra

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 11

PHD transmembrānu domēni

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 12

Disulfīdu saites

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 13

Prosite motīvi

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 14

GLOBE - globularitāte

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 15

Scan Prosite

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 16

ProDom domēnu rezultāti

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 17

NCBI CDART analīzes rezultāti

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 18

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 19

http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 20

JPRED

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 21

Proteīnu lokalizācija šūnā

• TargetP http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

• Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools. Nature Protocols 2: 953-971

• Proteīnu funkcionālai raksturošanai svarīgi noteikt to lokalizāciju šūnā. To var noteikt gan eksperimentāli, gan paredzēt ar bioinformātikas palīdzību

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 22

Proteīnu lokalizācijas paredzēšana

• Proteīnu lokalizācija šūnā ir atkarīga no to aminoskābju sekvences. Pastāv (parasti N gala) signālsekvences, kas nosaka, ka proteīns tiks transportēts caur citoplazmatisko membrānu (sekretētie proteīni) vai arī uz mitohondrijiem, vai hloroplastiem

• Signālsekvencēm nav vienkāršas konsensus sekvences, bet analizējot lielu skaitu proteīnu ar raksturotu lokalizāciju, ir noteiktas to raksturīgās īpašības

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 23

TargetP

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 24

TargetP piemērs

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 25

Varbūtējs hloroplastu proteīns

Varbūtējs mitohondriju proteīns

Varbūtēji sekretēti proteīni

Proteīnu lokalizācijas paredzēšana

• TargetP • http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

• Piemērs – Arabidopsis thaliana RecA homologs, kas tiek transportēts uz mitohondrijiem (Q8RY99)

Khazi et al. (2003) An Arabidopsis homologue of bacterial RecA that complements an E. coli recA deletion is targeted to plant mitochondria. MGG: 269, 454-463

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas

katedra 26

Signālpeptīdu paredzēšana

• SignalP • http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 27

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 28

Sekretēta proteīna piemērs

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 29

Neural Networks

HMM

Transmembrānu domēnu paredzēšana

• Daudzi šūnas proteīni ir saistīti ar membrānām, piemēram, receptori, jonu kanāli un tmldz. Tiem ir kopīga hidrofoba alfa spirāles struktūra, kas šķērso plazmas membrānu

• http://www.psort.org – apkopotas saites uz dažādiem serveriem transmembrānu domēnu paredzēšanai

• TMHMM - http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 30

TMHMM

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 31

TMHMM – negatīvs rezultāts

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 32

TMHMM – pozitīvs rezultāts

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 33

PHOBIUS

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 34

http://www.ebi.ac.uk/Tools/phobius/

HvCNGC4 transmembrānu domēni

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 35

Proteīnu struktūra un farmakoloģija

• Medikamentu izveide, kas specifiski mijiedarbojas ar noteiktiem proteīniem, vai noteiktām šūnām

• Lai paredzētu kādi ķīmiskie savienojumi varētu saistīties ar proteīnu, nepieciešams zināt proteīna struktūru

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 36

Jaunam medikamentam jābūt:

• drošam;• efektīvam;• ķīmiski un metaboliski stabilam; • transportējamam uz noteiktu vietu organismā; • pieejamam vai nu no dabiskiem avotiem vai

ķīmiskās sintēzes ceļā; • jaunam – tas nozīmē patentējamam

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 37

Soļi jaunu medikamentu izveidē

• Jāsaprot slimības bioloģiskais pamats un simptomi – vai slimības cēlonis ir bioloģiskas (vīrusi, baktērijas), vai nebioloģiskas (toksīni) izcelsmes, vai arī tas ir mutācijas rezultāts

• Jānosaka mērķis uz ko koncentrēties medikamenta izveidē – bieži tas ir proteīns

• Jāiegūst priekšstats, kāda molekula varētu saistīties ar šo proteīnu. Varbūt jau ir zināms kāds savienojums vai inhibitors, kas var saistīties pie šī proteīna

• Jāidentificē “lead compound” – ķīmiskais savienojums, kuram potenciāli piemīt nepieciešamā bioloģiskā aktivitāte

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 38

Soļi jaunu medikamentu izveidē

• “Lead compound” pilnveidošana, tā atvasinājumu aktivitātes un efektu novērtēšana

• Pirmsklīniskās pārbaudes in vitro un in vivo uz dzīvniekiem• Klīnisko izmēģinājumu 1. fāze – veseli brīvprātīgie – efektivitāte,

droša doza u.t.t. • Klīnisko izmēģinājumu 2. fāze – brīvprātīgie pacienti – pierāda

efektivitāti slimības ārstēšanā • Klīnisko izmēģinājumu 3. fāze – lielāka pacientu grupa, randomizēti

“double-blind” testi • Jaunā medikamenta reģistrācija (piemēram, FDA) • Klīnisko izmēģinājumu 4. fāze – blakus efektu, efektivitātes

monitorings 2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas

katedra 39

Bioinformātika medikamentu veidošanā

• Mērķa izvēle – ar slimību saistīts proteīns, kuru ietekmējot varētu mazināt vai apgriezt slimības efektus

• “Lead compound” paredzēšana – proteīna mērķa ligandu izvēle

• Molekulārā modelēšana – liganda saistības pie mērķa proteīna modelēšana

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 40

Antivielas kā medikamenti

• Aizvien plašāku pielietojumu medicīnā gūst monoklonālās antivielas

• Antigēnu epitopu paredzēšana un monoklonālo antivielu izveide pret noteiktiem proteīniem/proteīnu rajoniem

• Antivielu stabilitātes nodrošināšana un transports uz noteiktām organisma vietām

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 41

Genoma ekspresijas analīze. Gēnu ekspresijas ģenētika. Proteomika

un sistēmbioloģija

Genoma ekspresijas analīze

• DNS -> RNS -> Proteīns • Genomika • Proteomika • Transkriptomika• Proteīni ir tie, kas nodrošina šūnas funkcionēšanu, bet

relatīvo proteīnu sastāvu un daudzumu šūnā ir grūti noteikt • mRNS daudzums korelē ar proteīnu daudzumu • Pastāv metodes ar kurām var noteikt visu genomā esošo

gēnu ekspresijas līmeni noteiktos audos

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 43

Gēnu ekpresijas analīze

• Northern blots, kvantitatīvā reālā laika PCR, DNS čipi

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 44

DNS čipu veidi

• Makro čipi, piemēram, neilona membrānas ar saistītu cDNS vai BAC DNS

• Mikro čipi: - “spotted arrays” – DNS (cDNS, PCR vai oligonukleotīdi) uzpilināti uz stikla slaidiem (šķidruma pārneses roboti, tintes printeru tehnoloģija)- sintezētie čipi – oligonukleotīdi tiek sintezēti uz stikla slaida virsmas (Affymetrix)

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 45

DNS čipu pielietojums

• Gēnu ekspresijas pētījumi – transkriptomika • Jaunu RNS veidu identifikācija • Genoma polimorfismu identifikācija

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 46

cDNS makro čips

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 47

cDNS čips

• cDNS fragmenti uz stikla slaida • RNS zondes iezīmētas ar Cy3 (zaļa) un Cy5

(sarkana) fluorescentām krāsām • Iespēja izgatavot pašiem savus cDNS čipus

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 48

cDNS čipi

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 49

Oligonukleotīdu čipi

• “Spotted” oligonukleotīdu čipi – 60 – 80 bp gari oligonukleotīdi uznesti uz stikla slaidiem

• In situ sintezētie oligonukleotīdu čipi – Agilent garo oligonukleotīdu čipi Affymetrix 25 bp oligonukleotīdu čipi

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 50

Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

2011 gada 1. decembris

Gēnu ekspresija profilēšana

AAAAAA

AAAAAA

R e v ers e tr a n s c r ip tio n , d sD N A s y n th e sis ,

tra n s c r ip tio n /la b e l lin g F ra g m e n ta tio n o f th e cR N A

in v itro***

******

******

****** ******

*****

**

** **

**

*** ** *

*

*

probeset1

probeset2

***

************

******

*********

*** ***

************

******

*** ******

***

SCRI...

0.01

0.1

1

10

100

0.01

0.1

1

10

100

Norm

alize

d in

tens

ity (l

og sc

ale)

Control Drought Low_nitrate Salt Waterlog

51

Čipu izgatavošanas fotolitogrāfijas process

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 52

http://www.affymetrix.com/about_affymetrix/outreach/lesson_plan/downloads/student_manual_activities/activity3/activity3_manufacturing_background.pdf

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 53

Nukleīnskābju hibridizācija

2011 gada 1. decembris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 54