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Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos para la vigilancia epidemiológicade difteria por laboratorio
P á g i n a 1/61 Difteria-RNLSP
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
DE DIFTERIA POR LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP
2015
Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos
P á g i n a 2/61 Difteria-RNLSP
PRIMERA EDICIÓN, 2015
DIFTERIA-RNLSP
ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL PARA LA
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE).
TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY
© INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD
SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE DIFTERIA POR LABORATORIO” VERSIÓN NO. 01.
INDRE, 2015.
COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:
ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO DR. MANUEL MARTÍNEZ
BÁEZ.
FRANCISCO DE P. MIRANDA 177, COL. UNIDAD LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO
OBREGÓN C.P. 01480, MÉXICO, DISTRITO FEDERAL, TEL. (55)53-42-75-50
WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX
LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ
EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ
IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
P á g i n a 3/61 Difteria-RNLSP
SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ
SECRETARIA DE SALUD
DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD
DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS
DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS
COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD
LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS
DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA
COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO
DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD
LIC. RODRIGO REINA LICEAGA TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL
DR. NELLY AGUILERA ABURTO
TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO
LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN
DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES
DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
P á g i n a 4/61 Difteria-RNLSP
LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD
P á g i n a 5/61 Difteria-RNLSP
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
M EN C. BELÉN TORRES LONGORIA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
BIOL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
DRA. LUCIA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ
JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y
PERTUSSIS COORDINADORA DE LA RED PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIFTERIA
P á g i n a 6/61 Difteria-RNLSP
GRUPO DE TRABAJO
DRA. LUCIA ÁLVAREZ HERNÁNDEZ
JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y
PERTUSSIS
QBP. MÓNICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS
COORDINADORA TÉCNICA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS
BACTERIANAS Y PERTUSSIS
COORDINADORA DE LABORATORIO EN SIREVA II
IBI. PATRICIA GABINO NORIEGA
QBP. MARÍA DEL CARMEN HERRERA BAUTISTA
QPB. SUGEI JEANNETTE GÁMEZ CONTRERAS
IMI. JORGE MACEDO ESPAÑA
QBP. SUSANA JIMÉNEZ MORENO
TÉC. LAB. ENRIQUE HERRERA GONZÁLEZ
ADSCRITOS AL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y
PERTUSSIS
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO
ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
P á g i n a 7/61 Difteria-RNLSP
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE DIFTERIA POR
LABORATORIO
DGE-InDRE–RNLSP
2015
P á g i n a 8/61 Difteria-RNLSP
Contenido
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 9
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA ..................................................................................................................... 9
ANTECEDENTES DE LA PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIFTERIA ...................... 10
MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ..................................................................... 12
DEFINICIONES OPERATIVAS ................................................................................ 13
OBJETIVOS ............................................................................................................... 15
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA DIFTERIA ................................................................................................................................... 16
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIFTERIA .. 17
TOMA, MANEJO, Y ENVÍO DE MUESTRAS .......................................................... 19
ESTÁNDARES DE CALIDAD ................................................................................... 29
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 32
ANEXO I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ................................................................... 34
ANEXO II. PRUEBAS DIFERENCIALES DE CATALASA Y OXIDASA .................. 48
ANEXO III. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS ............................................................................. 50
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INTRODUCCIÓN
La difteria es una enfermedad infectocontagiosa, que afecta exclusivamente al
hombre, causada por los efectos de una toxina que produce y libera
Corynebacterium diphtheriae, la puerta de entrada de este microorganismo es por
vía aérea. Clínicamente la sintomatología se presenta de 2 a 7 días después de la
infección, manifestándose en vías respiratorias altas; faringe, nasofaringe y con
menos frecuencia en piel, conjuntivas, órganos genitales y heridas. La toxina tiene
la característica de que se puede diseminar por vía sanguínea, se caracteriza por la
presencia en faringe de una o varias placas de tipo membranoso, color gris y
adherentes, con inflamación a su alrededor que se extiende a nasofaringe y la
tráquea provocando problemas obstructivos. Las corinebacterias son
microorganismos ampliamente distribuidos en el medio ambiente como son el
suelo, agua, piel y mucosas de otros mamíferos, además del hombre. Por lo tanto es
relativamente frecuente la presencia de cepas de Corynebacterium diphtheriae no
toxigénicas y aún toxigénicas en individuos sanos. Es por ello que la confirmación
por laboratorio de un caso con sospecha clínica de difteria no se puede limitar solo
al aislamiento del bacilo con características morfológicas y aún bioquímicas
compatibles con las corinebacterias, se requiere además la demostración de la
capacidad toxigénica de la cepa aislada.
El bacilo diftérico es resistente a la desecación y sobrevive por semanas en
superficies contaminadas por secreciones o gotas de saliva de los enfermos. Se
establece fácilmente en las vías respiratorias de individuos, incluso de los que
presentan inmunidad natural o artificial a la toxina.
Por otra parte la infección por el microorganismo puede ser atípica, por lo que se
recomienda la búsqueda de portadores de C. diphtheriae entre los contactos
cercanos del paciente, así como el muestreo de ropas de cama del enfermo para
confirmar la presencia de bacilos toxigénicos. Esto es especialmente crítico cuando
debido a la gravedad del paciente, el clínico no puede retrasar el tratamiento con
antimicrobianos, lo cual puede dificultar el diagnóstico bacteriológico del caso.
El propósito del siguiente lineamiento es el de establecer las directrices para la
toma, manejo y envió de muestras para el diagnóstico por laboratorio de difteria de
una forma estandarizada, estableciendo los flujos de información adecuados de los
datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia epidemiológica.
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE
SALUD PÚBLICA
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de
laboratorios de vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han
permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de
resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de
P á g i n a 10/61 Difteria-RNLSP
recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia
epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de
decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de
laboratorio en muestras biológicas.
La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez” (InDRE) su órgano rector
en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial
Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está
conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32
entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en
16 redes de vigilancia específica.
ANTECEDENTES DE LA RNALSP PARA EL DIAGNÓSTICO DE
DIFTERIA
El Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) y Pertussis,
inició desde hace 3 décadas, como parte de su marco analítico instrumentó el
diagnóstico de la difteria en México a partir del estudio de casos probables de
difteria y sus contactos, hace aproximadamente 33 años.
Hoy en día la RNLSP en coordinación con el laboratorio de IRAB y Pertusis está
capacitada para la toma y manejo de muestras para el diagnóstico de difteria y
solo están capacitados para realizar el cultivo bacteriológico; Guanajuato e
Hidalgo.
El InDRE lleva a cabo el diagnóstico bacteriológico, así como abastecimiento del
medio de transporte de PAI a los laboratorios de la red ante la sospecha de un caso
probable o en situación de brotes, y les proporciona los reactivos y materiales
necesarios para el diagnóstico y la toma de muestra cuando así sea requerida.
Todas las cepas sospechosas de Corynebacterium diphtheriae aisladas en los
laboratorios a través de la red se envían al laboratorio de IRAB y Pertusis del
InDRE como referencia.
Brotes de difteria estudiados por el InDRE
Desde la década de 1980 en el país se han presentado casos de difteria con una
periodicidad anual. El laboratorio de IRAB y Pertussis del departamento de
bacteriología del InDRE en coordinación con la Dirección General de
Epidemiología, confirmaron más de una decena de brotes ocurridos entre 1985 y
1991, los casos se presentaron principalmente en zonas con clima tropical y
subtropical.
P á g i n a 11/61 Difteria-RNLSP
LA DIFTERIA EN MEXICO de 1985 al 2010
Brotes de difteria estudiados por el INDRE
1985-2010
En el siguiente cuadro se presentan las zonas y las fechas de los brotes de difteria
que fueron estudiados por el InDRE durante el periodo de 1985 a 2010.
Figura 1.- Brotes de difteria estudiados por el InDRE (1985-2010). Tomado de “La Difteria en México: Epidemiología y Diagnóstico .Publicación técnica del INDRE
No. 17
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Cuadro 1.- Brotes de Difteria estudiados por el INDRE durante el periodo 1985-
2010
MARCO LEGAL DEL LABORATORIO
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF
05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139
y 141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia
epidemiológica. DOF: 19/02/2013.
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección
ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-
clasificación y especificaciones de manejo.
5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos.
Casos Contactos Total
YUCATAN AGOSTO, 1985 4 82 1 1 2
SINALOA Y NAYARIT SEPTIEMBRE, 1986 12 194 2 4 6
SINALOA Y NAYARIT ENERO, 1987 1 92 1 4 5
GUERRERO AGOSTO, 1987 1 129 1 2 3
SINALOA FEBRERO, 1988 1 8 1 0 1
CD. VALLES SLP SEPTIEMBRE, 1988 1 30 1 0 1
CD. VALLES SLP MAYO, 1989 1 31 1 0 1
B. APIZA MICHOACAN MAYO, 1989 1 309 0 6 6
EL ROSARIO, SINALOA JULIO , 1989 1 112 0 0 0
ARTEAGA, CAMPECHEAGOSTO, 1989 1 129 0 0 0
TAMAZUNCHALE, SLP 0CTUBRE, 1991 1 68 0 0 0
LAZARO CARDENAS, MICH.0CTUBRE, 1991 1 371 1 5 6
CAMPECHE FEBRERO, 2004 2 0 0 0 0
EDO. MEXICO MARZO, 2004 1 75 0 0 0
QUERETARO JUNIO, 2004 1 0 0 0 0
CD. VALLES, SLP FEBRERO, 2010 1 10 0 0 0
CHETUMAL, Q .ROO MARZO, 2010 1 10 0 0 0
PACHUCA, HGO JUNIO, 2010 1 8 0 1 1
SAN LUIS POTOSI JULIO, 2010 1 25 0 0 0
TEPIC, NAYARIT SEPTIEMBRE,2010 1 5 0 0 0
CONTACTO POSITIVO A Corynebacterium ulcerans toxigénico
Cepas toxigénicas aisladasNo. De Casos
No. De
ContactosLUGAR FECHA
P á g i n a 13/61 Difteria-RNLSP
7. Norma Oficial Mexicana, NOM-031-SSA2-1999, Para la atención a la salud
del niño.
8. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial
de la Federación el 19 de enero de 2004, última reforma publicada DOF 10
de enero de 2011.
9. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial
de la Federación DOF: 12/12/2013.
10. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación,
DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx.
11. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
12. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de
la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública DGE-InDRE-RNLSP,
2014.
13. Manual para la toma, envío y recepción de muestras para Diagnóstico. DGE-
InDRE-RNLSP, 2014.
14. Manual de la Evaluación del Desempeño “Caminando a la Excelencia”,
México, DGE-InDRE-RNLSP, 2014.
15. Lineamientos del Sistema de Reconocimiento a la Competencia Técnica de
Laboratorios que apoyan a la Vigilancia Epidemiológica. DGE-InDRE-
RNLSP, 2014.
16. Lineamientos para la Gestión de Riesgo Biológico. DGE-InDRE-RNLSP,
2014.
17. Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.
DEFINICIONES OPERATIVAS
Definición operativa de caso
Definición clínica: Paciente que presenta una enfermedad aguda de las
amígdalas, faringe, nariz y se caracteriza por una o varias placas grisáceas
adherentes confluentes e invasoras, con una zona inflamatoria circundante de color
rojo mate, dolor de garganta, aumento de volumen del cuello, fiebre, cefalea y
grado variable de compromiso del estado general. La enfermedad puede afectar
otras localizaciones como mucosas y piel.
Caso sospechoso de difteria: Toda persona de cualquier edad que presente
algún proceso infeccioso de vías aéreas superiores, o bien, lesiones de cualquier
tipo en piel.
Esta definición se utiliza exclusivamente durante la búsqueda de casos en un brote
o el estudio epidemiológico de un caso probable o confirmado. No deben ser
notificados a menos que pasen a la clasificación de probable o portador.
P á g i n a 14/61 Difteria-RNLSP
Caso probable de difteria: Todo caso sospechoso de cualquier edad que
presente infección de vías aéreas con presencia de placas blanco-grisáceas con dos
o más de las siguientes características: borde hiperémico, consistencia dura,
adherentes, fácilmente sangrantes, fétidas y dos o más de los siguientes síntomas:
Adenomegalias cervicales (cuello de toro)
Disfagia, odinofagia y/o disnea.
Fiebre
Malestar general
Estado tóxico infeccioso
Nota: Esta definición es el detonador del sistema de vigilancia, se utiliza ante el
reporte de casos, defunciones o durante la búsqueda activa de casos en las Redes de
Notificación; deberá ser aplicada también a todo cuadro con diagnóstico de difteria,
o bien, de angina de Vincent, mononucleosis infecciosa, candidiasis y estreptococia
o absceso peri-amigdalino grave.
Estos casos deben ser notificados de inmediato y realizar los estudios clínico y
epidemiológico correspondientes así como la toma de muestras del caso, sus
contactos y convivientes.
Caso confirmado de difteria: Todo caso probable al que se le agregue lo
siguiente:
Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae cepa toxigénica.
Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae toxigénico a partir de
convivientes, contactos, o personas con asociación epidemiológica con el
caso.
Asociación epidemiológica con otro caso confirmado.
Caso compatible de difteria: Todo caso probable de difteria en el que no se
logra identificar la etiología o que fallece o que se pierde durante su seguimiento y
no se dispone de estudios de laboratorio.
La clasificación de un caso como compatible representa una falla en la vigilancia
epidemiológica del evento.
Caso de difteria cutánea: Toda persona de la cual se aísle Corynebacterium
diphtheriae toxigénica de alguna lesión en la piel, en ausencia de infección
aparente en vías aéreas u otro sitio, y tenga o no manifestaciones de la enfermedad.
Portador asintomático: Toda persona en la que se identifique Corynebacterium
diphtheriae toxigénica y no presenta signos o síntomas de la enfermedad.
Caso descartado de difteria: Todo caso probable en el cual se demuestra otra
etiología, o bien todo caso probable en el cual las muestras de laboratorio son
negativas para Corynebacterium diphtheriae toxigénica y los resultados de sus
convivientes, contactos y personas con asociación epidemiológica son también
negativos.
P á g i n a 15/61 Difteria-RNLSP
OBJETIVOS
Objetivo general
Establecer las directrices para realizar la toma, manejo y envió de muestras para el
diagnóstico por laboratorio de difteria de una forma estandarizada, estableciendo
los flujos de información adecuados de los datos generados por el laboratorio en
apoyo a la vigilancia epidemiológica.
Objetivos específicos:
Generar y difundir los datos de laboratorio que contribuyan a la prevención
y control epidemiológico de la difteria.
Realizar el diagnóstico, control de calidad y referencia de C. diphtheriae y
otras corinebacterias toxigénicas mediante las técnicas de cultivo
bacteriológico.
Emitir los lineamientos para la operación de la toma de muestras y envío al
Laboratorio Estatal de Salud Pública (LESP) (Guanajuato e Hidalgo) o al
InDRE.
Desarrollar y evaluar la competencia técnica de los laboratorios de la RNLSP
P á g i n a 16/61 Difteria-RNLSP
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA DIFTERIA
Figura 2.- Estados con metodología implementada para la toma y manejo de
muestras para el diagnóstico por laboratorio de difteria.
P á g i n a 17/61 Difteria-RNLSP
Flujo de trabajo de la red nacional de laboratorios para el diagnóstico de la difteria
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIFTERIA
Funciones de los integrantes de la red nacional
Nivel nacional
El InDRE a través del Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas
y Pertusis es la institución de referencia para el estudio de la difteria al nivel
nacional y desempeña las siguientes funciones:
Llevar a cabo actividades de diagnóstico de difteria y diversos análisis, en
muestras de seres humanos, en apoyo a la vigilancia epidemiológica.
Participar en el desarrollo, estandarización, adaptación y validación de
técnicas y procedimientos de laboratorio, para las pruebas mínimas,
generales y especializadas.
InDRE (Nivel I)
Diagnóstico, referencia y vigilancia epidemiológica
Envío de información a Epidemiología
Control de calidad y Referencia Internacional CDC de Atlanta
Prueba de pirazinamidasa para la detección de cepas toxigénicas
Laboratorio estatal de salud pública (LESP)
(nivel II)
Toma de muestras y primo aislamiento para la búsqueda de colonias sospechosas
Corynebacterium diphtheriae
Envió del aislamiento al InDRE para su identificación final (referencia)
Tomar muestra de sangre (sueros pareados) para la determinación de anticuerpos y realizar diagnóstico
diferencial con otras patologías
Envió de las muestras en red fría con la información correspondiente al LESP
Unidad de salud de primer nivel
(Centros de Salud, J.S. Hospitales de
1er y 2° nivel) (Nivel II)
Toma de muestras en medio de transporte PAI o Loeffler, o AMIES
Toma de tejidos (pseudomembranas o biopsia de piel) en solución salina fisiológica estéril en tubo o contenedor
estéril
P á g i n a 18/61 Difteria-RNLSP
Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológica y
diagnóstico de la difteria a nivel nacional.
Realizar investigaciones seroepidemiológicas y bacteriológicas que permitan
conocer directa o indirectamente la prevalencia de la difteria en las
diferentes regiones del país.
Establecer el uso de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE, en
apoyo a la vigilancia epidemiológica de la difteria.
Capacitar al personal de los LESP (químicos, laboratoristas y auxiliares de
laboratorio), así como a los epidemiólogos en las diferentes técnicas,
procedimientos, toma y manejo de las respectivas muestras biológicas, para
el diagnóstico por laboratorio de difteria.
Establecer programas de supervisión para la red de laboratorios.
Elaborar y mantener actualizados los lineamientos, manuales de
procedimientos y técnicas de laboratorio para el diagnóstico por laboratorio
de difteria.
Organizar y participar en las reuniones científicas en las que se aborden
temas relacionados con el diagnóstico de difteria.
Coordinar el flujo de información de la RNLSP y notificar al órgano
normativo de vigilancia epidemiológica correspondiente, los casos
confirmados de difteria.
Nivel estatal
Está constituido por todos los LESP y sus funciones son las siguientes:
Participar en actividades de vigilancia epidemiológica mediante la
realización de pruebas mínimas y generales en el diagnóstico por laboratorio
de difteria.
Ser el centro de referencia de la red estatal de laboratorios locales de salud
pública.
Coordinar, asesorar y supervisar el procedimiento adecuado de la toma de
muestras, para el diagnóstico por laboratorio de difteria.
Participar en el diseño de los programas de vigilancia epidemiológica y de
diagnóstico por laboratorio a nivel estatal. Diseñar programas de capacitación para el personal de la red de laboratorios
locales concernientes a la toma, conservación y envió de las muestras
biológicas para el diagnóstico por laboratorio de difteria.
Notificar al órgano normativo correspondiente los casos sospechosos de
difteria.
P á g i n a 19/61 Difteria-RNLSP
Nivel local
Los laboratorios locales tienen las siguientes funciones:
Realizar la toma, manejo y transporte de muestras biológicas para el
diagnóstico por laboratorio de difteria.
Realizar las pruebas mínimas para el diagnóstico por laboratorio de difteria
en muestras humanas, que solo requieran de equipo básico para laboratorio.
Referir las muestras biológicas al LESP correspondiente.
Llevar a cabo la toma de muestras de los contactos de un caso probable o
sospechoso de difteria.
Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos
confirmados de difteria.
TOMA, MANEJO, Y ENVÍO DE MUESTRAS
Toma de muestras, condiciones de transporte, conservación y envío al
laboratorio estatal o nacional.
Las muestras sugeridas para el diagnóstico y búsqueda de C. diphtheriae son las
siguientes:
Exudado faríngeo
Exudado nasofaríngeo
Biopsia de pseudomembrana faríngea
Lesiones de la piel
Hemocultivo
Suero
Toma de muestra
Exudado nasofaríngeo
Introducir las tres cuartas partes del mango del hisopo, por la fosa nasal,
hasta topar con la nasofaringe, rotar suavemente el hisopo y sacarlo
lentamente, posteriormente depositarlo en el medio de transporte PAI,
Loeffler o AMIES.
Exudado faríngeo
Es una de las muestras recomendadas para el diagnóstico por cultivo de C.
diphtheriae, se sugiere tomar una parte de la pseudomembrana, si es que se
encuentra presente y debe ser depositada en el medio de transporte de PAI,
Loeffler o AMIES y si el transporte no excede de 24 horas, el tejido de la
pseudomembrana puede ser depositada en un vaso estéril con solución
salina fisiológica estéril, y posterior a ello sellarla perfectamente.
P á g i n a 20/61 Difteria-RNLSP
Biopsia de pseudomembrana faríngea
Es una de las muestras recomendadas para el diagnóstico por cultivo de
Corynebacterium diphtheriae. Se recomienda tomar una parte de la
pseudomembrana, si es que se encuentra presente. La pseudomembrana
debe ser depositada en cualquiera de los siguientes medios de transporte:
PAI, AMIES con carbón activado o medio de transporte de Loeffler o si el
transporte de la muestra no excede de 24 horas, el tejido de la
pseudomembrana puede ser depositada en un recipiente estéril con solución
salina fisiológica y sellarse perfectamente.
Biopsias
Las muestras para cultivo de tejidos se remiten de inmediato al laboratorio,
en un recipiente estéril con tapa adecuada.
Para la conservación y transporte de estas muestras se recomienda el medio
de PAI o de Loeffler, que son medios sólidos en tubo e inclinados.
Las muestras conservadas en formol no son adecuadas para el cultivo.
Lesión de la piel
Previo a la toma, se debe realizar una limpieza de la lesión con solución
salina estéril, si hay material endurecido o costra remover antes de la toma.
Presionar con firmeza el hisopo en el interior de la lesión e introducirlo en el
medio de transporte.
Para el diagnóstico de difteria cutánea, se toma una muestra de la lesión
cutánea y se deposita en solución fisiológica estéril, en medio de transporte
de PAI o de Loeffler.
El contenedor con la muestra se envía en red fría, sellado y rotulado, con la
especificación del tipo de muestra y de la localización.
Suero
La muestra de sangre se debe tomar antes del tratamiento con anti-toxina
diftérica o gammaglobulina.
Para obtener la sangre se debe de utilizar los tubos apropiados, pueden ser
tubos con tapones de gel, que permita separar los componentes de la sangre
después de la centrifugación.
No se debe de utilizar anticoagulante para la obtención de suero.
Después de la centrifugación realizar alícuotas del suero y conservarlas en
congelación a -20 °C.
Mantener una alícuota de las muestras que se procesarán a corto plazo, en
refrigeración hasta por ocho días. Si el proceso de la muestra excede de los
P á g i n a 21/61 Difteria-RNLSP
ocho días, estas deben congelarse. Es muy importante minimizar los ciclos
de congelación y descongelación de las muestras serológicas para evitar el
deterioro de los anticuerpos.
Las muestras de suero deben de venir perfectamente etiquetadas, así como
acompañadas con la información requerida en el Formato de estudio
epidemiológico de difteria.
Es muy importante que la primer muestra serológica sea tomada a partir de
las dos semanas de haber iniciado los síntomas y previo al tratamiento con
antitoxina diftérica, y la segunda muestra a las dos semanas de haberse
tomado la primera muestra.
Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio, resumen clínico
del paciente, así como los estudios de laboratorio que le hayan efectuado.
La falta de alguno de los documentos antes mencionados o las condiciones
inadecuadas de la muestra, causará el rechazo de la misma, y se notificará al
responsable del envío.
Manejo y envío
Transporte y conservación de las muestras:
a. El transporte de las muestras debe ser tan rápido como sea posible, en las
condiciones y temperatura adecuada, así como en los medios de transporte
apropiados.
b. Los medios de transporte sugeridos son: el medio de transporte de PAI o de
Loeffler, sin embargo también se puede emplear el medio de transporte de
AMIES que es un medio semisólido con carbón, aunque este último se
recomienda más para el transporte de cepas sospechosas de C. diphtheriae u
otras corinebacterias toxigénicas.
c. Una vez que la muestra se ha tomado e inoculado en los medios de
transporte de PAl o Loeffler el tiempo óptimo de transporte es de 6 a 8 horas
a temperatura ambiente, si el tiempo de transporte es mayor, entonces la
muestra debe ser transportada entre 2 a 8 °C, ya que después de este tiempo
las proteínas digeridas por esta bacteria, permiten el desarrollo de la flora
acompañante dificultando su aislamiento.
d. Si se utiliza el medio de AMIES, la muestra debe ser transportada entre 2 a 8
°C hasta su recepción en el laboratorio. Si el tiempo de transporte excede las
24 horas se sugiere que estos hisopos sean resguardados en empaques
especiales que contengan silica gel, se tienen reportes de recuperación de C.
diphtheriae, después de 9 semanas de haber sido tomada la muestra.
e. Las muestras serológicas deben transportarse en red fría, si el tiempo no
excede las 24 horas, pero si el tiempo de transporte es mayor debe de
enviarse en congelación.
P á g i n a 22/61 Difteria-RNLSP
Estas muestras se procesarán de acuerdo a los algoritmos mostrados en las figuras
3 y 4.
Información requerida:
La muestra debe de enviarse perfectamente etiquetada, señalando si es la primera o
segunda toma, en el caso de muestras serológicas se debe de enviar con el formato
único de envío de muestras del InDRE, resumen de la historia clínica y oficio de
solicitud de estudio.
La información mínima requerida se menciona a continuación y debe ser
recopilada durante la toma de la(s) muestra(s) y conforme se realiza el estudio
epidemiológico de caso:
Datos del paciente: Nombre completo, edad, género, lugar de residencia,
hospital de procedencia, nombre del médico tratante.
Datos de laboratorio: Tipo de muestra, fecha de la toma, tiempo de
transporte, etc.
Datos clínicos; síntomas, fecha de inicio, tratamiento con antibióticos,
antitoxina diftérica o gammaglobulina, fechas de inicio de los tratamientos
suministrados al paciente.
Datos epidemiológicos: Clasificación de caso, especificar si se trata de un
caso sospechoso, contacto o portador, historial de inmunización, datos de
asociación epidemiológica, contacto con granjas, animales de granjas, o
consumo de leche o derivados lácteos no pasteurizados, estos dos últimos
datos son requeridos si se sospecha de infección por C. ulcerans o C.
pseudotuberculosis; también se requiere de un listado de contactos
muestreados, toda esta información debe venir concentrada en el formato de
Estudio Epidemiológico de Difteria.
La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la
muestra son causa de rechazo temporal. El cual se le notificará al usuario y contará
con un periodo de siete días, para enviar la documentación complementaria o la
nueva muestra en las condiciones adecuadas, de no ocurrir así, se rechazará
definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.
Envío de los aislamientos sospechosos de C. diphtheriae y otras cepas
toxigénicas al laboratorio de referencia nacional.
Todos los aislamientos en los que se sospecha la presencia de corinebacterias
potencialmente toxigénicas; C. diphtheriae, C. ulceras o C. pseudotuberculosis,
aisladas del tracto respiratorio o de sitios cutáneos deben remitirse al Laboratorio
de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas y Pertussis del InDRE, para su
confirmación y para realizar las pruebas de toxigenicidad.1
P á g i n a 23/61 Difteria-RNLSP
Para la confirmación del diagnóstico de difteria por serología se deben enviar
muestras pareadas del suero del paciente, con una diferencia entre cada toma de
dos semanas, indicando la fecha de la toma de cada una de las muestras.
1 El Sistema Básico de Triple Embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia,
suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para
evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de
muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel
absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan
varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material
absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera)
tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C, si el tipo de muestra y
ensayo lo requiere. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de
orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío
(caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado
con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple
embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.
Material:
Los materiales requeridos para la toma y manejo de las muestras son:
a. Equipo de protección personal: bata, guantes, cubrebocas, lentes de
seguridad o goggles
b. Bolsas de plástico
c. Gradilla para colocar los tubos de ensayo
d. Hisopos de alginato de calcio, rayón o dacrón estériles, con mango flexible
de aluminio para los menores de 6 años y con mango de plástico, para
adolescentes y adultos.
e. Tubos con medio de transporte de PAI, Loeffler o AMIES.
Cuadro 2. Condiciones para la toma, manejo y envío de muestras para el
diagnóstico por cultivo y serología de la difteria.
Principales
entidades
clínicas Difteria Estreptococcia
Mononucleosis
infecciosa Candidiasis
Principales
agentes
etiológicos
Corynebacterium
diphtheriae
toxigénico,
raramente C.
ulcerans
Estreptococo
beta-hemolítico Virus del Epstein
Bar
Candida
albicans y
Candida no
albicans
P á g i n a 24/61 Difteria-RNLSP
Tipo de
muestra
requerida
Exudado faríngeo,
nasofaríngeo,
pseudomembrana,
tejido, hisopado de
lesión cutánea,
muestras pareadas
de suero
Exudado faríngeo,
nasofaríngeo,
pseudomembrana,
tejido, hisopado
de lesión cutánea,
muestras
pareadas de suero
Muestra pareada
de suero, con
diferencia de 15
días
Exudado
faríngeo
Material para
la toma de
muestra
Hisopos de
algodón, rayón o
dacrón, recipientes
herméticos y
estériles
Hisopos de
algodón, rayón o
dacrón,
recipientes
herméticos y
estériles
Tubos para
extracción de
sangre
Hisopos de
algodón,
rayón o
dacrón,
recipientes
herméticos y
estériles
Medio de
transporte PAI, Loeffler,
AMIES AMIES, Stuart No se requiere
Solución
salina
fisiológica
estéril
Tiempo
óptimo para la
toma y
transporte de
la muestra
En la fase aguda de
la enfermedad,
previo al
tratamiento
antimicrobiano. El
tiempo óptimo de
transporte es hasta
6 horas
En la fase aguda
de la enfermedad,
previo al
tratamiento
antimicrobiano. El
tiempo óptimo de
transporte es 24
horas
En la fase aguda
de la enfermedad
De 1 a 3 días
posteriores al
inicio de
cuadro
clínico. El
tiempo
óptimo de
transporte es
24 horas
Temperatura
de transporte
Temperatura
ambiente hasta 6 h,
si el tiempo de
transporte es mayor
a 6 h en red fría
En red fría En red fría En red fría
Técnicas de
laboratorio
Cultivo,
identificación
bioquímica (API
CORYNE)
determinación de
toxigenicidad (in
vivo o in vitro)
Cultivo,
identificación
bioquímica (API
strep)
Determinación de
grupo y
determinación de
antiestreptolisinas
en muestras
pareadas
ELISA
Determinación
de IgM e IgG
Examen
microscópico
y cultivo
Tiempo de
proceso para 7 a 12 días 4 a 5 días 48 a 72 h
Examen
microscópico
P á g i n a 26/61 Difteria-RNLSP
ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS
Estándar de servicio 15 días
Figura 3.- IRAB-M-10/0. Diagnóstico y Referencia de Corynebacterium
diphtheriae y otras especies e identificación de cepas toxigénicas a partir de
muestras clínicas.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEY OTRAS
ESPECIES E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS
Corynebacterium diphtheriae
Primoaislamiento sugestivo deCorynebacterium diphtheriae
Identificación bioquímicapositiva a C. diphtheriae
Prueba tamiz de producción detoxina (pirazinamida negativa)
Conservación a -70°C encaldo-glicerol al 30%
Pruebas de toxigenicidad positivasIn vivo (conejo o cobayo)
In vitro Eleck (inmunodifusión)
Se reporta positivo aDifteria
Muestras de exudado nasofaríngeofaríngeo y membrana faringeo
Pruebas desensibilidad
CLAVE - 1B153300
CLAVE - 1B1533003
P á g i n a 27/61 Difteria-RNLSP
ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Estándar de servicio 7 días
Figura 4.- IRAB-M-014. Demostración de anticuerpos anti-toxina diftérica o
tetánica por Hemaglutinación pasiva.
P á g i n a 29/61 Difteria-RNLSP
ESTÁNDARES DE CALIDAD
Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por el
laboratorio el InDRE define los siguientes estándares:
Estándares de evaluación de la calidad
Indicador Estándar Cálculo Acción Evaluación
Calidad de las muestras
90% de las muestras cumplen con los criterios de aceptación
(Muestras aceptadas/muestras recibidas) x 100
La define el laboratorio local o estatal. Puede ser capacitación dirigida u oficio de notificación
Cumplimiento del envío de muestras
Envío de las muestras con sospecha de Corynebacterium diphtheriae y otros Corynebacterium spp.
Muestras aceptadas en el InDRE/muestras informadas en el sistema de información en salud x 100
El laboratorio de referencia nacional enviará oficio de notificación
Para asegurar el diagnóstico de la vigilancia epidemiológica de difteria se deberán
cumplir los siguientes estándares de servicio, iniciando desde la fase pre analítica;
toma y manejo de muestras, seguido de la fase analítica en donde el éxito del
diagnóstico radica en la aplicación de la técnica adecuada en función de la
evolución de la enfermedad del paciente y la fase post- analítica en el cumplimiento
de los estándares de servicio en tiempo y forma.
Criterios de aceptación
Se aceptarán las muestras que cumplan con las definiciones operacionales de caso
para el diagnóstico de difteria: caso probable, caso sospechoso, caso atípico y
contacto, los cuales deberán de cumplir los siguientes criterios:
Estar registradas en el InDRE.
Deben ser transportadas en los medios adecuados y perfectamente
etiquetadas.
Ser de contactos para búsqueda de portadores tomadas dentro de los diez
primeros días, después de haberse iniciado el estudio de caso probable o
sospechoso.
Estar almacenadas a temperatura de refrigeración 4 a 8 °C.
Las muestras deberán de no exceder las 48 horas de transporte.
Cumplir los lineamientos del manual de toma y envío, editado por el InDRE.
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Criterios de rechazo
Se rechazarán las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales de
caso para el diagnóstico de difteria: caso probable, caso sospechoso, caso atípico y
contacto.
Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos: formato único de
envío de muestras biológicas del InDRE, copia del Formato de Estudio
Epidemiológico de caso de difteria.
Muestra de suero insuficiente (>200 microlitros), y que estén
indebidamente etiquetadas.
Muestras tomadas con un hisopo de algodón.
Muestras que excedan los dos días de tránsito.
Muestras derramadas.
Muestras que no estén etiquetadas.
Muestras enviadas a temperatura mayor de 8 °C.
Captura de datos y resultados
Captura de datos
Los datos que acompañan a la muestra en el formato único para el envío de
muestras biológicas del InDRE, en la historia clínica o en la solicitud
correspondiente son revisados y cotejados inicialmente por el personal del
departamento de recepción de muestras del InDRE.
En el caso de que las muestras o cepas enviadas no cumplan con las condiciones de
envío, se realiza el rechazo correspondiente, este dependerá de la calidad de la
muestra de acuerdo a lo estipulado en el formato de rechazo definitivo de muestras.
El formato de rechazo se entregará en el área de recepción de muestras, para que se
le informe al usuario, con la finalidad de que éste solucione el problema
administrativo o envíe otra muestra.
En el caso de que la muestra se aceptada se entrega al área correspondiente, para su
análisis.
Resultados
Los resultados emitidos por el InDRE deben cumplir con lo siguiente:
Ser legibles, sin errores de trascripción e informados a las personas
autorizadas para recibir y utilizar la información.
Tener anotado la fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando
esté disponible y sea pertinente para el cuidado del paciente, así como la
hora de recepción en el laboratorio.
Fecha y hora de la liberación del informe, las cuales si no están en el
informe, deben de estar fácilmente accesibles cuando sea necesario.
Datos de identificación de la persona que autoriza la liberación del informe.
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Si es pertinente, se proporcionarán los resultados originales y los corregidos.
Firma de la persona autorizada que verifica o libera el informe.
P á g i n a 32/61 Difteria-RNLSP
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas color. 5a ed. Ed Panamericana.
2003 pp. 416-424 y 651-664.
2. Efstratiou A, Engler KH, Mazurova IK, Glushkevich T, Vuopio-Varkila J and
Popovic T. Current Approaches to the Laboratory Diagnosis of Diphtheria. J
Infect Dis 2000; 181(Suppl 1):S138–45.
3. Efstratiou A, Roure C and Members of the European Laboratory Working
Group on Diphtheria. The European Laboratory Working Group on
Diphtheria: A Global Microbiologic Network. J Infect Dis 2000; 181(Suppl
1):S146–S151
4. Chima J. Ohuabunwo, MBBS, FWACP; Kristine M. Bisgard, DVM, MPH;
Popovic T; Wharton M, in VPD Surveillance Manual, Chapter 1, Diphtheria,
3 rd. Edition, Centers for Disease Control, 2002.
5. Efstratiou A, PAC Arce. Manual para el diagnóstico de laboratorio de la
difteria. Copenhague: Programa Ampliado de La inmunización en la Región
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7. Efstratiou A, RC George. Laboratory guidelines for the diagnosis of
infections caused by Corynebacterium diphtheriae and C. ulcerans.
Commun Dis Public Health 1999: 2(4): 250-7.
8. Stephen J, Pietrowski RA. Diphtheria toxin. In: Bacterial toxins, 2d. Edition.
Washington DC: American Society for Microbiology, 1986 pp 25-30.
9. Frobisher, M Jr Cystine-tellurite agar for C. diphtheriae. J. infect Dis 1937,
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10. Inserto del Sistema de identificación de bacterias corineformes api®
Coryne, Referencia 20 900, bioMérieux SA. Año 2009/2010, español, pp 1-
4.
11. Secretaría de Salud. Manual de procedimientos estandarizados para la
Vigilancia Epidemiológica de la Enfermedades prevenibles por vacunación.
Secretaría de Salud, Subsecretaria de Prevención y Promoción a la Salud,
Dirección General Adjunta de Epidemiología Septiembre de 2012: 109-121.
12. Infecciones Respiratorias Agudas 2012., SINAVE/DGE/salud/notificación
semanal de casos nuevos de enfermedades semana 52 2012.
13. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal
medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012.
14. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol.
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15. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of
Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
P á g i n a 33/61 Difteria-RNLSP
16. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories – 5th ed. CDC-NIH; 2009.
17. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory
biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011.
18. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva:
WHO Press; 2004.
P á g i n a 34/61 Difteria-RNLSP
ANEXO I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
Técnicas para el aislamiento de Corynebacterium diphtheriae:
Cultivo
Para aislar C. diphtheriae se aprovecha su capacidad para crecer en medios de
cultivo a base de proteínas coaguladas como albúmina bovina, o de huevo, por lo
que se recomienda el empleo de este tipo de medios que favorecen el desarrollo de
las corinebacterias. Si la muestra sospechosa se inocula en medios como el de PAI y
de Loeffler y se incuba por 6 a 8 horas, la flora acompañante es inhibida,
facilitando la proliferación de C. diphtheriae, pero si se prolonga la incubación, esta
flora se multiplica rápidamente y dificulta el aislamiento del microorganismo.
Estos medios se emplean por lo general para el transporte de la muestra biológica.
Otra característica de las corinebacterias que puede facilitar su aislamiento es su
capacidad para reducir el telurito de potasio. C. diphtheriae crece en medios con
esta sal y forma colonias grises o negras. No es la única bacteria que lo hace pero sí
se reduce notablemente el número de especies que se desarrollan en estas
condiciones. Una vez recibida en el laboratorio se debe de resembrar en los medios
específicos y selectivos para el aislamiento como agar sangre cistina telurito, este
medio contiene 0.3% de telurito de potasio, que sirve para inhibir el desarrollo de
muchas especies bacterianas de la flora normal del tracto respiratorio superior.
También para el primo-aislamiento se puede utilizar el medio de Tinsdale que es
un medio selectivo para el crecimiento de Corynebacterium diphtheriae.
Identificación presuntiva de C. diphtheriae y C. ulcerans
Los medios mínimos necesarios para realizar una identificación presuntiva de
corinebacterias toxigénicas son agar sangre de carnero al 5% (ASC), agar sangre
telurito de potasio, medio de Tinsdale y pruebas bioquímicas para pirazinamidasa,
hidrólisis de la urea (ureasa) hidrólisis y la reducción del nitrato. En el laboratorio
los criterios que se deben de informar para un aislamiento presuntivo C.
diphtheriae y C. ulcerans son los siguientes:
Bacilos Gram positivos.
Catalasa positivo.
Urea negativo para C. diphtheriae, positivo para C. ulcerans.
Nitrato positivo excepto el biotipo var belfanti
Pirazinamidasa negativo.
Cistinasa negativo.
Las pruebas de pirazinamidasa y cistinasa son útiles para diferenciar entre
las especies potencialmente toxigénicas y otros corineformes.
Si no se dispone de pruebas de detección rápidas (enzimáticas), se recomienda
utilizar las pruebas bioquímicas convencionales.
P á g i n a 35/61 Difteria-RNLSP
Estos microorganismos, catalasa positiva, se someten a las pruebas de
fermentación de la glucosa, sacarosa, almidón y se determina su actividad
hemolítica para confirmar la especie C. diphtheriae y su variedad (ver cuadros 3 y
4). Para la fermentación de glucosa, sacarosa y almidón se utiliza el caldo rojo de
fenol o base de CTA, con los substratos al 1%.
Las características bioquímicas de las corinebacterias potencialmente toxigénicas
son cuatro biotipos: C. diphtheriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis y otras
bacterias corineformes que pueden encontrarse en la garganta o en una herida. Las
características bioquímicas se describen en el cuadro 3. Las corinebacterias no
toxigénicas que se han encontrado con mayor frecuencia son C. amycolatum, C.
pseudodiphtheriticum y C. striatum.
Cuadro 3.- Identificación bioquímica de las corinebacterias de importancia clínica Especie CYS PYZ Nitrato Urea Glucosa Maltosa Sacarosa Glucógeno
C. diphtheriae Var gravis + - + - + + - + Var mitis + - + - + + - - Var intermedius + - + - + + - - Var belfanti + - - - + + - - C. ulcerans + - - + + + - + C. pseudotuberculosis + - - + + + - - C. amycolatum - + V V + V V - C. imitans - +/- - - + + +/- - C. pseudodiphtheriticum
- v + + - - - -
C. striatum - + + - + - V -
P á g i n a 36/61 Difteria-RNLSP
Cuadro 4.-Características de las variedades de Corynebacterium diphtheriae Existen equipos comerciales para la identificación de C. diphtheriae, C. ulcerans y
con una adecuada precisión. El API Coryne (BioMerieux, Francia) fue el primer kit
comercial que fue lanzado en el año de 1991 y está siendo utilizado periódicamente
por los laboratorios de Referencia Internacional como los del Reino Unido y del
CDC de Atlanta EEUU.
La identificación de C. diphtheriae, por este sistema es confiable y es una excelente
alternativa en caso de no contar con los métodos convencionales.
Pruebas de toxigenicidad de las cepas aisladas
Una vez aislado el microorganismo es necesario cultivarlo en un medio libre de
hierro para determinar la toxigenicidad de la cepa, ya que incluso bajas
concentraciones de este elemento son capaces de inhibir la producción de toxina.
La capacidad toxigénica de las cepas se puede determinar por dos tipos de pruebas
de laboratorio: una in vivo, de gran sensibilidad, que se puede realizar en conejo o
en cobayo y otra in vitro, que es en cultivo celular o en caja de Petri. La prueba in
vivo puede ensayarse con diversas variaciones, la recomendada es en conejo, el
cual se inocula por vía subcutánea con un extracto del cultivo en estudio.
Posteriormente es protegido con antitoxina diftérica endovenosa y de nuevo es
inoculado a los 20 a 30 minutos más tarde en un sitio cercano a la primera
inoculación. Se busca la presencia de una zona dermonecrótica en el lugar de la
primera inoculación, en contraste con el aspecto sano o no necrótico del segundo
sitio inoculado después de la aplicación de la antitoxina. Es recomendable que las
cepas ensayadas tengan más de 48 horas de incubación, ya que la toxina se produce
en la fase de crecimiento estacionario.
P á g i n a 37/61 Difteria-RNLSP
La prueba in vitro se basa en la formación de un precipitado de complejos antígeno
anticuerpo en un agar nutritivo sin hierro. El agar se vacía en una caja de Petri que
contiene una tira de papel filtro impregnada con antitoxina diftérica (500 UI/mL),
al solidificarse se siembra en la placa las cepas de manera transversal como se
colocó el papel con la antitoxina. Se incuba durante 72 horas a 37 °C y dos días más
en refrigeración. Se forman líneas visibles en un ángulo de 45° con respecto a la tira
de papel filtro y la estría de cultivo.
Figura 6. Diagrama de flujo para el aislamiento e identificación de
Corinebacterias toxigénicas.
Equipo y reactivos requeridos
Material
Asa bacteriológica
Mechero bunsen
Tira de papel filtro
Jeringa
Tijeras
Marcador de tinta indeleble
CT
ASC
Prueba de catalasa
A las colonias formadas
porbacilos Gram positivos
Inocular la muestra en agar
Sangre de carnero (ASC)
y agar cistina telurito (CT)
Exudado de faringe
Nasofaringe ó piel
Medios de transporte
de PAI, Loefflero AMIES
Tinción de Gram
Selección de colonias con base en su
Morfología colonial en medio
Cistina telurito
Purificar las
colonias
seleccionadas (de 5
a 10 de cada
morfotipo
diferente)
Pruebas bioquímicas
fermentación de:
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Almidón, Ureasa, y Red. NO3 Pruebas de toxigenicidad
In vivo (conejo)
In vitro (Eleck)cultivo en medio
con baja conc.
de Fe.
DIFERENCIACION DE ESPECIES
BIOQUIMICA CONVENCIONAL SISTEMA API CORYNE
Prueba de
pirazinamida
(4 horas)
Negativa Positiva
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
Corynebacterium diphtheriae toxigénico
P á g i n a 38/61 Difteria-RNLSP
Portaobjetos
Hoja de resultados
Ficha técnica
Equipo
Incubadora con rango de temperatura de 35 a 38 °C
Refrigerador con un rango de temperatura de 4 a 6 °C
Cámaras de incubación
Reactivos
Antitoxina diftérica de 500 UI/mL
Caldo Infusión cerebro corazón más maltosa al 0.3%
Colorantes y reactivos para la tinción de Gram
Medio de Loeffler o PAI
Medio de agar sangre-cistina telurito al 0.03%
Medio de Elek
Tubos con 0.25 mL de pirazinamida
Galerías API Coryne
Ampollas API G Medium
Ampollas Suspensión Medium de 3mL
Programa informático de identificación API WEB™ Anywhere
NIT 1, + NIT 2
ZYM A
ZYM B
PYZ
Aceite de parafina
Peróxido de hidrógeno
DENSIMAT o Ampolla de McFarland tubo número 6
Peróxido de hidrógeno diluido 1:10 vol/vol
Sulfato ferroso de amonio al 20%
Procedimiento analítico
A. Aislamiento de Corynebacterium diphtheriae (Fig. 6)
1. Sembrar las muestras o cepas en medios de PAI o de Loeffler y se incuban a
temperatura ambiente durante 6 a 8 h. En estos medios la flora
acompañante retrasa su crecimiento favoreciendo el desarrollo de
Corynebacterium diphtheriae y otras Corinebacterias, pero si la incubación
se prolonga la flora se multiplica rápidamente dificultando el aislamiento de
la bacteria.
P á g i n a 39/61 Difteria-RNLSP
2. Resembrar el crecimiento obtenido en el medio de transporte, en agar
sangre-cistina telurito (ASCT) y agar sangre de carnero al 5% (ASC),
utilizando el método de estría cruzada para aislar colonias, incubar a 37 °C
durante 24 a 48 h, el microorganismo crece formando colonias de color gris
o negras en ASCT.
3. A partir de las colonias de color gris o negras de 1 a 3 mm de diámetro,
preparar un frotis y teñir por la técnica de Gram.
4. Si las colonias seleccionadas están formadas por bacilos Gram positivos
frecuentemente se observan en empalizada, realizar la prueba de catalasa,
(ver anexo II).
5. Las características bioquímicas de las variedades de C. diphtheriae que
pueden estar asociadas a casos de difteria se muestran en los cuadros 3 y 4.
Diferenciación de especies
Pruebas bioquímicas convencionales
Estos microorganismos catalasa positivos se someten a las pruebas de
fermentación de la glucosa, sacarosa, almidón y se determina su actividad
hemolítica para confirmar la especie C. diphtheriae y su variedad (ver cuadro 3).
Para la fermentación de glucosa, maltosa, sacarosa y almidón se usa caldo rojo de
fenol, con los carbohidratos al 1%.
1. Los medios se incuban en aerobiosis a 35 °C, se examinan diariamente y se
descartan si no hay cambio hasta las 72 horas.
2. Tomar una colonia sospechosa bien aislada e inocular de forma masiva en
una placa de ASC incubarla de 24 a 48 h a 37 °C.
3. Si se utilizan la galería API Coryne desarrollar el siguiente procedimiento.
Sistema api®Coryne (Fig. 6)
Preparación de la Galería
1. Colocar en la base de la cámara de incubación aproximadamente 5 mL de
agua destilada o desmineralizada, llenando todos los pozos de la cámara,
para crear una atmósfera húmeda.
2. Rotular la lengüeta de la parte lateral de la base de la cámara con el número
de registro de la cepa.
3. Sacar una galería de su envase individual y colocarla en la cámara de
incubación.
P á g i n a 40/61 Difteria-RNLSP
Preparación del inóculo
4. Abrir una ampolla de API Suspensión Medium.
5. Con ayuda de un hisopo de rayón o dacrón cosechar el crecimiento de la
placa de ASC; utilizar cultivos jóvenes de 24 a 48 horas de incubación.
6. Realizar una suspensión de turbidez mayor al tubo No. 6 del nefelómetro de
McFarland; la cuál debe ser utilizada inmediatamente después de su
preparación.
Inoculación de la galería
7. En las once primeras pruebas de la galería (desde NIT a GEL) repartir la
suspensión evitando la formación de burbujas, inclinando la cámara de
incubación hacia adelante y colocar la punta de la pipeta sobre el lateral de
la cúpula.
8. Se inoculan de 100 a 150 L de la suspensión desde las pruebas de NIT a
ESC Para la prueba de URE llenar únicamente el tubo.
Para la prueba de GEL llenar el tubo y la cúpula.
Para inocular las últimas nueve pruebas de la galería (pruebas desde 0 a
GLYG): Abrir una ampolla API GP Medium y transferir el resto de la
suspensión original (Aproximadamente 0.5 mL) y homogenizar bien.
Repartir esta nueva suspensión en los tubos únicamente.
9. Llenar las cúpulas de las pruebas marcadas con URE, 0 a GLYG con aceite
de parafina formando un menisco convexo.
10. Cerrar la cámara de incubación.
11. Incubar las galerías por 24 horas (± 2 horas) a 36 ± 2 °C en aerobiosis.
12. Después de la incubación, agregar los reactivos:
Prueba NIT: una gota de NIT 1 y una gota de NIT 2
Prueba PYZ: una gota de PYZ
Pruebas PyrA, PAL, βGUR, βGAL, αGLU, βNAG: Una gota de ZYMA
y ZYMB.
Lectura de la galería
13. Esperar 10 minutos y después leer todas las reacciones consultando el
cuadro 5.
P á g i n a 41/61 Difteria-RNLSP
NEGATIVO POSITIVO
incoloro
rosa muy pálido
rosa intenso
rojo
incoloro
marrón muy pálido
naranja muy pálido
marrón
naranja
incoloro
naranja pálido naranja
PAL 2-naftil-fosfato 0.0244 Fosfatasa Alcalina
incoloro
beige-púrpura pálido
naranja pálido
púrpura
βGURácido-naftol-ASBI-
glucurónico0.0548 β-GlucURonidasa
incoloro
gris pálido
beige pálido
azul
βGAL 2-naftil-βD-
galactopiranosida0.0312 β-GALlactosida
incoloro
beige-púrpura pálido púrpura
∝ GLU2-naftil-αD-
glugopiranosida0.0308 α-GLUcosidasa
incoloro
beige-púrpura pálido
verde pálido
púrpura
βNAG1-naftil-N-acetil-βD-
Glucosaminida0.0348 N-Acetil-β-Glucosaminidasa
incoloro
beige-púrpura pálido
marrón- pálido
gris pálido
marrón
ESCEsculina citrato
férrico
0.546
0.078β-Glucosidasa (ESCulina)
incoloro
grisnegro
URE urea 0.76 UREasaamarillo
naranja
rojo
rosa
GELgelatina (origen
bovino)0.6 Hidrolisis (GELatina)
sin difusión del
pigmento negro
difusión del pigmento
negroO Testigo negativo - Fermentación
GLU D-glucosa 1.56 Fermentación (GLUcosa)
RIB D-ribosa 1.4 Fermentación (RIBosa)
XYL D-xilosa 1.4 Fermentación (GILosa)
MAN D-manitol 1.36 Fermentación (MANitol)
MAL D-maltosa 1.4 Fermentación (MALtosa)
LACD-lactosa (origen
bovino1.4 Fermentación (LACtosa)
SAC D-sacarosa 1.32 Fermentación (SACarosa)
GLYG glicógeno 1.28 Fermentación (GLIcógeno)
ausencia de burbujas presencia de burbujas
TABLA DE IDENTIFICACIÓN
H2O2 (3 %) / 1 minCATalasa -(ensayo ESC o GEL )CAT
rojo amarillo
naranja amarillo-anaranjado
ZYM A + ZYM B(PyrA → βNAG) / 10 min
PYRAácido piroglutámico-
β-naftilamida0.0256 PIRolidonil Arilamidasa
NIT 1 + NIT 2 / 10 min
NIT nitrato potásico 0.136 reducción de NITratos
PYZ / 10 min
PYZ pirazina carboxamida 0.56 PiraZinamidasa
ENSAYOS COMPONENTES
ACTIVOS
CANT
(mg/cúp.)REACCIONES/ENZIMAS
RESULTADOS
Cuadro 5. Identificación api®Coryne
Si fuera necesario, exponer la galería bajo una lámpara de 1000 W durante 10
segundos para decolorar el exceso de reactivo en los tubos PyrA al βNAG.
Figura 7.- Pruebas positivas y negativas con cepas de referencia para las galerías
apiCoryne.
P á g i n a 42/61 Difteria-RNLSP
14. Anotar todas las reacciones en la hoja de resultados.
Figura 8.- Hoja de resultados del Sistema api®Coryne
15. Interpretación: la identificación se obtiene a partir del perfil numérico.
16. Determinación del perfil numérico:
En las hojas de resultados, las pruebas están separadas en grupos de
tres y se asigna para cada uno un valor 1, 2, o 4. Sumando en el
interior de cada grupo los números que corresponden a reacciones
positivas, se obtienen 7 cifras que constituyen el perfil numérico, a la
reacción de la catalasa que constituye el ensayo No. 21, le
asignaremos el valor 4, cuando resulte positiva.
17. Identificación. Se realiza a partir de la base de datos (V3.0).Esta se realiza
por medio de un software de identificación apiweb™.
P á g i n a 43/61 Difteria-RNLSP
18. Introducir manualmente con el teclado el perfil numérico de 7 cifras y
validar
Automáticamente el sistema arroja el resultado de la identificación con el
porcentaje de concordancia correspondiente.
P á g i n a 44/61 Difteria-RNLSP
Prueba de la pirazinamidasa (Fig. 6)
La prueba de pirazinamida es una prueba rápida que nos permite diferenciar las
corinebacterias patógenas (C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis y C. ulcerans) de
otras especies de corinebacterias.
Procedimiento
1. Distribuir 0.25 mL de solución de pirazinamida en tres criotubos estériles.
2. Preparar una suspensión densa, a partir de un cultivo puro crecido en agar
sangre. Preparar suspensiones densas para los controles positivo y negativo
en los otros dos criotubos.
3. Incubar a 37 °C por 4 horas o toda la noche.
4. Después de la incubación adicionar una gota del reactivo PYZ (sulfato
ferroso de amonio 20%) a cada suspensión.
Pruebas de toxigenicidad (Fig. 6)
1. Para determinar la toxigenicidad, cultivar las colonias catalasa positivas en
un medio libre de iones fierro (BHI más maltosa al 0.3%), ya que, aún a
bajas concentraciones de este elemento pueden inhibir la producción de
toxina.
2. La producción de toxina se puede determinar por dos tipos de pruebas de
laboratorio: una in vivo que se realiza en conejo o en cobayo, y otra in vitro o
prueba de Eleck que se efectúa en caja de Petri.
P á g i n a 45/61 Difteria-RNLSP
Procedimiento in vivo.
1. A partir de un cultivo puro de Corynebacterium diphtheriae (muestra
problema) y dos cepas control (positivo y negativo), se inoculan estas por
separado en un tubo con 10 mL de caldo BHI más maltosa al 0.3% (pH 7.8 a
8.0) y se incuba a 35 °C por 72 h.
2. Rasurar el dorso y los flancos de un conejo blanco (Nueva Zelanda) o de un
cobayo de pelaje claro. Después de eliminar el pelo, se marcan en la piel
cuadros de 2 cm2 (mínimo 3 cuadros por ambos lados del dorso) con un
marcador de tinta indeleble.
3. Con una jeringa graduada en décimas de mililitro, y aguja de 1 cm, calibre
24, se toma de 1 a 2 mL del cultivo en caldo a probar.
4. Se inocula al animal con 0.2 mL de caldo por vía intracutánea en un cuadro
de cada lado. El cuadro siguiente al sitio de la inoculación, se utiliza para
inyecciones de los testigos positivo y negativo. Se mantienen refrigeradas las
jeringas que contienen el resto de las suspensiones en caldo.
5. Cinco horas después de las inoculaciones, se administran al animal 500 UI
de antitoxina diftérica por vía intraperitoneal si se usó cobayo, o en la vena
marginal de la oreja si fue un conejo.
6. Después de 30 minutos, con el contenido de la jeringa que se guardó en
refrigeración se inoculan 0.2 mL de caldo de cultivo por vía intracutánea en
el cuadro inmediatamente debajo del sitio de la prueba.
7. Las lecturas preliminares se hacen a las 48 h y las lecturas finales a las 96
horas.
Procedimiento in vitro (Prueba de Elek)
1. En 10 mL de agar virulencia KL (Difco), precalentado a 55 °C en baño maría,
se añaden 2 mL de suero estéril de conejo y 1 mL de telurito de potasio al
0.3%.
2. Con una pipeta, se transfieren 10 mL de medio a una placa de Petri y se
mezclan bien, rotándola unas 20 veces.
3. Antes de que el medio solidifique, se coloca una tira de papel de filtro de 1
por 8 cm saturada con antitoxina diftérica (diluida hasta contener 100
unidades de antitoxina/mL).
4. Se deja solidificar el medio y la placa se coloca en la incubadora con la tapa
entreabierta para que se evapore la humedad superficial.
5. La placa se inocula durante las primeras 2 h de haberse secado, con un
cultivo de 24 h de una cepa conocida de C. diphtheriae productora de toxina,
trazando con el asa una estría en forma perpendicular a la tira de antitoxina.
De igual modo se inocula una cepa control negativa.
6. Los cultivos problemas desconocidos se siembran igual en estrías paralelas a
las de los cultivos testigo.
P á g i n a 46/61 Difteria-RNLSP
7. Se incuba la placa durante 24 a 48 h a 35 °C.
Los resultados de la identificación bioquímica y de la producción de toxina se
anotan en la libreta de registro cepas varias.
Interpretación de resultados
Control de calidad
El control interno del método se realiza a través de ensayos de repetitividad y
reproducibilidad, utilizando cepas de referencia trazables a las de American Type
Culture Collection (ATCC).
En bacteriología se incluyen controles internos con cierta periodicidad
dependiendo de las siguientes situaciones:
Cuando se emplea un lote de nuevos reactivos, colorantes y medios de
cultivo.
Cuando se empleé un nuevo equipo o kit comercial con la frecuencia que
indique el fabricante y con los controles que proporcione el equipo o kit de
prueba.
Interferencias: Cantidad de microorganismos presentes en la muestra, y/o
pureza de la cepa.
Intervalo biológico de referencia: Negativo a C. diphtheriae, C. ulcerans o C.
pseudotuberculosis
Intervalo reportable: Presencia (positivo) o ausencia (negativo) de C.
diphtheriae, C. ulcerans o C. pseudotuberculosis.
Positivo: Desarrollo y confirmación bioquímica de C. diphtheriae, C. ulcerans o C.
pseudotuberculosis a partir de aislamientos de muestras clínicas o cultivos puros.
Negativo: Ausencia de desarrollo de C. diphtheriae, C. ulcerans o C.
pseudotuberculosis.
Cepa no viable: Aplica para aquellas cepas enviadas para control de calidad o
referencia, que no desarrollan en los medios de cultivos inoculados a las 72 horas
de incubación.
Valores de alerta críticos: Presencia de Corynebacterium diphtheriae
toxigénico
P á g i n a 47/61 Difteria-RNLSP
Interpretación por el laboratorio
Bacilo Gram positivo
Catalasa positiva.
Urea negativa para C. diphtheriae, positiva para C. ulcerans
Nitrato positivo (excepto el biotipo var belfanti).
Pirazinamidasa negativa.
Cistinasa negativos (ver cuadro 3).
En caso de no haber desarrollo de colonias sugestivas de C. diphtheriae, C.
ulcerans, posterior a 72 horas de incubación, el cultivo se considera como negativo.
Medidas de bioseguridad
Se procede con base en las reglas básicas de seguridad correspondientes al nivel II
de bioseguridad que se especifican en el Manual de Bioseguridad editado por el
InDRE. Uso de equipo de protección personal (GABI-P-20).
Descartar todo el material desechable de acuerdo al procedimiento de manejo
interno de RPBI (GABI-P-05) manejo de punzocortantes GABI-I-04 que forman
parte del manual de bioseguridad del InDRE.
Fuentes de variabilidad
Etapa pre analítica
o La toma inoportuna y el manejo inadecuado de muestras son fuentes
potenciales de variabilidad.
Etapa analítica
o Los medios de cultivo y reactivos son fuentes potenciales de
variabilidad por ello se lleva a cabo el control de calidad con cepas de
referencia.
o La inadecuada interpretación de las pruebas confirmatorias
observación de aglutinación pueden generar resultados falsos
positivos, lo cual está directamente relacionado con la experiencia y
pericia visual del analista.
P á g i n a 48/61 Difteria-RNLSP
ANEXO II. PRUEBAS DIFERENCIALES DE CATALASA Y OXIDASA
Catalasa
Principio
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno. Es una hemoproteína de estructura similar a la hemoglobina,
excepto porque los cuatro átomos de hierro de su molécula están en el estado
oxidado (Fe³) en lugar del estado reducido (Fe²). Excepto los estreptococos, la
mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad
catalasa.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de oxidación
del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule,
resulta letal para las células bacterianas. La catalasa peróxido de hidrógeno en agua
y oxígeno según la siguiente reacción:
2 H2O2―――> 2 H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la
familia Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.
Reactivos
Peróxido de hidrógeno al 3% almacenado en botellas color ámbar.
Un cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo a probar.
Controles
El reactivo peróxido de hidrógeno se debe probar con microorganismos control
negativos y positivos, todos los días o inmediatamente después de probar bacterias
desconocidas.
Positivo: Staphylococcus aureus
Negativo: especies de Streptococcus ssp
Procedimiento
1. Con una aguja de inoculación o con un palillo de madera, transferir parte del
centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de
burbujas.
Interpretación
La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reacción
positiva. Debido a que algunas bacterias poseen enzimas distintas de la catalasa
que pueden descomponer el peróxido de hidrógeno, la observación de unas pocas
burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos no se considera un resultado
positivo. Además, los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tener cuidado de
no tomar eritrocitos junto con el material de la colonia.
P á g i n a 49/61 Difteria-RNLSP
Oxidasa
Principio
La prueba de oxidasa determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa, la
oxidasa cataliza la transferencia de iones de compuestos donadores a receptores,
generalmente oxígeno. El sustrato en esta prueba, para-fenilendiamina
dihidroclorada, actúa como un receptor artificial de iones, y cuando es oxidado,
forma un compuesto colorido, indofenol.
Empleando otro reactivo, el tetrametil, para- fenilendiamina dihidroclorada, que es
menos tóxico pero más caro, una pigmentación que varía del azul al morado.
Para-fenilendiamina dihidroclorada 0.1 g
Agua destilada 10 mL
Procedimiento:
1.-Tomar una asada del crecimiento bacteriano con asa de plástico o de platino o
con la punta de una pipeta Pasteur y colocarla en un papel filtro previamente
impregnado con el reactivo (dejar secar el papel antes de depositar el inóculo).
Usar como control positivo: Moraxella catarrhalis y como control negativo:
Escherichia coli
Observación:
No usar asa de níquel cromo para evitar un falso positivo
Lectura de la prueba: Una reacción positiva es cuando se desarrolla un color
púrpura en 10 segundos.
P á g i n a 50/61 Difteria-RNLSP
ANEXO III. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
PARA MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS
Medios de cultivo
Agar sangre de carnero al 5%
Agar cistina telurito
Medio Elek
Medio de transporte de AMIES
Medio de transporte de PAI
Caldo BHI con maltosa al 0.3%
Base de Caldo Rojo de Fenol con carbohidratos al 1%
Medio de Movilidad–nitritos
Urea de Christensen
Caldo Mueller-Hinton con sangre lisada de caballo
Agar bilis esculina
Caldo maltosa al 0.3%
1. Agar Sangre de Carnero (ASC) al 5%
El agar sangre de carnero se utiliza como un medio general de agar sangre, y sirve
para el aislamiento, cultivo y detección de la actividad hemolítica de los
estreptococos y otros microorganismos exigentes.
Fórmula aproximada en gramos por litro
Base de agar sangre 40 g
Sangre desfibrinada de carnero estéril 50 mL
Agua destilada 1000 mL
pH final de 7.3 +/- 0.2
Modo de Preparación:
1. Pesar 40 g de base de agar sangre (DIBICO) y disolver con 950 mL de agua
destilada como lo indican las instrucciones del fabricante y esterilizar a 15
libras de presión y 121 °C por 15 minutos.
2. Dejar enfriar el medio hasta aproximadamente 56 °C.
3. Adicionar 50 mL de sangre de carnero desfibrinada y mezclar.
4. Distribuir 25 mL del medio en placas Petri estériles de 15 mm x 100 mm.
5. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
6. Incubar para prueba de esterilidad.
7. Almacenar en refrigeración hasta su uso.
Control de calidad
P á g i n a 51/61 Difteria-RNLSP
Pruebe con una cepa de referencia cada nuevo lote de placas de agar sangre
preparado fresco, para el crecimiento y la reacción hemolítica.
Microorganismo de
referencia
Incubación
Resultado Tiempo
Temperatura
°C
Atmósfe
ra
Streptococcus
pyogenes 18-24 h 35-37 Aeróbica
Crecimiento
con
hemólisis
Staphylococcus
aureus 18-24 h 35-37 Aeróbica Crecimiento
Almacenamiento y caducidad
Almacenar de 2-8 °C por 30 días, lejos de la luz directa, no utilizar si hay
señales de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado. El
medio es sensible a la temperatura y a la luz, proteger de la humedad y el
congelamiento.
Precauciones
Es para uso diagnóstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y una
vez utilizado se descarta de acuerdo a la guía para manejo de los Residuos
Peligrosos Biológico Infecciosos (RPBI).
2. Agar Sangre Cistina Telurito (ACT)
Método para la preparación Agar Sangre Cistina Telurito empleado en el proceso
de aislamiento e identificación de Corynebacterium diphtheriae.
Fórmula por litro de agua destilada
Agar Infusión de cerebro y corazón 52 g
Telurito de potasio, solución al 0.3% 150 mL
L-Cistina 50 mg
Sangre de carnero 50 mL
Preparación del medio
1. Pesar 52 gramos de agar infusión cerebro y corazón y disolver con 800 mL
de agua destilada como lo indican las instrucciones del fabricante.
2. Esterilizar a 15 libras de presión, a 121 °C por 15 minutos.
3. Dejar enfriar entre 45 a 50 °C.
4. Mantener cuidadosamente esta temperatura mientras se realizan los
siguientes pasos.
P á g i n a 52/61 Difteria-RNLSP
Añadir en condiciones de asepsia la solución de telurito de potasio
(esterilizada antes en autoclave) y la sangre de carnero.
Mezclar y agregar la cistina en polvo, mezclar nuevamente y verter el medio
en placas de Petri estériles.
Nota: Agitar continuamente el matraz mientras se vierten en las placas de Petri ya
que la cistina no se incorpora totalmente a la solución.
Usos
El Agar Sangre Cistina-Telurito se utiliza para el aislamiento primario de
Corynebacterium diphtheriae. Posee ventajas en comparación con el medio de
Tinsdale, su preparación es sencilla y dura más. El telurito de potasio presente en el
medio inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias que normalmente habitan
el tracto respiratorio superior, incluida la mayor parte de las cepas de
Staphylococcus y Streptococcus.
C. diphtheriae se desarrolla bien y produce colonias grisáceas o negras después de
24 a 48 horas de incubación. En forma ocasional las colonias de estafilococo no
inhibidas aparecen de color gris; sin embargo pueden diferenciarse con la
coloración de Gram.
Se distinguen tres biotipos de C. diphtheriae en agar sangre cistina-telurito.
Las colonias tipo gravis, son planas de color gris oscuro, con estrías radiales,
secas y de bordes irregulares
Las colonias del biotipo mitis son pequeñas, negras, brillantes, y convexas
con bordes lisos y aspecto húmedo
Las del biotipo intermedius son pequeñas planas, con centro negro y
elevado. El medio se inocula por el método de estría cruzada.
Control de calidad
Microorganismo
de referencia
Incubación
Resultado Tiempo
Temperatura
°C Atmósfera
Corynebacterium
diphtheriae 24-48 h 35-37 Aerobia
Colonias
negras
Almacenamiento y caducidad
Las placas ya preparadas se pueden guardar a temperatura de 2 a 8 °C, lejos de la
luz directa, no utilizar si hay señales de deterioro, contaminación, proteger de la
humedad y el congelamiento.
Precauciones
Es para uso diagnóstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y una
vez utilizado se descarta como RPBI.
P á g i n a 53/61 Difteria-RNLSP
3. Medio de Elek
El medio de Elek se utiliza para determinar la toxicidad de Corynebacterium
diphtheriae in vitro.
Fórmula para preparar el medio base
Proteasa peptona 2.0 g
Agar bacteriológico 1.75 g
Cloruro de sodio Q. P. 0.25 g
Agua destilada 100 mL
Ajustar a pH = 7.8 y esterilizar a 15 lb/15 min
Fórmula aditivo o suplemento
Glicerina Q. P. 1.0 mL
Tween 80 1.0 mL
Bacto casaminoácidos 1.0 g
Agua destilada 100 mL
Preparación del medio
1. Mezclar el medio de cultivo en el agua destilada por agitación hasta perfecta
incorporación y esterilizar a 15 lb/15 min. Preparar una solución al 0.3% de
telurito de potasio y esterilizar a 15 lb/15 min.
2. Agregar el aditivo al 20% en el medio base y vaciar en placas de Petri, dejar
solidificar, colocar una tira de papel filtro impregnada con antitoxina
diftérica 500 UI, meter a prueba de esterilidad.
3. A veinte mililitros de aditivo se le agrega 80 mL de medio base, más 15 mL
de solución de telurito de potasio y por último se agrega un 1 mL de suero
fetal bovino al medio base.
Almacenamiento y caducidad
Las placas ya preparadas se pueden guardar hasta por 7 días a temperatura de 2 a 8
°C y hasta por 30 días lejos de la luz directa, no utilizar si hay señales de deterioro,
contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado, proteger de la humedad y el
congelamiento.
Precauciones
Es para uso diagnóstico, debe ser utilizado solamente por personal calificado y una
vez utilizado se debe de descarta como RPBI.
Preparación de tiras de papel filtro impregnadas con antitoxina diftérica
Procedimiento:
2. Recortar tiras de papel filtro de 8 cm x 0.5 cm.
P á g i n a 54/61 Difteria-RNLSP
3. Esterilizarlas en una caja Petri a 15 lb por 15 min.
4. Preparar una solución de antitoxina difteria a una concentración de 500
U.I/mL.
5. Impregnar con esta solución las tiras de papel filtro previamente
esterilizadas.
6. Dejar secar las mismas dentro de una caja Petri en la estufa.
7. Una vez secas sellar las cajas de Petri con parafilm
8. Guardar las tiras en refrigeración hasta el momento de su utilización.
4. Medio de transporte de Amies
Procedimiento:
1. Agregar 20 g del medio de transporte en 1000 mL de agua destilada.
2. Llevar a ebullición hasta la disolución completa del agar.
3. Distribuir 0.5 ml en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
4. Agitar para mantener el carbón en suspensión homogénea.
5. Enroscar totalmente los tapones de los tubos ya llenos.
6. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
7. Agitar los tubos mientras se enfría para distribuir el carbón de forma
uniforme.
8. Conservarlos en un lugar fresco.
5. Medio de transporte de Amies con carbón activado en tubo con
hisopo de dacrón o rayón estéril integrado, con envoltura
individual.
EUROTUBO DATALAB
Este medio de transporte es proporcionado por el fabricante listo para utilizarse.
6. Medio de transporte de PAI
Huevo 500 mL
Agua destilada estéril 250 mL
Glicerol estéril 60 mL
Material requerido:
Dos vasos de precipitados de un litro estéril
Una varilla de vidrio estéril
Gasa estéril
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca estéril
Huevos
1. Lavar el huevo con abundante agua y desinfectar con alcohol.
P á g i n a 55/61 Difteria-RNLSP
2. Abrir el huevo y depositar la yema y clara en un vaso de precipitados estéril.
Mezclar hasta homogenizar.
3. Colar el huevo a través de una gasa estéril y medir 500 mL de huevo.
4. Agregar en condiciones de esterilidad 250 mL agua destilada estéril, más 60
mL de glicerol y mezclar hasta homogenizar.
5. Distribuir 5 mL del medio en tubos de 16 x 150 mm estériles con tapón de
rosca.
6. Introducir los tubos al coagulador a una temperatura de 82 °C durante una
hora.
Nota: El coagulador se enciende desde un día antes para estabilizar la
temperatura entre 82 a 83 °C.
7. Incubar para prueba de esterilidad.
8. Almacenar en refrigeración hasta su uso. Si no es utilizado de inmediato el
medio ya preparado, colocarlo en bolsas de plástico y almacenarlo en
refrigeración por un tiempo máximo de 3 meses.
7. Caldo BHI con Maltosa al 0.3%
Caldo infusión cerebro corazón 37 g
Proteosa peptona 20 g
Maltosa 3 g
Agua destilada 1000 mL
1. Pesar 37 g de infusión cerebro corazón, 20 g de proteosa peptona, 3 g de
maltosa y disolver todos los componentes con 1000 mL de agua destilada
como lo indican las instrucciones del fabricante y esterilizar 15 libras a 121°C
por 15 minutos.
2. Dejar enfriar al medio ambiente.
3. Distribuir 10 mL de medio en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca de
16 x 100 mm.
4. Incubar para prueba de esterilidad.
5. Almacenar en refrigeración hasta su utilización.
Observación: Almacenarlo en refrigeración por un tiempo máximo de 2 meses.
8. Medio de movilidad nitritos
Los microorganismos pueden diferenciarse de acuerdo a su capacidad de
metabolizar ciertos sustratos. La capacidad de un microorganismo para reducir
los nitratos a nitritos es una característica importante que se utiliza para
identificar y diferenciar especies de muchos grupos; Neisseria, Moraxella,
P á g i n a 56/61 Difteria-RNLSP
bacilos Gram positivos aerobios, bacilos Gram negativos no fermentadores
entre otros.
Los microorganismos que reducen los nitratos tienen la capacidad de extraer
oxígeno de aquellos para formar nitritos y otros productos de reducción. La
presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado de α-
naftilamina y ácido sulfanílico, con formación de colorante rojo de diazonio,
el p-sulfobenzoato de α-naftiamina. La aparición de un color rosa a rojo
dentro de los 30 segundos después que se agregó un mililitro de los reactivos
A y B, indica la presencia de nitritos siendo la prueba positiva para la
reducción de nitratos. En caso de que no haya cambio de color agregar una
pequeñísima cantidad de polvo de zinc. La aparición de un color rosa a rojo
intenso indica que el nitrato ha sido reducido. En algunos casos el color
puede desaparecer de inmediato.
Uso
El medio de Movilidad-Nitratos se utiliza para la detección de motilidad y
reducción del nitrato.
Fórmula aproximada en gramos por litro
Caldo nutritivo Extracto de carne
Peptona de caseína
3 g
5 g
Agar agar 3 g
Agua destilada 1000 mL
Nitrato de potasio 1 g
pH final: 7.6 ± 0.1
Modo de Preparación
1. Disolver los ingredientes en 1000 mL de agua destilada y hervir hasta disolver.
2. Distribuir 3 mL del medio en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Esterilizar a 15 libras, 121 oC durante 15 minutos.
3. Dejar solidificar con los tubos en forma vertical a temperatura ambiente e
incubar para prueba de esterilidad.
4. Almacenar en refrigeración hasta su uso.
Control de calidad
Positivo: Escherichia coli, Moraxella catarrhalis
Negativo: Acinetobacter bawmannii, Streptococcus agalactiae
Almacenamiento y caducidad
P á g i n a 57/61 Difteria-RNLSP
Los tubos preparados y bien sellados se pueden guardar en un refrigerador a
temperatura entre 2 a 8 °C, y lejos de la luz directa hasta por 6 meses, no
utilizar si hay señales de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad
ha pasado, proteger de la humedad y el congelamiento.
Ácido sulfanílico y alfa naftilamina para nitritos
Solución A
Ácido sulfanílico 0.8 g
Ácido acético 5N 100 mL
Disolver por calentamiento suave
Solución B
Alfa-naftilamina 0.5 g
Ácido acético 5N 100 mL
Se puede utilizar también
NN, dimetil-1-naftilamina 0.6 g
Ácido acético 5N 100 mL
Disolver por calentamiento suave
Precaución:
El alfa-naftilamina es carcinogénico y en el caso de NN, dimetil-1-naftilamina no se
ha demostrado tal efecto hasta el momento, es por ello que se deben de manejar
con cuidado, evitar formar aerosoles, pipetear o el contacto con la piel o mucosas.
P á g i n a 58/61 Difteria-RNLSP
Pruebas bioquímicas para determinar especie y variedad de C.
diphtheriae y otras especies
Fermentación de carbohidratos
1. Base de Caldo Rojo de Fenol
Peptona de caseína 10 g
Cloruro de sodio 5 g
Rojo de fenol 18 mg
Procedimiento:
1. Pesar 7.2 gramos de Base Caldo Rojo de Fenol y disolver en 540 mL de agua
destilada.
2. Calentar a ebullición hasta su disolución completa.
3. Dejar enfriar y ajustar el pH a 7.4 ± 0.2
4. Repartir el volumen total en seis matraces, conteniendo cada uno 90 mL.
5. Cerrar y esterilizar a 15 libras durante 15 minutos.
6. Sacar de la autoclave y dejar enfriar.
7. Agregar 10 mL de cada uno de los carbohidratos, previamente disueltos y
esterilizados por filtración, en cada uno de los 6 matraces que contienen la
base de caldo y homogeneizar.
8. Ya incorporados los carbohidratos mezclar y vaciar en tubos de ensaye
estériles un volumen de 3 mL.
Este procedimiento se repite para cada uno de los carbohidratos que se deseen
preparar
Nota: los carbohidratos deben estar a una concentración final del 1%
Preparación de la solución de carbohidratos:
Los carbohidratos utilizados para la diferenciación de especies del género
Corynebacterium spp son los siguientes:
Dextrosa, maltosa, sacarosa, manitol, lactosa, xilosa, ribosa y almidón.
1. Pesar un gramo de cada uno de los carbohidratos a probar.
2. Disolver en 10 mL de agua destilada.
3. Recoger el volumen con una jeringa de 10 mL.
4. Esterilizar por medio de filtración directamente en el matraz que tiene la
base de caldo rojo de fenol ya esterilizada.
5. Realizar el mismo procedimiento para cada uno de los carbohidratos.
Nefelómetro de Mc Farland
Organizar una serie de tubos de ensaye nuevos, con tapón de rosca, numerarlos de
la siguiente forma; 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Llenar los tubos con una solución
P á g i n a 59/61 Difteria-RNLSP
de Cloruro de bario anhidro al 1% en solución acuosa, y una solución fría de ácido
sulfúrico P. A. al 1%(v/v) según el siguiente cuadro.
Preparación de la escala de Mc Farland
Tubo # 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2 1%
(mL) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
H2SO4 1% (mL)
9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0
Densidad Aproximada
de células (x 108/mL)
1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Densidad Aproximada
de células en
millones/mL
150 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
Para utilizar la escala de Mc Farland, se debe agitar cada tubo previamente para
que el precipitado de sulfato de bario se resuspenda, promoviendo que la turbidez
sea homogénea.
Control de calidad:
Se debe verificar que la turbidez de cada uno de los tubos sea correcta, utilizando
un espectrofotómetro con una absorbancia de 625 nm.
La lectura del tubo No 0.5 de la escala de Mc Farland debe de encontrarse entre
0.08 a 0.10
Almacenamiento: mantener los tubos bien cerrados y sellados, con una cinta
adhesiva, a temperatura ambiente en un lugar oscuro y renovar cada 3 meses.
2. Agar bilis esculina
*Fórmula aproximada por litro. (DIFCO)
Extracto de res 3.0 g
Peptona 5.0 g
Esculina 1.0 g
Bilis de buey 40.0 g
Citrato férrico 0.5 g
Agar 15.0 g
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
P á g i n a 60/61 Difteria-RNLSP
Para uso de laboratorio
Al recibirlo, se debe guardar a temperatura entre 2 a 30 °C
Modo de preparación
1. Pesar y diluir según lo que indique el marbete; o hacer una relación de
acuerdo al volumen requerido.
2. Mezcle bien, y caliente hasta hervir por no más de un minuto, agitando con
frecuencia para disolver por completo el polvo, hay que evitar calentar
demasiado.
3. Ajustar el pH final a 6.6 ± 2.0
4. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Procedimiento de envasado requerido por el laboratorio:
Cuando el medio esté a una temperatura entre 40 °C hay que dosificarlo en
condiciones de esterilidad en un volumen de 3 mililitros en tubos de 13 x 100 mm.
Colocarlos con una inclinación de 20 a 30° hasta que solidifique.
3. Urea de Christensen
Fórmula aproximada en gramos por litro
Peptona 1.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato mono potásico 2.0 g
Urea 20.0 g
Rojo de fenol 12.0 mg
Agar 15 g
Agua destilada 1000 mL
4. Ajustar el pH final a 6.8 ± 0.2
Algunas bacterias poseen la enzima ureasa que puede hidrolizar la urea con
producción de amoniaco de acuerdo a la siguiente reacción química:
Urea + 2H2O→CO2 + H2O +2NH3
El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio,
produciéndose alcalinización y aumento del pH del medio que se detecta por la
presencia de un indicador de pH en el medio.
Uso
El medio de urea se utiliza para determinar la capacidad de diferentes
microorganismos tanto Gram positivos y negativos para hidrolizar la urea debido a
la producción de la enzima ureasa.
P á g i n a 61/61 Difteria-RNLSP
Modo de preparación:
Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del medio de urea.
1. Disolver 29 g del polvo en 100 mL de agua purificada, mezclar bien y
esterilizar por filtración.
2. Suspender 15 g de agar en 900 mL de agua purificada.
3. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
4. Después de esterilizada la base, mezclar bien y dispensar en tubos de ensaye
estériles y colocarlos inclinados hasta su solidificación.
Control de Calidad:
Positivo: Proteus spp
Negativo: Escherichia coli
Almacenamiento y caducidad
Los tubos preparados y bien sellados se pueden guardar a temperatura entre
2 a 8 °C, y lejos de la luz directa hasta por 3 meses, no utilizar si hay señales
de deterioro, contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado, proteger
de la humedad y el congelamiento.
Reactivos para la prueba de pirazinamidasa para
Corynebacterium spp por el método de colindal
1. Solución de pirazinamida
Sigma, número de catálogo 7136
Preparar una solución de 2 mg/mL en agua destilada
Esterilizar por filtración utilizando una membrana millipore de 0.45 µm
Dispensar un volumen de 0.25 mL en tubos estériles
Almacenar a -20 °C
Cepas Control
o Control positivo: Corynebacterium xerosis
o Control negativo: Corynebacterium ulcerans
2. Reactivo PYZ; Sulfato Ferroso de amonio
Preparar una solución al 20% peso/volumen en agua destilada estéril
Almacenar a -20 °C
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