marcadores moleculares rodrigo rocha latado. marcadores fenotípicos características do organismo -...
Post on 17-Apr-2015
103 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Marcadores Moleculares
Rodrigo Rocha Latado
• Marcadores fenotípicosCaracterísticas do organismo - Ex. cor da pele, cor e tipo
de cabelo, presença de pelos, etc...
• Marcadores bioquímicosPresença ou ausência de compostos - Ex. isoenzimas,
proteínas ou de polissacarídeos específicos, etc...
• Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA -
Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas
USOS• Testes de paternidade
• Exames genéticos - aberrações cromossômicas ou SNP´s)
para Humanos, animais, plantas e microorganismos
• Causas forenses (criminais, patenteamento)
USOS• Estudos de fingerprinting
(impressões digitais) - Biochips de DNA
• Estudos básicos de genômica e proteômica
• Estudos ambientais (conservação de germoplasma, avaliação da diversidade genética)
USOS
• Estudos evolucionários e populacional
• Melhoramento animal e vegetal (seleção assistida, seleção de progenitores)
CLASSIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES
Classificação por Tipo de Técnica
• Métodos sem uso de PCR• RFLP• VNTR
• Métodos com uso de PCR– PCR com primers arbitrários
• RAPD, AP-PCR, DAF; • Polimorfismo de Tamanho de Fragmento Amplificado AFLP;• ISSR• TRAP
– PCR sítio-específico• CAPS, SCAR• SSRs (microssatélites)• TGGE, SSCP, DGGE
Classificação por Número de Cópias da Seqüência Alvo
• Seqüência de poucas cópias - codificante• RFLP
• Seqüência com cópias repetidas• VNTR• SSRs (microssatélites) • ISSR
• Seqüência com número de cópias indefinido • RAPD, AP-PCR, DAF;• AFLP;• CAPS, SCAR• TRAP
MARCADORES MOLECULARES PARA
MELHORAMENTO DE PLANTAS
• Sucesso no melhoramento de plantas depende da capacidade de distinguir fatores genéticos herdáveis, dos ambientais
• Marcadores genéticos são unidades herdáveis simples
marcadorescromossoma
• Polimorfismo de DNA é resultado do acúmulo de mutações– pontual ou inserção/deleção– macro-rearranjos: translocações, inversões,
deleções
Ex. magnitude mutações pontuais:• Gene Opaco-2 : 1.933 pares de bases• 14% das bases polimorfismo• 26 fenômenos de Inserção/Deleção
• Marcadores genéticos, quando associados a características de interesse, aumentam a eficiência de seleção
R cromossoma
População de São Paulo9.291.000 habitantes em 2.600.000 domicílios
Como achar alguém? E se fosse Tokyo?
Aplicações no Melhoramento
• Mapeamento genômico – Seleção Assistida por Marcadores -
MAS
• Diversidade genética e filogenia• Caracterização de germoplasma• Identificação de acessos• Seleção de genitores
Histórico de Marcadores
1. 1970’s - ferramentas molecularesdesenvolvimento de vetores de clonagem; enzimas de restrição; polimerases; ligases; Southern (1977);
2. RFLP proposto por Botstein et al. (1980)descrito para humanos
3. PCR proposto por Mullis & Faloona (1987)
4. RAPD por Rafalski et al. (1990)
Histórico de Marcadores
5. Microssatélites em plantas por Akkaya et al. (1992)
6. AFLP por Zabeau & Vos (1993)
7. SCAR por Paran & Michelmore (1993)
8. Cho et al. (1999) - SNPs em Arabidopsis
DESCRIÇÃO DOS MARCADORES MOLECULARES
Marcadores Moleculares
• RFLP• RAPD, AP-PCR, DAF• PCR-específico - SSR, ISSR, CAPS,
SCARs• AFLP• SNPs
Restriction Fragment Length Polymorphism -
RFLP• RFLP examina diferenças no
tamanho de fragmentos de restrição de DNA específicos
• Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção
• Utiliza-se DNA celular total• Requer DNA puro, de alto peso
molecular
Metodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel
eletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA
para filtro
Fonte: IPGRI
Metodologia de RFLP
4. Visualização dos fragmentos de DNA– sondas marcadas (32P) ou a frio
5. Análise dos resultados– bandas analisadas para alelos e/ou
presença/ausência– diferenças em padrão de bandas reflete
diferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição é crucial
Fonte: IPGRI
digestão
1
1
52
34
2
5
43
DNA
Digestão de DNA Genômico e Separação em Gel
Separaçãoem gel
Transferência para Membrana de Nylon ou Nitrocelulose
1
2
3
4
5
Hibridização em Nylon ou Nitrocelulose
Interpretação de resultados
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6
Sítio alvo para sonda
Sítio de restrição
Inserção
Fonte: IPGRI
6 Kb
AHerança de RFLPs
8 Kb
B
6 Kb
F1
8 Kb
6 Kb 6 Kb
8 Kb
6 Kb
8 Kb 8 Kb
F2
RFLP em Cana de Açúcar
1 5 10 15 20
Fonte: CEBMEG
Vantagens e Desvantagens de RFLP
• Reprodutível• Marcadores co-dominantes• Simples
• Trabalhoso• Caro• Uso de sondas radioativas*
Fonte: IPGRI
Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD
• Amplifica seqüências anônimas de DNA usando primers arbitrários– 10 bases com >50% G+C
• PCR com um único primer• Método rápido para detecção de
polimorfismos• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade
RAPD
AA
Aa
aa
AA Aa aa
Interpretação de RAPDs• Marcadores RAPD são anônimos• Dados binários (presença x
ausência)• RAPD são dominantes (AA = Aa)
• Problemas de co-migração– mesma banda, mesmo fragmento?– uma banda, um fragmento?
RAPD - resumo
• Rápido• Simples• Baixo custo• Sem uso de radioisótopos
• Marcador dominante• Problemas de reprodutibilidade• Problemas de interpretação
Fonte: IPGRI
RAPD - primer OPJ04 - Bananeira
1500 pb
RAPD - Feijoeiro
OPAM13
OPY04
top related