marmara Üniversitesi tıp fakültesi tıbbi biyokimya a.d...

Antioksidan Moleküllerin Farklı Yöntemler

ile Lipozomlanması

Ziba Mokhberi Oskouei1, Gökhan Biçim1,2, A. Suha Yalçın1,2

1 Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya A.D., Haydarpaşa, İstanbul

2Oksante Ar-Ge Laboratuvarı, Eyüp, İstanbul

Lipozom oluşumu ve yapısı

Lipozomlar, tek veya iç içe birçok tabakadan oluşmuş, aralarında sulu faz içeren küresel

vesiküllerdir.Lipozomlar lipit tabaka ve sulu faz olmak üzere iki bölümden oluşurlar. Lipit

tabakanın temel yapıtaşıfosfolipitlerdir. Sulu faz, tek bir tabakadan oluşan lipozomlarda içteki

bölümdür. İlk keşfedildiği yıllarda biyolojik membran özellikleri ile ilgili çalışmalarda

kullanılmış olan lipozomlar, günümüzde başta ilaç taşıyıcı sistemler olmak üzere birçok bilim

dalında farklı kullanım alanlarına sahiptir.. Lipozomlar, biyogeçimli ve biyoparçalanan

özellikteki lipit içerikleri sayesinde hücre membran yapısına benzerlik gösterir ve benzerlik

derecesi çeşitli kimyasal modifikasyonlarla artırılabilir. Bu özellikleri sayesinde, ilaç

hedeflendirme çalışmalarında ve immun sistemin modulasyonunda yaygın olarak kullanılırlar.

Lipozomların yapısı farklı özellikte birçok maddeyi üzerlerinde taşımaya uygun olduğundan

kullanım alanları giderek genişlemektedir.

Bu çalışmada, farklı antioksidan moleküllerin değişik lipozom hazırlama yöntemleri (ince

tabaka, ters faz, dondurma-çözme, aralıklı sonikasyon) ile lipozomlanması ve lipozom

yapısında aktivitelerini koruyup korumadıklarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Ayrıca değişik

lipozom elde etme yöntemleri karşılaştırılarak aralarından en uygun olan yöntemin

belirlenmesi hedeflenmiştir. Farklı yapısal özellikteki antioksidan moleküllerin

lipozomlanması ve karakterizasyonu ile ilgili ön denemelerden sonra, C vitamini, E vitamini

ve polifenol ekstresi içeren lipozomlarda antioksidan aktivite ölçümleri yapıldı. E vitaminli

lipozomların en yüksek Trolox eşdeğeri aktiviteye sahip olduğu bulundu. Ayrıca, E vitaminli

lipozomların santrifuj öncesi ve sonrası antioksidan aktivitesi ölçüldüğünde, ‘pellet’ kısmında

yüksek antioksidan aktivite gözlendi. Kullandığımız yöntemlerden aşamalı sonikasyon

yönteminin diğerlerinden daha kısa sürede sonuçlanması ve metanol, kloroform gibi organik

çözücüler içermemesi nedeni ile daha avantajlı ve kullanışlı olduğu sonucuna varıldı.

Işık mikroskopu ile boş

lipozom görüntüsü (40x)

Floresan mikroskop ile boş

lipozom görüntüsü (63x)

İnce tabaka yöntemiyle elde edilmiş lipozomların boyut analizi

Dondurma-çözme yöntemiyle elde edilmiş

lipozomların boyut analizi Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 200

Particle Size (µm)

0

2

4

6

8

10

12

14

Volu

me (

%)

lipozom-5, 19 Haziran 2012 Salý 15:52:11

Particle Size Distribution

0.01 0.1 1 10 100 200

Particle Size (µm)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Volu

me (

%)

lipozom_7, 19 Haziran 2012 Salý 16:53:20

D (0.5)=12,282

HPLC yöntemi ile fenolik bileşik tayini

Çay polifenollerinin HPLC ile analizi

Antioksidan lipozomlarda CUPRAC

yöntemiyle antioksidan aktivite ölçümü

Lipozomlanmış C vitamini, lipozomlanmış E vitamini

ve lipozomlanmış polifenol Ekstresinde antioksidan

aktivite ölçümleri yapıldığında E vitaminli lipozomların

en yüksek Trolox eşdeğeri aktiviteye sahip olduğu

bulundu.

CL EL PFL

mM TR 8,63 13,57 7,36

0

2

4

6

8

10

12

14

16

CL: C vitaminli Lipozom, EL: E vitaminli Lipozom, PFL: Polifenolik Lipozom

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

PFL (A-280)

PF (A-280)

BL (A-280)

Sephadex G-25 kolon kromatografisi

Lipozomlanmış ve lipozomlanmamış

moleküllerin ayrımı Sephadex G-25 kolon

kromatografisi ile gerçekleştirildi. Ayrıca elde

edilen fraksiyonların 280 nm’deki

absorbansları ile antioksidan aktiviteleri

ölçülerek grafiklendi. Lipozomca yoğun

fraksiyonlar 4. – 6. fraksiyonlar arasındaydı.

Serbest radikaller yaşam için gerekli, ama hücrede oluşumları kontrolsüz bir davranış gösterirse oksidatif hasarlara neden olan bileşiklerdir. Oksijenli yaşamla birlikte aerobik organizmalarda oksijen kaynaklı

radikaller oluşmaya başlamıştır. Bununla eş zamanlı olarak, tüm aerobik canlılarda oksidatif hasara karşı koyan antioksidan savunma sistemleri gelişmiştir. Günümüzde antioksidanların lipitleri, proteinleri,

nükleik asitleri ve diğer hedef makromolekülleri koruyucu etkileri olduğu bilinmektedir. Serbest radikal düzeyleri ile antioksidanlar arasındaki denge bozulduğunda oksidatif stres durumu ortaya çıkar.

Farklı Lipozom Elde Etme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Aşamalı sonikasyon işleminin lipozom boyutlarına etkisi

A-Sonikasyon yok; B-10x sonikasyon; C- 20x sonikasyon;

D-30x sonikasyon şık mikroskopu görüntüsü (40x)

1: GA-Gallik asit 2: EGC-Epigallokateşin 3: K-Kafein 4: EC-Epikateşin 5: EGCG Epigallokateşingallat 6: ECG-Epikateşingallat 7: T-Teaflavin

Folin yöntemi ile total fenolik bileşik tayini Çaydan polifenol ekstresi elde edildikten sonra Folin yöntemiyle yapılan toplam fenolik bileşik tayini tungsten ve molibden oksitleri indirgeme kapasitesine dayanır. Reaksiyon, koyu mavi renk oluşumuyla sonlanır. 750 nm dalgaboyundaki absorbansı okunur. Çay örneklerinin Trolox cinsi fenolik bileşik içeriğinin 4.5 mM olduğu bulundu.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

A-280

mM TR

Antioksidan aktivite ölçümü CUPRAC yöntemi ile suda ve yağda çözünen moleküllerin antioksidan aktivitelerinin ölçümü bakır iyonu indirgeme kapasitesine dayanır. Reaksiyon, açık mavi renk oluşumuyla sonlanır. 450 nm dalgaboyundaki absorbansı okunur.

E vitaminli antioksidan lipozomlarda CUPRAC

yöntemiyle antioksidan aktivite ölçümü

E vitaminli lipozomlar elde edildikten sonra

lipozomların santrifüjle çöktürülmesi

sonrasında yapılan aktivite ölçümleri alt ve üst

fazlar arasında belirgin aktivite farkı olduğunu

gösterdi .

GA 0.157mM EGC 0.395mM K 0.035mM EC 0.124mM EGCG 0.133mM ECG 0.029mM T 0.122mM

Lipozom elde etme yöntemleri İnce tabaka yöntemi Ters faz buharlaştırma yöntemi Dondurma çözme yöntemi Aşamalı sonikasyon yöntemi

Antioksidan aktivite ölçümü

Lipozomlanmış polifenol ekstresi Sephadex G-25 jel

filtrasyon kromatografisi ile fraksiyonlara ayrıldıktan sonra

elde edilen fraksiyonların antioksidan aktiviteleri CUPRAC

yöntemiyle ölçüldü.Lipozomca yoğun olan fraksiyonların en yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu gözlendi.

Farklı fenolik bileşiklerin HPLC kromatogramı

D (0.5)=9,784

Kolon: 2x26 cm; Örnek hacmi: 1 ml; Elüsyon: % 0.9 NaCl; Akış hızı: 2 ml/dakika

18,8

1,89

13,4

Alt Faz

Üst Faz

Santrifüj Öncesi

mM Trolox

İnce tabaka yöntemiyle elde edilmiş

lipozomların boyut analizi