microbiologia ambientale panorama sulle tecniche classiche e molecolari

MICROBIOLOGIA AMBIENTALE

PANORAMA sulle TECNICHE

“CLASSICHE E MOLECOLARI”

http://en.wikipedia.org/wiki/Growth_medium

Diversità morfologica dei microrganismi

MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO

Monotrico Anfitrico

Lofotrico Peritrico

Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula

Flagello/i non visibile al microscopio!!!

Diversità morfologica dei microrganismi

MORFOLOGIA CELLULARE

Microscopia ottica ed elettronica

MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici

Microscopia ottica ed elettronica

Microscopia ottica ed elettronica

Fonte luminosa

Campione

Obiettivo

Oculare

Fascio di elettroni

Campione

Lente magnetica

Lente obiettivo

Lente proiettore

Immagine schermo fluorescente

Microscopia ottica

Microscopia elettronica a trasmissione(TEM)

Concetti chiave1. Ingrandimento

2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.- occhio umano 75-100 m- microscopio ottico: 0.2 m (200 nm)- microscopio elettronico: 0.2-2 nm

Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni)

Microscopia ottica ed elettronica

Schema: microscopio composto

Tubo metallico

OCULARE-

GENERALMENTE BINOCULARE !!

OBIETTIVO 10X

OBIETTIVO 40X

OBIETTIVO 100X

Ganci

CondensatoreDiaframma

Sorgente di luce

Braccio

TavolinoPorta campione

Vite macrometrica

Vite micrometrica

MESSA A FUOCO

Base microscopio

Ruota obiettivi

Principi di base: microscopio composto

Sistema di lenti convergenti:

1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)

- Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita

- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita

Principi di base: microscopio composto

OBIETTIVO ED OCULARELAVORANO INSIEME

PER RISOLVERE L’IMMAGINE

L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo

10X oculare

10X, 40X,100X obiettivi

INGRANDIMENTO

FISSO

Ingrandimento totale=

Ingr. oculare X Ingr. obiettivo

Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione

- L’obiettivo 100X è sempre ad immersione

- L’obiettivo 100X è retrattatile

- L’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell’obiettivo

Microscopio composto: campo chiaro- scuro e a contrasto di fase

1. CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della celluna di assorbire o

disperdere la luce. Illuminazione dal basso ( condensatore).

Colorazione generalmente necessaria

2. CAMPO SCURO: ideale per l’osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori

“falsi”.

3. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la

differenza di “ritardo” della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per

l’osservazione di campioni in vivo.

Campo scuro Contrasto di fase

Osservazione in vivo e le colorazioni1. Osservazione in vivo:

- vetrino + goccia campione+ coprioggetto

- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto

- vetrino + goccia campione+ coprioggetto

2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità

per specifiche componenti cellulari.

Distinguiamo :

A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e

polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto

B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture

cellulari citoplasmatiche].

Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

Colorazione di Gram

1884 Hans Christian Gram-Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare

Colorazione di Gram

Asciugare all’aria

Fissare alla fiamma

RISULTATO AL MICROSCOPIO?

Colorazione di Gram

Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?

Colorazione di Gram

…“ma…”

La colorazione di GRAM è molto utilizzata

in microbiologia clinica, ma poco

sfruttabile in microbiologia ambientale

Microscopia ad epifluorescenza

DAPI

SYBR-GREEN

Labels double

DNA strain

A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells

Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a) and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom(b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c) at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel(d) magnification was 23006 ×.

• COLTURE DI MICRORGANISMI

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiedel'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con iquali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in

grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismoche si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve

essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di unsistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotteosservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione

del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

Colture di microrganismi

RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE

DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE

DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN

LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE

FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER

APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA

solido liquido

TERRENI DI COLTURA

Terreni sintetici o definiti :

COMPOSIZIONE ESATTA

Terreni complessi :

COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono

Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc…

Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi,

nucleotidim vitamine

Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali

per il metabolismo cellulare.

Terreni selettivi

Terreni differenziali

Terreni di arricchimento

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but

does not ferment mannitol.

Esempio di Terreno selettivo:

MANNITOL SALT AGARSelettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;

TERRENO DI COLTURA: differenziale

Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi.24 h at 35°C

Shigella flexneri Inibito dall’ acetato.Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi . 24h a 35 °C

Sodium Chloride 5.0gm

Sodium Acetate 2.0gm

Monoammonium Phosphate

1.0gm

Dipotassium Phosphate

1.0gm

Magnesium Sulfate 0.1gm

Bromothymol Blue 0.08gm

Agar 20.0gm

Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.

Diversità morfologica dei microrganismi

DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIEIMPORTANZA DEI PIGMENTIE DEI MARGINI DELLE COLONIE

PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

DIVERSITà METABOLICA

DALLA COLONIA

Test biochimici identificativi

DIVERSITà METABOLICA

LA COLONNA DI WINOGRADSKY

SCHEMA di una colonna

Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce

PAROLA CHIAVE: GRADIENTE- DI OSSIGENO- DI LUCE- DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)

CONTA DEI MICRORGANISMI

A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10 -2 dilution.This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10 -7, 10-8,

and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.

CONTA DEI MICRORGANISMI

DAPI, syber green, arancio di acridiniSono colaranti utilizzati anchenella conta di microganismi medianteMicroscopia a fluorescenza

MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI

RESPIRAZIONE

Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added

through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask.

During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube.

This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added

and the alkali replaced to continue the process of analysis.

MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI

AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI

METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI

-Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio

CH4 + 2 O2 -----> CO2 + 2 H2O + energy

- enzima chiave metano-ossigenasi

Struttura primaria e

secondaria dell’ rRNA 16S di

E.coli

16S RNA RIBOSOMIALE

PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE

CFU_ colony-forming unitUnità formante colonia

Biolog_example of commercial kit

PLFA: phospholipids fatty acid profile

FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique

IS-PCR Intergenic Spacer-Polymerase Chain reaction

PLFA: phospholipids fatty acid profile

PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms

reazione di polimerizzazione a catena

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

Esempi di utilità della PCR :1. Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie,

genere,,etcc (microbiologia clinica)2. Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente

oligotrofico)

COMPONENTI

TEMPERATURA

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

AGAROSIO

PERCENTUALE dipendente

dalla lunghezza del frammento

da caricare

EBOLLIZIONE (microonde)

PREPARAZIONE Cassetta

“versamento”del gel nella

cassetta

ELETTROFORESI

ELETTROFORESI

CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer)

CORSA TRA ELETTRODI

Risultati PCR su gel

1 2 3 4 5 6 7

NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO

NUOVE TECNICHE: molecolari

Microscopio ad epifluorescenza

Microscopio ad epifluorescenza

Schema sorgente di luce1. Globo di quarzo2. e 3. Catodo e Anodo4. Camera di combustione (contenente Hg)5. Arco voltaico

365 nm404434546577613

“linee del mercurio”

colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza

[4',6-diamidino-2-phenylindole ]

Campione DAPI+

Microscopio a fluorescenza

“le colorazioni in” Ecologia microbica

Microscopio ad epifluorescenza: immagini

DAPI SYBR-GREEN

Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

Microscopio ad epifluorescenza e FISH

MICROSCOPIO CONFOCALE

MICROSCOPIO CONFOCALE

Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione.

Intensità luminosa

Segnale elettrico

Digitalizzazione

1 punto = 1 pixel

Specchio dicroicoCoerenza-Alta intensità-Unica λ

MICROSCOPIO CONFOCALE

Spostamento verticale della sezione ottica

Sovrapposizione singoli piani

Ricostruzione 3D

Microbiologia : analisi delle acque

- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento

- Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici)

- Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia

intestinalis)

- Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di

inquinamentoParametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5

100- OD( % sat)

>10 <20 <30 <50 >50

BOD5 (O2 mg/L)

< 2.5 <4 <8 <15 >15

COD (O2 mg/L)

<5 <10 <15 <25 >25

NH4 (N mg/L) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5

NO3 (N mg/L) <0.3 <1.5 <5.0 <10.0 > 10

P (mg/L) <0.07 <0.15 <0.3 <0.6 >0.6

Escherichia coli (UFC/100 ml)

<100 >1.000 < 5.000 <20.000 > 20.000

Punteggio 80 40 20 10 5

Microbiologia : analisi delle acque

Microbiologia : analisi delle acque

- Conta dei coliformi totali (UFC/ml)

- Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml)

- Conta delgi Streptococchi fecali

  TERRENO DI COLTURA

T° INC. TEMPO INC.

CONTA BATTERICA

TOTALE

PCA (Plate Agar

Count)

22°C36°C

72h48h

COLIFORMI TOTALI

Membrane endo agar less

36°C 24h

COLIFORMI FECALI

Membrane faecal coliform

44°C 24h

STREPTOCOCCHI FECALI

KF streptococcus

36°C 48h

Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si “cercano”-“Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae.- Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti-“Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni- Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp.

-Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro

- Escherichia coli….

Microbiologia : Coliformi fecali

- Sinonimo di Coliformi termoresistenti

- Fermentano il lattosio a 44.5-45 °C

Microbiologia : Streptococchi fecali

- Gram positivi

- Indicatori di inquinamento non recente (vita media>)

- Terreno KF

- Sodio azide (inibitore di altri microrganismi)

- Colonie rosse con alone chiaro attorno

Microbiologia : Streptococchi fecali

- Chi sono e come si “cercano”

Species Colonia rossa

Alone giallo

Enterococcus faecalis+ +

Enterococcus hirae+ (poor) +

Enterococcus equinus+ (poor) +

Streptococcus pyogenes- -

Streptococcus agalactiae - -

Lactobacillus plantarum- -

Escherichia coli

Enterobacter cloacae

Pseudomonas aeruginosa

Microbiologia : metodo delle membrane filtranti

Metodo delle membrane filtranti

N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100