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Microbiologia delle infezioni delle vie

respiratorie inferiori

Microbiologia delle Microbiologia delle infezioni delle vie infezioni delle vie

respiratorie inferiorirespiratorie inferiori

Dr.ssa Lo Cascio GiulianaDipartimento di Patologia e diagnostica, Sezione di Microbiologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di VeronaServizio di Microbiologia, Ospedale G. B. Rossi, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona

Quale l’approccio microbiologico?

• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto campione)

• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il patogeno?

• Test di Sensibilità• Resistenze e problematiche correlate

PolmonitePolmonitePolmonite

Eziologia: Età Microrganismi più frequenti

Neonato (0-1 mese) E. coli, Streptococcus agalactiae

Infante (1–6 mesi) Chlamydia trachomatis, respiratorysyncytial virus

Bambino (6 mesi –5 anni) Respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses

Bambino (5–15 anni) Mycoplasma pneumoniae, influenza virus type A

Giovane adulto (16-30 anni) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcuspneumoniae

Adulto Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae

Tabella LRI-2. Agenti eziologici di polmonite: tipologia e correlazione con stato immunitario

Presentazione e Stato immunitario Cause più frequenti Cause meno frequenti

Community acquired typical pneumonia

Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae

Staphylococcus, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis

Nosocomial pneumonia typical pneumonia

Gram-negative aerobic bacilli (Enterobacter, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas), Staphylococcus aureus, anaerobic bacteria, standard bacteria*

Legionella, Streptococcus pneumoniae

Community acquired primary interstitial pneumonia

Mycoplasma pneumoniae, respiratory viruses†, influenza virus, Chlamydophila pneumoniae, Legionella sp.

Adenovirus, Chlamydophila psittaci, Chlamydia trachomatis, primary tuberculosis, acute fungal pneumonias

Hematogenous pneumonia Staphylococcus, Streptococcus Gram-negative aerobic bacilli

Opportunistic pneumonia occurring in immunocompromised host

Standard bacteria*, Pneumocystis jirovecii, Cytomegalovirus, herpes simplex virus, Nocardia, opportunistic fungi (e.g., Candida, Phycomycetes mucor, Aspergillus)

Legionella, Listeria, Histoplasma, Coccidioides

Pneumonia acquired by environmental exposure

Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Chlamydophila psittaci, Mycobacterium tuberculosis

Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Coxiella burnetii, Yersinia pestis, Pasteurella multocida, Paracoccidioides

Aspiration pneumonia

Prevotella melaninogenicus, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus, Peptococcus, and other anaerobes, Staphylococcus, Gram-negative aerobic bacilli

* Standard bacteria:batteri che comunemente causano CAP. †Respiratory viruses include influenza, parainfluenza, and respiratory syncytial virus.

Modificata da: N. Chamberlain, 2010

Tabella 3. Cause di Polmoniti secondo Tempo di esordio, modalità di acquisizione e trasmissione

Esordio Tipologia di polmonite

Trasmissione Agenti causali

Acuta Community acquired

Persona-a-persona Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Neisseria

meningitidis, Moraxella catarrhalis, influenza virus, Streptococcus pyogenes

Acuta Community acquired

Animali o esposizione ambientale

Legionella, Francisella tularensis, Coxiella burnetii, Chlamydophila

psittaci, Yersinia pestis (peste), Bacillus anthracis (antrace), Burkholderia

pseudomallei (melioidosi), Pasteurella multocida (pasteurellosi)

Acuta Community acquired

Persona a persona in infanti e bambini

piccoli

Chlamydia trachomatis (polmonite apiratica), respiratory syncytial virus e

altri virus respiratori, Streptococcus agalactiae (Group B), S aureus,

Cytomegalovirus, S pneumoniae, H influenza

Acuta Nosocomial pneumonia

Persona a persona Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacters, S aureus

Subacuta interstiziale

Community acquired

Persona a persona Mycoplasma pneumoniae, influenza virus

Subacuta Nosocomial or community

acquired

Aspirazione Mista: anaerobi e aerobi gram-negative, enterobatteri, usualmente

polimicrobiche Subacuta o cronica

Nosocomial or community

acquired

Persona a persona o aspiratione in immunocompromessi

Pneumocystis jiroveci, cytomegalovirus, atypical

mycobacterium (e.g., Mycobacterium kansasii), Nocardia, Aspergillus,

Phycomycetes mucor, Candida albicansCronica Community

acquired Persona a persona Mycobacterium tuberculosis,la più

frequente. Polmoniti MICOTICHEBlastomyces dermatitides,

Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Cryptococcus

neoformans Modificata da: N. Chamberlain, 2010

Sethi S., NEJM 2008

Ricerca e isolamento di microrganismi responsabili di polmonite dipende da:

• Adeguatezza del campione delle basse vie respiratorie

• Assenza di contaminazione della flora del tratto

respiratorio superiore

• Utilizzo delle tecniche microscopiche e colturali

• Trattamenti antimicrobici in corso recenti

Tipologia di campioni• Emocolture

• Toracentesi

• Aspirazione Transtoracica

• Lavaggio Broncoalveolare;

• Aspirato bronchiale;

• Brushing bronchiale;

• Escreato spontaneo o indotto;

• Tampone faringeo/nasale, Aspirato nasofaringeo;

Tecniche INVASIVE: siti NON Sterili

Tecniche INVASIVE: siti Sterili

Tecniche NON INVASIVE: siti NON Sterili

Raccolta dei campioni

• Tempo ottimale di prelievo: – Emocolture: prima possibile e precedente a terapia

antibiotica (alta specificità ma positive solo nel 4-18% dei casi, 34% se eseguite nei primi 4 giorni dall’esordio sintomi )

– Escreato: preferibile campione della mattina

– Preferibile campione precedente alla terapia

antibiotica (Legionella può risultare positiva anche dopo inizio

terapia)

Raccolta dei campioniTipo di campione appropriato e metodo di prelievo

– Escreato profondo

– Se tosse secca, possibilmente fare fisioterapia o drenaggio posturale o

inalazione di aerosol

• Quantità adeguata e numero appropriato di campioni

» Per Emocolture: almeno 2 campioni

» Per BAL max volume

» Escreato: almeno 2 ml, possibilmente ripetere il

campione per 3 giorni consecutivi

Trasporto e conservazione del campione

• Tempo tra prelievo del campione e procedura analitica– Minimo possibile, l’escreato può essere refrigerato per

2-3 h, oltre possibile perdita di Haemophilus e Streptococcus pneumoniae, sovracrescita di bacilli Gramnegativi.

– In casi eccezionali il campione può essere seminato fino a 48h dopo il prelievo, ma l’interpretazione deve essere fatta con attenzione

• Accorgimenti speciali per ridurre il deterioramento– Refrigerazione è preferibile alla conservazione a T

Ambiente. Non tollerati ritardi superiori alle 48h.

PERCORSO DIAGNOSTICO POLMONITE

CAP HAP/HCAP/VAP

IMMUNOCOMPETENTE IMMUNOCOMPROMESSO IMMUNOCOMPETENTE IMMUNOCOMPROMESSO

EMOCOLTURA

COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/BASP/BAL

Pneumocistis su BAL

β-d glucano su sangue

Ag. CMV su sangue

Antigene Legionella su urine

Antigene Pneumococco su urine

COLTURALE su liquido pleurico (se presente)

Sierologia agenti pneumotropi su sangue

Se sospetto BK • Coltura ESCR/BAS/BAL • Quantiferon su sangue • Quantiferon su l.pleur.

EMOCOLTURA

Antigene Legionella su urine

β-d glucano su sangue

Ag. Aspergillo su sangue

Ag. Aspergillo su BAL

Ag. CMV su sangue

Virus respiratori su BAL

Virus respiratori sierologia su sangue

COLTURALE (batt., miceti e legionella su ESCR/BASP/BAL

COLTURALE su liquido pleurico (se presente)

Cosa attenderci?

Che risultati possiamo garantire al clinico?

Loens K., JCM 2009

Microscopia• Retaggio del passato?• Se buon campione, una diagnosi

“probabile” di S. pneumoniae o H.influenzae può essere fatta in 30-60 min.

ESCREATO: Campioni non idonei

> 10 cell squamose/campo, <25 PMN/campo

ESCREATO: Campioni idonei

Circa il 30-50% dei campioni di pz con CAP!!

Morfotipi predominanti

Coltura• Fondamentale discriminare fra colonizzazione e infezione;( In CAP

che richiedono ospedalizzazione la coltura dovrebbe essere supportata dalla

microscopia: convincente solo se il microrganismo isolato è compatibile con la

morfologia del batterio evidenziabile nel >90% dei PMN al GRAM)

• Valutazione quantitativa:

– BAL: cutoff: 103 CFU/ml

– Brush: cutoff: 104 CFU/ml

– Escreato: cutoff: 106 CFU/ml

Necessarie informazioni cliniche!!

• Interpretazione di colture dovrebbe sempre essere coadiuvata dal “sospetto clinico”;

• Comunitaria (CAP)? Nosocomiale (HAP)? Associata a ventilatore (VAP)?

Eziologia varia in funzione:

• Tempo di ospedalizzazione• Trattamento antibiotico• Ventilazione meccanica è maggiore fattore di rischio

Si modifica la flora colonizzante

Aumento dei bacilli Gramnegativi aerobi

Tot HAP VAP VE-VAP

MSSA 16.3 10 18 20.3

MRSA 16 21.4 14.6 12.7

PSE 23.1 25.7 22.8 20.3

Acineto 19.1 21.4 20.2 10.1

Enterobat 43.8 50 43 36.7

Coronamento dell’esame colturale….

Antibiogramma

Inciso diagnostico: nuove strategie diagnostiche rapide

• Per contenere inappropriato uso di antibiotici• Per tempestiva terapia mirata, riduzione mortalità;

• Tecniche basate prevalentemente su Metodi di Amplificazione Molecolare (Real-time Multiplex, Microarray, PCR/ESI-MS spettrofotometria di massa dell’aerosol amplificato)

Inciso diagnostico: nuove strategie diagnostiche rapide

• Utili se:– Disponibili 24h/day, 7 g/wk, risultati disponibili

in poche ore;– Semplici da eseguire, point-of care– Prezzi ragionevoli;– Possibilità di evidenziare batteri resistenti– Capacità di quantificare per distinguere

colonizzazioni da infezioni;

Torniamo all’antibiogramma….

CHE COS’ E’ L’ANTIBIOGRAMMA?

L’antibiogramma è un test che permette la valutazione del profilo di sensibilitàbatterica in vitro a vari antibiotici

COME SI MISURA LA SENSIBILITA’ DEI BATTERI AGLI ANTIBIOTICI?

Determinando la minima concentrazione inibente (MIC), intesa come la più bassa concentrazione del farmaco in grado di inibire la crescita in vitro del microrganismo saggiato

Come?• Microdiluizione

• E-test

• Agar-diffusione(MIC estrapolata)

La MIC di per sé non è utile, ma deve essere comparata per esempio alla concentrazione che il farmaco può raggiungere nel sito di infezione, parametro considerato anche nella definizione dei breakpoints.

Metodi automatizzati• Noi usiamo Vitek

• Ma ci sono anche altri

MIC non precisa ma a cavallo dei breakpoint

I breakpoint servono per interpretare i saggi di sensibilità

I breakpointbreakpoint servono per interpretare i saggi saggi di sensibilitdi sensibilitàà

Saggi di sensibilità : MICSaggi di sensibilitSaggi di sensibilitàà : : MICMIC

La MIC è alla base della determinazione dei breakpoint

La MICMIC è alla base della determinazione dei breakpointbreakpoint

Il cardine di tutti i saggi di sensibilità (ovviamente dei metodi fenotipici, ma indirettamente anche degli altri) è la MIC

Il cardine di tutti i saggi di saggi di sensibilitsensibilitàà (ovviamente dei metodi fenotipici, ma indirettamente anche degli altri) è la MICMIC

MICMICMIC

Seregno, 20 dicembre 2010

Breakpoint:• Interpretazione qualitativa della MIC,

classificando il ceppo batterico come Sensibile, Intermedio o Resistente al farmaco saggiato

• Deriva dall’armonizzazione di piùinformazioni: – Distribuzione MIC dei principali microrganismi– Dati di PK/PD e modelli di simulazione– Dati di esito clinico

COME SI INTERPRETA L’ANTIBIOGRAMMA?

I valori delle MIC vengono poi rapportati a valori sogliavalori soglia ( MIC breakpointbreakpoint ) fissati da Istituzioni Scientifiche Internazionali per le diverse combinazioni microrganismo-antibiotico.

Attraverso il confronto con i breakpoint, i risultati ottenuti possono essere tradotti nelle cosiddette categorie di interpretazione:– S (sensibile)– I (intermedio)– R (resistente)

Isolati da tutti i materiali: Medicine AOUI

2010

2011

Rianimazione AOUI: isolati da RESPIRATORI (% isolati)

0%

20%

40%

60%

80%

100%

2008 2009 2010

Gram- fastidiosi

Funghi f ilamentosi

Gram+

Gram- ferment

Gram- non ferment

Medicine AOUI: isolati da Respiratori

0%

20%

40%

60%

80%

100%

2010 2011

Gram- fastidiosi

Funghi filamentosi

Gram+

Gram- ferment

Gram- non ferment

Pneumococco• Problematica principale è la

resistenza a Penicillina, dovuta a modifiche del bersaglio: le PBP hanno ridotta affinità.

EARSS Report 2008

Streptococcus pneumoniae:non sensibilità alla penicillina

Streptococcus pneumoniae: isolati 2010-2011

Differenze fra CLSI ed EUCAST?

Streptococcus pneumoniae (totale isolati 42/44): sensibilità (%).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

PENICILLINA

ERITROMICINA

CLINDAMICINA

LEVOFLOXACINA

TEICOPLANINA

VANCOMICINA

LINEZOLID

trimestre 2010

trimestre 2011

POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint per PENICILLINA in base alla dose usata in terapia

PENICILLINA - Polmonite pneumococcica

S ≤ 0,5 mg/L R > 2,0 mg/LSe si usa dose 1.3 g x 4

POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpoint per PENICILLINA in base alla

dose usata in terapia

PENICILLINA - Polmonite pneumococcica

S ≤ 1 mg/L R > 2,0 mg/L Se si usa dose 2.4 g x 4 o 1.3 g x 6

POLMONITE PNEUMOCOCCICA: Breakpointper PENICILLINA in base alla dose usata in

terapia

PENICILLINA - Polmonite pneumococcica

S ≤ 2 mg/L R > 2,0 mg/L Se si usa dose 2.4 g x 6

AMPICILLINA - Streptococcuspneumoniae

Isolati Sensibiliad Ampicillina(MIC ≤0.5 mg/L) possonoessere riportatisensibili ad Ampicillina, Amoxicillina e Piperacillina(con o senzainibitori di Beta-lattamasi)

ECOFF ≤ 0,064 mg/L

R > 2,0 mg/LS ≤ 0,5 mg/L

CEFALOSPORINE - Streptococcuspneumoniae

Cefotaxime, Ceftriaxone, Cefepime: finoranon sono maistati riportaticeppi con MIC superiori aibreakpoint disensibilità. Se siriscontrasseroceppi con MIC superiori al Breakpoint diSensibilità ocorrefar controllare I risultati ma anchesconsigliare l’usodel farmaco.

S ≤ 0,5 mg/L R > 2 mg/L

Per questi BP può essere necessario aumentare dosaggio

MEROPENEM - Streptococcuspneumoniae

Meropenem è ilsolo farmacocarbapenemicoutilizzabile in casodi meningite. I Breakpoint in questo caso sonoS ≤0.25 mg/L e R >1 mg/L.

R > 1 mg/L S ≤ 0,25 mg/L

MEROPENEM - Meningite pneumococcica

MEROPENEM - Infezioni diverse da Meningite

S ≤ 2 mg/L R > 2 mg/L

CARBAPENEMI - Streptococcuspneumoniae

Carbapenemi: finora non sonomai stati riportaticeppi con MIC superiori aibreakpoint disensibilità. Se siriscontrasseroceppi con MIC superiori al Breakpoint diSensibilità ocorrefar controllare I risultati ma anchesconsigliare l’usodel farmaco.

S ≤ 2 mg/L R > 2 mg/L

Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni

Nota 2:i ceppi wild-type non sono considerati sensibili alla ciprofloxacina e sono pertanto classificati come “intermedio” (breakpoint di sensibilità per la ciprofloxacina inferiore/uguale a 0.12 mg/L)

Streptococcus pneumoniae e fluorochinoloni

Se R a Ciprofloxacina [mutazione singola]riportare un warning per i fluorochinoloni

Se R a Levofloxacina [mutazioni multiple]refertare R a tutti i fluorochinoloni

Klebsiella pneumoniae: isolati 2010-2011

Medicine Rianimazione

Klebsiella pneumoniae(totale ceppi 223/229): sensibilità (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

AMIKACINA

AMOX / AC-CLAV

CEFEPIME

CEFOTAXIME

CEFTAZIDIME

LEVOFLOXACINA

COLISTINA

GENTAMICINA

ERTAPENEM

IMIPENEM

MEROPENEM

PIPER+TAZOBACTAM

TIGECICLINA

TRIM.+SULFAMET

trimestre 2010

trimestre 2011

Klebsiella pneumoniae produttrice di carbapenemasiKPC: isolati da materiali Respiratori in Rianimazione

ESBL in rianimazione

ESBL in Medicina

Primi isolamenti KPC

KPC ormai quotidiana!!!

89 Klebsiella spp. 59 Enterobacter spp. (isolati non sensibili ai carbapenemi)Woodford et al., JAC 2007; 50:582

ESBL oproduzione di AmpC

+perdita di porine

Produzione di carbapenemasi a

serina(KPC, SME, IMI)

Klebsiella pneumoniaeresistente ai carbapenemi

Resistenza emergente ai carbapenemi nelle Enterobacteriaceae

Produzione dimetallo-β-lattamasi

(VIM, IMP)

EARSS 2008

Negli enterobatteri KPC-positivi,la MIC per i carbapenemi variada 0.25 mg/L a valori superiori a 32 mg/L

MBL E-Test• Striscia con due metà

– Imipenem– Impinem + EDTA

• Positivo con una riduzione di MIC in presenza del chelante– Rapporto ≥ 8– Riduzione di 3 diluizioni

Altri casi di positività del MBL E-test

KPC• K Klebsiella pneumoniae• P producing• C carbapenemase (cahos)

• Carbapenemase di classe A– Non inibita dall’EDTA

Test di Hodge modificatoDiluizione inoculo

1/10

Opzioni terapeutiche?

Pseudomonas aeruginosa isolati da materiali respiratori: % Resistenza (2010-2011)

Medicina Rianimazione

Pseudomonas aeruginosa (totale isolati 207/156): sensibilità (%)

0 20 40 60 80 100

AMIKACINA

AZTREONAM

PIPER+TAZOBACTAM

CEFEPIME

CEFTAZIDIME

CIPROFLOXACINA

COLISTINA

GENTAMICINA

IMIPENEM

MEROPENEM

POLIMIXINA B

TICAR/AC-CLAV

TOBRAMICINA

trimestre 2010trimestre 2011

Eucast

CLSI

CLSI

EUCAST

S. aureus isolato da materiali respiratori: % Resistenza (2010-2011)

Medicine Rianimazione

MRSA isolati da emocolture- AOI Verona- tutti i reparti

33,6

22,4 22,7

0

510

1520

25

3035

40

2008 2009 2010

resistenza oxacillinaMRSA isolati da emocolture ICU- AOI Verona-

48,5

29,4

37,5

0

10

20

30

40

50

60

2008 2009 2010

resistenza oxacillina

MRSA isolati da BASP-BAL- AOI Verona-

43,935,5

41,348,5

5457,7

0

10

20

30

40

50

60

70

2008 2009 2010

BASPBAL

Staphylococcus aureus (totale isolati 794/834): sensibilità (%)

0 20 40 60 80 100

OXACILLINA

LEVOFLOXACINA

CLINDAMICINA

GENTAMICINA

LEVOFLOXACINA

COTRIMOXAZOLO

ERITROMICINA

RIFAMPICINA

TEICOPLANINA

LINEZOLID

VANCOMICINA

trimestre 2010trimestre 2011

Distribuzione MIC S.aureusBP: S <=1

R: 256

Quindi in conclusione…

Quale l’approccio microbiologico?

• Fase pre-analitica (raccolta e trasporto campione)

• Fase analitica-diagnostica: se e chi è il patogeno?

• Test di Sensibilità• Epidemiologia, Resistenze e problematiche

correlate

Con la speranza di riuscire ad essere sempre più veloci!!!

Grazie per l’attenzione!