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がん遺伝子解析の最前線

次世代シーケンスとデジタルPCR の活用例

ライフテクノロジーズジャパン株式会社

テクニカルサポート

大滝 真作 Ph.D.

2

本日の内容

•デジタル PCR の原理

•デジタル PCR による造血幹細胞移植後のキメリズム解析

• RNA シーケンスによる融合遺伝子の探索とデジタル PCR による検証

•微量の融合遺伝子を網羅的に検出できる最新ツール

Ion Proton™ シーケンサ QuantStudio® 3D

デジタル PCR システム

Ion PGM™ シーケンサ

3

デジタル PCR の原理

4

デジタルPCRとは？

反応液を多数の微細ウェルに分配してPCRを行い、多数の個別ウェルでそれぞれPCR増幅を行う。ターゲット配列の存在したPositiveウェル数と、ターゲット配列が入らなかった増幅しないNegativeウェル数をカウントすることで、サンプルの絶対濃度（copies/ μL）を直接的に算出する手法。

5

Ct

Conc. PCR Cycles

リアルタイムPCR: スタンダードサンプルと増幅サイクル数(Ct値)を比較することにより定量

検量線サンプルの準備（希釈系列）

対象サンプル

溶液

デジタルPCR: 増幅したウェルの数をカウントし定量

1ウェルごとにPCRでターゲット増幅 エンドポイントで増幅の有無をカウント

XX コピー /μL

1 コピー/反応に分配

PCR カウント

直接的な定量

間接的な定量

qPCR サイクル数に依存した定量 ダイナミックレンジが広い ⇒ 高濃度域を幅広く測定 検量線（比較対象）が必要

dPCR 目的分子のコピー数を算出 低濃度域を高感度に検出 わずかな濃度差を識別可能 検量線が不要 増幅効率に依存しない

互いに補完し合う技術

リアルタイムPCRとデジタルPCRの違い

6

Molecule Counting Requires A “Correction” Factor

• Problem: ランダムに分配されるので、全てが1コピー/ 反応になるわけではない

• 少なくとも1反応は0コピーの反応がなくてはならない

• ポワソンモデルにより複数コピーの分配を補正し、0、１、２、３etc. コピーの分配確率を導くことができる

7

Poisson Distribution

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

0.001 0.01 0.1 1 10

Average Copies per Reaction

Percen

t R

eacti

on

s

1 Copy

2 Copies

3 Copies

Positive Reactions

ポワソン分布

％陽性反応数

平均コピー数/反応

Molecule Counting Requires A “Correction” Factor

どれもPositive wellとして1カウント

補正

8

デジタル PCR による

造血幹細胞移植後のキメリズム解析

Quantification of donor/recipient chimerism in bone

marrow transplants of leukemia samples

–Dr. Jiménez-Velasco –Carlos HayaHospital

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造血幹細胞移植後におけるキメリズム

完全キメラ

混合キメラ

再発の可能性

再発なし

赤: 白血病細胞、青: 正常細胞

化学療法

放射線 移植前 移植後 幹細胞

再発の可能性をできるだけ早くモニタリングしたい

デジタル PCR 法の活用

10

デジタル PCR による患者由来細胞の検出

患者の DNA を検出するアッセイ (ターゲット): FAM でラベリング

患者とドナー の DNA を検出するアッセイ (リファレンス): VIC でラベリング

キメリズム (%)= (ターゲット/リファレンス) サンプル / (ターゲット/リファレンス) 移植前

11

デジタル PCR によるキメリズムの検出

患者 (移植前) ドナー 62 日目

147 日目 174 日目 192 日目

12

リアルタイム PCR とデジタル PCR のキメリズム解析の比較 （再発症例）

デジタル PCR の方が検出感度が高い

デジタル PCR とリアルタイム PCR の結果が相関

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リアルタイム PCR とデジタル PCR のキメリズム解析の比較 （非再発症例）

デジタル PCR とリアルタイム PCR の結果が相関

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まとめ

•デジタル PCR によって造血幹細胞移植後のキメリズムを検出可能であった

• リアルタイム PCR よりも、デジタル PCR の方が高感度でキメリズムを検出できた

•高感度にキメリズムが検出できれば、早期に再発について検討できる

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RNA シーケンスによる融合遺伝子の探索と

デジタル PCR による検証

大滝真作、千賀一徳、砂山智子、浅野士郎、石倉隆、橋詰航

ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート

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融合遺伝子とは？

• 染色体の転座、挿入、逆位などの組み換えの結果、複数の遺伝子が連結されて生じる新たな遺伝子。

• 融合タンパク質が細胞増殖シグナルを活性、あるいは分化シグナルを抑制する場合はがん化の原因となり得る。

• 白血病の BCR-ABL1、肺がんの

EML4-ALK などの融合遺伝子がドライバー遺伝子として広く知られている。

Image from Fusion Gene Wikipedia

Gene A Gene B

Break point

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RNA シーケンシングによる融合遺伝子の探索

FusionGene Reads PosA PosB NCBI ID

BCR-ABL1 20 chr22: 23632601 chr9:133655755 AJ131466.1

MBD1-CCDC11 9 chr18: 47799047 chr18: 47788589 -

RRM2-C2orf48 9 chr2: 10269281 chr2: 10281981 -

PILRB-STAG3 7 chr7: 99936512 chr7: 99811630 NR_103720.1

RNA シーケンスで検出された融合遺伝子

ゲノムにマッピングした融合遺伝子(PILRB-STAG3) のリード

Break point

Break point

【方法】

• K562 （白血病細胞株）の Poly(A) RNA を用意

• cDNA を合成後、フラグメントライブラリを作成

• Ion Proton™ シークエンサによりシーケンス

• FusionMap により融合遺伝子を検出

【結果】

• トータル 6,600 万リードを取得

• 白血病原因遺伝子のBCR-ABL1 を検出

• BCR-ABL1 の他にも MBD1-CCDC11、RRM1-

C2ofr48、PILRB-STAG3などを検出

• 配列情報を基に、break point を検出

Ion ProtonTM シーケンサ

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TaqMan® Gene Expression Assays の 融合遺伝子検出 Assay のラインナップ

【TaqMan® Gene Expression Assays 検索ページ】 https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=ABGEKeywordSearch&catID=600689

Fusion Transcripts を選択

融合遺伝子名を入力

①

②

③ 検索

合計 193 種類の

融合遺伝子検出する

Assay のラインナップ

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Assay 検索結果と詳細について

Assay 検索結果

Assay 詳細

検出できる Fusion Transcripts

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TaqMan® Assays をカスタムで設計

PILRB-STAG3

CATCGTCATAGCTGGAAACAGTCAGAGCCACCAGCCAATGATCTTTTCAATGCTGCGAAAG

CTGCCAAAAGTGACATGCAGGATTTCTGACAGGACTCTGGGCCCCTCCCCAGCTCCACTC

CCTACCTCAAGAATGTGACCATTTGGAAAAGGCAAAGAGAAAAGGAGCAAAATGAAGCATT

Fwd Primer

Rev Primer

TaqMan® MGB Probe

• Break Point 上に TaqMan® MGB

Probe を設計し、融合遺伝子のみが検出される設計にした

Break Point

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リアルタイム PCR による K562 cDNA をサンプルとした 各 TaqMan® Assay の増幅

BCR-ABL1 MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

• カスタム設計を行った Assay

でも増幅が確認された。

• これらの融合遺伝子は RNA-

Seq とリアルタイム PCR で検出されたため、確かにサンプル中に存在していることが確認された。

• リアルタイム PCR で絶対定量を行う場合は、検量線が必須である。

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デジタル PCR による各融合遺伝子の絶対定量結果

11.9 13.0

30.8

1.4

0

5

10

15

20

25

30

35

40

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

391.5

310.4 285.3

0.6 0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

57.5

8.8

31.9

47.5

0

10

20

30

40

50

60

70

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

1635.2

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

co

pie

s / n

g (

cD

NA

)

BCR-ABL1

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

MBD1-CCDC11

Not Detected

23

K562 における各融合遺伝子の発現比較

11.9

57.5

391.5

1635.2

0 500 1000 1500 2000

PILRB-STAG3

MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48

BCR-ABL1

copies / ng (cDNA)

• デジタル PCR は検量線を使用しなくても絶対定量が可能。

• デジタル PCR はエンドポイントで検出するので、PCR 効率の影響を受けにくい。

• 絶対量を求めることができれば、融合遺伝子間の比較をすることもできる。

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リアルタイム PCR (ddCT 法) と デジタル PCR のデータ比較

• Brain を refernce とし、リアルタイム

PCR (ddCT 法) とデジタル PCR のデータを相対定量で比較による相対定量結果

• リアルタイム PCR の方が値が高めに出るのは、PCR 効率の影響の可能性

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

K562 KG-1 HeLa-S3 Brain

dPCR

qPCR

MBD1-CCDC11

RRM2-C2orf48 PILRB-STAG3

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まとめ

•次世代シーケンスにより、新規融合遺伝子配列を取得できた

•融合遺伝子配列を基に TaqMan® Assay を設計し、検出することができた

•デジタル PCR により、融合遺伝子の絶対定量が可能であり、融合遺伝子間の比較ができた

•デジタル PCR は PCR 効率の影響を受けにくい

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微量の融合遺伝子を網羅的に検出できる最新ツール

Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

Ion PGM™ シーケンサ

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次世代シーケンサを活用した肺癌研究を促進させる OncoNetwork コンソーシアム

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Ion AmpliSeq™ RNAワークフロー

逆転写(ランダムプライマー)

ターゲットの増幅

プライマー配列の部分的な消化

アダプターの付加と精製

ライブラリの増幅と精製

Ion OneTouch™ 2 による

テンプレート調製へ

ライブラリ濃度の調製

(複数ライブラリを１つにまとめる*）

領域A 領域B

A P1

マルチプレックスPCR

プライマー配列の消化

アダプターの付加*

ライブラリ

RNA

Bioanalyzer®もしくはqPCRによる

ライブラリ定量

cDNA

逆転写

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Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

•肺癌関連融合遺伝子 (ALK, ROS1, RET) を網羅的に検出

• FFPE 由来の total RNA (10ng) に対応

•現在、製品開発中

30

Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2

計 38 種類

31

製品の検証結果

1% の spike-in を検出 FFPE サンプルの融合遺伝子を検出可能

1 回の実験で複数融合遺伝子を同時に検出

32

他の手法との比較

他の融合遺伝子検出手法と高い相関性が認められた

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• Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2 は肺癌に関連する融合遺伝子を網羅的に検出することができる

• 1% の Spike in を検出できるほどの高い感度がある

• FFPE 由来の融合遺伝子でも検出可能で、複数の融合遺伝子を同時に検出することができる

• FISH など、他の融合遺伝子検出手法と比較して、高い相関性が認められた

まとめ

(注意) Ion AmpliSeq™ RNA Lung Fusion Panel v2 は現在開発中の製品です。

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研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。

記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。

販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC

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TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Used under permission and license.

© 2014, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan.

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電話 0120-477-392

E-mail jptech@lifetech.com

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