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Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em Biociência Animal
GABRIELA MOLINARI DAROLD
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE
CUIABÁ, MATO GROSSO
Cuiabá, 2017
GABRIELA MOLINARI DAROLD
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE
CUIABÁ, MATO GROSSO.
Cuiabá 2017
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência Animal da Universidade de Cuiabá - UNIC, como requisito parcial para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Prof ª. Drª. Michele Lunardi
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP) Bibliotecária Elizabete
Luciano /CRB1-2103 D224d Darold, Gabriela Molinari
Detecção Molecular de Paramixovírus em Gatos Domésticos de Cuiabá, Mato Grosso./ Gabriela Molinari Darold. Cuiabá-MT, 2017. 53p.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência Animal da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Michele Lunardi
1.Felinos. 2.Doença Renal. 3.Morbilivírus Felino. 4.RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.
CDU 619
GABRIELA MOLINARI DAROLD
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-graduação em Biociência
Animal da Universidade de Cuiabá - UNIC, como requisito parcial para obtenção do
título de mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores.
Orientadora: Profa. Dra. Michele Lunardi
BANCA EXAMINADORA
------------------------------------------------------
Profa. Dra. Michele Lunardi
UNIC – Universidade de Cuiabá
------------------------------------------------------
Profa. Dr. Alexandre Mendes Amude
UNIC – Universidade de Cuiabá
------------------------------------------------------
Prof. Dr. Daniel Moura Aguiar
UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso
Cuiabá, 10 de maio de 2017
Dedico este trabalho à
Todos aqueles que de alguma forma estiveram е estão próximos de mim,
fazendo esta vida valer cada vez mais а pena.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente quero agradecer à minha família, pоr sua capacidade dе acreditar е investir еm mim. Mãe, sеυ cuidado е dedicação deram-me, еm alguns momentos, а esperança pаrа seguir. Pai, sυа presença significou segurança е certeza dе qυе não estou sozinha nessa caminhada. Agradeço imensamente à minha orientadora pela brilhante ideia deste trabalho e também pelo incentivo à Virologia e a Biologia Molecular. Agradeço também aos meus amigos, pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas. Com vocês, as pausas entre um parágrafo e outro de produção melhora tudo o que tenho produzido na vida. Um agradecimento especial à todas do laboratório de Análises Clínicas do HOVET-UNIC, Lívia, Rubi, Janine... Vocês foram excepcionais, desde a manipulação “chata” até o processamento de todas as amostras, principalmente aos finais de semana. Agradeço também à minha colega de mestrado e amiga Káryta e também aos meus estagiários, Patricia, Moisés, Kae, Joaquim, Daniel Bica, Aline, Paulo Victor e Raphael que colaboraram grandemente nas coletas a campo. Além deles, agradeço ao enfermeiro Ednaldo pela enorme ajuda nas venopunções. Um agradecimento exclusivo a Glaucenyra (Glau) pela ajuda, paciência e ensinamentos durante a análise estatística deste trabalho. Desejo agradecer aos responsáveis pelo Laboratório de Virologia Animal da Universidade Estadual de Londrina, Dra. Alice e Dr. Amauri, pela enorme ajuda na purificação e sequenciamento das amostras. Um sincero agradecimento aos proprietários e protetores que ajudaram disponibilizando seus gatos para este trabalho. Quero agradecer a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudos para realização do curso de mestrado. De forma geral, agradeço a todos que contribuíram de forma direta e indireta na execução deste trabalho, pois sem vocês nada seria feito de forma excelente.
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO.
RESUMO
DAROLD, G. M. Detecção molecular de paramixovírus em gatos domésticos de Cuiabá, Mato Grosso. 2017. Dissertação (Mestrado em Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2017. O gênero Morbillivirus, incluído na família Paramyxoviridae, compreende patógenos de extrema importância em Medicina Veterinária. Em 2012 um novo morbilivírus foi identificado em gatos domésticos em Hong Kong, sendo caracterizado como morbilivírus felino (FeMV). Após essa primeira identificação, novas pesquisas foram realizadas no Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia, e mais recentemente no Brasil, onde foi comprovada a circulação do vírus em todas as regiões descritas. Existem contradições acerca da infecção pelo vírus sobre uma provável associação com a doença renal em felinos. Devido à falta de dados no Brasil, surge a necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência e analisar a diversidade genética de paramixovírus excretados por gatos domésticos, além de associar os dados com os achados laboratoriais compatíveis com alterações renais. Neste estudo, foram coletadas amostras de urina e sangue de 276 gatos, independentemente do estado clínico, provenientes de abrigos, de protetores e de animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá. Dos 276 gatos avaliados, a presença do vírus em amostras de urina foi detectada por RT-snPCR em 95 (34,4%) animais, sendo que oito animais apresentavam evidências de alterações renais e 87 não apresentavam alterações compatíveis com uropatias. Com esta investigação foi possível demonstrar uma alta prevalência da infecção nos gatos na região, levantando dados epidemiológicos locais e, além disso, não pode ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com alterações renais nos felinos domésticos, demonstrando a necessidade da realização de estudos complementares sobre essa virose no país, para maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.
Palavras-chave: Felinos. Doença Renal. Morbilivírus felino. RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.
ABSTRACT
DAROLD, G. M. Molecular detection of feline paramixovirus in domestic cats of Cuiaba, Mato Grosso. 2017. Dissertation (Master Science in Animal Bioscience) – Faculty of Veterinary Medicine, University of Cuiaba, Cuiaba, 2017.
The genus Morbillivirus, included in the family Paramyxoviridae comprises pathogens of importance in Veterinary Medicine. A new morbillivirus was identified in domestic cats in Hong Kong in 2012, being characterized as a feline morbillivirus (FeMV). After the initial identification, new investigations carried out in Japan, Italy, Germany, United States, Turkey, and more recently in Brazil, confirmed the viral circulation in all the regions cited. However, contradictions about viral infection and a likely association with a feline kidney disease remains. Due to the lack of data in Brazil, investigations aiming at studying epidemiological aspects of the infection and molecular characterization of viral strains are necessary. The aim of this study was to verify the prevalence and analyze the genetic diversity of paramixovirus excreted by domestic cats, as well as to relate the data with laboratorial findings compatible with renal disorders. In this work, urine and blood samples were collected from 276 cats regardless of clinical status, from shelters, multi-cat household and client-owned admitted to the Department of Small Animal Medicine of the University of Cuiaba Teaching Veterinary Hospital. Of the 276 cats evaluated, the presence of the virus in urine samples was detected by RT-snPCR in 95 (34,4%) cats, eight presenting loss of renal function and 87 without any alteration compatible with uropathies. Through this investigation, it was possible to demonstrate a high prevalence of the viral infection within cats from the region, adding new epidemiological data, demonstrating the necessity to carry out complementary studies on this virus in the country, for better clarification about the pathogenesis of the virus. Keywords: Cats. Kidney disease. Feline morbillivirus. RT-PCR. Sequencing. Brazil.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………... 10
2 REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………… 12
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO……………………………………………………… 12
2.1.1 Classificação taxonômica………………………………………………….. 12
2.1.2 Propriedades biológicas do virus………………………………………… 12
2.2 EPIDEMIOLOGIA…………………………………………………………….. 14
2.3 DIAGNÓSTICO……………………………………………………………….. 16
2.4 FeMV versus DOENÇA RENAL CRÔNICA............................................... 18
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 21
3 OBJETIVOS…………………………………………………………………… 26
3.1 OBJETIVO GERAL…………………………………………………………… 26
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………… 26
4 ARTIGO……………………………………………………………………...... 27
FIRST REPORT OF FELINE MORBILLIVIRUS IN SOUTH AMERICA… 28
ABSTRACT…………………………………………………………………… 28
INTRODUCTION……………………………………………………………… 29
MATERIAL AND METHODS………………………………………………... 30
RESULTS……………………………………………………………………… 33
DISCUSSION…………………………………………………………………. 37
REFERENCES………………………………………………………………... 39
5 ARTIGO………………………………………………………………………... 42
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS
DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO........................................ 43
RESUMO.................................................................................................. 43
ABSTRACT.............................................................................................. 44
INTRODUÇÃO......................................................................................... 45
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 46
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 48
CONCLUSÃO........................................................................................... 51
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 52
10
INTRODUÇÃO
A família Paramyxoviridae é composta por vírus envelopados cujo genoma é
constituído de RNA fita simples com polaridade negativa. De acordo com o ICTV
(International Committee on Taxonomy of Viruses), esta família compreende sete
gêneros, sendo o Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus,
Aquaparamyxovirus, Ferlavirus e Avulavirus, além de outros que ainda não
possuem classificação (KING et al., 2011).
Os paramixovírus são patógenos cosmopolitas, com potencial zoonótico, e já
foram identificados em diversas espécies domésticas e silvestres, incluindo
pássaros, animais aquáticos, roedores, cães, gatos, ovinos, répteis, equinos,
bovinos, suínos, macacos e humanos (DREXLER, 2012; TONG et al., 2008).
Dentro do gênero Morbillivirus tem-se diversos patógenos de importância,
como o vírus da cinomose canina (canine distemper vírus - CDV). Este vírus tem
uma ampla gama de hospedeiros em condições naturais e experimentais, inclusive
já foi relatada a suscetibilidade de felídeos silvestres mantidos em cativeiros ou em
seu ecossistema natural ao CDV, representando uma ameaça às espécies em
extinção (APPEL et al., 1994; HARDER et al., 1996). Outras investigações foram
realizadas em diversas regiões da Ásia para identificação de anticorpos anti-CDV
em amostras de soros de felinos domésticos, a qual teve variações nos resultados
de acordo com a região (IKEDA et al., 2001).
Apesar da presença de paramixovírus em uma variedade de animais,
nenhum foi observado infectando naturalmente os gatos, e devido à proximidade
com os cães, um grupo de pesquisadores chineses levantaram a hipótese da
ocorrência de um paramixovírus em gatos. Um estudo epidemiológico foi realizado
em Hong Kong para esclarecer a hipótese de que os gatos são hospedeiros de
morbilivírus ainda não descritos, o que culminou na identificação de um morbilivírus
felino (FeMV) que possa estar associado a diversas uropatias, como a nefrite túbulo-
intersticial (WOO, 2012).
11
Para confirmar a ocorrência da infecção pelo FeMV, outras investigações
foram feitas e detectaram a presença do vírus no Japão, Itália, Alemanha, Estados
Unidos e, mais recentemente, na Turquia, levando-se em consideração a ausência
ou manifestação de uropatias, utilizando a técnica de RT-PCR (transcrição reversa
seguida da reação em cadeia pela polimerase) para amplificação do gene L.
(SAKAGUCHI et al., 2014; LORUSSO et al., 2015; SIEG et al., 2015; FURUYA et
al., 2013; PARK et al., 2014; SHARP et al., 2016; YILMAZ et al., 2017).
Entretanto, a relação entre a infecção pelo FeMV e as doenças do trato
urinário em felinos não foi comprovada. Yilmaz et al (2017) relataram achados
histopatológicos renais em animais com FeMV e coronavírus felino (FCoV), além de
colangio-hepatite e necrose hepática, sugerindo que o FeMV também pode replicar-
se no tecido hepático.
Devido à carência de informações sobre o FeMV no Brasil, surge a
necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados
epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante, e devido a isto o objetivo deste
estudo foi identificar a presença do vírus utilizando amostras de urinas de gatos
domésticos e investigar a diversidade genética do FeMV no Brasil, além de
colaborar com as pesquisas sobre a provável relação entre as doenças do trato
urinário e a infecção por este agente viral.
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO
2.1.1 Classificação taxonômica
A família Paramyxoviridae está incluída na ordem Mononegavirales e existem
atualmente sete gêneros classificados nesta família, sendo eles Morbillivirus,
Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus, Aquaparamyxovirus, Ferlavirus e
Avulavirus, e outros que permanecem sem classificação definida até o presente
momento. O gênero Morbillivirus é altamente patogênico para os mamíferos sendo
responsável por doenças em humanos e animais nas últimas duas décadas (LAMB;
PARKS 2013), como sarampo, caxumba, cinomose canina e peste bovina (KING et
al., 2011; WOO, 2012).
De acordo com a classificação do ICTV o gênero Morbillivirus compreende
sete espécies, que incluem o CDV (vírus da cinomose canina), CeMV (morbilivírus
de cetáceos), FeMV (morbilivírus felino), MV (vírus do sarampo), PPRV (vírus da
peste dos pequenos ruminantes), PDV (vírus da cinomose das focas) e RV (vírus
da peste bovina).
2.1.2 Propriedades biológicas do vírus
A família Paramyxoviridae tem uma relação especial com outras duas
famílias de vírus RNA fita simples polaridade negativa que são a família
Orthomyxoviridae, devido as propriedades biológicas das glicoproteínas de
envelope, e a família Rhabdoviridae pela similaridade da organização genômica
não-segmentada e sua expressão (LAMB; PARKS, 2013).
Os morbilivírus são vírus envelopados, com simetria helicoidal à esquerda,
possuem genoma não segmentado e com extensão variável entre 15690 a 16050
nucleotídeos, cuja replicação ocorre inteiramente no citoplasma. Esse gênero
possui seis unidades de transcrição (N, P / V / C, M, F, H e L), tendo uma região
13
extensa não traduzida entre os quadros de leitura abertos (open reading frame –
ORF) codificando a proteína de matriz (M) e glicoproteína de fusão (F) (LAMB;
PARKS, 2013; TAPPAREL; MAURICE; ROUX, 1998). Internamente ao envelope,
encontra-se o núcleo contendo o genoma e as proteínas N (nucleocapsídeo), P
(fosfoproteína) e L (polimerase). O envelope lipídico contém duas glicoproteínas de
superfície, F (proteína de fusão) e H (hemaglutinina) envolvendo os vírions. Entre o
envelope e o núcleo está a proteína de matriz viral (M), sendo uma importante
estrutura para o vírion onde é liberada durante a entrada do vírus (LAMB; PARKS,
2013).
O gene L é amplamente utilizado nos diagnósticos moleculares devido ao
fato de constituir uma sequência conservada no genoma (WOO et al., 2012;
FURUYA et al., 2014).
Os morbilivírus partilham de diversas características biológicas que devem
ser consideradas quando novos vírus são descobertos em amostras clínicas
durante inquéritos epidemiológicos. Acima de tudo, este gênero compreende
viroses altamente linfotrópicas e o CD150 (molécula de ativação de linfócitos de
sinalização) é o receptor universal, sendo este essencial para iniciar uma infecção.
Esta molécula está presente na superfície celular de linfócitos T e B, células
dendríticas e macrófagos (TATSUO; ONO; YANAGI, 2001).
Uma característica biológica pertencente ao FeMV é a infectividade do vírus
em cultivos celulares. Pesquisas realizadas para detecção da infecção viral, através
da inoculação do vírus em células hospedeiras de diversos animais, comprovaram
um maior grau de infectividade apenas em células de origem felina (Crandell-Reese
feline kidney - CRFK) e de primatas (célula Vero), não podendo descartar, a partir
disto, a possibilidade de uma infecção futura por FeMV em outras espécies animais
(WOO et al., 2012; SAKAGUCHI et al., 2015).
Koide; Sakaguchi; Miyazawa (2015) realizaram ensaios quantitativos para
diferenciação das características biológicas do FeMV a partir do isolamento viral em
células CRFK seguido de imunofluorescência, utilizando polibreno e tripsina TBCK
tratada (L-1-tosilamida-2-feniletilo clorometil cetona). Foi possível afirmar que os
tratamentos com polibreno e tripsina não são necessários para determinação da
14
titulação e isolamento viral, enquanto outros morbilivírus usam a tripsina para
clivagem da proteína F (Woo et al., VON MESSLING et al., 2001).
Métodos de inativação viral através do tratamento térmico são comuns e
eficazes tanto para vírus envelopados ou não envelopados (BURNOUF;
RADOSEVICH, 2000), e todos os membros da família Paramyxoviridae são
relativamente sensíveis ao aquecimento (ENDERS, 1996). Esse mecanismo ocorre
através da desmontagem de partículas virais pelo calor em proteínas únicas ou
subunidades virais não infecciosas (SCHLEGEL; IMMELMANN; KEMPF, 2001).
Os procedimentos para inativação viral foram pesquisados por Koide;
Sakaguchi; Miyazawa (2015) que puderam comprovar que o FeMV permanece
estável a 4°C por pelo menos 12 dias, o que favorece o armazenamento a longo
prazo do vírus para a detecção e isolamento viral. Além disso, incubação por 12
dias a 37°C também manteve a infectividade do vírus e a 25°C houve diminuição do
título viral, conferindo sobrevivência ao FeMV em temperaturas ambientes. Já a
incubação a 60°C durante 10 minutos foi suficiente para reduzir os títulos virais para
níveis indetectáveis, ocorrendo o mesmo quando o vírus foi submetido a
temperatura de 70°C, tendo uma queda drástica nos títulos virais com apenas 2
minutos, sendo esta última temperatura uma medida confiável para inativação viral,
minimizando os riscos de infecção e contaminação pelo FeMV.
2.2 EPIDEMIOLOGIA
De acordo com Visser e colaboradores (1993), os diferentes morbilivírus
evoluíram provavelmente de um vírus ancestral comum que se adaptou aos seus
respectivos hospedeiros mamíferos, apontando que estes patógenos tem uma
capacidade intrínseca de se adaptarem a novos hospedeiros.
Nos últimos anos, novos paramixovírus provenientes de animais silvestres e
domésticos foram detectados, presumindo que a maioria dessas infecções ocorrem
atravessando as barreiras interespécies (DREXLER, 2012). Acredita-se que o
FeMV seja cosmopolita assim como outros vírus deste gênero, como o vírus do
15
sarampo e o CDV, porém a falta de sequências genômicas completas de espécies
virais de outras regiões impossibilita o levantamento de dados epidemiológicos, a
relevância clínica do agente e a diversidade genética (NAMBULLI et al., 2016).
Em 2012, na China, houve a primeira descrição da ocorrência de um
paramixovírus de felinos, com proximidade filogenética dentre os morbilivírus,
ficando assim classificado como um morbilivírus felino (FeMV). Este estudo
envolveu a avaliação de 427 gatos, sendo 12,3% (56/427) classificados como
positivos para a presença do agente viral em amostras de urina, swab retal e sangue
(WOO et al., 2012).
A próxima descrição do FeMV foi realizada no Japão em 2013, envolvendo
82 amostras de urina, 10 alíquotas de sangue selecionados de forma randomizada
e 10 tecidos renais de gatos domésticos com nefrite fixados em parafina. O
percentual de animais positivos foi 6,1% (5/82), 10% (1/10) e 40% (4/10) para
amostras de urina, sangue e tecidos renais, respectivamente (FURUYA et al., 2014).
De acordo com a classificação filogenética, os morbilivírus descritos na China e
Japão se mostraram geneticamente diferentes de outros já descritos (WOO et al.,
2012; DE VRIES; DUPREX, DE SWART, 2015), e pertencentes à uma classe de
paramixovírus não classificados (FURUYA et al., 2014; SAKAGUCHI et al., 2014).
Após as descobertas na China e no Japão, deu-se a primeira evidência do
FeMV na Europa, na Alemanha. Tal relato foi conduzido com um grupo de gatos
afetados por diversas uropatias e um grupo controle, sendo observada a presença
do vírus apenas em gatos doentes (6,7%). Além disso, foi encontrado um
paramixovírus diferente dos previamente detectados na China e Japão, com apenas
86% de homologia a outros morbilivírus felinos conhecidos (SIEG et al., 2015).
Posteriormente, foi realizada a detecção do vírus na Itália em uma amostra de urina
de um felino de 15 anos de idade com sinais compatíveis de nefropatia (LORUSSO
et al., 2015).
Um estudo conduzido nos Estados Unidos por Sharp e colaboradores (2016)
detectou a presença do FeMV em apenas 3% das amostras de urina de gatos
domésticos, incluindo animais com presença ou ausência de uropatias, e as
sequências encontradas semelhantes às detectadas na China e Japão. Outro dado
16
obtido neste estudo foi o monitoramento de um gato saudável, onde observou-se
que por 15 meses permaneceu excretando o vírus, sugerindo uma cronicidade da
infecção.
Mais recentemente, na Túrquia, o FeMV foi investigado em 110 amostras de
urina e 15 amostras de tecidos fixados em formol, sendo detectado o vírus na urina
de 6 gatos (5,4%) e em 4 gatos houve a detecção do agente em tecidos como rins,
fígado, pulmão, baço, intestino e linfonodos (YILMAZ et al., 2017).
De fato, além da presença de morbilivírus felino, também foram descritos
paramixovírus felino (FPaV), sendo este último mais intimamente relacionado a
paramixovírus de roedores e morcegos (SIEG et al., 2015). Indubitavelmente, a
descoberta de novos paramixovírus em gatos ressalta ainda mais a importância de
se ter um plano de vigilância adequado para infecções virais em animais domésticos
que possam potencialmente infectar seres humanos, como proposto pela One
Health (MARCACCI et al., 2016).
2.3 DIAGNÓSTICO
Desde a primeira descoberta do vírus, diversos métodos diagnósticos foram
implantados, incluindo técnicas indiretas e diretas para detecção do FeMV. O
método de diagnóstico direto mais utilizado é a RT-PCR, através do uso de primers
consensuais ou específicos para amplificação de determinado fragmento do RNA
viral. Além da RT-PCR convencional, pode-se utilizar a RT-qPCR (Real Time RT-
PCR), que além de quantificar, traz também maiores taxas de detecção do vírus. As
amostras para execução de tal técnica podem ser desde fluídos como urina e
sangue, swab nasal e/ou retal e, até mesmo tecidos parafinados (WOO et al., 2012;
YILMAZ et al., 2017; SIEG et al., 2015; SAKAGUCHI et al., 2014; LORUSSO et al.,
2015; SHARP et al., 2016; FURUYA et al., 201; PARK et al., 2014).
Apesar da RT-PCR ser um dos métodos mais confiáveis para detecção do
FeMV, este teste passa por diversas etapas de amplificação e o uso de
termocicladores para submissão da reação a diferentes temperaturas. Por isso, a
17
nova técnica RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification) foi testada com sucesso (KOIDE et al., 2016). Essa técnica recém-
desenvolvida é um método de amplificação que combina rapidez, simplicidade e alta
especificidade desde a extração de ácidos nucléicos até a detecção do agente,
sendo possível a amplificação de um DNA em 1000 vezes em até 60 minutos
(NOTOMI et al., 2015).
Outros métodos para detecção viral também são utilizados com frequência,
não somente para o FeMV, mas também para relacionar os animais positivos para
o FeMV com FIV, FeLV (vírus da leucemia felina), coronavírus e outras doenças. A
principal técnica de diagnóstico indireto utilizada é a imunofluorescência indireta
(IFA), através da detecção de anticorpos anti-FeMV em amostras de soros de felinos
(WOO et al., 2012; SAKAGUCHI et al., 2014; SHARP et al., 2016; KOIDE;
SAKAGUCHI; MIYAZAWA, 2015; YILMAZ et al., 2017).
Outro método indireto empregado para a detecção de anticorpos contra a
proteína N do FeMV é o immunoblot, utilizando amostras de plasma de felinos. Este
método foi utilizado pelos pesquisadores de modo a comparar as amostras positivas
utilizando técnicas moleculares, como a RT-PCR, com amostras reagentes ao
immunoblot, sendo possível indicar que alguns gatos, individualmente, têm
anticorpos contra o agente com duração prolongada. Na pesquisa realizada por
Woo e colaboradores (2012) envolvendo 56 gatos positivos para o FeMV na RT-
PCR, apenas cinco reagiram positivamente ao teste. Outra pesquisa realizada no
Japão obteve apenas um felino positivo no immunoblot dos três gatos positivos na
RT-PCR, porém dos 10 gatos negativos na RT-PCR, dois deles reagiram
positivamente ao teste sorológico (SAKAGUCHI et al., 2014).
Em geral, o isolamento viral é considerado uma técnica padrão ouro, sendo
um dos métodos mais confiáveis para a detecção do vírus. Porém, este teste requer
múltiplas passagens e o efeito citopático induzido pelo FeMV é pequeno e ainda
pouco esclarecido (KOIDE; SAKAGUCHI; MIYAZAWA, 2015). Diante disto,
Sakaguchi e colaboradores (2015) realizaram um estudo infectando diversas
linhagens de células cultivadas, de diversas espécies, durante duas semanas para
18
avaliação da eficácia de replicação do vírus em cada tipo de célula, tendo melhores
resultados nas células CRFK e Vero.
Para a detecção de antígenos do FeMV em tecidos fixados realiza-se a
técnica de imunohistoquímica, utilizando o anticorpo policlonal proveniente do soro
de porquinhos-da-índia infectados com a proteína N do FeMV, em tecidos fixados
em formol, os quais podem ser rins, fígado e linfonodos (WOO et al., 2012; YILMAZ
et al., 2017).
Técnicas complementares para relacionar lesões renais com animais
infectados pelo FeMV podem ser utilizadas, como análises hematológicas e
bioquímicas séricas e urinárias, urinálise e histopatológico de fragmentos de tecidos
renais (WOO et al., 2012; YILMAZ et al., 2017).
2.4 ASSOCIAÇÃO DO FeMV COM A DOENÇA RENAL CRÔNICA
A doença renal crônica (DRC) é comumente encontrada em felinos idosos
(com idade superior a 10 anos) e definida como um declínio irreversível da função
renal acima de 50% da taxa de filtração glomerular, durante pelo menos três meses
(PIYARUNGSRI; PUSOONTHORNTHUM, 2016; FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).
A DRC nos animais não se trata de uma síndrome única, mas heterogênea,
resultando em perda de massa renal funcional devido ao surgimento de desordens
congênitas ou adquiridas. Além disso, danos renais agudos podem ocorrer, como
os casos de obstrução urinária, depósito de nefrotoxinas, pielonefrite ou lesão
isquêmica evoluindo para a DRC (FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).
Existem dados limitados acerca da prevalência da DRC em gatos mesmo
com uma alta casuística de diagnósticos dessa síndrome nos felinos domésticos
(BROWN et al., 2016). Por ser uma doença com alta morbidade e mortalidade em
gatos, tem-se muito interesse em identificar fatores de risco e etiológicos para esta
síndrome, os quais podem ajudar, não somente, no diagnóstico precoce, mas
também no entendimento da patogênese e no desenvolvimento de novas medidas
terapêuticas (LULICH et al., 1992).
19
Dentre os fatores de risco da DRC estão incluídas diversas alterações
fenotípicas, metabólicas, nutricionais e clínicas como perda de peso, desidratação,
histórico recente de anestesia geral, diagnóstico prévio de doença periodontal,
cistite em machos (GREENE et al., 2014), hipertireoidismo, doença do trato urinário
inferior, vômitos frequentes, alterações no apetite (BARTLETT et al., 2010), dieta
com baixa quantidade de fibras (HUGHES et al., 2002) e gatos infectados com FIV
(vírus da imunodeficiência felina) (WHITE et al., 2010). Além disso, existem raças
predispostas ao desenvolvimento da DRC como Maine Coon, Abissínio, Siamês,
Azul Russo e Birmanês (LULICH et al., 1992)
Estudos sugerem que não existe um único fator de risco ou exposição que
possa explicar o desenvolvimento da DRC em gatos, mas deve-se considerar que
os efeitos cumulativos de múltiplos fatores de risco e fatores interativos podem
contribuir para uma diminuição da função renal (FINCH; SYME; ELLIOTT, 2016).
A severidade da DRC em gatos é variável e pode ser estagiada de acordo
com as recomendações da IRIS (International Renal Interest Society). Mudanças
adaptativas na estrutura e função renal, como hiperfiltração, hipertensão e
hipertrofia glomerulares ocorrem quando a função renal é reduzida devido a
hipótese de que todas as doenças renais são autoperpetuantes e inerentemente
progressivas (BROWN et al., 1997). Alterações extrarrenais como hiperfosfatemia,
hiperparatireoidismo secundário renal, hipocalemia, anemia, proteinúria,
hipertensão sistêmica, acidose metabólica e uremia podem contribuir para a
progressão da doença dificultando o tratamento (ELLIOTT; WATSON, 2014) e o
prognóstico (BOYD et al., 2008).
A maioria dos gatos geriátricos com DRC não possuem evidências
histológicas de doença glomerular primária, como a glomerulonefrite
imunocomplexa e a amiloidose, apesar de serem achados descritos em gatos
resultando em lesões túbulo-intersticiais crônicas. Alternativamente, na maioria dos
gatos com DRC, as lesões primárias estão dentro do compartimento túbulo-
intersticial apresentando lesões escleróticas secundárias (CHAKRABARTI et al.,
2013; McLELAND et al., 2015).
20
De maneira geral, os rins afetados com a DRC são diminuídos de tamanho
com superfície irregular. Histologicamente, as lesões renais são multifocais a
segmentares, além da fibrose intersticial, degeneração tubular e atrofia,
mineralização das cápsulas de Bowman e membranas basais tubulares e
glomerulosclerose (CHAKRABARTI et al., 2013; McLELAND et al., 2015).
Complementarmente, o FeMV possui patogenia diferente de outros
morbilivírus, sendo que este pode estar associado à uropatias como a nefrite túbulo-
intersticial, sendo muitas vezes questionado com relação a sua taxonomia (DE
VRIES; DUPREX, DE SWART, 2015). Ainda é incerto se este vírus é emergente ou
se sempre existiu e nunca foi detectado, e também se ele provoca doenças em
outras espécies de felídeos (PARK et al., 2014).
Segundo Woo e colaboradores (2012) o morbilivírus felino está relacionado
a nefrite túbulo-intersticial, a qual compreende uma lesão primária aos túbulos
renais e interstício, sendo esta a causa mais comum de insuficiência renal e uma
das principais causas de mortes em gatos (PITTARI et al., 2009). Cerca de 30% dos
gatos com idade superior a 15 anos sofrem de insuficiência renal crônica (LULICH
et al., 1992).
Outros estudos corroboram com os achados de Woo e colaboradores (2012),
como a detecção do agente viral por RT-PCR na Itália em uma amostra de urina de
um gato com nefropatia severa (LORUSSO et al., 2015). Da mesma maneira, no
Japão, amostras de urina, sangue e tecidos parafinados foram positivas para o
vírus, sendo maior a prevalência nesta última amostra, sustentando a hipótese de
que existe uma alta infecção por FeMV em gatos com nefrite (FURUYA et al., 2013).
Um estudo de caso controle realizado na Alemanha detectou o vírus apenas em
gatos que apresentavam sinais clínicos compatíveis com uropatias, cuja prevalência
foi de 6,7% de gatos positivos dentre 120 amostras de urina coletadas (SIEG et al.,
2015).
De modo contrário, Sharp e colaboradores (2016), nos Estados Unidos, não
relacionaram a presença do FeMV à doença renal, pois foram avaliadas 327
amostras de urina, sendo realizada a detecção do vírus em 10 felinos, dos quais
sete eram clinicamente saudáveis e três tinham doença renal crônica. Além disso,
21
um gato foi acompanhado durante 15 meses e manteve-se clinicamente saudável,
mesmo com a excreção contínua do vírus neste intervalo de tempo.
Uma pesquisa realizada recentemente na Turquia, também não pode
comprovar a relação de animais com alterações no trato urinário com a presença
do vírus. Foram analisadas 110 amostras, sendo 95 de urina e 15 fragmentos de
tecido renal e o RNA viral foi detectado em 6 amostras de urina enquanto que nos
tecidos renais apenas três amostras apresentavam o genoma viral. Além disso, os
achados clínico-patológicos foram semelhantes tanto em gatos infectados quanto
não-infectados para o FeMV (YILMAZ et al., 2017).
Diante disto, ressalta-se a necessidade de estudos epidemiológicos
adicionais e mais abrangentes, e infecções experimentais para determinar se o vírus
causa a DRC ou se apenas se beneficia dos tecidos renais inflamados ou da falha
imunológica dos rins como base para a infecção (SAKAGUCHI et al., 2014 SIEG et
al., 2015).
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26
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a ocorrência da infecção pelo paramixovírus em gatos
domésticos e sua provável relação com alterações renais em animais
excretando o vírus.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a frequência de infecção pelo paramixovírus em gatos
domésticos através da detecção do RNA viral em amostras de urina
por meio da técnica de RT-snPCR
Relacionar o percentual de animais excretando o vírus quanto à perda
da função renal
Caracterizar geneticamente o agente viral identificado através da RT-
PCR seguida de sequenciamento direto dos amplicons obtidos
27
4 ARTIGO
FIRST REPORT OF FELINE MORBILLIVIRUS IN SOUTH AMERICA
28
First report of feline morbillivirus in South America
Gabriela Molinari Darold1,*, Amauri Alcindo Alfieri4, Lívia Saab Muraro2, Alexandre Mendes Amude3,
Rosana Zanatta3, Kelly Cristiane Ito Yamauchi3, Alice Fernandes Alfieri4, Michele Lunardi1,*, #
1Laboratories of Veterinary Microbiology and 2Veterinary Clinical Pathology, 3Department of Small Animal
Medicine, Teaching Veterinary Hospital, University of Cuiabá, 3100 Ave Beira Rio, 78065-900 Cuiabá, MT,
Brazil 4Laboratory of Animal Virology, Department of Veterinary Preventive Medicine, Universidade Estadual de
Londrina, Celso Garcia Cid Road, PR 445 Km 380, 86051-990 Londrina, PR, Brazil
*Both authors contributed equally to the development of this paper.
# Corresponding author. Tel.: +55 65 3363 1271; fax: +55 65 3363 1271. E-mail address:
michelelunardi@gmail.com (M. Lunardi)
Received: 27 July 2016/ Accepted: 17 October 2016/ Published Online: 2 November 2016
© Springer-Verlag Wien 2016
Abstract. The first identification of feline morbillivirus occurred in healthy and diseased
stray cats captured in Hong Kong. Recently, viral circulation was demonstrated within cat
populations from Japan, Italy, Germany, and US. Importantly, association between feline
morbillivirus infection and chronic kidney disease was suggested by histological analyses in
kidney tissue of infected cats. The aim of this study was to verify the presence and genetic
diversity in feline morbilliviruses that might be associated with infections in domestic cats in
Brazil. Seventeen cats without clinical manifestation of urotract diseases from a multi-cat
household and 35 random client-owned cats admitted to the Teaching Veterinary Hospital
for a variety of reasons were evaluated for paramyxoviral infection and the presence of
uropathies. A partial fragment of the paramyxoviral L gene was amplified from urine samples
using a reverse transcription semi-nested PCR assay. For the first time, we detected a feline
morbillivirus strain genetically related to viral strains previously characterized in Japan, from
urine samples of cats from South America, Brazil. Altogether, with the recent description of
feline morbillivirus identification within cat populations in the US, we suggest a possible
widespread distribution of this viral agent in the American continent. Our data demonstrated
feline morbillivirus RNA shedding mostly in the urine of cats without clinical, laboratorial,
or ultrasonographic signs of urotract diseases. Diversely from findings previously published
which associated feline morbillivirus infection with chronic kidney disease, we could not
observe a clear relationship between feline morbillivirus RNA shedding in urine and kidney
disease in cats evaluated.
Keywords: Cats; Chronic kidney disease; Paramyxoviruses; RT-PCR; Phylogeny; Brazil.
29
Introduction
Members of the Paramyxoviridae family are enveloped, negative-sense single-
stranded RNA viruses that are classified into subfamilies Paramyxovirinae and
Pneumovirinae. Currently, the subfamily Paramyxovirinae groups five genera,
Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus, together with some
members that remain unclassified [1]. Paramyxoviruses infect many species such as humans
and domestic and wild animals, and have been correlated with serious diseases with zoonotic
potential or significant economic impact. In the past two decades, new unclassified
paramyxoviruses have been described from either disease outbreaks or subclinical infections
of both humans and animals. This raises the concern that viruses have crossed over from their
original hosts to other species [2-6].
Within Morbillivirus, which includes pathogens that are significant to the medical and
veterinary fields, canine distemper virus (CDV) has been recognized for its importance as an
infective agent of carnivores. Despite being well known for its high potential to affect
domestic and wild canids, CDV infections have been observed among large felids. Outbreaks
involving diverse species maintained in captivity or in natural ecosystems have been
documented worldwide [7-10]. This represents a threat to the endangered feline species.
Investigations have identified neutralizing antibodies against CDV in serum samples
from cats living in diverse geographical locations [11, 12]. To test the hypothesis that cats
also represent a host species for previously undescribed morbilliviruses, one research group
recently performed a molecular epidemiological study of a large number of stray cats
captured in Hong Kong. This culminated in the identification of feline morbillivirus (FeMV)
in both healthy and diseased animals [13].
To confirm the occurrence of FeMV infection in domestic cats with or without
manifestation of uropathies, from other geographical regions, diverse surveys based on RT-
PCR analysis, employing several primer sets for amplification of the FeMV L gene, revealed
viral circulation within cat populations from Japan, Italy, Germany, and more recently, from
the US [14-19].
30
In an attempt to verify diseases related to FeMV infection in cats from Hong Kong,
histopathological examination of tissues from two euthanized RT-PCR positive animals
showed interstitial inflammatory infiltrates and renal tubular degeneration or necrosis. In
addition, viral replication in this organ was confirmed by immunohistochemical staining of
renal tubular cells [13]. However, the association between FeMV infection and feline chronic
kidney disease (CKD) was not proven by studies in FeMV-naive cats. Therefore, systematic
research of cat populations and studies based on experimental infection are needed to
elucidate the correlation of FeMV with renal disease [16, 18, 19].
The aim of this study was to verify the presence and genetic diversity in FeMV that
might be associated with infections in cats in Brazil. We evaluated shedding of viral RNA in
urine samples from domestic cats presenting chronic kidney disease and without any apparent
uropathy.
Materials and methods
Animals and clinical samples
In this study, 17 cats without clinical manifestation of urotract diseases from a multi-
cat household in Cuiabá, Western Brazil, wherein 23 stray cats were housed in close contact,
were evaluated for paramyxoviral infection and the presence of uropathies. In addition, 35
random client-owned cats admitted to the Department of Small Animal Medicine of the
University of Cuiabá Teaching Veterinary Hospital for a variety of reasons including
uropathies, were also investigated for paramyxovirus infection. The group of animals was
composed of the same proportion of males (n = 26) and females (n = 26), with ages ranging
from 1 month to 15 years, with an average age of five years. Blood and urine samples were
collected from all animals, the latter being obtained by cystocentesis, with ultrasound
guidance. Sample collection was performed based on ethical and animal welfare
considerations.
Clinical pathology evaluation and immunochromatographic tests
31
Serum biochemistry screening included tests for creatinine, total protein, globulin,
and albumin concentrations for all cats; normal ranges were considered to be < 1.8 mg/dl,
5.4–7.6 g/dl, 2.6–5.1 g/dl, and 2.1–3.9 g/dl, respectively. Urine samples of all cats from the
multi-cat household and most animals that were brought to the hospital were evaluated by
standard urinalysis including urine specific gravity (USG), dipstick analysis, urine sediment
analysis, and urine protein to creatinine concentration ratio (UPCR).
In this study, some cats were diagnosed with chronic kidney disease (CKD) based on
the detection of functional kidney damage observed by means of proteinuria, and indicated
by UPCR values 0.4 and/or USG 1035 and/or evidence of structural kidney change
demonstrated by ultrasound examination, irrespective of the presence of azotemia.
In addition, serum samples from all cats were simultaneously tested by rapid
immunoassay to detect the feline leukemia virus (FeLV) antigen and antibodies against feline
immunodeficiency virus (FIV) using a FIV/FeLV Combo Test (IDEXX, Westbrook, USA).
Ultrasonography evaluation
Ultrasound images were obtained using real-time ultrasonographic equipment with
linear array transducer frequencies of 7.5–12 MHz. Sagittal and transverse ultrasonography
images of the kidney were obtained to evaluate echogenicity, size, shape, position,
corticomedullary differentiation, and to determine focal or diffuse abnormalities of the renal
parenchyma and renal pelvis, collecting system, and proximal ureters. The bladder was
scanned from left to right in the longitudinal plane and cranial to caudal in the transverse
plane to evaluate wall thickness and regularity, distention, shape, location, and content.
Reverse transcription semi-nested PCR assay
Viral RNA was extracted from urine samples using the QIAamp Viral RNA Mini Kit
(Qiagen, Hilden, Germany), following the manufacturer’s instructions. To amplify a partial
fragment of the paramyxoviral L gene, which is the most conserved gene in the viral genome,
a reverse transcription semi-nested PCR (RT-snPCR) system was used. Initially, viral RNA
32
was amplified using SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, USA) with a specific forward
primer, whereas semi-nested PCR was performed with primers that anneal to a conserved
region of L gene in Respirovirus, Morbillivirus, and Henipavirus genera, as described
previously, with Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Sao Paulo, Brazil) [20].
Aliquots from the PCR-amplified products were analyzed by electrophoresis in a 2% agarose
gel stained with ethidium bromide (0.5 mg/ml) and examined under UV light.
Direct sequencing
All PCR products were purified using the PureLink Quick Gel Extraction and PCR
Purification Combo Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Direct sequencing was performed using
the BigDye Terminator v.3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Carlsbad, USA)
with forward and reverse primers and the 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,
Carlsbad, USA), according to the manufacturer’s instructions.
All sequences obtained were examined with the Phred application for quality analysis
of chromatogram readings. The sequences were accepted if the base quality was 20. The
consensus sequences were determined using CAP3 software, and the sequence identities
were compared with all sequences deposited in GenBank using the BLAST program.
Phylogenetic analyses
Pairwise and multiple sequence alignments at the nucleotide and amino acid levels
and sequence similarities were calculated using ClustalW in MEGA v5 software [21]. The L
gene nucleotide sequences of previously reported FeMV strains, representatives of
Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus genera, as well as
some unclassified paramyxoviruses, were included in the analyses. Phylogenetic trees were
reconstructed from a partial fragment of the L gene nucleotide sequence alignment using the
Maximum-likelihood method with the Kimura two-parameter model using MEGA v5
software.
33
The partial sequences of L gene of FeMVBR1 strain were deposited in GenBank
database, developed by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), with the
accession numbers KX452069, KX452070, KX452071, KX452072, KX452073, KX452074,
KX452075, KX452076, and KX452077.
Results
RT-snPCR for paramyxovirus detection in urine samples revealed positive rates of
52.9% (9/17) for cats belonging to the multi-cat household, whereas 8.6% (3/35) of cats
individually admitted to the Teaching Veterinary Hospital were shedding paramyxovirus
RNA through their urine. Five of the 17 cats from the multi-cat household were diagnosed
with non-azotemic CKD. Only two of these cats, in which viral RNA was detected in the
urine, presented with preserved renal function as indicated by normal serum creatinine levels,
USG, and UPCR, with evidence of structural changes in the kidney based on ultrasound
evaluation, demonstrated by the loss of corticomedullary distinction and increased
echogenicity of the renal cortex (Table 1). Of the 35 cats brought to the hospital for a variety
of reasons, 17 were diagnosed with CKD, whereas only one was experiencing urethral plugs.
Among patients attended at the veterinary hospital experiencing uropathies, paramyxoviral
RNA was detected in the urine sample of only one animal. This cat presented with normal
kidney function as suggested by normal level of serum creatinine, USG, and UPCR.
However, upon ultrasound examination, the kidneys were shown to have hyperechoic
cortices (Table 1).
FIV infection was identified by rapid immunoassay in three paramyxovirus-positive
cats, two being from the multi-cat household. Two of the three cats having paramyxoviral
and retroviral infections were also diagnosed with non-azotemic CKD based on evidence of
structural kidney changes upon ultrasound evaluation (Table 1). Among the paramyxovirus-
negative cats, four and two were infected with FIV and FeLV, respectively.
34
Table 1 Characteristics of domestic cats that were shedding FeMV RNA in urine samples
evaluated in this investigation
Animal Agea Genderb Origin Renal
functionc
Kidney
structural
changesd
Health
status
FIV
statuse
FeLV
statuse
FeMV GenBank
accession numberf
1 7 y F veterinary
hospital preserved absent normal - - KX452069
2 adult M veterinary
hospital preserved present
non-
azotemic
CKD
+ - KX452070
3 8 y F multi-cat
household preserved absent normal + - KX452071
4 8 y M multi-cat
household preserved present
non-
azotemic
CKD
+ - KX452072
5 6 m M multi-cat
household preserved absent normal - - KX452073
6 5 y F multi-cat
household preserved present
non-
azotemic
CKD
- - KX452074
7 6 y F multi-cat
household preserved absent normal - - KX452075
8 4 y F multi-cat
household preserved absent normal - - KX452076
9 5 y F multi-cat
household preserved absent normal - - KX452077
10 1,5 y M multi-cat
household preserved absent normal - - NS
11 6 y F multi-cat
household preserved absent normal - - NS
12 9 y F veterinary
hospital preserved absent normal - - NS
a y, year(s); m, months b F, female; M, male c Renal function was evaluated through serum biochemistry and standard urinalysis d Renal structure was evaluated by ultrasonography evaluation e -, negative; + positive f NS, not sequenced
Direct sequencing of amplicons obtained from nine cats, from the first and second
rounds of RT-snPCR, confirmed that amplified L gene fragments corresponded to previously
published feline morbillivirus. Despite several attempts, PCR products amplified from the
urine of three paramyxovirus-positive cats could not be sequenced because of limited
amounts of sample. The FeMV strain identified in this study, referred to as FeMVBR1, was
shown to be 98% identical to the Japanese strains SS1 and OtJP001 based on partial L gene
35
nucleotide sequences. Pairwise comparisons of the partial L gene nucleotide and amino acid
sequences of FeMVBR1, with the corresponding sequences of previously reported FeMV
strains, are demonstrated in Table 2. In this investigation, FeMV sequences detected in nine
cats with or without urinary tract diseases, were closely related to each other with nearly
100% identity based on partial L gene nucleotide sequences.
Table 2 Pairwise comparison of nucleotide (bottom left) and amino acid (upper right)
partial sequences of FeMV L gene
Similarity in percentage
Strains FeMVBR1* US1 M252A SS2 OtJP001
FeMVBR1* 95.1 96.2 95.6 99.4
US1 88.5 97.8 98.3 95.6
M252A 89.9 93.0 98.3 96.7
SS2 89.9 92.8 95.3 96.2
OtJP001 98.0 89.0 90.5 90.1
* Feline morbillivirus strain identified in this study.
For the maximum-likelihood phylogenetic tree, based on partial L gene nucleotide
sequences, the FeMVBR1 strain clustered with other previously reported FeMV strains
identified from diverse geographical locations around the world, indicating that they form a
distinct clade apart from the cluster containing other morbilliviruses. FeMVBR1 was shown
to be only distantly related to representatives of Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and
Rubulavirus genera and other paramyxoviruses that remain unclassified (Fig. 1).
36
Fig. 1 Maximum-likelihood phylogenetic tree constructed based on partial L gene nucleotide
sequences of FeMVs, Morbillivirus, Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus, and Rubulavirus
genera, and unclassified paramyxoviruses. Brazilian FeMVBR1 strain identified in this study is
represented by a black circle symbol. Numbers at internal nodes represent the bootstrap support
values (percentages) determined for 1,000 replications (values less than 60 are not shown). The
scale bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. GenBank accession numbers
of paramyxoviral sequences included in the phylogenetic analysis are stated in parentheses
37
Discussion
For the first time, we detected a FeMV strain genetically related to viral strains
previously characterized in Japan, from urine samples of cats from South America, Brazil,
through RT-snPCR and direct sequencing. Altogether, with the recent description of FeMV
identification within cat populations in the US, we suggest a possible widespread distribution
of this viral agent in the American continent [19].
In our study, the positive rate for shedding of FeMV RNA in the urine of cats living
in a multi-cat household was higher (52.9%) than the frequencies observed in other
investigations. In contrast to our data which demonstrated that only three of 23 cats with
uropathies were eliminating virus in urine, previously obtained FeMV positive rates were
high, ranging from 6.7–40%, only for cats suffering from kidney disease, as demonstrated by
testing kidney tissues from cats with nephritis or urine from cats with other urotract diseases
[14, 18]. In a recent investigation of urine samples from German cats attended at a veterinary
hospital, sequences from paramyxoviral L gene could not be amplified from 86 evaluated
cats without clinical or laboratory evidence of urotract diseases. Differently, FeMV strains
were identified exclusively in urine samples from cats aging from seven to 18 years old and
suffering from diverse uropathies as feline lower urinary tract disease (FLUTD), urostasis,
urolithiasis, cystitis and CKD [18]. Recently, a RT-nested PCR for FeMV partial L gene
amplification revealed that 40% of archival kidney tissues of Japanese cats with nephritis,
collected at veterinary clinics, tested positive for the presence of FeMV RNA while only
6.1% of urine samples from patients randomly choosen, had FeMV L gene detected based on
this assay [14]. A hypothesis that could explain the higher rate of feline paramyxovirus
detection in Brazilian cat urine could be the occurrence of long-term viral shedding through
the urine, as previously suggested for FeMV infections [19]. However, testing additional
groups of cats will be required to support this hypothesis.
In this study, we used the nucleotide sequences of partial fragments of the L gene,
from paramyxovirus species isolated from cats of diverse countries and other members of
Paramyxoviridae, in the construction of maximum-likelihood phylogenetic trees.
Phylogenetic analyses of paramyxoviral sequences identified in domestic cats from Brazil
demonstrated that feline morbillivirus was detected. The herein identified strain, named
38
FeMVBR1, was shown to be closely related to the previously characterized Japanese strains
SS1 and OtJP001, which were detected from urine samples of domestic cats. These FeMV
sequences formed a distinct cluster in the phylogenetic tree, apart from the group consisting
of Morbillivirus, and being only distantly related to Henipavirus, Respirovirus, Avulavirus,
Rubulavirus, and other unclassified paramyxoviruses. However, it is still uncertain whether
FeMV strains identified from domestic cats from different geographical regions represent a
new species of the Morbillivirus genus or whether they are also unclassified paramyxoviruses
within this viral family [16]. Accordingly, it seems that these phylogenetically related viruses
most likely present a ubiquitous distribution within domestic cat populations worldwide.
Whether FeMV is able to infect and cause disease in other representatives of Felidae is
uncertain. The example of CDV, which has a well-known tendency for host switching, has
raised concerns about its potential threat to endangered animal species. This might justify
further investigations attempting to identify these new morbilliviruses in healthy and diseased
individuals in this and other families of wildlife.
The association between FeMV infection and tubulointerstitial nephritis in domestic
cats, one of the leading causes of death in older cats with a prevalence of 1.6–20%, was
examined through a case-control study involving 27 stray cats from Hong Kong. The ratio of
cats affected by renal disease was confirmed to be higher in the group of infected cats (7/12)
than in the group of uninfected animals (2/15) [13, 22, 23]. In contrast, our data demonstrated
FeMV RNA shedding mostly in the urine of cats without clinical, laboratorial, or
ultrasonographic signs of urotract diseases (9/12), with the exception of three cats with
preserved kidney function but ultrasound findings compatible with CKD. It is noteworthy to
highlight that two of these three FeMV positive-cats with non-azotemic CKD were also
infected with FIV, which is also associated with this renal disease, making it difficult to
correlate the observed CKD with FeMV infection [24, 25]. However, data obtained in this
study was contrary to previous findings obtained in other investigations, which highlighted
an association between FeMV infections and CKD in domestic cats [13, 18, 14]. A reasonable
hypothesis to explain this difference could be that in our study, the evaluation of cats occurred
during the early stages of infection when no damage to kidney function and structure had
occurred. Thus, it is clear that further epidemiological studies, with larger numbers of cats
39
affected and unaffected by kidney disease, as well as investigations based on experimental
infection, will clarify the pathogenesis of FeMV in domestic cats.
According to data presented recently, there is substantial evidence that FeMV can
chronically infect healthy cats, being shed persistently in the urine for a period of at least 15
months [19]. Based on this finding, a follow-up of paramyxovirus-infected cats is ongoing to
confirm the long term shedding of this viral agent and to verify the development of renal
disease or FLUTD.
In the present study, we report the first evidence of FeMV infection in cat populations
from South America (Brazil). Additionally, diversely from findings previously published
which associated FeMV infection with CKD in domestic cats, we could not observe any clear
relationship between FeMV RNA shedding in urine and kidney disease in cats that were
evaluated herein. Detailed molecular epidemiological investigations involving larger
numbers of cats with and without urotract diseases from different geographical areas within
South America are required to define the prevalence of FeMV infection in healthy and
diseased cats and the genetic diversity of viral strains that are circulating in cat populations
from this region.
Acknowledgments
This study was supported by University of Cuiabá and the Brazilian funding agencies National
Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq) and Brazilian Innovation Agency
(FINEP). A.A.A. and A.F.A. are supported by research fellowships and grants from CNPq.
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest.
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42
5 ARTIGO
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS
DE CUIABÁ, MATO GROSSO
43
DETECÇÃO MOLECULAR DE PARAMIXOVÍRUS EM GATOS DOMÉSTICOS DE CUIABÁ, MATO GROSSO
Gabriela Molinari Darold1,*, Amauri Alcindo Alfieri4, Lívia Saab Muraro2, Alexandre Mendes Amude3, Káryta Maria de Lima Bezerra Bertti1, Janine Cruvinel de Lima2, Alice Fernandes Alfieri4, Michele Lunardi1,*
1Laboratório de Biologia Molecular e Virologia Animal, 2Laboratório de Patologia Clínica e 3Departamento Clínico de Pequenos Animais - Faculdade de Medicina Veterinária - Universidade de Cuiabá, Avenida Beira Rio, 3100, 78065-900, Cuiabá, MT, Brasil, 4Laboratório de Virologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380, 86051-990 Londrina, PR, Brasil *Both authors contributed equally to the development of this paper.
RESUMO
O gênero Morbillivirus, incluído na família Paramyxoviridae, compreende patógenos de extrema importância em Medicina Veterinária. Em 2012 um novo morbilivírus foi identificado em gatos domésticos em Hong Kong, sendo caracterizado como morbilivírus felino (FeMV). Após essa primeira identificação, novas pesquisas foram realizadas no Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia, e mais recentemente no Brasil, onde foi comprovada a circulação do vírus em todas as regiões descritas. Existem contradições acerca da infecção pelo vírus sobre uma provável associação com a doença renal em felinos. Devido à falta de dados no Brasil, surge a necessidade de maiores investigações sobre o vírus na região para levantar dados epidemiológicos e caracterizar o vírus circulante. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência e analisar a diversidade genética de paramixovírus excretados por gatos domésticos, além de associar os dados com os achados laboratoriais compatíveis com alterações renais. Neste estudo, foram coletadas amostras de urina e sangue de 276 gatos, independentemente do estado clínico, provenientes de abrigos, de protetores e de animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá. Dos 276 gatos avaliados, a presença do vírus em amostras de urina foi detectada por RT-snPCR em 95 (34,4%) animais, sendo que oito animais apresentavam evidências de alterações renais e 87 não apresentavam alterações compatíveis com uropatias. Com esta investigação foi possível demonstrar uma alta prevalência da infecção nos gatos na região, levantando dados epidemiológicos locais e, além disso, não pode ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com alterações renais nos felinos domésticos, demonstrando a necessidade da realização de estudos complementares sobre essa virose no país, para maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.
Palavras-chave: Felinos. Doença Renal. Morbilivírus felino. RT-PCR. Sequenciamento. Brasil.
44
ABSTRACT
The genus Morbillivirus, included in the family Paramyxoviridae comprises pathogens of importance in Veterinary Medicine. A new morbillivirus was identified in domestic cats in Hong Kong in 2012, being characterized as a feline morbillivirus (FeMV). After the initial identification, new investigations carried out in Japan, Italy, Germany, United States, Turkey, and more recently in Brazil, confirmed the viral circulation in all the regions cited. However, contradictions about viral infection and a likely association with a feline kidney disease remains. Due to the lack of data in Brazil, investigations aiming at studying epidemiological aspects of the infection and molecular characterization of viral strains are necessary. The aim of this study was to verify the prevalence and analyze the genetic diversity of paramixovirus excreted by domestic cats, as well as to relate the data with laboratorial findings compatible with renal disorders. In this work, urine and blood samples were collected from 276 cats regardless of clinical status, from shelters, multi-cat household and client-owned admitted to the Department of Small Animal Medicine of the University of Cuiaba Teaching Veterinary Hospital. Of the 276 cats evaluated, the presence of the virus in urine samples was detected by RT-snPCR in 95 (34,4%) cats, eight presenting loss of renal function and 87 without any alteration compatible with uropathies. Through this investigation, it was possible to demonstrate a high prevalence of the viral infection within cats from the region, adding new epidemiological data, demonstrating the necessity to carry out complementary studies on this virus in the country, for better clarification about the pathogenesis of the virus. Keywords: Cats. Kidney disease. Feline morbillivirus. RT-PCR. Sequencing. Brazil.
45
INTRODUÇÃO
A família Paramyxoviridae é composta por vírus envelopados cujo genoma é
constituído de RNA fita simples com polaridade negativa, compreendendo sete
gêneros: Morbillivirus, Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus, Aquaparamyxovirus,
Ferlavirus e Avulavirus. Outros que não possuem classificação definida também
estão agrupados nesta família viral, sendo que os vírus classificados no primeiro
gênero são altamente patogênicos em mamíferos, responsáveis por doenças em
humanos e animais (LAMB; PARKS 2013), como sarampo, cinomose canina e peste
bovina (KING et al., 2011; WOO et al., 2012).
Recentemente, novos vírus emergentes classificados no gênero Morbillivirus,
foram identificados como o phocine distemper virus (PDV) em focas e o morbilivírus
dos cetáceos (CMV) (MAZZARIOL et al., 2012; RUBIO-GUERRI et al., 2013). Além
destes, sabe-se que o vírus da cinomose canina (canine distemper vírus - CDV),
classificado neste gênero, possui uma ampla gama de hospedeiros, incluindo
felídeos silvestres, mamíferos marinhos e primatas (ROELKE-PARKER et al., 1996;
SAKAI et al., 2013).
Em 2012, na China, houve a primeira descrição da ocorrência de um
paramixovírus em felinos domésticos com classificação filogenética no gênero
Morbillivirus, sendo assim designado como morbilivírus felino (FeMV). Após isso,
novas investigações foram realizadas em populações de gatos domésticos de
diversos países, como Japão, Itália, Alemanha, Estados Unidos, Turquia e Brasil
(WOO et al., 2012; FURUYA et al., 2013; LORUSSO et al., 2015; SIEG et al., 2015;
DAROLD et al., 2016; YILMAZ et al., 2017).
De fato, além da presença do morbilivírus felino, também foi descrito o
paramixovírus felino (FPaV), sendo este último mais intimamente relacionado aos
paramixovírus isolados a partir de outras espécies animais, ainda sem classificação
definitiva na família (SIEG et al., 2015).
Além da detecção viral, existem estudos relacionando a presença da infecção
pelo vírus com uropatias e, por isso, este trabalho teve como objetivo o estudo da
46
frequência da infecção pelo agente viral em gatos domésticos de Cuiabá, assim
como verificar a sua provável relação com achados laboratoriais compatíveis com
alterações renais.
MATERIAL E MÉTODOS
ANIMAIS E AMOSTRAS
Neste estudo, foram incluídos 276 gatos domésticos, independentemente da
apresentação de algum sinal clínico, provenientes de atendimentos no Hospital
Veterinário da Universidade de Cuiabá – UNIC (n = 59), de abrigos (n = 136) e de
acumuladores (n = 81). Entre os animais avaliados, 161 eram machos e 115 fêmeas,
com idades variando entre 3 meses e 12 anos e pertencentes a diversas raças entre
persa (n = 8), siameses (n = 5) e sem raça definida (n = 263).
Amostras de sangue e urina foram coletadas de todos os animais, sendo esta
última coletada por meio de cistocentese, ambas respeitando os conceitos éticos e
de bem-estar animal durante a contenção e coleta.
ANÁLISE CLÍNICO-LABORATORIAL
A análise bioquímica sérica de todos os gatos incluiu testes de dosagem de
creatinina, proteínas totais, albumina e globulina, cujos valores de referência
considerados foram de 0,8 – 1,8 mg/dl; 5,4 – 7,6 g/dl; 2,1 – 3,9 g/dl; 2,6 – 5,1 g/dl,
respectivamente (MEYER; HARVEY, 1998). As amostras de urina foram avaliadas
através da urinálise (avaliação física, química e de sedimentos) e testes bioquímicos
para obtenção da relação proteína-creatinina (UPC).
Os animais do estudo foram classificados quanto a presença ou ausência de
uma ou mais alterações urinárias segundo a presença de alterações na densidade
urinária (valores abaixo de 1035), presença de cilindros na avaliação microscópica,
47
valores de UPC acima de 0,4 e aumento na concentração sérica de creatinina acima
de 1,8 mg/dl.
Entre os felinos analisados, foram considerados doentes renais não-
insuficientes os que apresentavam forte evidência de lesão renal, sendo possível a
detecção de cilindros na urinálise. Os animais classificados como insuficientes
renais apresentavam azotemia e densidade inferior ou igual a 1035. Além disso, os
gatos que demonstraram apenas densidade urinária inferior ou igual a 1035 foram
classificados como candidatos a doença renal.
TRANSCRIÇÃO REVERSA SEGUIDA DE SEMI-NESTED PCR
O RNA viral foi extraído das amostras de urina de 276 gatos utilizando o kit
QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo com o manual de
instruções. Após a obtenção do RNA viral, a transcrição reversa foi realizada
utilizando a enzima SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, USA) com primer positivo.
A técnica de semi-nested RT-PCR (RT-snPCR) foi realizada com primers que
amplificam um fragmento parcial do gene L de membros dos gêneros Respirovirus,
Morbillvirus e Henipavirus, utilizando a enzima Platinum Taq DNA Polymerase
(Invitrogen, Carlsbad, USA) (TONG, et al. 2008). Em cada RT-snPCR foi incluída
uma alíquota de água ultrapura e RNA proveniente de material encefálico de cão
diagnosticado com cinomose canina como controles negativo e positivo,
respectivamente. Uma alíquota de 5µl do produto obtido na PCR foi submetida a
eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio (0,5mg/ml), e
avaliado sob luz UV em transiluminador (Loccus, São Paulo, Brasil).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para elucidar a ocorrência da associação entre excreção viral e alteração
renal, os dados foram tabulados e avaliados pelo Teste Exato de Fisher e/ou Qui-
quadrado, quando apropriado, considerando nível de confiança de 95% e
significância menor que 0,05 (p<0,05), no software Epi Info™ versão 7.2. As
48
variáveis avaliadas foram: sexo, origem dos gatos, infecção pelo paramixovírus e
achados nos exames laboratoriais.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através da RT-snPCR para detecção do paramixovírus, amostras de urina
foram avaliadas a partir de 276 gatos, dos quais 95 (34,4%) estavam excretando o
vírus, sendo 15 (15,8%) provenientes de proprietários, 58 (61%) de abrigos e 22
(23,1%) de acumuladores. Dentre os animais infectados, 64 (67,4%) eram machos
e 31 (32,6%) eram fêmeas.
Dos animais avaliados, 28 apresentaram alterações nos exames bioquímicos
séricos e/ou urinálise compatíveis com uropatias. Três foram classificados como
doentes renais, nove como insuficientes renais e 16 candidatos a doença renal. Os
demais 248 gatos não demonstraram alterações compatíveis com perda da função
renal em nenhum dos exames laboratoriais realizados.
Entre os 95 gatos excretando o FeMV na urina, apenas oito apresentavam
alterações renais, sendo um doente renal, um insuficiente renal e seis com
incapacidade em concentrar a urina. Com relação aos felinos não infectados, foram
20 animais detectados com alterações renais, sendo dois doentes renais, oito
insuficientes renais e 10 candidatos a doença renal.
Neste estudo, foi verificada a infecção pelo vírus em 34,4% dos gatos
avaliados, dado que diverge do apresentado em outros estudos que também
avaliaram elevado número de animais. Entre as investigações anteriores, a maior
prevalência encontrada foi de 12,3% na China em estudo envolvendo 427 gatos
(WOO et al., 2012). Outros estudos de detecção do vírus mostraram número
reduzido de animais excretando o vírus, como o estudo conduzido no Japão
envolvendo 82 gatos e na Alemanha com 206 gatos, onde foram demonstradas
prevalências de apenas 6,1% e 6,7%, respectivamente (FURUYA et al., 2013; SIEG
et al., 2015). Além disso, outras pesquisas mostraram percentuais mais baixos,
49
como o estudo realizado na Turquia com 96 amostras de urina de felinos, e de
maneira similar, nos Estados Unidos, cujo percentual de detecção viral foi de 3%
em ambos (YILMAZ et al., 2017; SHARP et al., 2016).
No presente trabalho houve diferença estatística na excreção viral segundo
o sexo dos animais. A frequência da infecção observada em machos foi de 39,75%
enquanto nas fêmeas foi de 26,96% (p=0,03) (Tabela 1). Em trabalho anterior,
conduzido por Sieg e colaboradores (2015) na Alemanha, foi observada maior
frequência de infecção pelos paramixovírus em gatos machos, no qual sete eram
machos dentre os oito que estavam excretando o vírus na urina. Porém, devido a
uma maior representação desse sexo entre os animais avaliados, não foi possível
verificar a associação entre a virose e o sexo com maior acurácia.
Tabela 1 – Distribuição da infecção pelo paramixovírus segundo o sexo dos animais.
Sexo Avaliados Positivos Frequência (%) Intervalo de confiança
95%
Valor de p
Fêmeas 115 31 26,96 18,85-35,07 0,03
Machos 161 64 39,75 32,19-47,31
Na análise estatística, foi mostrada a associação da infecção pelo vírus
apenas com relação a origem dos animais, cuja frequência foi de 42% em animais
provenientes de abrigos (p=0,03) (Tabela 2). Essa alta frequência poderia ser
justificada por diversos fatores tais como más condições higiênico-sanitárias dos
abrigos, ausência de controle sanitário, manutenção de alta densidade populacional
e considerável rotatividade de animais, sendo que, a associação de tais fatores
provavelmente favoreça a disseminação da infecção.
Tabela 2 – Distribuição da infecção pelo paramixovírus segundo a origem dos animais.
Origem Testados Positivos Frequência (%)* Intervalo de
confiança 95%
Abrigo 138 58 42,03a 33,79-50,26
Proprietário 57 15 26,32a,b 14,88-37,75
Protetor 22 81 27,16b 17,47-36,85
* valores com letras sobrescritas distintas indicam diferença estatística (p<0,01) pelo teste de Qui-quadrado.
50
Os achados encontrados em nosso estudo, que incluiu gatos com origem
diversificada, diferiram dos encontrados em estudos realizados anteriormente em
outros países, envolvendo gatos errantes e domiciliados, cuja prevalência foi de
12,3% e 6,1%, respectivamente (WOO et al., 2012; FURUYA et al., 2013).
Os dados levantados pela presente investigação diferem dos achados
demonstrados na China, Japão, Itália e Alemanha, onde foi possível correlacionar a
infecção viral com alterações renais. Woo e colaboradores (2012), na China,
associaram a presença do vírus no tecido renal à nefrite túbulo-intersticial, a partir
da técnica de imunohistoquímica. Similarmente, a detecção do agente viral por RT-
PCR em uma amostra de urina de um gato com nefropatia severa na Itália também
reforçou tal associação (LORUSSO et al., 2015). Da mesma maneira, no Japão,
amostras de urina, sangue, e tecidos parafinados de rins de gatos com nefrite,
revelaram a presença do vírus, sendo maior a prevalência nesta última amostra,
sustentando a hipótese de que existe uma frequência da infecção pelo FeMV em
gatos com nefrite (FURUYA et al., 2013). Um estudo caso controle realizado na
Alemanha detectou o vírus apenas em gatos que apresentavam sinais clínicos
compatíveis com uropatias, cuja prevalência foi de 6,7% dentre os 120 animais com
alterações renais que tiveram a urina avaliada por RT-PCR (SIEG et al., 2015).
No presente estudo não houve associação da infecção pelo vírus com a
doença renal, pois a frequência de gatos excretando o vírus com ausência de
alterações renais foi de 91,6% (IC:95%: 85,99–97,16), enquanto apenas 8,4% dos
animais infectados apresentavam alterações renais (p=0,63). Sharp e
colaboradores (2016), nos Estados Unidos, também não relacionaram a presença
do FeMV à doença renal na avaliação de 327 amostras de urina de gatos
domésticos, onde foi realizada a detecção do vírus em apenas 10 felinos, dos quais
sete eram clinicamente saudáveis e três tinham doença renal crônica. Além disso,
um gato foi acompanhado durante 15 meses e manteve-se clinicamente saudável,
mesmo com a excreção contínua do vírus neste intervalo de tempo.
Outra pesquisa demonstrou resultados semelhantes ao presente trabalho, a
qual foi realizada recentemente na Turquia, não relacionando a infecção pelo FeMV
com alterações no trato urinário. Neste trabalho, 110 amostras foram testadas,
51
sendo 95 de urina e 15 fragmentos de tecido renal, cujos achados clínico-
laboratoriais não foram estatisticamente significantes, pois a excreção viral não
variou diferentemente no grupo de animais com manifestações clínicas de trato
urinário (YILMAZ et al., 2017).
Outros achados laboratoriais como hematúria, leucocitúria, cristalúria,
proteinúria e hipoalbuminemia foram comparados quanto a infecção pelo
paramixovírus, sendo observado significância estatística apenas na proteinúria
associada de hematúria, cuja frequência encontrada foi de 4,21% (IC95%: 1,65 –
10,33; p:0,01).
Apesar da alta casuística de diagnósticos de doença renal em gatos, ainda
são escassos os dados acerca da prevalência dessa síndrome em gatos no Brasil.
Com isso, este estudo pôde colaborar com dados a respeito desta enfermidade, o
qual mostrou uma baixa prevalência da doença nos felinos avaliados neste
município.
Em virtude da distribuição difundida do FeMV, o qual está presente na Ásia,
Europa e Américas, são necessários estudos mais abrangentes para melhor
compreensão a respeito da patogenia e transmissibilidade do vírus, além da
realização de estudos caso-controle para esclarecimento da provável correlação do
vírus com a doença renal em gatos domésticos.
CONCLUSÃO
Os paramixovírus felinos estão circulando na população de gatos da região,
com alta prevalência (34,4%), sendo necessária a realização de estudos mais
abrangentes a respeito deste agente nas demais regiões do país. Além disso, não
pôde ser observada a associação da excreção do paramixovírus pela urina com a
ocorrência de alterações renais nos felinos domésticos, cuja frequência de gatos
com alterações renais excretando o vírus foi de apenas 8,4%, demonstrando a
necessidade de maiores esclarecimentos acerca da patogenia do vírus.
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