reazione a catena della polimerasi (pcr) ed elettroforesi · amplificare un frammento di dna...
Post on 15-Feb-2019
219 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Gioele Casagranda,
Camilla Larentis,
Emanuele Pallaoro,
Filippo Quattrocchi
Povo, 1 marzo 2016
P r o g e t t o C L I L - E s p e r i m e n t o f i n a l e
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
ed elettroforesi
Cos’è la PCR: introduzione generale e premesse al
nostro esperimento
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un
procedimento che serve per replicare alcune
sequenze di materiale genetico al fine di
ottenerne molteplici copie che possono essere
utilizzate a scopo di ricerca. L'amplificazione
mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di
materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.
Questa metodica ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione
cellulare, ovvero la sintesi della doppia elica di DNA, processo che, come noto, si
definisce semiconservativo. Infatti, le doppie eliche che si formano contengono
ciascuna un filamento della molecola di DNA originale. Lo stesso discorso vale per
la PRC, anche se ad essere duplicato è solo un frammento del codice genetico.
La PCR fu ideata nel 1983 da
Kary B. Mullis il quale
ottenne, per questo, il Premio
Nobel per la chimica nel
1993.
La PCR richiede che due molecole d’innesco si ibridino alle estremità dei due
filamenti opposti della molecola di DNA stampo. Per eseguire una PCR è
necessario denaturare lo stampo di DNA e lasciare ai due inneschi, ai nucleotidi e
alla DNA polimerasi il tempo di interagire e dare avvio alle reazioni di sintesi.
Successivamente il materiale genetico e determinati composti chimici vengono
sottoposti a numerosi cicli durante i quali viene riscaldato e raffreddato
ripetutamente il mix favorendo denaturazione e duplicazione della molecola
interessata.
Fino a questo punto si è parlato di DNA, ma per quanto riguarda il nostro
esperimento sarebbe più corretto appellare il materiale genetico con il nome di
cDNA (dall’inglese Complementary DNA). Si tratta di una particolare molecola che
contiene l’informazione genetica e si origina a partire dal singolo filamento di una
molecola di mRNA per opera dell’enzima
trascrittasi inversa. La molecola risultante
è costituita dal filamento iniziale di mRNA
e dal filamento duplicato, quindi ha una
struttura a doppia elica.
La reazione a catena della
polimerasi si costituisce di
diverse fasi:
Denaturazione
Consiste nella separazione dei
legami a idrogeno che intercorrono
fra le basi azotate complementari
delle due eliche di cDNA.
• Annealing
Si formano dei legami a idrogeno tra i primer e le sequenze di DNA. La
temperatura di questo stadio dipende dai primer usati. Durante
l’annealing vengono utilizzati due primer che si legano ai loro siti specifici.
Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei
primer ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da template (filamento
stampo). I primer che si appaiano esattamente con il filamento stampo
formano i legami più stabili e, in questo piccolo tratto di doppia elica, si
lega la polimerasi che inizia così a copiare il filamento stampo;
• Estensione/Elongation
La DNA polimerasi estende il filamento a partire dal primer fino alla fine
della sequenza. La temperatura di elongation dipende dalla DNA
Polimerasi. Durante l’estensione la Polimerasi prolunga la sequenza di
basi dei primer aggiungendo le basi (complementari al template)
dall’estremità 5’ all’estremità 3’. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio
filamento.
Questi step principali vengono poi ripetuti 30 volte attraverso l’utilizzo di
un termociclatore.
Step Temperature Time
Initial denaturation 95 °C 2 min
Denaturation 95 °C 15 sec 30 cicli
Annealing 58 °C 15 sec
Extenstion 72 °C 15 sec
Final Extention 72 °C 5 min
Hold 4 °C Indefinite
Scopo dell’esperimento
Eseguire una PCR di cDNA derivante da cellule staminali neurali (NSC) ed
embrionali (ESC) e verificarne il corretto funzionamento attraverso l’osservazione
di determinati geni (Nestin, OCT4, 18S) che, come spiegheremo, si esprimono solo
ad un determinato grado di specializzazione delle cellule staminali.
Strumenti
• Microprovette Eppendorf;
Nota operativa:
Questo esperimento ha un’elevata sensibilità ed efficienza; infatti il
procedimento, e quindi i risultati, dipendono sensibilmente dalla presenza di
materiale genetico contaminante che si può trovare nell’ambiente e sulla
strumentazione. Il problema della contaminazione è elevato tanto quanto la
sensibilità della PCR, questo perché gli elementi contaminanti vengono
anch’essi amplificati.
E’ quindi opportuno mantenere tutto ciò che può essere necessario al fine
dell’esperimento il più possibile sterile.
Tutti i puntali e le provette Eppendorf sono state sterilizzate attraverso un
procedimento a caldo, in autoclave e con onde ultraviolette.
Il primo apparato consiste in una camera d’acciaio, chiusa ermeticamente al
cui interno del vapore sotto pressione produce temperature di 121°C senza che
i liquidi vadano in ebollizione.
• Micropipette con relativi puntali per maneggiare quantità dell’ordine di 1-
20 microL;
• Termociclatore (strumento che permette di regolare la temperatura
dell’ambiente di reazione in maniera precisa e per periodi di tempo ben
determinati);
• Forno a microonde;
• Vasca di preparazione per gel di Agarosio;
• Cella elettrolitica per elettroforesi;
• Pettine per pozzetti;
• Transilluminatore UV.
Materiali
• Mater mix (23 microL): composto contenente 2.5 microL di buffer di
reazione ad una concentrazione 10X, 2.5 microL di MgCl2 50mM, 2.5
microL di dNTP 10mM, 1 microL di primer forward 10 microM, 1 microL di
primer reverse (i primer nei vari mix sono specifici per determinati geni:
Nestin, OCT4 e/o 18S), 10
microM, 0.5 microL di EuroTaq
5U/microL, 14.5 microL di acqua;
• cDNA (2 microL): da
cellule NSC per i gruppi 1, 3, 5 e
da cellule ESC per i gruppi 2, 4,
6;
• Agarosio in polvere;
• TAE buffer 10X;
• Acqua;
• Colorante blu;
• Colorante BIOATLAS UV;
Nestin è un gene che è espresso principalmente dalle
cellule staminali neurali (e non deve quindi essere presente nelle cellule
staminali embrionali).
OCT4 è un gene che è espresso principalmente dalle cellule
staminali embrionali (e non deve quindi essere presente nelle cellule
staminali neurali).
18S è un gene che è espresso in tutte le cellule.
Template DNA: filamento stampo di DNA.
MgCl2: è un cofattore essenziale per il funzionamento della
TAQ.
TAQ DNA polimerasi: è un enzima termostabile che aiuta a
catalizzare la polimerizzazione dei desossinucleotidi che risultano in un
filamento di DNA; proviene dall'organismo termofilo Thermus
aquaticus.
Primer: è una
sequenza a filamento singolo di
DNA atta a localizzare la sequenza
target. Ne sono necessari due per
amplificare un frammento di DNA
agganciandosi ai due punti
estremi del frammento.
dNTP: è un mix di
nucleotidi desossiribonucleici.
PCR buffer: crea un
ambiente per l’attività ottimale
della TAQ.
Procedimento
Preparare 2 Eppendorf, nelle quali verranno versati, rispettivamente, 23 microL di
Master mix + 2 microL di cDNA e 23 microL di Master mix + 2 microL di acqua
(campione di controllo); in seguito indicarne con una sigla il contenuto.
Posizionare nel termociclatore per l’esecuzione di 30 cicli di PCR al fine di
svolgere la moltiplicazione dei frammenti di DNA secondo lo schema indicato
nella premessa.
Ogni ciclo si compone, quindi in questo modo:
• Denaturazione: alla temperatura di 95 °C per 15 sec, in seguito ad una
denaturazione iniziale che avviene a 95 °C per una durata di 2 min.
• Annealing: alla temperatura di 58 °C per 15 sec;
• Estensione: alla temperatura di 72 °C per 15 sec.
Si termina con un’estensione finale a 72 °C per 5 minuti. Poi il composto viene
tenuto a una temperatura di 4 °C all’interno del termociclatore.
Preparazione del gel di agarosio
Per preparare
l’ambiente su cui si
svolgerà la corsa
elettroforetica si
diluisce il TAE
buffer per crearne
una soluzione di
questo al 10%
volume/volume,
quindi si deve
aggiungere 1 parte
del composto ogni 9
parti di acqua (si intendono partizioni di volume). Il buffer è infatti inizialmente
ad una concentrazione che è 10 volte maggiore di quella operativa e va quindi
diluito.
Per preparare il gel vero e proprio, si prepara una soluzione di concentrazione
pari al 2% massa/volume e si mette la soluzione così ottenuta nel forno a
L’agarosio è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una
sostanza gelatinosa estratta dalle alghe. E’ un polimero
lineare e neutro, uno zucchero solubile in acqua alla
temperatura di ebollizione. Quando raffredda assume la
composizione di gel grazie alla formazione di una matrice
tridimensionale costituitasi attraverso legami ad idrogeno fra
le catene lineari. La sue rete di pori permette al gel di fungere
da setaccio e di separare le molecole in base alla loro
grandezza e, quindi, anche in base alla loro velocità.
microonde. La soluzione viene fatta riscaldare fino a quando, giunta ad
ebollizione, diviene trasparente.
In seguito la soluzione in questione viene versata nella vasca di preparazione a
gelificare, dove in precedenza era stato posizionato il pettino per pozzetti e si
aggiungono al composto 9 microL di colorante BIOATLAS che, grazie alla sua
proprietà di legarsi con le basi di acido nucleico a doppio filamento ed emettere
luce fluorescente se irradiata a raggi UV, ci permette di identificare con precisione
i risultati della corsa.
Una volta solidificato, si pone il gel nella cella elettrolitica e si ricopre il tutto con
la soluzione buffer, fino a che il gel di agarosio non è immerso per 1 cm circa.
Elettroforesi su gel di agarosio:
A questo punto si devono aggiungere i campioni che hanno subito il processo di
PCR nei pozzetti lasciati liberi dalla rimozione del pettine. Abbiamo aggiunto ai
nostri campioni un colorante blu che permette di allocare la sostanza nelle
fenditure verticali più agevolmente e precisamente e di disciogliere il DNA
amplificato in una temporanea fase omogenea più densa dell’acqua, che ne evita
la risalita dal pozzetto.
Le bande centrali contengono un composto detto “ladder” che essendo costituite
da frammenti di lunghezza prefissata (ad esempio, 100, 200, 300, 400 nucleotidi)
forniscono per l’appunto una scala atta a determinare la lunghezza dei frammenti
di DNA che si fanno correre sul gel.
La cellula elettrolitica genera un campo elettrico che mette in moto le molecole di
DNA aggiunte nei pozzetti. Il DNA è un acido nucleico e liberando protoni assume
una carica negativa che fa sì, grazie alla d.d.p. fra i due poli, che venga attratta al
polo positivo.
Osservazioni e conclusioni
Come previsto, si osserva la presenza di Nestin solo nelle cellule neuronali, la
presenza dell’OCT4 solo in quelle embrionali e il 18S in tutte le cellule. Inoltre
dalla tabella e dalle immagini si può notare che tutti i gruppi di controllo hanno
dato esito negativo.
L’ordine seguito
nell’introdurre i mix
amplificati nei pozzetti
è lo stesso seguito nella
tabella per i campioni
contenenti il DNA e
inverso per quanto
riguarda i campioni
contenenti l’acqua.
Quindi a partire da
sinistra abbiamo:
NSC+Nestin,
ESC+Nestin,
NSC+OCT4, ESC+OCT4, NSC+18S, NSC+18S, “ladder”, Acqua+18S, Acqua+18S,
Acqua+OCT4, Acqua+OCT4, Acqua+Nestin, Acqua+Nestin.
GENE TIPO DI
CELLULA
BANDE
OSSERVATE
Nestin
NSC SI
ESC NO
Acqua NO
OCT4
NSC NO
ESC SI
Acqua NO
18S
NSC SI
ESC SI
Acqua NO
La PCR è riuscita alla perfezione. Si sono amplificati tratti di DNA solo nei
composti dove ci aspettavamo preventivamente che il processo avesse effetto.
Unica nota negativa, forse, una leggera banda nel campione di controllo del
gruppo 6 che, come si può notare nella foto al trasilluminatore, ha lasciato una
piccola traccia sul gel di agarosio. Bisogna ricordare che il gene 18S è espresso da
gran parte delle cellule viventi e quindi anche una leggerissima contaminazione
può determinare un esito negativo.
top related