stepanov

В. М. Степанов

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Структураи функциибелковПод редакциейакадемика А.С. Спирина

Рекомендовано Государственнымкомитетом Российской Федерациипо высшему образованиюв качестве учебника для студентоввысших учебных заведений,обучающихся по направлениюи специальности «Биология»

МОСКВА«ВЫСШАЯ ШКОЛА» 2002

ББК 28-070С 79УДК 577

Федеральная целевая программакнигоиздания России

Издание осуществлено при поддержке Российского фондафундаментальных исследований по проекту 95-04-28700

Р е ц е н з е н т ы :кафедра биохимии Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - проф. А.Д. Виноградов);проф. Ю.П. Винецкий (Государственный научно-исследовательский

институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов)

Степанов В.М.С79 Молекулярная биология. Структура и функции белков: Учеб. для биол. спец., вузов / Под ред. А.С.Спирина. — М.: Высш. шк., 2002 — 335 с.: ил.

ISBN 5-06-002573-Х

Книга завершает ряд учебников по теме «Молекулярная биология» («Молекулярная био-логия. Структура рибосомы и биосинтез белка» - 1986 г.; «Молекулярная биология!Структура и биосинтез нуклеиновых кислот» - 1989 г.). В ней рассмотрены основныечерты строения и функционирования белков, все уровни организации структуры этихбиополимеров. Обсуждены особенности функционирования важнейших типов белков- ферментов, транспортных, фибриллярных; кратко рассмотрены свойства аминокис-лот и пептидов, реакции посттрансляционной модификации.

ISBN 5-06-Q02573-X

©В.М.Степанов, 2002

ПРЕДИСЛОВИЕ

Предлагаемая вниманию читателя книга представляет собой учебник, рас-считанный прежде всего на тех, кто, приступая к изучению молекулярной биоло-гии, хотел бы систематизировать знания о строении и функциональных свойствахбелка. Построение материала в известном смысле традиционно — после вводныхглав, в которых кратко излагаются сведения об аминокислотах и пептидах, а также овыделении и первичной характеристике белков, рассматриваются основные уровниорганизации их структуры, реакции модификации, которым они подверга-ются вбиологических системах. Обсуждению функциональных свойств белков посвяще-но несколько отдельных глав. Выбор тех или иных групп белков для рассмотрениядиктовался прежде всего необходимостью познакомить читателя с белками, иссле-дование которых служило и еще продолжает служить фактической основой длявыработки концепций этой отрасли науки. Понятно, впрочем, что в рамках учеб-ника было невозможно, да и вряд ли нужно давать описание хотя бы основныхгрупп белков.

Автор счел бы свою задачу выполненной, если бы читатель смог на относи-тельно небольшом материале получить представление об основных результатах ис-следования белков и возникающих новых проблемах. Учебник составлен на основелекционного курса, читаемого автором на биологическом факультете Московскогогосударственного университета для студентов, специализирующихся по молекуляр-ной биологии и вирусологии, и близок к курсу, читаемому на химическом факуль-тете МГУ. От читателя потребуется, безусловно, знание основ биохимии и органи-ческой химии, однако пробелы в них, если они обнаружатся, могут быть легковосполнены с помощью общих руководств, а также рекомендуемой литературы,которая послужит также более углубленному изучению тех или иных вопросов.

Можно надеяться, что книга будет полезной не только для студентов и ас-пирантов, но и для научных сотрудников, которые соприкасаются в своей работе спроблемами молекулярной биологии, в частности с белками.

Предлагаемая вниманию читателя книга является частью учебника по мо-лекулярной биологии, издаваемого под редакцией акад. А.С.Спирина. С благо-дарностью отмечая его инициативу в написании учебника, автор считает необхо-димым отдать долг памяти профессору Вадиму Олеговичу Шпикитеру, которыйучаствовал в обдумывании плана книги. Автор глубоко благодарен своим сотруд-никам и друзьям, практический опыт и взгляды которых сыграли неоценимуюроль в формировании представлений о белке, изложенных в этой книге.

В.М.Степанов

ВВЕДЕНИЕ

Изучение белков имеет давнюю традицию, богатую и исполненную драма-тизма, однако современные представления об их строении сформировались лишьза последние четыре десятилетия. Заметим, что, несмотря на крупные результатыи исключительно быстрый технический прогресс, закономерности организацииэтих биологических макромолекул никак нельзя считать полностью познанными.К числу ключевых проблем исследования белка относится прежде всего выяснениеправил, управляющих формированием его пространственной структуры, сверты-ванием полипептидной цепи. Можно думать, что немало нового скрыто в динами-ке белковой структуры. И все же, видимо, центральная роль принадлежит анализуфункции белков.

Еще не так давно способность выступать в качестве биологических катали-заторов представлялась настолько значимой особенностью белков, что их иныефункции невольно отодвигались в тень и выглядели если не второстепенными, тово всяком случае нетипичными, маргинальными. Бесспорно, в таком подходе от-ражались как состояние знаний, свойственное совсем недавнему времени, так идействительно выдающееся значение биологического катализа. Нет также сомне-ния в том, что анализ соотношения строения и функциональных свойств фермен-тов до сих пор остается чрезвычайно важным и очень продуктивным направлени-ем исследований. И все же нельзя не заметить, что результаты последних лет вы-явили множество новых аспектов функционирования белков как регуляторовбиологических процессов — не только обмена веществ, но также роста и развития— как участников системы коммуникаций, которые объединяют биологическиемолекулы, органеллы, клетки, ткани, органы в единую управляемую систему. Посуществу, открылся новый мир белков, и необходимо не только их описание, но ипонимание способов действия столь разнообразных молекул.

Функция белка всегда индивидуальна, однако могут быть выделены неко-торые общие принципы молекулярных механизмов действия белков, поскольку вних заложены такие фундаментальные этапы, как узнавание того или иного парт-нера, формирование единой структуры комплекса, в которой так или иначе просту-пают черты взаимодействующих молекул, действие высокоорганизованных ан-самблей функциональных групп, организация микроокружения, глубоко влияю-щего на природу протекающих химических превращений, передача эффектов внут-ри молекулы или надмолекулярного комплекса и т.д.

Проблематика химии и биохимии белка изменилась еще и потому, что ме-тодический прорыв, связанный с развитием генной и белковой инженерии, от-

крыл не только широкие возможности направленной реконструкции белков, но ипоказал перспективу создания белковых структур, в том числе и наделенных тойили иной функцией de novo (с самого начала), не копируя достижения природы, аконструируя их заново. Разумеется, в этом скрыта уникальная возможность глу-бокой проверки истинности знания, приобретенного трудом нескольких поколе-ний исследователей, и вместе с тем перспектива новых достижений, научную исоциальную значимость которых трудно переоценить.

ГЛАВА 1АМИНОКИСЛОТЫ

α-Аминокислоты — мономеры, из которых построены пептиды и белки.Лишь двадцать аминокислот — так называемые белковые аминокислоты — встраи-ваются в полипептидную цепь в ходе трансляции. В дальнейшем в результате ре-акций посттрансляционной модификации некоторые из них превращаются вдругие аминокислотные остатки (например, цистеин — в цистин, серин — в фос-фосерин и т.п.). В природе встречается гораздо большее число аминокислот. На-пример, множество «небелковых» аминокислот содержится в пептидных анти-биотиках, синтез которых протекает по нематричному механизму, целый ряд «не-белковых» аминокислот участвует в процессах обмена. Таковы, в частности, гомо-серин, аргининянтарная кислота, полуальдегид аспарагиновой кислоты — проме-жуточные продукты биосинтеза белковых аминокислот, азетидинкарбоновая ки-слота — обычный компонент клеточного сока растений и т.д.

Азетидин- Полуальдегид карбоновая аспарагиновой кислота кислоты

В данной главе будут кратко рассмотрены химические свойства белковыхα-аминокислот (табл. 1.1). Нередко возникает вопрос, чем обусловлен именнотакой набор белковых аминокислот, который выработан в ходе эволюции и уни-версален для всех ныне живущих организмов. Разумеется, однозначного ответадать невозможно, тем более что выбор мог диктоваться возможностью биосинте-за той или иной структуры. Однако очевидно, что набор боковых групп белковыхаминокислот должен быть достаточно разнообразен.

Аминокислотные остатки с гидрофобными цепями различной геометриипозволяют сформировать компактное внутреннее ядро, стабилизирующее струк-туру белка, организовать гидрофобные контакты с его лигандами. Глицин, лишен-ный бокового радикала, незаменим при сближении пептидных цепей, обеспечи-вает их повороты. Гидрофильные нейтральные аминокислоты - серин, треонин,

аспарагин – участвуют в образовании системы водородных связей, обеспечиваютгидратацию белка.

Боковые цепи, содержащие ионогенные группы (остатки глутаминовой иаспарагиновой кислот, гистидина, лизина и аргинина), помимо образования во-дородных связей участвуют в ионных взаимодействиях как внутри белка, так и сдругими молекулами. Остатки цистеина открывают возможность участия белкав окислительно-восстановительных процессах также служат предшественникамиостатков цистина, образуя дисульфидные мостики – дополнительные факторыстабилизации белковой структуры.

В то же время нельзя не заметить, что многообразие функциональных группбелковых аминокислот не столь уж велико. Однако их химические возможностирезко обогащаются в рамках специфической белковой структуры за счет образова-ния пространственно организованных ансамблей. И все же для многих задач функ-циональных групп белка недостаточно, для их решения привлекаются специфи-чески связываемые им леганды – ионы металла, хромофорные группы, кофер-менты и т.п.

1.1. КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ

Кислотно-основные свойства аминокислот определяет одновременное присутствие в их структуре аминной и карбоксильной групп, которые будучи предельно сближены, глубоко влияют друг на друга.

В нейтральной среде, в довело широком диапазоне pН, α-аминокислотысуществуют как 6иполярные ионы, поэтому обычная запись формулы аминокис-лот, например глицина - NH

2-COOH условна. Правильнее было бы писать для

нейтральных растворов NH3

+-CH2-COO-. Именно в такой форме биполярных

ионов – цвиттер-ионов (устаревшее название «бетаиноподобная структура») –аминокислоты существуют в нейтральных растворах и кристаллах. Влияние поло-жительно заряженной аммонийной группы в α-положении делает α-кар-боксильную группу значительно более сильной по сравнению с карбоксиломалифатических кислот. Так, если рКа уксусной кислоты (рН при котором диссо-циация проходит наполовину) составляет 4,7, то у глицина рКа карбоксила равен2,34. Примерно такие же величины рКа свойственны карбоксильным группамдругих α -аминокислот (табл. 1.1).

Разумеется, карбоксильные группы, удаленные от α-аммонийной, напри-мер β-карбоксил аспарагиновой или γ-карбоксил глутаминовой кислот, не испыты-вают столь значительного влияния положительного заряда и по своим кислотнымсвойствам, по способности отдавать и принимать протон, приближаются к обыч-ным жирным кислотам.

Таблица 1.1. Аминокислоты, включающиеся в белки при трансляции (белко-вые аминокислоты)

Название

Сокра-щенное обозна-чение

Структура R

α-C O O H

α−ΝΗ+3

боко -вой цепи

Аланин

Ala, A

Аргин ин

Arg, R

N H II -( C H2)3 N H-C -N H2

Аспарагин

Asn, N

-C H2 -C O-N H2

Аспарагиновая

Asp, D

-C H2 -C O O H

2,77 кислота

Цистеин Cys, С

-C H2 -S H

Глутаминовая Glu, E

-C H2 C H2-C O O H

3,24 кислота

Глутамин

Gin, Q

-C H2 C H2 -C O -N H2

2,17 9,13

5,65 -H Глицин

Гистидин

Gly, G

His, H

CHHC||| |NC2CH −−

C H3 |

Изолейцин

Ile, I

-С Н -С Н 2 - О Н з

Лейцин

Leu, L

C H 3 -C H2 – CH C H 3

Лизин Lys, К

- ( C H 2)4 -N H2 2,18

Метионин Met, M

-C H2 C H2 -S - C H 3

Фенилаланин

Phe, F

-С Н 2 -С6 Н5

Продолжение табл. 1.1

*Структура пролина приведена полностью.

Точно так же α-аминогруппа в α-аминокислотах испытывает влияние кар-боксилат-аниона, присоединенного к тому же углеродному атому, и становится зна-чительно менее основной, чем аминогруппа первичных алифатических аминов — еерКа равен 9,6 — 9,7 в отличие 10 от 10,7 для этиламина. Влияние карбоксильнойгруппы на свойства аминогруппы, в частности на ее основность, падает по мере

рКа

Название

Сокра-щенное

обозначение

Структура R

α-СО О H

α−ΝΗ +3 боко -

вой цепи

Пролин

Рго , Р

C H2 CH 2

| | C H2 CH C O O H N H

Серин

Ser, S

- C H 2 - O H

Треонин

Thr, Т

C H3 - C H O H

Триптофан

T rp,W

Тирозин

Туг, Y

C H - CH - C H 2 - C C - O H C H - CH

Валин

Val, V

C H3 - C H C H3

возрастания расстояния между ними, поэтому ε-аминогруппа лизина практиче-ски не отличима по химическим характеристикам от алифатических аминов, еерКа равен 10,5.

Если к нейтральному раствору α-аминокислоты, содержащему биполярныеионы, прибавлять кислоту, увеличивая концентрацию ионов водорода, последниебудут присоединяться к карбоксилатным группам, превращая их в незаряженныекарбоксильные группы. При этом аминокислота, в которой заряды первоначаль-но были скомпенсированы, приобретет суммарный положительный заряд, в част-ности в электрическом поле она будет перемещаться к катоду. Напротив, еслипонижать концентрацию ионов водорода, добавляя щелочь, гидроксильные ионыбудут реагировать с аммонийными группами, отщепляя протон и переводя их внезаряженные аминогруппы. В результате аминокислота приобретет суммарныйотрицательный заряд и в электрическом поле будет перемещаться к аноду:

Суммарный заряд +1 0 -1

Значение рН, при котором как аминная, так и карбоксильная группы ами-нокислоты полностью заряжены и. заряды скомпенсированы, называют иэоэлек-трической точкой (pI). Для α-аминокислот, которые не имеют ионогенных группв боковой цепи, величина рI равна полусумме рКа α-аминной и α-карбоксильнойгрупп. Если аминокислота содержит дополнительные ионогенные группы, прирасчете рI следует учитывать их вклад.

Например, рI аспарагиновой кислоты не может быть близкой к 6, как умоноаминомонокарбоновых кислот, так как при этом рН будет практически пол-ностью диссоциирована ее β-карбоксильная группа и аспарагиновая кислота, сле-довательно, будет нести суммарный единичный отрицательный заряд. Для его по-давления необходимо значительно понизить рН — до 2,77, чтобы протонироватьβ-карбоксил примерно на 90%, что оставит на этой группе около 0,1 отрицатель-ного заряда. При столь низком рН начнется и протонирование α -карбоксильнойгруппы, которая сохранит около 0,9 отрицательного заряда. В сумме эти зарядыскомпенсируют единичный положительный заряд аминогруппы, что и обеспечитизоэлектрическое состояние аспарагиновой кислоты. Легко видеть, что рI в этомслучае близка к среднему арифметическому из рКа α-и β-карбоксильных групп.То же справедливо и для расчета рI глутаминовой кислоты, равной 3,24. Анало-гично, рассчитывая изоэлектрическую точку лизина (рI = 9,82), используют сред-нее из рКа α- и ε-аминогрупп.

1.2. ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ αα -АМИНОКИСЛОТ

Эти реакции разделяют на характерные для α-аминогрупп, α-карбоксиль-ных групп и протекающие с совместным участием обеих функций.

1.2.1. Реакции аминогрупп

В целом эти реакции аналогичны реакциям алифатических аминов. Ацили-рование активированными производными кислот в присутствии основания, свя-зывающего выделяющуюся кислоту, протекает достаточно легко. К таким реак-циям, например, относят: — ацилирование аминокислот уксусным ангидридом:

Уксусный Аланин N-Ацетил-аланин ангидрид

— реакция с хлорангидридом 5-диметиламинонафталинсульфокислоты(дансилхлоридом) — дансилирование, — позволяющая превратить аминокислоту вофлуоресцирующее соединение:

Дансилхлорид

Дансил-аланин

Сходно протекает арилирование весьма активным 1-фтор-2,4-ди-нитробензолом — реакция динитрофенилирования, сыгравшая большую роль вопределении структуры пептидов.

2,4-Динитрофтор- Серин 2,4 -Динтрофенил- бензол серин (ДНФ-серин); имеет характерную желтую окраску, (λ

max ~ 360 нм)

Реакция аминогруппы с альдегидами приводит к образованию непредель-ного соединения — так называемого основания Шиффа, в котором основность

азота существенно понижена. Эта реакция обратима, и в кислой среде альдегидотщепляется с регенерацией аминокислоты. Для основания Шиффа характернаблизость двойной связи к асимметрическому центру, что может способствоватьрацемизации аминокислоты за счет миграции двойной связи к α-атому углерода.Гидрирование двойной связи, в основании Шиффа, например боргидридом на-трия, стабилизирует связь C-N:

К аналитически важным реакциям с карбонильными соединениями отно-сят взаимодействие аминокислот с трикетогидринденгидратом (нингидрином):

Фиолетовый Руеманна (λmax

= 570 нм)

На этой реакции основано как качественное, так и количественное опреде-ление аминокислот (в том числе в автоматических анализатоpax). Флуоресци-рующие производные образуются при реакции α-аминокислот с о-фталевымальдегидом в присутствии меркаптоэтанола. Эта реакция позволяет определятьочень малые, порядка пикомолей, количества аминокислот:

Продукт реакции, производное изоиндола; интенсивно флуорес- цирует λ

max = 455 нм (λ

max воз-

буждения равна 360 нм)

1.2.2. Реакции карбоксильных групп

Эти реакции аминокислот в определенной мере соответствуют реакциямалифатических карбоновых кислот. Этерификация протекает в безводных спир-тах в присутствии кислотных катализаторов. Так, фенилаланин этерифицируетсяпочти количественно в безводном метаноле в присутствии соляной кислоты или(лучше) тионилхлорида:

Метиловый эфир фенил- аланина (хлоргидрат)

Эфиры аминокислот — важные исходные вещества для пептидного синтеза— могут гидролизоватъся,, в особенности в щелочной среде (реакция омыления):

Обработка эфиров аминокислот безводным аммиаком превращает их в амиды:

Амид фенилаланина

Для временной защиты α-карбоксильных групп, необходимой при пеп-тидном синтезе, их превращают в трет-бутиловые эфиры путем реакции с изо-бутиленом в присутствии серной кислоты:

Tpem-бутиловый эфир лейцина

Такие эфиры устойчивы в слабощелочных средах, но избирательно расщеп-ляются кислотами с регенерацией

свободной карбоксильной группой.

1.2.3. Реакции с совместным участием αα-аминной иαα-карбоксильной групп

Соли аминокислот с некоторыми ионами металлов, в частности с ионамидвухвалентной меди, никеля, кобальта, образуются при участии как карбоксилат-иона (ионная связь), так и аминогруппы (координационная связь), причем воз-

никают весьма устойчивые бициклические (клешнеобразные, или хелатные) струк-туры, в которых ион металла координирован с двумя молекулами аминокислоты,например

Медная соль лизина, в образовании которой участвуют карбоксильная иаминная группа при α-углеродном атоме. ε-Аминогруппа в комплекс не входит иостается свободной, что может быть использовано для проведения реакций, спе-цифически затрагивающих только удаленную аминогруппу.

Такие комплексы интенсивно окрашены, например комплексы меди с ами-нокислотами — в фиолетово-голубой цвет.

Известны реакции, переводящие аминокислоты с участием как аминной,так и карбоксильной групп в циклические структуры. Так, фосген превращает a-аминокислоты в так называемые N-карбоксиангидриды, легко полимеризую-щиеся с отщеплением СO

2 и образованием полиаминокислот:

Очень важна реакция аминокислот с фенилизотиоцианатом, которая сна-чала приводит к производному по α-аминогруппе — фенилтиокарбамиламино-кислоте:

Фенилтиокарбамиламинокислоты и некоторые их аналоги интенсивно по-глощают в ультрафиолетовом свете, что используют при количественном опре-делении аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.Обработка кислотами приводит к внутримолекулярной циклизации фенилтио-карбамиламинокислоты с образованием фенилтигидантоина.

Эти производные аминокислот играют важную роль в анализе первичнойструктуры белка.

1.3. МЕТОДЫ СИНТЕЗА α-АМИНОКИСЛОТ

1.3.1. Химический синтез

Методы химического синтеза аминокислот весьма разнообразны. Многиеиз них нашли применение в промышленном производстве аминокислот, исполь-зуемых в качестве добавок к кормам для сельскохозяйственных животных, а так-же в медицине. Рассмотрим лишь главнейшие, не останавливаясь на тех методах,

которые позволяют получать лишь одну аминокислоту.Простейшие аминокислоты можно получать аминолизом α-галоидкар-

боновых кислот, например аланин — обработкой хлорпропионовой кислоты оченьбольшим избытком аммиака, чтобы подавить побочную реакцию образованияиминодикарбоновой кислоты:

Синтез, предложенный еще в прошлом веке А.Штреккером, основан нареакции альдегида R—CHO с цианидом калия и солями аммония, причем по-следние можно заменить мочевиной.

Получающийся в последнем случае замещенный гидантоин (циклическоепроизводное соответствующей аминокислоты) далее гидролизуют щелочью, по-лучая D, L-аминокислоту. Таким способом в промышленности синтезируют D,L-метионин (аминокислоту, применяемую в медицине и в животноводстве), ис-ходя из β-метилтиопропионового альдегида, в свою очередь образующегося пореакции акролеина и метилмеркаптана.

Альдегиды можно вводить в реакцию с заранее полученным гидантоином.Последующее гидрирование двойной связи и гидролиз приводят к получению ра-цемата соответствующей аминокислоты:

1.3.2. Разделение рацемических аминокислот

Как бы ни протекал химический синтез, он приводит к образованию смесистрого одинаковых количеств L- и D-изомеров аминокислоты — к ее рацемату.Практический интерес имеют, как правило, природные L-изомеры, поэтому важ-ны способы разделения рацематов, позволяющие выделить L-изомеры. Химиче-ские методы разделения основаны на взаимодействии рацемических аминокис-лот или их производных с асимметрическими соединениями.

Так, прибегают к получению солей эфиров аминокислот с заранее получен-ным стереизомером аминокислоты, например с L-глутаминовой кислотой, аци-лированной L-аминокислотой или какой-то другой асимметрической кислотой,в частности D-винной. Образующиеся диастереомерные соли обладают, как пра-вило, разной растворимостью. Соль эфира L-изомера разделяемой амино-кисло-ты с D-винной кислотой по растворимости отличается от соли, построенной изэфира D-аминокислоты и D-винной кислоты. Это открывает возможность выде-ления изомеров дробной кристаллизацией. Сложность этого пути очевидна, по-этому к нему прибегают лишь в тех случаях, когда иные подходы не дают результа-та.

Наибольшее распространение получил ферментативный способ разделениярацематов аминокислот. Чаще всего используют способность фермента ацилазыL-аминокислот, содержащейся в почках животных или продуцируемой некото-рыми микроскопическими грибами, избирательно гидролизовать N-ацил-L-ами-нокис-лоты, не затрагивая D-изомеров. После исчерпывающего гидролиза аци-лированной (чаще ацетилированной) аминокислоты в присутствии ацилазы об-разуется смесь свободной L-аминокислоты и ацетил-D-аминокислоты, которыелегко разделяются кристаллизацией или ионным обменом:

Как правило, после разделения проводят рацемизацию ацетил-D-амино-кислоты, а образовавшийся рацемат вновь гидролизуют ацилазой, достигая в ко-нечном счете практически полного превращения ацетил-D,L-аминокислоты вL-аминокислоту.

Интересно превращение рацемического лактама D,L-лизина (получаемогоиз доступного исходного соединения — капролактама) в L-лизин за счет совмест-ного действия двух ферментов. Один из них — L-лизинлактамаза — гидролизу-ет с образованием L-лизина только L-изомер лактама, другой же рацемаза —превращает нерасщепленный лактам D-изомера в рацемический лактам D,L-ли-зина. L-Изомер вновь гидролизуется лактамазой. Итогом является полное пре-вращение лактама D,L-лизина в L-лизин, применяемый в качестве кормовой до-бавки:

1.3.3. Ферментативный синтез аминокислот

Практически удобны способы получения аминокислот путем катализиру-емого специфическими ферментами превращения соединений-предшествен-ни-ков. При этом фермент обеспечивает стереоизбирателъностъ реакции, образо-вание только одного, как правило, L-изомера. Широко распространен синтез L-аспарагиновой кислоты путем присоединения аммиака к фумаровой кислоте, ко-торый катализируется аспартазой или микробными клетками, содержащими этотфермент:

Для получения L-фенилаланина применяют реакцию коричной кисло-ты и аммиака, катализируемую фенилаланин-аммиак-лиазой:

1.3.4. Микробиологический синтез аминокислот

Способ основан на образовании свободных аминокислот некоторыми мик-роорганизмами из простого сырья — отходов сахарной промышленности, крахма-ла, ацетата и т.п. Используют мутанты микроорганизмов, утратившие некоторыеферменты разветвленного пути биосинтеза аминокислот, что приводит к усилен-ному образованию других аминокислот. Например, блокирование гомосеринде-гидрогеназы, ответственной за превращение полуальдегида аспараги-новой ки-слоты в гомосерин и далее в треонин, метионин, направляет практически весьполуальдегид аспарагиновой кислоты на синтез лизина. Дополнительно вводятмутации, снимающие торможение активности ферментов конечным продуктомцепи реакций, например лизином; иногда прибегают к умножению числа генов,кодирующих ключевые ферменты биосинтеза данной аминокислоты.

Сочетание этих приемов позволило получить мутанты, способные, напри-мер, синтезировать до 100 г L-лизина на 1 л культуральной жидкости при высо-кой степени конверсии исходных веществ в аминокислоту. Микробиологиче-ские,химические и отчасти ферментативные в методы синтеза аминокислот -положе-ны в основу их промышленного производства, достигающего сотен и десятковтысяч тонн в год (лизин, глутаминовая кислота, фенилаланин, аспарагиновая ки-слота, метионин). Эти аминокислоты применяют как добавки к кормам, вкусо-вые добавки, лекарственные препараты, исходные вещества для получения фи-зиологически активных пептидов.

ГЛАВА 2ПЕПТИДЫ

Бели карбоксильная группа одной α-аминокислоты ацилирует аминогруп-пу другой аминокислоты, то образующуюся амидную связь называют пептидной,а само соединение — пептидом:

Таким образом, пептиды представляют собой соединения, которые по-строены из остатков α-аминокислот, cоединенных между собой пептиднымисвязями. Иногда для достаточно длинных пептидов применяют термин полипеп-тиды. Заметим, что с участием аминокислот могут Образовываться и другие амид-ные связи, например между γ-карбоксильной группой остатка глутаминовой ки-слоты и ε-аминогруппой лизина при сшивании цепей фибрина в ходе старениятромба. Такие связи, химически близкие пептйдным, к последним не причисля-ют, иногда называют их изопептидными.

Образование пептидных связей в воде термодинамически невыгодно, этимобусловлена необходимость предварительной активации взаимодействующих групп(чаще — карбоксильной группы) при химическом синтезе пептидной связи, а такжепри ее биосинтезе. Однако кинетически пептидная связь достаточно стабильна иее гидролитическое расщепление происходит лишь при использовании химиче-ских, катализаторов (кислот или щелочей) либо при катализе специфическимиферментами (пептидазами).

Понятно, что в дипептиде, полученном конденсацией двух аминокислотныхостатков, сохраняются как карбоксильная, так и аминная группы, поэтому при-соединение к нему аминокислотных остатков может быть продолжено с обеих сто-рон, что открывает возможность образования очень длинных — в несколько сотени даже тысяч аминокислотных остатков — пептидных цепей. В пептидной цепиразличают N-концевой (или аминоконцевой) остаток, содержащий свободную ами-ногруппу, и С-концевой остаток, который несет свободную α-карбоксильную груп-пу.

2.1. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ

Подобно аминокислотам, пептиды, содержащие свободные аминную и кар-боксильную группы, являются биполярными ионами и имеют изоэлектриче-скуюточку. Их растворимость в воде весьма различна и определяется как длиной пеп-тида, так и природой образующих его аминокислот. Кислотно-основные свойствапептидов несколько отличаются от свойств аминокислот, поскольку взаимноевлияние аминной и карбоксильной групп в них значительно слабее, чем в α-амино-кислотах, а в длинных пептидах им вообще можно пренебречь. В пептидах рКаα-карбоксильной группы заметно выше, чем в аминокислотах, и составляет, на-

пример, для аланил-аланина 3,12 (ср. с рКа 2,34 для карбоксила аланина и 4,7 дляуксусной кислоты). Для карбоксильной группы аланил-аланил-аланина рКа = 3,39;с дальнейшим ростом цепи сохраняется значение, близкое к 3,4.

Некоторое повышение кислотности по сравнению с карбоксилом уксуснойкислоты следует приписать влиянию соседней пептидной связи. Аналогичноα-аминогруппа в пептидах становится менее основной, чем в (α-аминокислотах:рКа α-аммонийной группы составляет 9,69 для аланина, 8,30 для аланил-алани-на, 8,03 для аланил-аланил-аланина и с дальнейшим удлинением цепи не меняет-ся.

В остальном химические свойства α-аминной и карбоксильной групппептидов качественно близки свойствам аминокислот. В частности, они вступаютв те же реакции, которые были описаны для аминокислот, кроме протекающих содновременным участием обеих функциональных групп. Такие реакции для пеп-тидов не характерны. Исключением является довольно легкая циклизация эфи-ров и некоторых других производных дипептидов, в которых активирована α-карбоксильная группа, приводящая к дикетопиперазинам:

В сильнощелочных растворах пептиды дают окрашенные комплексы с ио-нами меди, построенные весьма сложно. На этом основана так называемая биу-ретовая реакция. Разумеется, пептиды могут также вступать в реакции за счетфункциональных групп, содержащихся в боковых цепях аминокислот (см. гл. 9).

2.2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ

Синтез пептидов, основы которого были заложены Э.Фишером в нача-ле столетия, развился в обширную область синтетической органической химии.Описаны синтезы весьма протяженных пептидов и нескольких, пока неболь-ших, белков. Не умаляя значения последних работ, укажем, что для практическо-го получения значительных количеств белка предпочтителен микробиологическийсинтез в рекомбинантных клетках; начал развиваться и биосинтез пептидов в

бесклеточных системах.Синтез пептидов определенной структуры, даже наиболее простых, требует

предварительного временного блокирования (защиты) функциональных групп,которые не должны участвовать в реакции. Если этого не предусмотреть, будутполучаться весьма сложные, смеси продуктов.

2.2.1. Защита аминогруппы

α-Аминогруппу ацилирующей аминокислоты или пептида защищают, так,чтобы блокирующую группировку после образования пептидной связи можно былоотщепить, снять в достаточно мягких условиях, которые гарантировали бы цело-стность пептида. Одной из первых была предложена (сохранившая значение досих пор) бензил-оксикарбонильная группа (сокращенное обозначение Z, устарев-шее название карбобензоксигруппа), которую вводят, ацилируя аминокислоту илипептид бензилоксикарбонилхлоридом:

Если надобность в защите миновала, бензилоксикарбонильную группу отщеп-ляют гидрированием в присутствии палладиевого катализатора или действием бро-мистого водорода в ледяной уксусной кислоте:

Широко применяют третг-бутоксикарбонилъную (ВОС) группу Ее вво-дят, ацилируя аминогруппу ангидридом моно-трет-бутилового эфира угольнойкислоты (ВОС-ангидридом), отщепление же достигается мягким действием ки-слотных агентов — трифторуксусной кислоты или хлористого водорода в органи-ческих растворителях:

В последнее время, особенно в автоматическом синтезе пептидов, все чащеиспользуют 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу (Fmoc-группу). Ее вво-дят, действуя на аминокислоту или пептид соответствующим хлорангидридом:

Известно множество других защитных групп, обладающих теми или ины-ми преимуществами и недостатками и применяемых в различных схемах синтеза.Необходимость использования большого их набора обусловлена тем, что специфи-ческие группы требуются для защиты функциональных групп боковых цепей, при-чем деблокирование α-аминогрупп необходимо проводить каждый раз перед но-вой стадией синтеза, тогда как защита боковых групп не должна затрагиваться вэтих условиях. Их отщепляют в самом конце синтеза пептида.

* Вызывает элиминирование водорода, указанного стрелкой.

2.2.2. Защита αα-карбоксильной группы

Для этой цели обычно используют превращение карбоксильной группы вметиловый или трem-бутиловый эфиры по реакциям, описанным в гл. 1. Дляотщепления метилового эфира прибегают к его омылению щелочью, которое невсегда протекает гладко и создает опасность рацемизации С-концевого остатка.Трem-бутиловые эфиры удобно расщеплять мягкой обработкой кислотными аген-тами, например трифторуксусной кислотой:

2.2.3. Образование иептидной связи

Для образования пептидной связи, которое при химическом синтезе, какправило, проводят в отсутствие воды, необходима активация карбоксильнойгруппы. Возможна, впрочем, и активация α-аминогруппы, однако ее практиче-ски не применяют. Активированное производное защищенной по аминогруппеаминокислоты или пептида может быть получено в отдельной реакции, а иногда ивыделено или образовано непосредственно перед конденсацией с аминокомпонен-том (аминокислотой или пептидом с защищенной карбоксильной группой).

Реакция в присутствии карбодиимидов. Ацилированная аминокислота реа-гирует с –N=C=N— (карбодиимидной)-группировкой, образуя соответствующуюO-ацилмочевину. Это активированное производное вступает в реакцию с амино-компонентом, причем образуются пептид и двузамещенная мочевина:

Активированные эфиры. Иногда удобнее превратить О-ацилмочевину в акти-вированный эфир (с некоторым допущением и само это соединение можно рас-сматривать как активированный эфир; однако оно нестабильно, что может при-вести к нежелательным побочным реакциям). Для этого к реакционной смеси,содержащей O-ацилмочевину, прибавляют пентафторфенол, р-нитрофенол, N-оксисукцинимид и т.п.:

Продукты переноса аминоацильного или пептидного остатка на окси-группу этих соединений относительно устойчивы и могут быть выделены. Их взаи-модействие с аминокомпонентом дает требуемый пептид:

Симметричные ангидриды защищенных аминокислот. О-Ацилмочевина спо-собна реагировать с карбоксильной группой второй молекулы защищенной ами-нокислоты, образуя ее симметричный ангидрид. Последний является хорошимацилирующим агентом и реагирует с аминокомпонентом, в результате чего полу-чается пептид и отщепляется защищенная аминокислота:

Известно и применяется гораздо большее число способов активации карбок-сильных групп; их описание можно найти в специальных руководствах.

2.2.4. Тактика пептидного синтеза

Изложенные подходы позволяют проводить направленный синтез весьмасложных пептидов. Оптимальный путь синтеза выбирают исходя из ряда соображе-ний. Особое внимание уделяют предотвращению рацемизации, наиболее вероят-ной у Cα-атома того остатка, карбоксильная группа которого активирована. Этообусловлено тем, что активирующие группы вызывают смещение электронной плот-ности не только от углерода карбонильной группы (что необходимо для облегченияатаки этого атома нуклеофильной аминогруппой аминокомпонента), но и от Cα-атома. Последнее благоприятствует отщеплению атома водорода, находящегося приэтом углероде, в виде протона. Такое отщепление переводит остающиеся, три за-местителя у α-атома углерода в плоскую тригональную конфигурацию. При возвратепротона, который может подойти к Cα-атому с обеих сторон плоскости, происходитобразование равной смеси L- и D-изомеров, т.е. рацемизация. Таким образом,активация карбоксильной группы несет в себе потенциальную опасность рацеми-зации С-концевых остатков аминокислот в пептидных фрагментах:

Амидные связи уретанового типа в бензилоксикарбонил- и ВОС-аминокис-лотах менее благоприятствуют рацемизации по сравнению с обычными пептид-ными связями. Следовательно, планируя синтез пептида, выгодно не конденси-ровать его фрагменты, поскольку для этого пришлось бы активировать карбок-сильные группы пептидов, а присоединять к растущему пептиду защищен-ныеактивированные аминокислоты, одну за другой начиная с С-концевого амино-кислотного остатка. Синтез длинных пептидов иногда приходится все же прово-дить из фрагментов, которые затем соединяют друг с другом. В этом случае стара-ются выбирать фрагменты так, чтобы в С-концевом положении каждого из них

оказывался, остаток глицина, который не содержит асимметрического атома и,значит, не может рацемизоваться, или остаток пролина, в котором нет - атомаводорода при α-углеродном атоме и не может происходить рацемизация по опи-санному выше механизму. Если такой прием почему-либо невозможен, прибега-ют к конденсации фрагментов, используя азиды пептидов, — метод, при которомопасность рацемизации минимальна, хотя и не исключена вовсе.

Исключительно ценным развитием ступенчатого синтеза пептидов явилсятвердофазный метод синтеза пептидов, предложенный Р.Меррифилдом.С-концевую аминокислоту присоединяют к полимерной матрице сложноэфир-ной связью, используя, например, реакцию соли аминокислоты с активными бром-метильными группами на поверхности поперечно сшитого полистирола:

После образования сложноэфирной связи между С-концевым остатком иматрицей отщепляют защитную группу (обычно ВОС или Fmoc), обрабатываяполимер соответственно кислотой или амином:

К освободившейся аминогруппе присоединяют аминокислоту, предшест-вующую С-концевой, используя для этого ангидрид защищенной аминокислотыили иной способ активации — реакцию в присутствии карбодиимида, пентафтор-фенилового эфира защищенной аминокислоты и т.п.:

Затем снова отщепляют защитную группу и повторяют цикл, присоединяяследующий аминокислотный остаток, и т.д.

Такие циклы можно повторять много раз, получая весьма длинные пептид-ные цепи, содержащие до 100 остатков и более. Многостадийный синтез на твер-дофазном носителе выгоден прежде всего тем, что он позволяет избежать потерьсинтезируемого пептида, неминуемых при выделении продукта синтеза в обыч-ных условиях. Выход на стадии присоединения аминокислоты и отщепления за-щитной группы достигает, как правило, 99 — 99,5%, в частности за счет примене-ния большого избытка ацилирующего компонента. Важно и то, что растущие пеп-тидные цепи, будучи связаны с носителем, защищены от агрегации — явления,резко ограничивающего возможности синтеза длинных пептидов в растворе.

Твердофазный синтез пептидов, который состоит из строго одинаковыхповторяющихся стадий, удалось автоматизировать — были созданы автоматиче-ские синтезаторы пептидов.

На практике метод все же ограничен неполнотой присоединения ацилами-нокислоты в отдельных циклах. Понятно, что «недостроенный» в том или иномцикле пептид будет ацилирован в следующем, что приведет к пропуску амино-кислотного остатка. Образование таких пептидов с ошибочными последователь-ностями даст при синтезе длинного пептида весьма сложную смесь продуктов.Метод оказался особенно продуктивным в сочетании с высокоэффективной жид-костной хроматографией, которая позволяет выделить главный компонент средимножества продуктов твердофазного синтеза.

Сочетание твердофазного синтеза и высокоэффективной жидкостной хрома-тографии в настоящее время — главный способ получения небольших количеств15—20-членных пептидов, в частности пептидных детерминант, используемыхдля получения специфических антител к тому или иному белку.

Применение различных приемов пептидного синтеза, по преимуществу твер-дофазного, позволило получить некоторые, как правило, не очень большие бел-ки. Первоначально эти работы имели только принципиальный характер, демон-стрируя возможность чисто химического синтеза белков. В последнее время, од-нако, проведены синтезы белков, имеющие практическое значение. В частности,в значительных количествах удается получать инсулин, ряд других пептидных гор-монов, например кальцитонин рыб, (32 аминокислотных остатка), синтезируемыйпартиями по 50 — 100 г, фактор роста эпителия (53 остатка), росттрансформи-рующий фактор α (50 остатков), интерлейкин-3 (140 остатков), α

1- и α2 -интер-

фероны лейкоцитов человека и их аналоги, панкреатический ингибитор трипси-на. Синтезирована и использована для определения пространственной структурыпротеиназа вируса иммунодефицита человека, пептидная цепь которой содержит99 аминокислот. Характерно, что свертывание полученных синтетически пептид-ных цепей в нативную структуру происходит самопроизвольно и не вызывает су-щественных затруднений.

Несмотря на то, что получение белков в значительных количествах в ближай-шем будущем будет, по-видимому, основано на микробиологическом синтезе или син-тезе в бесклеточной системе, возможны и дальнейшие успехи в развитии химическихспособов получения крупных пептидов и белков. Определенные перспективы имеет итак называемый полусинтез белков, при котором полипептидную цепь белка соби-рают из пептидных фрагментов, полученных ограниченным протеолизом и чисто хи-мическим путем с использованием химических, а иногда энзиматических методов ихконденсации. Такой подход был применен, в частности, для получения проинсулиначеловека присоединением ряда синтетических пептидных звеньев к выделенным изприродного инсулина А- и В-цепям.

2. 3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ

Протеолитические ферменты в обычных условиях катализируют гидро-лиз пептидных связей. Однако могут быть подобраны такие условия, прикоторых равновесие оказывается сдвинутым в сторону образования пептид-ной связи. Так, в концентрированных растворах бензилоксикарбонил-L-аспара-гиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина металлопротеиназы, на-пример термолизин, катализируют образование пептидной связи между ними,причем продукт реакции (метиловый эфир бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина), будучи малорастворимым, выпадает в осадок в виде соли с еще 1

одной молекулой метилового эфира L-фенилаланина. Именно эта низкая раствори-мость продукта, которая выводит его из сферы реакции, смещает равновесие всторону синтеза. После снятия защитной группы каталитическим гидрировани-ем получают метиловый эфир L-аспартил-L-фенилаланина — аспартам — со-единение, превосходящее сахарозу по сладости в 200 раз. Процесс используют дляпромышленного получения аспартама:

Еще один способ смещения равновесия в сторону синтеза — проведениекатализируемой протеиназой реакции пептидного синтеза в органическомрастворителе в присутствии малых количеств воды, достаточных только для гид-ратации фермента. Применяют при ферментативном синтезе и предварительнуюактивацию одного из компонентов. Так, эфиры ацилированных пептидов в при-сутствии сериновых протеиназ быстро реагируют с аминокомпонентами — про-изводными аминокислот или пептидов, образуя более длинные пептиды. Сдвигравновесия в сторону синтеза в этом случае обеспечен активацией ацилирую-щего пептида за счет его превращения в сложный эфир; скорость катализируе-мого ферментом синтеза пептидной связи из эфира пептида гораздо выше скоро-

сти гидролиза этой же пептидной связи ферментом. Описаны катализируемые ферментами частичные трансформации пеп-

тидов, например превращение свиного инсулина в инсулин человека, отличаю-щийся от первого только заменой С-концевого остатка аланина в В-цепи на трео-нин. Это достигается путем катализируемого ферментом отщепления аланина иприсоединения вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка трео-нина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке:

2.4. ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ

Пептиды в природных объектах не только появляются в качестве промежу-точных продуктов деградации белка, они часто играют самостоятельную физио-ло-гическую роль.

Пептидные антибиотики в большинстве своем синтезируются микроор-га-низмами по особому нематричному механизму и содержат в своем составе ряднебелковых аминокислот, а также D-изомеров. Многие из них являются цикло-пептидами. Среди таких антибиотиков отметим циклодекапептид грамицидинS - антимикробный агент широкого спектра действия:

Следует обратить внимание на присутствие в молекуле небелковой, аминокислоты- орнитина - и D-изомера фенилаланина. Стрелки показывают направление пеп-тидных связей в цикле.

Эффективным иммунодепрессантом служит другой циклопептидный анти-биотик - циклоспорин, содержащий N-метилированные и другие небелковые ами-нокислоты (непредельную оксиаминокислоту, α-аминомасляную кислоту, оста-ток D-аланина):

В последнее время обнаружены пептидные антибиотики, продуцируемыеклетками животных, в особенности лимфоцитами. Они образуются по обычномупути биосинтеза белковых структур.

Пептидные гормоны, в более широком смысле — регуляторные пепти-ды, играют важнейшую роль в управлении метаболическими процессами в разви-тии организма, передаче сигналов. К их числу принадлежат некоторые короткиепептиды, например, окситоцин, стимулирующий сокращение матки и лактацию:

Сходно построен нйнапептид вазопрессин, подавляющий диурез и повы-шающий давление крови. Адренокортикотропный гормон (АКТГ), пептиднаяцепь которого состоит из 39 аминокислотных остатков, регулирует функцию над-почечников и может затрагивать целый ряд процессов, в том числе мотивацию,обучаемость, поведение.

α-Меланоцитостимулирующий гормон СНзСО—Ser—Туr—Ser—Мet—Glu—His—Phe—Arg—Trp—Gly—Lys—Pro—Val-NH

2 контролирует образование мела-

нина в пигментных клетках позвоночных, но влияет и на функционирование нерв-ной системы, поведенческие реакции, а также развитие плода.

Следует отметить, что функции пептидных гормонов, как правило, много-значны, причем нередко в них удается выделить участки последовательности, от-ветственные за отдельные типы биологической активности. Для пептидных гор-монов характерны процессы посттрансляционной модификации: в случае α-мела-ноцитостимулирующего гормона — ацетилирование α-NН

2-группы и амидирова-

ние карбоксила.Биосинтез пептидных гормонов и других регуляторных пептидов протекает

так же, как и синтез белков. Многие физиологически активные пептиды, в особен-ности короткие, синтезируются в виде предшественников — полипептидов го-раздо большей длины. Последние затем подвергаются ограниченному протеолизуспецифическими ферментами, которые, действуя на строго определенные связи,высвобождают активные пептиды. Так, энкефалины — пептиды, взаимодейст-вую-щие с теми же рецепторами, что и морфин, и представляющие собой природ-ные анальгетики, — синтезируются в виде предшественника, в пептидной цепикоторого последоэательности энкефалина Туr—Gly—Gly— Phe—Leu или Туr—Gly—Gly—Phe—Met повторяются несколько раз. Им предшествуют и за ними следуютпары Arg—Arg, которые служат сигналом для действия специфической протеиза-ны, расщепляющей пептидную связь после такой пары остатков аргинина:

Пептидные связи, атакуемые специфическойпротеиназой в предшественнике энкефалина

Оба остатка аргинина затем отщепляются специфической карбоксипепти-дазой, высвобождающей энкефалин.

Нередко оказывается, что пептиды могут имитировать поведение соответст-вующих пептидных фрагментов белка в его взаимодействии с другими биологиче-скими молекулами, в частности с иными белками, например с рецепторами илиструктурообразующими молекулами. Так, пентапептидный фрагмент белка соеди-нительной ткани ламинина, имеющий последовательность Туг — Ile— Gly — Ser—Arg, ответствен за присоединение к этому белку клеток. Пентапептид такой жеструктуры способен препятствовать этому, по-видимому, блокируя рецепторы наповерхности клеток, вовлеченные во взаимодействие с ламинином.

ГЛАВА 3ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Выделение практически чистого индивидуального белка (в таких случаяхнередко употребляют не вполне удачный термин «гомогенный белок») — необхо-димая предпосылка для изучения его строения и функциональных свойств. Тех-нические приемы, используемые для этого, весьма многообразны и быстро совер-шенствуются, причем наряду с развитием микрометодов все чаще возникает не-обходимость масштабирования процессов, с тем чтобы получать крупные количе-ства высокоочищенных белков для нужд медицины и биотехнологии. Особеннообострилась потребность в эффективных методах разделения белков с развитиемгенно-инженерных способов их получения. В данной главе рассмотрены лишь наи-более общие. принципы препаративной химии белков.

3.1. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Получение чистых химических индивидуальных белков включает в себя какудаление небелковых примесей, так и разделение между собой собственно белко-вых компонентов. Последняя часть задачи в силу сходства физико-химическихсвойств белков особенно сложна, поэтому именно ее решение определяет выбортех или иных схем выделения белка. При этом необходимо учитывать некоторыеособенности поведения, присущие всем белкам.

К ним относится прежде всего способность белков подвергаться денатура-ции, т.е. претерпевать такие изменения пространственного строения, которые при-водят к утрате или частичной потере функциональных свойств. Правда, денатура-ция во многих случаях обратима, однако эта обратимость не обеспечива-ется ав-томатически, а требует в каждом отдельном случае подбора специальных прие-мов. В то же время полностью или даже частично денатурированные белки весьмауязвимы для необратимых повреждений, в особенности для действия протеоли-тических ферментов, поэтому условий, способствующих денатурации, следует все-мерно избегать.

Для предотвращения тепловой денатурации выделение белка проводят принизкой температуре, обычно при 4 °С. Необходимо также избегать крайнихзначений рН. Белки легко денатурируют при низких рН из-за протонированияотрицательно заряженных в нормальных условиях карбоксильных групп и возни-кающего вследствие этого резкого преобладания положительных зарядов, кото-рое благоприятствует развертыванию компактной структуры. В щелочной средепри рН 10 и выше утрачиваются положительные заряды, обусловленные протони-рованием ε-аминогрупп лизина, и опять-таки наступает декомпенсация зарядовна поверхности, дестабилизирующая глобулу. Одновременно фенольные гидрокси-

лы тех остатков тирозина, которые были скрыты внутри глобулы, получив отри-цательный заряд, стремятся выйти на поверхность, что также способствует дена-турации белка.

В еще более щелочных растворах происходят реакции, необратимо повреж-дающие белок, — отщепление серы от остатков цистеина и цистина, β-элими-нирование фосфатных остатков в фосфопротеинах, отщепление полисахаридныхцепей, присоединенных к остаткам серина в гликопротеинах. Образующиеся врезультате этих реакций остатки непредельной аминокислоты — дегидроаланина— присоединяются к близлежащим ε-аминогруппам лизина с образованием такназываемого лизиноаланина — соединения, присутствие которого в кислотномгидролизате белка свидетельствует о глубоком повреждении его структуры:

Причиной денатурации может стать применение органических раст-ворителей, способных нарушить существенную для стабильности белка системугидрофобных контактов внутри глобулы. Надо также учитывать возможность де-натурации белка на границе раздела фаз, в особенности при образовании пены.При выделении очень малых количеств белка, не редком в современной биохи-мии, следует считаться с потерями, вызываемыми его адсорбцией, часто необра-тимой, на поверхности стекла или полимерных материалов, особенно значитель-ной на заключительных стадиях очистки.

Особую опасность при выделении белков представляют содержащиеся в

исходном материале протеолитические ферменты, даже если они присутствуютв следовых количествах. Повреждение, которое приводит к образованию ложныхмножественных форм белка, а иногда и его глубокое расщепление становятся осо-бенно вероятными, если схема выделения включает условия, приближающие бе-лок к денатурации. Для предотвращения протеолиза необходимо уже на раннихстадиях очистки включать операции, направленные на отделение протеиназ, при-бавлять к смеси ингибиторы различных классов протеиназ. Очень важно, прово-дить очистку белка быстро, что снижает опасность протеолиза и вероятность де-натурации.

Распространено мнение об особой нестабильности чистых белков. Дейст-вительно, содержащиеся в неочищенных препаратах посторонние белки в опреде-ленной мере защищают белок от денатурирующих воздействий и протеолиза. Напромежуточных стадиях, когда полная очистка еще не достигнута, опасность про-теолиза увеличивается, с удалением же следов протеиназ на завершающих этапахочистки стабильность белка должна вновь возрасти. Впрочем, возрастает и опас-ность еорбционных потерь на поверхностях, которые могут восприниматься экс-периментатором как присущая чистому белку нестабильность.

3.2. ХАРАКТЕРНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ, НА КОТОРЫХОСНОВАНО ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ

На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаныспособы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия. На ис-пользовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультра-фильтрации, отчасти электрофорез в гелях.

Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных группна его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняет-ся в зависимости от рН, изоэлектрические точки белков — рH (значения рН, прикотором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенси-рованы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разныхбелков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионны-ми, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного за-ряда. На различии заряда белков при разных рН основано их разделение метода-ми электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрическрй иионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение за-ряженных групп, определяющее значение pI. Белки со сходными изоэлектриче-скими точками могут различаться распределением заряженных функциональныхгрупп по поверхности глобулы.Последние размещаются более или менее равно-мерно либо, наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженныхгрупп,что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.

В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участковповерхности, что используют при гидрофобной хроматографии.

Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам посебе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси — они недоста-точно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно бо-лее перспективно в этом отношении использование для выделения функциональ-ных свойств белка. Действительно, среди множества белков в исходном мате-риале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу илиблизкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилазбудет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на ис-пользовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфи-ческим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующий-ся на разнице физико-химических свойств.

Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо прин-цип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и до-полняют друг друга.

3.3. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЕ.ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ (ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ)

В этом методе используют гранулированные гели поперечно-сшитых гид-рофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их анало-ги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл).Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема длякрупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера ихорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от сред-него размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступнабольшая или меньшая часть общего объема гранул геля.

При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колон-ке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проник-шие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупныхмолекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающемих растворе. Не будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются вэлюате, как только через колонку пройдет «свободный» объем раствора V0, рав-ный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определя-ется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в видекоторых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободныйобъем составляет 30—35% общего объема колонки.

Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, со-ставляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элю-

ции и белок появится в объеме Vt, связанном с коэффициентом доступности Кдост(долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением

,VVVVK

0eДОСТ −

где Vt — полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится насам гельобразующий полимер.

Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует своезначение Кдост, на чем и основано разделение при гель-хроматографии. Понятно, чтоесли объем элюции Vt близок к свободному объему V0, то Кдост стремится к нулю иразделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не про-изойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаемвесь объем геля (Vt близок к V0 и Кдост стремится к единице), в геле с данными харак-теристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если Кдост находит-ся в пределах 0,4 — 0,6. Разумеется, пределы разделения можно расширить, исполь-зуя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших — мелкопо-ристые гели.

Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков определяется немолекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно,молекулы вытянутой формы за счет «кувыркания» в растворе труднее проникают вгели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняет-ся ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядо-ченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.

Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белкасправедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкостьэксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определениямолекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствую-щим гелем, калибруют набором белков с известными молекулярными массами,после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молеку-лярную массу интерполяцией (рис. 3.1). Точность метода не очень велика, новполне достаточна для большинства практически встречающихся задач. При ис-пользовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающиеиз-за того, что гельобразующий материал не вполне инертен, как это предпола-гает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, чтоискажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказы-вается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкостьматрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белкоммало отражается на процессе.

Рис. 3.1. Графики зависимости между молекулярной массой бел-ков и коэффициентом доступности для сефадексов серии G«сверхтон-ких» (А) и сефарозы 2В, 4В и 6В (Б)

Наилучшие результаты достигаются, если Кдост

для выделяемого белка лежит в диапа-зоне 0,4 - 0,6

Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ио-нообменными взаимодействиями, в частности содержанием отрицательно заряжен-ных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакрила-мидных материалах. В последних карбоксильные группы возникают при спонтан-ном гидролизе амидов, в полисахаридах же они могут образовываться в результатеокисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообмен-ными вза-имодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, напри-мер лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и мо-жет даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах та-кое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы рас-твора.

Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хрома-тографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пеп-тидов, — гидрофобное связывание с матрицей геля. Гидрофобные элементы вклю-чаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшиваю-щимиагентами, в частности эпихлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содер-жащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилаланина,триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются вэлюате позже неорганических солей.

Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простотапроведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преиму-ществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем,что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого рас-твора не должен превышать 3—5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-

хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выде-ления белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частно-сти при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, посколь-ку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильт-рацию используют особенно часто.

Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография — удобный спо-соб фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низко-молекулярных примесей, в том числе солей.

В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделе-ния белков по размерам начали применять макропористые неорганические но-сители — макропористые стекло и силикагель. Обычно поверхность этих мате-риалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исклю-чить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разде-лять белки по размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесси снижает помехи со стороны диффузии.

3.4. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Метод ионообменной хроматографии, основанный на различиях в соотноше-нии и распределении заряженных групп на поверхности белка, принадлежит к числунаиболее используемых. В хроматографии белков практически не применяют син-тетические ионообменные смолы на основе полистирола, весьма популярные ваналитической химии аминокислот и пептидов. Это объясняется, во-первых, боль-шим содержанием поперечных сшивок, делающих материалы такого рода прак-тически непроницаемыми для белков, во-вторых, сорбцией белков, подчас необ-ратимой, на гидрофобной поверхности полистирола.

По указанным соображениям для разделения белков используют ионооб-менники, в которых матрица («подложка») отчетливо гидрофильна. Особеннораспространены ионообменники, получаемые присоединением ионогенных группк целлюлозе, поперечно-сшитым декстранам (сефадексы).

Для получения катионитов в качестве ионогенной чаще всего используюткарбоксильную группу, рКa которой, несколько изменяющийся в зависимостиот микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы,сефадекса, содержащие группировки СН-О-СН

2СООН).

Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно заряжены при рН 5 и вышеи, следовательно, способны связывать белки, которые в этих условиях несут поло-жительный заряд. Связывание белков усиливается, если на их поверхности встре-чаются скопления («гроздья») катионных групп. При прочих равных условиях скатионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, чтообъясняется неоперативностью многоточечного взаимодействия обширных участ-ков поверхности такого белка с анионными группами ионообменника.

Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышениемионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой за-ряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заря-женных ионов солей. В результате при определенной концентрации соли, характер-ной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитомснимаются и белок элюируется с колонки. Плавное увеличение ионной силы раство-ра, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызы-вает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочносвязанных белков и т.д. В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатойэлюции, при которой концентрация соли повышается скачками. Это ускоряет раз-деление и позволяет собрать белок в небольшом объеме, однако легко приводит кобразованию одним и тем же белком нескольких ложных пиков.

При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концент-рации белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный «хвост», что можетбыть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте. Участки сих повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок,что и вызывает задержку элюции и образование «хвоста». В такой ситуации скачкооб-разное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия де-сорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы «хвост»,десорбируется скачком, давая ложный пик.

Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции неза-висимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, илиподвергать сомнительные пики повторной хроматографии в тех же условиях. Не-соблюдение таких предосторожностей нередко приводит к ошибочному обнару-жению «множественных форм» белков.

В принципе для десорбции белков с катионитов можно прибегать и к гра-диенту рН. Например, понижение рН до 3-4 приводит к протонированию кар-боксилатных ионов карбоксиметилцеллюлозы или аналогичных ионитов и посте-пенной десорбции связанных с ними белков. Можно рассчитывать и на достиже-ние изоэлектрической точки сорбированного белка, что опять-таки вызвало быего десорбцию. Однако такой прием используют не часто не только из-за опасно-сти денатурации белков при понижении рН, но и из-за осложнений, связанных ссорбцией ионитом части ионов элюирующего раствора и неопределенностью вы-зываемых этим локальных изменений рН. По таким же соображениям не реко-мендуется использовать в ионообменной хроматографии белков растворы, содер-жащие несколько разных катионов или анионов.

Помимо карбоксильных катионитов, о которых шла речь выше, применя-ют катиониты, содержащие сульфогруппы — SO

3-, например сульфопропилсефа-

декс. В отличие от карбоксильных сульфогруппы сохраняют отрицательный зарядпрактически при всех рН, используемых в хроматографии белков.

Моногенные группы фосфоцеллюлозы слабее, чем у сульфопропилсефа-

декса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионообменник может при-меняться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых фер-ментов фосфорного обмена.

Среди анионитов наибольшее распространение получили диэтил-ами-ноэтил (ДЕАЕ)-целлюлоза и ее аналоги с иными матрицами:

Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой по-лисахаридной матрице

Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа несколь-ко ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что еер равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как анионообменник вплоть до рН 8,5— 9,0. Аниониты, содержащие четвертичные аммонийные группы, — QAE-сефа-декс или QAE-сефароза — сохраняют положительный заряд и при более высокихрН.

Хроматография белков на DEAE-целлюлозе и аналогичных анионитах, по-добно хроматографии на катионитах, определяется многоточечным связыва-ниемотрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катион-ными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах; десорб-ции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее мож-но проводить ступенчато или с применением градиента концентрации соли. И вэтом случае не рекомендуют градиенты рН и использование растворов, содержащихразные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разно-именно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемыханионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислыхрастворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг рН вщелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сде-лает процесс трудно контролируемым.

В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионооб-мен-ники на основе гидрофильных органических полимеров, получаемых в фор-ме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабо-чей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хро-ма-тографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых моле-кул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионо-обменников с неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что по-зволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонкупри давлении порядка 20 атм1.

Рис. 3.2. Очистка щелочной фосфатазы ионообменной хроматографией:1 - оптическая плотность -при 280 нм, отражающая общее содержание бел-ка; 2 - активность щелочной фосфатазы;А - разделение неочищенного препарата на анионите Моно-Q при рН 8 вградиенте концентрации NaCl 0- 0,35 М (3);Б - хроматофокусирование на Моно-Р щелочной фосфатазы, очищенной напредыдущей стадии в градиенте рН (4);В - хроматография фракции, выделенной на Моно-Р, на анионите Моно-Q вградиенте концентрации NaCl (5)

Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и ско-рость хроматографии белков на такого рода сорбентах, получившей название быст-рой жидкостной хроматографии белков (английское сокращенное обозначениеFPLC). В качестве сорбентов используют Моно-Q) — сильный анионит с четвертич-ными аммонийными группами, Моно-S — сильный катионит, содержащий сульфо-группы, или Моно-Р — катионит с фосфатными группами (рис. 3.2).

К сожалению, до сих пор не удалось разработать достаточно эффективныйспособ препаративного электрофореза белков в гелях, хотя их аналитическое разде-ление электрофорезом в полиакриламидном геле дает очень хорошие результатыи является ведущим методом в исследовании белковых смесей и индивидуальныхбелков.

3.5. ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильными амино-кислотами, но в то же время содержит немало (до половины от их общего содержа-ния) гидрофобных остатков, нередко образующих скопления («гроздья»). Такие гид-рофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характер-ную особенность структуры каждого белка, на чем и основан метод гидрофобнойхроматографии. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая гидрофобные

группировки в гидрофильную матрицу, например в поперечносшитую агарозу — се-фарозу. По такому принципу построены, в частности, октил- и фенилсефароза:

Фенилсефароза

При пропускании белкового раствора через фенилсефарозу гидрофобныеучастки поверхности белков образуют контакты с фенильными группами, вытес-няя прилегающие к этим структурам молекулы воды Число и прочность такихконтактов весьма различны у разных белков. Повышению их прочности способ-ствует сорбция белков из концентрированных растворов солей, например, суль-фата аммония. Плавное понижение концентрации соли в растворе, протекаю-щем через колонку с фенилсефарозой, приводит к поочерёдной десорбции бел-ков (рис. 3.3).

Сходным образом действуют сорбенты, полученные присоединением к мак-ропористому кремнезему гидрофобных алкильных радикалов различной длины.Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давле-нии в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ.HPLC).

Те из них, которые содержат длин-ные — C

18- углеводородные цепи, мало-

пригодны для разделения белков из-заслишком сильного, нередко необрати-мого связывания, но могут применятьсядля хроматографии пептидов. Лучшие ре-зультаты дает хроматография белков насорбентах, содержащих более короткие —С

4 — С

8-углеводородные цепи.

Нередко гидрофобная хроматогра-фия сочетается с другими эффектами.Например, присоединение к активиро-ванной бромцианом сефарозе диаминовразличной длины дает сорбенты, в кото-рых содержатся гидрофобные углево-дородные цепочки наряду с двумя кати-онными группами. Объединение черт гид-рофобного сорбента и анионита в одномхроматографическом материале обогаща-ет его возможности.

Рис. 3.3. Выделение интерферонафибробластов человека гидрофоб-ной хроматографией на сефарозеCL4B:1 - содержание белка в элюате, 2 -градиент концентрации этилнглико-ля, использованного для десорбции, 3- активность интерферона; хорошо вид-ны проскок», содержащий белки, ко-торые не связываются с сорбентом, ипик очищенного интерферона

Описанный выше способ проведения хроматографии на гидрофобном сор-бенте — далеко не единственно возможный. Для сорбции белков не обязательновведение в раствор повышенных концентраций соли, а для элюции можно при-менять добавление органических растворителей, сдвиг рН. В некоторых случаях,когда связывание белка основано на сочетании гидрофобных и ионных взаимодей-ствий, хорошие результаты дает элюция растворами солей. Отметим также, чтопризнаки гидрофобной хроматографии встречаются и в других приемах разделе-ния белков, в особенности в аффинной хроматографии.

3.6. АФФИННАЯ, ИЛИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ,ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ

Как уже отмечалось, способы разделения белков, основанные на различияхв их физико-химических свойствах, не могут быть высокоспецифичными. С этойточки зрения гораздо перспективнее препаративные методы, которые базируютсяна функциональных различиях белков. Для множества белков, включая фермен-ты, их ингибиторы, транспортные белки, иммуноглобулины, регуляторные белки,токсины, рецепторы, — главнейшая функциональная черта состоит, в способно-сти избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты, коферменты,аллостерические эффекторы, антигены и т.п.

Такое связывание по существу своему весьма специфично, и это свойстворезко выделяет тот или иной белок из множества других. На использовании функ-ционально обусловленной способности белков обратимо связываться с соответ-ствующими лигандами и основан метод аффинной, или биоспецифической, хро-матографии.

Для синтеза аффинного сорбента отвечающий специфичности данного бел-ка лиганд (субстрат или его аналог при хроматографии фермента) присоединяютк инертной матрице так, чтобы возможно меньше затронуть те элементы егоструктуры, которые непосредственно участвуют во взаимодействии с белком.Иногда лиганд прямо вводят в реакцию с функциональными группами на поверх-ности матрицы, однако чаще их соединяют через промежуточное звено («встав-ку», «ножку» и т.п.), чтобы отдалить лиганд от матрицы и уменьшить пространст-венные препятствия для его сближения с белком.

К каждому из элементов структуры аффинного сорбента предъявляются оп-ределенные требования. Матрица должна быть инертной и не создавать стерическихпрепятствий для белка. Чаще всего в качестве матрицы используют макропорис-тые гели, образованные поперечно-сшитыми гидрофильными полимерами, на-пример производное агарозы — сефарозу, синтетические полимеры или неорга-нические носители макропористые производные кремнезема — силикагель илистекло, присоединение лигандов к сефарозе (непосредственно или через вставку)

обычно проводят, активируя ее бромцианом. Бромциан (сильный яд!) в щелочнойсреде реагирует с гидроксильными группами сефарозы, образуя весьма активныйэфир изоциановой кислоты:

Последний взаимодействует затем с аминогруппами лиганда L или «встав-ки» с образованием производного изомочевины, которое является сильным осно-ванием и в обычном диапазоне рН несет положительный заряд:

Таким образом, присоединение лиганда к сефарозе, активированной бром-цианом, одновременно создает на матрице эквивалентное содержанию лигандачисло катионных групп. Следовательно, такой сорбент помимо биоспе-цифиче-ского связывания белка лигандом может проявлять свойства анионита, что необ-ходимо учитывать при его использовании.

Известны и другие способы присоединения лигандов к матрице, однако вкаждом случае следует учитывать изменения в характере носителя, сопровождаю-щие реакцию с лигандом, а также большую или меньшую неустойчивость обра-зовавшейся связи, которая иногда может вызывать постепенную «утечку» лиган-да. Например, изомочевина может превращаться в производное гуанидина в при-сутствии значительных концентраций первичных аминов или аммиака, что вле-чет за собой отщепление лиганда.

Сложнее требования, предъявляемые к лиганду. Он прежде всего должендостаточно сильно взаимодействовать с белком. Так, принято считать, что дляполучения сорбентов, предназначенных для выделения ферментов, в качествелигандов могут быть использованы такие ингибиторы или аналоги субстрата, ко-торые имеют константу ингибирования. (субстратную константу), т.е. константудиссоциации фермент — лиганд, не хуже 10-4 М. При этом учитывается, что при-соединение лиганда к матрице ухудшает (т.е. повышает) константу ингибирова-ния по крайней мере на один порядок.

При подборе лигандов для аффинной хроматографии ферментов приходит-ся изменять структуру субстрата, чтобы предотвратить возможность его превра-щения ферментом в продукт, например, расщепления пептидного лиганда, еслиречь идет о хроматографии протеиназ. Очевидно, что сорбент, содержащий в ка-честве лиганда истинный субстрат, будет трансформирован при первом же кон-такте с ферментом и окажется непригодным.

При пропускании раствора, содержащего сложную смесь белков, другихбиополимеров, низкомолекулярных соединений, солей, пигментов и т.п., черезбиоспецифический сорбент, построенный по описанной выше схеме, лиганд об-разует комплекс только с тем белком, который имеет участок связывания, ком-плементарный структуре лиганда.

В результате именно этот белок удерживается аффинной колонкой, тогдакак все остальные компоненты смеси проходят через нее не задерживаясь.

После промывания колонки для удаления неспецифически удерживаемыхпримесей белок элюируют, изменяя состав протекающего через |колонку растворатак, чтобы ослабить взаимодействие белка с лигандом. Для этого прибегают к из-менению рН, добавляют к элюенту неорганические соли, органические раствори-тели. Все эти факторы, воздействуя на структуру зоны связывания лиганда и по-давляя отдельные виды белок-лигандных взаимодействий, например ионные связии гидрофобные контакты, обеспечивают десорбцию. В отдельных случаях прибе-гают к аффинной элюции раствором лиганда или его аналога. Этот прием, осно-ванный на конкуренции за связывание белка между присоединенным к матрицеи растворенным лигандами, весьма специфичен и эффективен, но дорог.

В качестве примера рассмотрим применение циклопептидного антибиотика — гра-мицидина S (см. гл. 2) — в качестве лиганда при аффинной хроматографии протеолитиче-ских ферментов. Он содержит ряд гидрофобных аминокислот, соответствующих специ-фичности многих протеиназ, и два остатка орнитина, δ -аминогруппы которых позволяютлегко присоединить циклопептид к активированной бромцианом сефарозе или другимматрицам:

Остаток орнитина, аминогруппа которого присоединена к активированной бром-цианом сефарозе

Грамицидин S связывает протеиназы различных классов, однако он устойчив к ихдействию и не подвергается гидролизу, по-видимому, из-за присутствия в структуре остат-ков D-фенилаланина, пролина, а также из-за особенностей конформации циклопептида.Следовательно, грамицидин S является природным аналогом субстратов протеиназ и хо-рошо подходит для роли лиганда широкой специфичности. Так, при пропускании черезколонку с грамицидин-8-сефарозой сложной смеси веществ, содержащихся в культураль-ной жидкости одного из штаммов бактерии Bacillus subtilis, сорбент связывает толькометаллопротеиназу, которую удается полностью освободить от примесей и получитьпрактически чистый белок.

Еще эффективнее сорбенты, содержащие такие лиганды, которыевзаимодействуют не только с зоной связывания, но и с каталитическим цен-тром фермента. Например, производные бензилянтарной кислоты оказалисьхорошими лигандами для выделения карбоксипептидаз — ферментов, отщеп-ляющих аминокислоты от карбоксильного конца пептидной цепи. Сходство ли-ганда с субстратами карбоксипептидаз на первый взгляд невелико, однако оказы-вается, что группа НООС-СН

2 способна выступать в качестве своеобразного анало-

га пептидной связи:

Аминогруппа, используемая для присоединения лиганда к матрице

С-Концевой остаток фенил- Бензилятарная кислота, имитиру-аланина в пептидном суб- ющая структуру остатка фенилала-страте карбоксипептидазы нина группу; СО-NH-СО-СH

В результате β-карбоксильная группа бензилянтарной кислоты взаимо-действует с каталитическим центром фермента, а боковая бензильная группа и α -карбоксил — с компонентами зоны связывания I субстрата. Образующийся ком-плекс лиганда, обычно присоединяемого к матрице через аминогруппу, введенную впара-положение бензольного кольца, связывает фермент весьма прочно.

Широко используют своеобразный вариант аффинной хроматографии, ос-нованный на применении в качестве лигандов синтетических красителей антра-хинонового ряда, например цибакрона голубого:

Плоская структура, образованная тремя конденсированными аромати-ческими кольцами замещенного антрахинона, к которому в положении 1 присо-единены замещенный анилин и триазиновый цикл, способна избирательновзаимодействовать с целым рядом белков. Лиганд связывается, по-видимому, вовпадинах, которые нередки на поверхности белков, в особенности в активных цен-трах ферментов. Высказывались предположения, что антрахиноны вместе с присое-ди-ненными ядрами анилина и триазина образуют структуру, стерически близкуюприродным лигандам, например таким коферментам, как NAD, и имитируютсвойственный последним способ связывания с белками. Ввиду этого сорбенты,содержащие цибакрон голубой и некоторые другие антрахиноновые красители,особенно рекомендуются для аффинной хроматографии белков, содержащих NADили иные соединения нуклеотидной природы.

Нет необходимости, чтобы нуклеотид или сходное по строению соединениебыло похоже на субстрат — оно может имитировать эффектор, регулирующий ак-тивность фермента. Так, например, хорошие результаты дает хроматография наантрахиноновых красителях аспартаткарбамилазы, где нуклеотиды выступают какаллостерические эффекторы.

Впрочем, круг белков, связываемых этими сорбентами, значительно ширеи включает, например, сывороточный альбумин. Последний легко присоединяетразличные лиганды, в том числе некоторые лекарственные препараты и трипто-фан, который можно ( с большими оговорками) считать напоминающим конден-сирован-ные кольца антрахинона. Структура лиганда — замещенного антрахино-на — небезразлична, поэтому, используя разные красители, удается получить се-рию сорбентов, не одинаково связывающих различные белки.

3.7. ИММУНОСОРБЦИЯ

К числу наиболее специфических принадлежит взаимодействие белков сантителами — иммуноглобулинами. Это свойство с успехом используют для соз-дания биоспецифических сорбентов, в которых роль лиганда выполняют специ-фические в отношении выделяемого белка иммуноглобулины. Получение и при-менение такого рода сорбентов происходят примерно так же, как и в обычнойаффинной хроматографии, отличаясь лишь немногими особенностями. Во-пер-вых, присоединение иммуноглобулина G к матрице необходимо проводить в ща-дящих условиях. Установление между молекулой антитела и носителем множест-ва ковалентных связей (которое может произойти, если добиваться повышенияемкости сорбента) благоприятствует денатурации белка и может, следовательно,привести к утрате специфичности антитела.

Во-вторых, использование обычных, поликлоналъных, антител, которыепредставляют собой весьма сложную смесь молекул иммуноглобулинов различ-ного строения, приводит к получению сорбента, в котором содержатся антитела сшироким диапазоном сродства к выделяемому белку-антигену. Это затрудняет егосорбцию и в особенности десорбцию, так как диссоциация целого набора неоди-наковых комплексов антиген—антитело может потребовать вариации условий элю-ции в весьма широком интервале, вплоть до весьма жестких. Это осложнение сни-мается, если доступны моноклональные антитела, представляющие собой одно-родные молекулы иммуноглобулина. Десорбция и в этом случае может доставлятьнекоторые трудности из-за прочности комплекса, однако их удается преодолеть,подавляя нековалентные взаимодействия между выделяемым белком и иммуног-лобулином при помощи изменения рН, ионной силы, добавления в элюенторганических растворителей или мочевины.

Иммуносорбция особенно уместна как высокоспецифичный метод выде-ления небольших количеств особо ценных белков из сложных смесей, посколькуиспользуемые сорбенты дороги и недолговечны из-за склонности иммуноглобу-линов к денатурации. Очень важно, что к иммуносорбции можно прибегнуть дажев таких случаях, когда сведения о свойствах белка, в том числе и о его функции,скудны. Если известна первичная структура, определенная по нуклеотидной по-следовательности гена, то возможно синтезировать ряд фрагментов его пептид-ной цепи и, присоединив их к белку-носителю, иммунизировать таким конъюга-том животное. Это дает возможность получить антитела к исследуемому белку,несмотря на то, что он не только не выделен, но и его функция пока неизвестна.Иммуносорбенты, синтезируемые присоединением таких антител к подходящемуносителю, позволяют выделить белок.

3.8. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

Методы генной инженерии позволяют присоединять к структурному генубелка последовательности, кодирующие такие белки или их фрагменты (доме-ны), которые облегчают выделение конструкции в целом. Полученный гибрид-ный («химерный») белок во многих случаях, хотя и не всегда, жизнеспособен, при-чем обе части «химеры» не зависимо друг от друга свертываются в компактныеструктуры. Это дает возможность, используя характерные свойства присоединен-ной к целевому белку структуры, провести специфическое выделение гибрида,после чего расщепить «шарнир», соединяющий обе его части.

Так, белки-гибриды, в которых одной из составных частей является белокА стафилококков, могут быть очищены хроматографией на колонках, содержа-щих присоединенные ковалентно иммуноглобулины. Белок А прочно связывает-ся с последними. Гибридные белки, в состав которых входит b -галактозидаза илиее крупные фрагменты, могут быть очищены на колонках, специфически сорби-рую-щих этот фермент, например содержащих ковалентно связанный аналог суб-страта — аминофенилтиогалактозид. По завершении очистки гибридный белокподвергают ограниченному протеолизу или расщепляют связь между объединен-ными в его структуре белками специфическими Химическими методами, напри-мер действием бромциана, и отделяют «целевой» белок от белка-носителя, что,как правило, не составляет затруднений.

Иногда к структурному гену белка присоединяют олигонуклеотидные фраг-менты, которые кодируют короткие аминокислотные последовательности, нара-щивающие этот белок с аминного или карбоксильного конца. Эти последова-тель-ности выбирают так, чтобы они не препятствовали свертыванию белка и в то жевремя сообщали всей конструкции то или иное характерное свойство, котороепозволяет легко выделить такую молекулу даже из очень сложной смеси. Затемэти фрагменты отщепляют в мягких условиях.

Так, присоединение к карбоксильному концу дегидрофолатредуктазыLys—Gly—Ser—Arg—Ser двух остатков гистидина дает последовательность Lys—Gly—Ser—Arg—Ser—His—His. Соседствующие остатки гистидина образуют комплекс сионом Ni2+, который удерживается специально полученным сорбентом с хелати-рующими группами. Это позволяет в одну стадию выделить клонированный E.coliфермент из культуральной жидкости практически чистым, с 90%-ным выходом.Отщепление обоих остатков гистидина карбоксипептидазой А приводит к дегид-рофолатредуктазе с С-концевой последовательностью Lys—Gly—Ser—Arg .

Предложено к аминному концу рекомбинантных белков-лимфоки-нов при-соединять последовательность Asp—Туr—Lys—Asp—Asp—Asp— Asp—Asp—Lys, ко-торую связывает специально полученное антитело. После очистки белка (модифи-цированного присоединением такой последовательности) иммуносорбцией его

обрабатывают энтеропептидазой — ферментом, специфически отщепляющимэтот пептид (см. гл. 11). По-видимому, описанный подход особенно перспективендля выделения и очистки рекомбинантных белков.

ГЛАВА 4ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА

4.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА КАК УРОВЕНЬ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА

К белкам относят полипептиды, способные самопроизвольно форми-ровать и удерживать определенную пространственную структуру. Нельзяуказать такого порога, границы, которые резко отделяли бы яки от пептидов.Действительно, известная способность к образованию предпочтительных конфор-маций в растворах замечается уже у сравнительно коротких пептидов, болеетого, эта способность существенна для функции некоторых пептидов (например,гормонов), облегчая их взаимодействие с клеточными рецепторами. И все же этотолько прообраз четкого соотношения между последовательностью аминокис-лот и пространственной структурой, которое составляет важнейшую отличи-тельную особенность белка.

Стабилизация пространственной структуры требует хорошо развитой сис-темы нековалентных взаимодействий, что может быть достигнуто лишь начиная снекоторой длины полипептидной цепи. Известны белки, полипептидная цепь ко-торых содержит всего лишь около пятидесяти аминокислотных остатков. К нимотносятся, например, панкреатический ингибитор трипсина, фактор роста эпи-телия, некоторые белки оболочек бактериофагов. Однако такие случаи отно-сительно редки и белки чаще всего содержат 100 — 400 аминокислотных остатковв одной полипептидной цепи, образующей глобулярную структуру.

Впрочем, длина полипептидной цепи может быть и гораздо большей, дос-тигая тысячи остатков и более. Известны и так называемые полибелки. Они пред-ставляют собой еще более длинную полипептидную цепь, формирующую после-довательно несколько вполне автономнных как в структурном, Так и в функцио-нальном отношении глобул, которые после разрезания полибелка по местам «пе-ретяжек» протеиназами существуют как независимые друг от друга ферменты.Видимо, сам по себе механизм биосинтеза не накладывает существенных ограни-чений на длину полипептидной цепи белка.

Следует подчеркнуть, что переход от пептида к пространственно структури-рованной, компактной белковой глобуле определяется не механическим удли-нением полипептидной цепи, а специфической последовательностью аминокис-лотных остатков. Иными словами, вовсе не обязательно случайно построенная по-липептидная цепь самопроизвольно образует компактную пространственную

структуру. Весьма вероятно, что способность к самосборке свойственна ограничен-ному кругу последовательностей, среди которых и те, что соответствуют природнымбелкам и отобраны в ходе эволюции. Во всяком случае известны последовательностиаминокислот, не свертывающиеся в компактную структуру.

Столь большое значение, которое придают самосборке пространственнойструктуры как отличительному признаку белка, объясняется тем, что именно онаслужит основой всех свойств белка, прежде всего его биологической функции.Физические характеристики белка как полимера полностью определяются его спо-собностью формировать компактную глобулу, от особенностей которой зависит иолигомеризация многих белков. Химические и функциональные свойства белковзависят от специфических взаимодействий функциональных групп, сближенныхв его пространственной структуре. Вследствие этого поведение этих групп в бел-ках коренным образом отличается от их реакционной способности в аминокисло-тах и небольших пептидах. Соответственно белок может функционировать, т.е.выступать в качестве фермента, структурного или транспортного белка, регулято-ра, токсина, ингибитора только потому, что он обладает вполне определеннымпространственным строением.

Еще на заре современной химии белка датский биохимик К.Линдерштрем-Ланг предложил рассматривать четыре уровня организации белковой молекулы:первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Эта класси-фикация закрепилась в литературе, поскольку в ней отразились реальные ступениформирования пространственного строения белковых молекул.

Первичной структурой называют последовательность аминокислотных остатковв молекуле белка. Она кодируется структурным геном данного белка и содержит всебе все необходимое для самоорганизации его пространственной структуры. По-следовательность аминокислот образуется в результате трансляции мРНК. Однакопервичная структура зрелой белковой молекулы далеко не всегда полностью совпа-дает с непосредственным продуктом трансляции, который, как правило, подвер-гается более или менее существенной ко- и посттрансляционной модификации,процессингу, причем могут изменяться аминокислотные остатки, длина полипеп-тидной цепи и т.п. (см. гл. 11). Для определения первичной структуры белка все чащеприбегают к анализу последовательности нуклеотидов в соответствующем структур-ном гене или кДНК, что требует гораздо меньшего времени и дает в целом болееточные результаты. Однако такой путь не всегда практичен, так как при этом не-обходимо выделение и клонирование гена. Кроме того, он не позволяет обнару-жить посттрансляционные модификации, без выявления которых исследованиеструктуры белка нельзя считать завершенным. Ввиду этого методы определенияпервичной структуры, основанные на анализе самого белка, сохраняют свое зна-чение и продолжают совершенствоваться. Помимо полного анализа первичнойструктуры те же методы применяют (обычно в неполном объеме) для первичнойхарактеристики вновь выделяемых белков, сравнения белков между собой, ана-

лиза их функционально важных фрагментов, локализации групп, подвергшихсяхимическому модифицированию, и т.п.

Число установленных первичных структур быстро нарастает — еще в 1965 г.их счет шел на единицы, в 1975 г. было известно около 600, в 1984 г. — 2500 после-довательностей, содержащих около 0,5 млн. аминокислотных остатков, к концу1989 г. эти цифры возросли соответственно до 14 400 и 4 млн.

4.2. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДИВИДУАЛЬНОСТИ БЕЛКА. МИКРОГЕТЕРОГЕННОСТЬ БЕЛКОВ

Определению первичной структуры белка предшествуют его очистка (см.гл. 3) и установление химической индивидуальности, или, как принято говорить,гомогенности. Универсальных критериев гомогенности белка нет, наиболее стро-гим доказательством его индивидуальности является однозначное установлениепервичной структуры, требующее большого труда и времени и не всегда доступ-ное. Практически полезными, хотя и неполными, критериями индивидуальностибелка служат:

— обнаружение при диск-электрофорезе или изоэлектрофокусированииединственной белковой полосы, проявляющей характерную для данного белка ак-тивность; весьма доказательны данные иммуно-электрофореза и иммуноблот-тинга;

— обнаружение при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутст-вии анионного детергента (додецилсульфата натрия) единственной полосы, отве-чающей денатурированному белку, в особенности если иммуноблоттинг подтвер-ждает, что она несет антигенные детерминанты данного белка. В случае олигомер-ных белков, построенных из разных субъединиц, таких полос может быть несколько,однако анализу первичной структуры должно предшествовать разделение субъе-диниц;

— обнаружение единственного белкового пика, достаточно симметричногои совпадающего с пиком активности при различных методах жидкостной хрома-тографии (аффинной, ионообменной, гидрофобной, гель-хроматографии). Сущест-венно, чтобы соотношение активности и содержания белка (удельная активность)оставалось постоянным по всеми пику;

— выявление единственной аминоконцевой последовательности. К иденти-фикации аминоконцевого остатка для этой цели прибегают редко, так как расходбелка для получения столь ограниченной информации оказывается неоправданнобольшим.

Эти приемы не единственны и не обязательны, доказательство индивиду-альности строится по-новому для каждого белка. Нередко при этом обнаружива-ется так называемая микрогетерогенность белка, вызываемая, как правило,

неоднозначностью посттрансляционных модификаций или случайными повреж-дениями белковых молекул in vivo или в процессе выделения. Возможна, впро-чем, и гетерогенность, обусловленная функционированием аллельных генов, илиальтернативным сплайсингом.

Среди наиболее частых причин микрогетерогенности укажем внутренниеразрывы полипептидной цепи за счет случайного действия протеиназ, так назы-ваемые растрепанные концы (результат неоднозначного процессинга аминокон-цевого участка белка), а также дезамидирование отдельных остатков аспарагина,реже глутамина. Последнее может происходить спонтанно, в особенности легко —в последовательности Asn—Gly и приводит к так называемой микрогетерогенно-сти по заряду. Известна микрогетерогенность за счет неполноты фосфорилирова-ния белка протеинкиназами или различий в структуре углеводных цепей тлико-протеинов.

Высказываемые иногда предположения о микрогетерогенности, обусловлен-ной существованием стабильных конформеров белка с одинаковой первичнойструктурой, экспериментального подтверждения не получили и труднообъясни-мы теоретически. Многие виды микрогетерогенности не препятствуют определе-нию аминокислотной последовательности, однако осложняют анализ и должныучитываться при его проведении.

4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА

Определение аминокислотного состава необходимо для характеристики ис-следуемого белка, а также пептидных фрагментов, получаемых в ходе анализа пер-вичной структуры. Для расщепления до свободных аминокислот пептид или бе-лок подвергают исчерпывающему гидролизу, нагревая его с постоянной кипящей(5,7) НС1 при 105 °С в течение 24 ч. Поскольку в таких условиях пептидные связиостатков изолейцина и валина гидролизуются неполно, проводят также 48—и72-часовой гидролиз. В то же время серии и треонин недостаточно устойчивы изаметно (примерно на 10%) расщепляются уже за 24 ч. Ввиду этого для полученияболее надежных величин содержание валина и изолейцина оценивают, экстраполи-руя найденные значения к «бесконечному» времени, а содержание серина и трео-нина определяют экстраполяцией к «нулевому» времени гидролиза.

Некоторые аминокислоты вообще не выдерживают кислотного гидролизаи разрушаются .практически полностью, поэтому для их определения требуютсяспециально разработанные приемы. Прежде всего полностью гидролизуются досвободных аспарагиновой и глутаминовой кислот их амиды — аспарагин и глу-тамин. Методы их прямого определения в белках до сих пор не разработаны. Дляопределения триптофана гидролиз белка проводят метансульфоновой кисло-той СН

3 H в присутствии триптамина, защищающего индольное кольцо трип-

тофана от деструкции. Для определения суммы цистина и цистеина белок перед

гидролизом подвергают окислению надмуравьиной кислотой НСО—ООН, в ре-зультате чего эти остатки превращаются в остатки цистеиновой кислоты:

Поскольку определение последней не позволяет судить о содержаниираздельно остатков цистина и цистеина, данные аминокислотного анализа выра-жают в остатках «полуцистина». Окисление надмуравьиной кислотой превращаеттакже остатки метионина в метионинсульфон, не разрушающийся при гидроли-зе в отличие от метионина:

Для количественного определения аминокислот в кислотном гидролизатебелка или пептида используют автоматические анализаторы, впервые описан-

ные У.Стейном, С.Муром и Д.Спекмэном. Их конструкции весьма разнообразны,однако все они основаны на хроматографическом разделении аминокислот насульфополистирольных катионитах. Элюция аминокислот происходит в порядке,который определяется, во-первых, их кислотно-основными свойствами (аспара-гиновая и глутаминовая кислоты элюируются в числе первых; гистидин, лизин иаргинин — последними); во-вторых, гидрофобными взаимодействиями боковыхрадикалов с полистирольной матрицей ионита (гидрофильные серии и треонинэлюируются рано; глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенила-ланин — примерно в порядке возрастания гидрофобности).

В элюате автоматически проводится цветная реакция аминокислот с нин-гидрином (см. гл. 1), на которой и основано их количественное определение. Та-кой способ позволяет определять до 1—10 пмоль аминокислоты. Более чувстви-тельно измерение флуоресценции продукта реакции аминокислот с о-фталевымальдегидом (см. гл. 1), позволяющим определять менее 1 пмоль.

Развивается новый подход к определению аминокислотного состава, Прикотором аминокислоты превращают в производные, интенсивно поглощающиесвет в ультрафиолетовой или видимой области спектра, например в фенилтиокар-бамил- (см. гл. 1) или р-диметиламино-фенилазофенилсульфонил («дабсил»)-про-изводные:

Дабсил-аланин

Эти производные разделяют высокоэффективной жидкостной хроматогра-фией на колонках, содержащих C

18-производные кремнезема, и определяют со-

держание аминокислот спектрофотометрически. Метод обладает высокой чув-ствительностью и скоростью, позволяя определять доли пикомоль — фемтомолиаминокислот.

Оценивая результаты аминокислотного анализа белков и пептидов, необхо-димо учитывать ограничения, связанные прежде всего с относительной неточностью(«грубостью») кислотного гидролиза белков. К сожалению, надежный метод полногоферментативного гидролиза белков, который был бы лишен этого недостатка, до сихпор не разработан. Точность самого метода определения аминокислот, как правило,заметно выше — порядка 2—3%. Учитывая это, следует с осторожностью относиться,например, к данным о небольших (в 1—2 остатка) различиях в составе белков, по-скольку они не выходят за пределы возможных погрешностей метода, особенно еслиречь идет о «трудных» для определения аминокислотах, разрушающихся при гидро-

лизе, образующих трудно расщепляемые пептидные связи или дающих низкийвыход окраски при реакции с нингидрином (например, пролин).

4.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

4.4.1. Подготовка белка к анализу

Подготовка белка к анализу первичной структуры призвана свести к мини-му-му влияние других, более высоких уровней его организации. Иными словами,объектом анализа должна быть неупорядоченная полипептидная цепь без каких-либо поперечных ковалентных связей (например, дисульфидных мостиков) так,чтобы все ее звенья, все пептидные связи были в равной мере доступны действиюкак химических реагентов, так и ферментов. К сожалению, в полной мере исклю-чить помехи со стороны свойственных белку нековалентйых взаимодействий неудается, однако разработаны приемы, позволяющие приблизиться к этой цели.

Итак, белок должен быть прежде всего подвергнут глубокой денатурациии утратить четвертичную, третичную и по возможности вторичную структуру. Еслив нем имеются дисульфидные связи, прибегают к их расщеплению, используя,как правило, восстановление большим избытком меркаптосоединения, напри-мер дитиоэритрита или меркаптоэтанола:

Эта реакция, которую обычно проводят в условиях, обеспечивающих дена-турацию белка (в 8 М растворе мочевины или в 6 М гидрохлориде гуанидина прирН 8—9), имеет своим результатом превращение остатка цистина в два остаткацистеина со свободными сульфгидрильными группами. Сохранять такое произ-водное и тем более использовать его для последующих превращений нельзя, таккак после удаления избытка восстановителя, что обычно достигается гель-фильтрацией смеси, вновь произойдет замыкание дисульфидных связей за счет

окисления свободных SH-групп кислородом воздуха. Во избежание этого сульф-гидрилъные группы блокируют, обрабатывая восстановленный и денатурирован-ный белок избытком иодуксусной кислоты, которая переводит остатки цистеи-на в устойчивый -S-карбоксиметил-цистеин:

Такое превращение необратимо. Если желательна последующая регенера-ция остатков цистеина, прибегают к получению S-сульфопроизводных, обраба-тывая белок сульфитом натрия в присутствии ионов меди. Получающийся приэтом S-сульфоцистеин при действии избыт ка меркаптосоединений количест-венно переходит в цистеин:

Несмотря на совершенствование автоматических методов определения пер-вичной структуры, даже в благоприятных случаях редко удается в одной цепи заодин прием определить последовательность более чем 50 аминокислотных остат-ков. Этого достаточно для исследования небольших белков, в остальных же случа-ях необходимо прибегать к фрагментации полипептидной цепи несколькими ме-тодами, с тем чтобы получить систему перекрывающихся пептидов. Определениеих строения и сопоставление полученных данных приводят к установлению по-следовательности аминокислот всей полипептидной цепи белка. Известны фер-ментативные и химические методы специфического расщепления полипептид-ной цепи.

4.4.2. Ферментативные методы фрагментации полипептидной цепи

При выборе протеолитических ферментов, подходящих для избирательногогидролиза белка, особенно, важна их специфичность. Как правило, пользуютсятак называемой первичной специфичностью протеиназ, т.е. их способностью преи-мущественно атаковать пептидные связи, образованные тем или иным амино-кислотным остатком. Аминокислотные остатки субстрата принято обозначать ла-тинской буквой Р с индексами, соответствующими номеру остатка, считая отрасщепляемой связи к аминному концу («влево»). Остатки, расположенные в сто-рону карбоксильного конца («вправо» от гидролизуемой связи) обозначают Р' ссоответствующим индексом:

Если использовать эти обозначения, то первичной специфичностью следу-ет считать способность той или иной протеиназы избирательно расщеплять пеп-тидные связи, образованные остатками Р

1 и Р

1'. Все протеиназы, однако, имеют

более или менее выраженную вторичную специфичность: скорость расщепле-ния ими пептидной связи зависит не только от строения той аминокислоты, ко-торая прямо участвует в ее построении своей карбоксильной или аминной груп-пой (т.е. остатка Р

1 и Р

1'), но и от соседних аминокислотных остатков Р

2', Р

и т.д. Обычно в образовании комплекса с ферментом участвует не менее 5—6аминокислотных остатков (см. гл. 10).

Влияние вторичной специфичности уменьшают, проводя гидролиз достаточ-но долго, так, чтобы расщепились и те пептидные связи, которые находятся в не-выгодном для данного фермента окружении. Специфичность протеиназ редкобывает совершенно строгой: наблюдается и расщепление не характерных для дан-ного фермента связей, нарастающее со временем. Все это требует оптимизацииусловий ферментативного гидролиза полипептидных цепей.

В настоящее время для специфического гидролиза белков при определениипервичной структуры наиболее часто применяют следующие протеиназы.

Трипсин. Это фермент поджелудочной железы животных, который принад-лежит классу так называемый сериновых протеиназ и специфически гидролизуетпептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков аргининаили лизина (Р

1 = Arg, Lys). Боковые цепи этих аминокислот несут на определен-

ном расстоянии от о-углеродного атома положительно Заряженную катионнуюгруппу. Показано, что в зоне связывания субстрата последняя входит во впадину,где расположена отрицательно заряженная β-карбоксильная группа одного из ос-татков аспарагиновой кислоты трипсина:

Электростатическое взаимодействие между катионной и анионнойгруппами играет определяющую роль в специфичности трипсина. Это подтвер-ждается тем, что замена аспарагиновой кислоты в зоне связывания субстрата дру-гим остатком приводит к утрате способности гидролизовать пептидные связи ар-гинина или лизина.

Блокирование ε-аминогрупп лизина в атакуемом трипсином полипептиде,например ацилированием цитраконовым ангидридом (см. гл. 9), приводит к за-мене катионной аминогруппы на анионную (карбоксилатную), поэтому в соот-ветствующем производном трипсин расщепляет только пептидные связи аргини-на. Это позволяет получить более крупные фрагменты белка, которые после ихвыделения из гидролизата выдерживают в слабокислом растворе, что вызываетотщепление остатка цитраконовой кислоты и высвобождение ε-аминогрупп ли-зина. Затем такие пептиды с регенерированными остатками лизина вновь расще-пляют трипсином.

Аналогично можно регулировать доступность пептидных связей аргининагидролизу трипсином. Для этого блокируют гуанидогруппу аргинина, обрабаты-вая белок в щелочной среде дикетоном, например диацетилом, закрепляя образую-щийся при этом диол образованием комплекса с борной кислотой (см. гл. 9).

При гидролизе белка трипсином обычно используют рН, близкий 8, темпе-ратуру 37 °С и весовое соотношение фермент — субстрат 1:100, регулируя полнотугидролиза временем реакции. Нередко при гидролизе трипсином расщепляютсяотдельные пептидные связи, соответствующие специфичности родственного фер-мента — химотрипсина. Это может объясняться присутствием в препарате трип-сина примеси химотрипсина или продуктов ограниченного гидролиза трипсина,однако и - вполне чистый трипсин может сам по себе обнаруживать не характер-ную для него специфичность.

Химотрипсин. Сериновая протеиназа поджелудочной железы, струк-турно родственная (гомологичная) трипсину. Химотрипсин специфически гидро-лизует (оптимум рН вблизи 8) пептидные связи, образованные карбоксильнымигруппами ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина, триптофа-на и нередко лейцина, сравнимого с этими остатками по гидрофобности (Р

Phe, Туr, Тrр, Leu).Термолизин. Металлопротеиназа, секретируемая клетками термофильной

бактерии Bacillus amyloliquefaciens. Этот фермент, имеющий ион цинка в актив-

ном центре, оптимально активен при рН 6—8 и избирательно гидролизует пеп-тидные связи, образованные с участием аминогрупп гидрофобных аминокислот— лейцина, фенилаланина, тирозина, валина, изолейцина (Р

1' = Leu, Phe, Туr, Val,

Ile). Фермент может применяться даже при 60—80оС.Glu, Asp-специфичные протеиназы (эндопротеиназы Glu—С). Сериновые протеи-

назы Staphylococcus aureus, а также некоторых стрептомицетов и термоактиномицетов.Ферменты гидролизуют пептидные связи, образованные α-карбоксильными группамиостатков глутаминовой кислоты, значительно реже аспарагиновой кислоты (Р

1 = Glu,

Asp). Имеют в зависимости от субстрата и состава буферного раствора два оптимума рН:при 4 и 8. Характерная для этих протеиназ и весьма строго выдерживаемая специфичностьхорошо дополняет специфичность других протеолитических ферментов, поэтому они всешире применяются в анализе структуры.

Эндопротеинза Lys-C. Протеолитический фермент из Lysobacter enzymo-genes, специфически гидролизующий пептидные связи, образованные карбоксиль-ной группой лизина, но не аргинина (Р

1 = Lys).

Эндопротеиназа Arg-C. Протеиназа из подчелюстной железы мыши, изби-рательно расщепляющая пептидные связи, образованные с участием карбоксиль-ной группы аргинина (Р

1 = Arg).

Можно предполагать, что будут найдены и войдут в практику фрагментациибелков и другие протеолитические ферменты с четко определенной специфичностью.

4.4.3. Химические методы специфического расщепления пептидных связей

Из множества предлагавшихся в различное время методов избирательногохимического расщепления пептидных связей наибольшее распространение в прак-тике анализа первичной структуры получило расщепление бромцианом, проводи-мое обычно в муравьиной или трифторуксусной кислоте. Эта реакция ведет к расще-плению пептидных связей, образованных с участием карбоксильной группы остат-ков метионина. Бромциан реагирует с серой тиоэфирной группы метионина, обра-зуя сульфониевую соль. В этом промежуточном продукте положительный заряд наатоме серы индуцирует возникновение частичного положительного заряда (d+) насоседнем γ-атоме углерода боковой цепи метионина. Возникший таким образом наγ-углероде электрофильный центр подвергается атаке кислородным атомом карбо-нильной группы, на котором постоянно существует частичный отрицательный заряд,усиливающийся во время реакции, что обусловлено поляризацией связи С=0.

В результате смещение электронной плотности в этой группе и во всей пеп-тидной связи завершается образованием ковалентной связи между γ-углеродныматомом и атомом кислорода, двойная связь С-N переходит в простую, а связьC-NH пептидной группы, обычно частично двойная, становится полностью двой-ной с переносом положительного заряда на ее атом азота:

Одновременный разрыв связи S——СН2 освобождает летучий метилрода-

нид. Получившееся в результате внутримолекулярной реакции производное имидо-эфира лактона гомосерина легко гидролизуется с разрывом связи C—N, что изавершает специфическое расщепление пептидной связи остатка метионина. На С-конце вновь образовавшегося пептидного фрагмента оказывается остаток гомо-серина или его лактон, легко превращающиеся друг в друга:

Метод расщепления бромцианом достаточно избирателен, затруднениявстречаются лишь в тех случаях, когда за остатком метионина следуют серии илитреонин. Характерно, что к расщеплению пептидных связей бромцианом прибе-гают при «вырезании» из гибридных генно-инженерных конструкций пептидов илинебольших белков, встроенных в структуру белка-хозяина для лучшей экспрессиив бактериальных клетках.

Среди других методов химического расщепления пептидной связи в следуетупомянуть более или менее избирательное выщепление остатков аспарагиновойкислоты при кратком нагревании белка или пептида в слабокислом растворе.Видимо, внутримолекулярный катализ с участием β-карбоксильной группы аспа-рагиновой кислоты, которая может быть сближена с обеими пептидными связя-ми, образованными этим остатком, ответствен за преимущественный гидролизименно этих связей. В еще более мягких условиях при выдерживании в кислыхрастворах избирательно расщепляются пептидные связи Asp—Pro.

Описаны также методы специфического расщепления пептидных связейтриптофана, цистеина и пролина, однако они нашли лишь весьма ограниченноеприменение.

4.4.4. Разделение пептидов, полученных фрагментациейполипептидной цепи

Разделение смесей пептидов, получаемых в результате ферментативного илихимического расщепления полипептидной цепи белка, составляет одну из наибо-лее сложных, не стандартных, стадий анализа первичной структуры. Традицион-ная схема разделения состояла из большого числа стадий и, следова-тельно, быласопряжена с очень большими потерями пептидов, причем ведущую роль игралаионообменная хроматография пептидов чаще всего на сульфополистирольныхкатионитах с элюцией в градиенте рН. Метод дополняли гель-фильтрацией, хро-матографией и электрофорезом на бумаге или тонкослойной хроматографией.

В последние годы доминирует фракционирование пептидов высокоэффек-тивной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на сорбентах с «обращеннойфазой». Последние представляют собой мелкие частицы кремнезема с большойповерхностью, к которой ковалентно присоединены углеводородные цепи различ-ной длины. Разделение на таких сорбентах определяется гидрофобными взаимо-действиями между этими цепями, содержащими 4, 8, иногда 18 углеродных ато-мов (С

18), и гидрофобными элементами в структуре пептидов. Определен-

ную роль играют и ионообменные эффекты. Пептиды элюируют при высоких дав-лениях — порядка 100 атм, используя градиент концентрации органических рас-творителей с различной десорбирующей способностью (метанол, ацетонитрил,изопропанол, диоксан), к которым для регулирования рН прибавляют трифторук-сусную кислоту или буферные смеси.

Хорошие результаты дает также ионообменная хроматография на мелкозер-нистых ионитах типа Моно-Q и Моно-S (см. гл. 3) с использованием давленияпорядка 20 атм. Эти методы, обладающие высокой разрешающей способностью,позволили резко сократить число стадий выделения индивидуальных пептидов,снизить их потери и перейти к анализу первичной структуры очень малых (поряд-ка сотен наномоль) количеств белка.

4.5. Определение первичной структуры пептидов

4.5.1. Определение С-концевых аминокислот

Определение С-концевых аминокислот и последовательностей пептидовразработано недостаточно. Единственным химическим методом идентификацииС-концевых аминокислот, получившим распространение, является исчерпываю-щий гидразинолиз пептидных связей. При нагревании совершенно сухого препа-рата белка или пептида с безводным гидразином все пептидные связи расщепля-ются им с образованием соответствующих гидразидов аминокислот:

Последние, будучи основаниями (кроме α-гидразидов дикарбоновых ами-нокислот), легко отделяются (например, ионообменной хроматографией в усло-виях обычного аминокислотного анализа) от единственной свободной аминоки-слоты, содержащейся в продуктах гидразинолиза, которая и является С-конце-вым остатком.

Ферментативный метод, позволяющий не только идентифицировать С-кон-цевой остаток, но и определить С-концевую последовательность небольшой длины,основан на последовательном отщеплении аминокислот от карбоксильного концапептида (или белка) при действии карбоксипептидаз.

Карбоксипептидаза А. Фермент поджелудочной железы животных, содержа-щий ион цинка в активном центре. Активен в слабощелочной или нейтральнойсреде. Являясь экзопептидазой, фермент отщепляет от карбоксильного концаполипептидной цепи нейтральные и особенно легко гидрофобные аминокислоты.Труднее отщепляются остатки дикарбоновых аминокислот, еще труднее глицин иостатки, за которыми следует пролин. Не отщепляются вовсе пролин и остаткиаргинина и лизина.

Карбоксипептидаза В. Также содержится в поджелудочной железе и гомоло-гична карбоксипептидазе А, от которой отличается главным образом специфично-тью, отщепляя С-концевые остатки аргинина и лизина.

Карбоксипептидаза Y (от англ. yeasts — дрожжи). Содержится в клетках дрож-жей. Имеет остаток серина в активном центре и обладает; весьма широкой спе-цифичностью, отщепляя почти любые аминокислотные остатки (в том числе и ос-татки пролина) от карбоксильного конца полипептидной цепи. Аналогичные фер-менты выделены из грибов и растений.

При действии карбоксипептидаз на пептидный или белковый субстрат по-сле отщепления С-концевого остатка хотя бы от части молекул открывается возмож-ность высвобождения из цепи следующего остатка, затем третьего с C-конца и т.д.Ввиду этого для определения С-концевой последовательности необходимо количе-ственно определить накопление аминокислот в зависимости от времени реакции.Анализ данных дополнительно осложняется весьма значительными различиями вскорости отщепления аминокислот, отражающими специфичность фермента. Так,гидрофобные аминокислоты настолько легко отщепляются карбоксипептидазой А,что их количество нередко оказывается почти таким же, как и содержание ранееотщепившихся гидрофильных остатков, пептидные связи которых гидролизуют-ся гораздо медленнее. Скорость гидролиза зависит и от природы аминокислот,предшествующих отщепляемому остатку Р

1' остатков — Р

2 и т.д.

Таким образом, метод обычно дает возможность определить чередованиелишь немногих, обычно 2—5, аминокислотных остатков на карбоксильном участ-ке пептида.

4.5.2. Определение N-концевых аминокислот и последовательностей

Методы анализа пептидов с аминного конца разработаны значительно луч-ше, чем с карбоксильного, и являются основными при определении первичной струк-туры белков.

Идентификация N-концевой аминокислоты важна как одно из дока-зательств индивидуальности пептида или белка. Классическим является примене-ние для этой цели реакции динитрофенилирования. Динитрофторбензол реа-гирует с α-аминогруппой белка или пептида с образованием окрашенного в жел-

тый цвет ( 360350max

÷≈λ нм, молярная экстинкция около 15 000) 2,4-динит-

рофенил (Dnp)-производного (см. гл. 1). Одновременно в реакцию вступают и е-амицогруппы остатков лизина, и гидроксильные группы тирозина. Затем динит-рофенил-производное гидролизуют 5,7 М НС1 при 105°С, причем расщепляютсявсе пептидные связи, но сохраняются Dnp-аминокислоты (кроме производныхглицина и пролина). Их выделяют из гидролизата и идентифицируют.

Метод почти полностью вытеснен так называемым дансилъным методом. Вэтом случаев в качестве реагента на аминогруппу используют 5-диметиламинонаф-талин-1-сульфохлорид (дансилхлорид) (см. гл. 1). Кислотный гидролиз полученногодансилпептида дает дансил-производное N-концевой аминокислоты, которое иден-тифицируют двумерной хроматографией на полиамидных пленках. Анализ облегча-ется интенсивной флуоресценцией дансил-производных в ультрафиолетовом све-те, что обеспечивает высокую чувствительность метода, позволяющего работать сколичествами пептида порядка нескольких наномоль.

Наиболее продуктивно определение N-концевой последовательности в пеп-тидах и белках фенилтиогидантоиновым методом ступенчатого отщепленияаминокислотных остатков, предложенным П.Эдманом. Метод основан на сле-дующей цепи реакций.

Обрабатывая пептид в щелочной среде фенилиэотиоцианатом, его превра-щают в фенилтиокарбамил-производное:

Смысл этой операции состоит во введении нуклеофильного атома серы вположение, благоприятствующее реакции с углеродом карбонильной группыN-концевого остатка, которая происходит на следующей стадии при обработкефенилтиокарбамил-производного трифторуксусной кислотой:

Результатом этой атаки является образование гипотетического промежуточ-ного продукта, в котором атом углерода карбонила N-концевого остатка приобрелтетраэдрическую конфигурацию. Далее происходит разрыв связи C-N в этом со-единении, причем образуются циклический фенилтиазолинон (производное ами-ноконцевого остатка) и пептид, укороченный на одну аминокислоту.

Фенилтиазолиноны недостаточно устойчивы, поэтому их подвергают, пред-варительно отделив от остаточного пептида, более жесткой кислотной обработкепри нагревании и переводят в стабильные фенилтиогидантоины. Последние иден-тифицируют тонкослойной хроматографией на полиамидных пленках, газожидкост-ной или высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Образовавшийся после отщепления N-концевого остатка остаточный пеп-тид вновь обрабатывают фенилизотиоцианатом и подвергают далее такому же циклу

превращений, отщепляя на этом шаге вторую аминокислоту, считая с аминногоконца. Повторение циклов приводит к ступенчатому отщеплению последующихаминокислотных остатков.

Используется также вариант метода Эдмана, при котором идентифицируютне фенилтиогидантоин или другое производное аминокислоты, отщепленной в дан-ном цикле, а следующий за ней остаток, прибегая для этого к определению N-концевой аминокислоты в небольшой доле (аликвоте) остаточного пептида мето-дом дансилирования. Остальную, главную, часть остаточного пептида вводят вновый цикл деградации по Эдману, затем вновь определяют N-концевуюаминокислоту в остаточном пептиде, укороченном уже на два остатка, и т.д. Такойспособ позволяет обычно определить последовательность 10—15 аминокислот.

Гораздо большие возможности открыла автоматизация метода Эдмана:разработаны специальные приборы — автоматические секвенаторы белков и пеп-тидов, основанные на его использовании. В одном из видов секвенатора пленку бел-ка или пептида наносят на внутреннюю стенку быстро вращающегося стеклянногостаканчика, который затем используется как реактор. В него последовательно вводятфенилизотиоцианат, гептафтормасляную кислоту (высо-кокипящий аналог трифто-руксусной кислоты) и проводят циклизацию. Затем внутрь стаканчика подают ток 1-хлорбутана, который, распределяясь под действием центробежной силы, по его внут-ренней стенке, экстрагирует отщепившийся фенилтиазолинон. Экстракт отводят изстаканчика и в отдельной операции превращают фенилтиазолин в фенилтиогидантоин.Укороченный белок или пептид остается в виде пленки на стенке стаканчика и далееподвергается следующему циклу отщепления по Эдману и т.д.

Все операции, включая подачу реагентов и промывание осадка белка илипептида, программированы. Прибор позволяет за сутки проделать 1.5 циклов от-щепления. Выход фенилтиазолинона на цикле обычно близок к 95—99%, что по-зволяет определить за один опыт последовательность в 20—50, а иногда и большеаминокислотных остатков, используя весьма малые, порядка сотен наномоль, ко-личества белка или пептида.

Метод ограничивают побочные реакции, например образование пироглута-миновой кислоты из N-концевого глутамина, a-перегруппировка остатков аспара-гиновой кислоты и в особенности неспецифическое расщепление пептидных свя-зей при кислотной обработке. Неполное протекание реакции с фенилизотиоциа-натом или циклизации влечет за собой постепенное «отставание» части пептид-ных цепей от общего хода отщепления аминокислот, вследствие чего на каждом шагев анализируемой смеси появляются наряду с фенилтиогидантоином соответствую-щей аминокислоты более или менее значительные примеси фенилтиогидантоиновот предыдущих циклов отщепления.

Ввиду этого при анализе протяженных последовательностей чрезвычайно важ-но, чтобы каждый цикл протекал с выходом, близким количественному. Существен-ным ограничением являются потери остаточного белка или пептида, в особенности

короткого за счет его растворения в используемых реагентах. Радикальный способ борь-бы с такими потерями состоит в ковалентном присоединении к инертной матрице,например к макропористому стеклу, содержащему аминные группы. К такому носи-телю удается присоединить пептиды, полученные при расщеплении бромцианом засчет реакции лактона гомосерина с аминогруппами:

Пептиды, содержащие остатки лизина, присоединяют к аминогруппам наповерхности стекла при помощи реакции с бифункциональным сшивающим реа-гентом, например р-фенилендиизоцианатом:

Этот реагент образует мостики между носителем и остатками лизина в пеп-тиде, но одновременно блокирует и α-аминогруппу первого аминокислотного ос-татка. Однако после кислотной обработки N-концевой остаток отщепляется отпептида, хотя и остается связанным со стеклом. При этом открывается амино-группа второго аминокислотного остатка и становится возможным ступенчатоеотщепле-ние последующих аминокислот, хотя остатки лизина, прочно связанныес носителем, ускользают от анализа и «пропускаются». Идентификацию первогоаминокислотного остатка проводят в отдельном опыте дансильным методом. Та-кие «твердофазные» секвенаторы применяют при анализе пептидов и небольшихбелков.

В еще одном типе секвенаторов — газофазном — принципиально те же ре-акции проводят с белком, сорбированным на пористой подложке, обрабатываяего парами реагентов и прибегая к жидкостной экстракции лишь для отделенияфенилтиазолинонов. Это еще более снижает потери образца и дает возможностьопределять весьма протяженные последовательности, используя сотни пикомольбелков и крупных пептйдов. Удается даже определять N-концевые последователь-ности в тех небольших количествах белков, которые содержатся в зонах, выре-занных из геля после электрофоретического разделения.

Методом Эдмана установлено подавляющее большинство последо-вательностей аминокислот при анализе первичной структуры белков.

ГЛАВА 5ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА

Вторичной структурой называют пространственное расположение атомов глав-ной цепи молекулы белка на отдельных ее участках.

В соответствии с этим определением любой участок белка имеет вторич-ную структуру. Иногда рассматривают как вторичную структуру только те ее эле-менты, которые являются периодическими: α-спиралъ и β-структуру. Однако вбелках нередко встречаются такие участки пептидной цепи, которые уложенывполне определенным способом, хотя их пространственная структура не содержиткакого-либо периодически повторяющегося, регулярного мотива. Тем не менее кним вполне приложимо понятие вторичной структуры. Следует различать два видавторичных структур: регулярные и нерегулярные.

Понятие вторичной структуры, как подчеркивается в его определении, от-носится не ко всей белковой молекуле в целом, а к отдельным, более или менеепротяженным участкам ее полипептидной цепи. Обсуждая вторичную структу-ру, мы, по крайней мере на первых порах, абстрагируемся от дальних взаимодей-ствий в молекуле белка, а также от вклада боковых групп аминокислотных остат-ков, концентрируясь на главной цепи белка. Ближние взаимодействия, которымпринад-лежит важнейшая роль в формировании вторичной структуры, определя-ются прежде всего особенностями пептидной связи.

5.1. СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ

Пептидной называют связь, образованную α -аминной и α−карбоксиль-ной группами аминокислот. Традиционное изображение пептидной связи

не вполне правильно передает ее электронную структуру. Двойная связь С=О кар-бонильной группы поляризована и в определенном смысле может быть представ-лена как одинарная связь с разделением зарядов:

причем отрицательный заряд локализуется на атоме кислорода.Изучение кристаллических структур соединений, содержащих амидную связь,

показало, что расстояние С-О в них примерно 10% больше свойственного карьо-нильной группе в альдегидах и кетонах. Напротив, связь С-N за счет смещения сво-бодной электронной пары азота к углероду приобретает в определенной мере харак-

тер двойной и укорочена опять-таки примерно на 10%. По Л.Полингу, электроннаяструктура пептидной связи передается двумя резонансными структурами:

причем на долю структуры II с двойной связью углерод—азот в гибриде приходит-ся около 40%. В результате азот пептидной связи практически полностью утрачи-вает основность. То обстоятельство, что связь C-N в пептидной группировке име-ет характер частично двойной, приводит к важным стереохимическим последст-виям: вращение вокруг нее сильно ограничено, она задает плоскость, в которойрасполагаются шесть атомов: О и С карбонильной группы, атомы азота и водородагруппы NH и Сa -атомы обоих аминокислотных остатков.

Плоскостная геометрия пептидной группировки и затрудненность поворо-та вокруг С-N-связи делают возможным существование достаточно устойчивыхцис- и транс-изомеров, разделенных значительным энергетическим барьером(около 20 ккал/моль), что делает превращение одного изомера в другой редкимсобытием. Они отличаются тем, что С

a -атомы главной цепи размещаются по одну

(цис) или по разные (транс) стороны пептидной связи C-N (рис. 5.1):

Рис. 5.1. Структура пептидной связи. А - транс — типичная, Б - цис— редковстречающаяся конфигурация пептидной связи

Атомы Сαi, С

αi+1, С и О карбонильной группы, N и связанный с ним Н

лежат в одной плоскости. Указаны межатомные расстояния в ангстремах ивалентные углы. О конфигурации судят по ходу главной цепи

1 1 ккал = 4,184 кДж.

Транс-изомер пептидной связи энергетически выгоднее цис-изомера при-мерно на 2,6 ккал/моль, так как сближение Сα-атомов в последнем вызывает про-странственные затруднения. Эта разница между изомерами в значительной мереснимается, составляя 0,5 ккал/моль, если азот пептидной связи принадлежит про-лину, поскольку в таком случае в обоих изомерах в чие-положении к Сα -атомуацилирующего аминокислотного остатка оказываются Сα - или Сδ - атомы проли-на. Рентгено-структурный анализ подтвердил, что пептидные связи в белках явля-ются плоскими и представлены почти исключительно mpawc-изрмерами. Цис-пептидные связи редки: их встречается, как правило, не более одной-двух на бе-лок среднего размера, причем преобладают связи, образованные остатками про-лина. Среди 32,5 тыс. пептидных связей в большой выборке изученных простран-ственных структур только 116 (0,36%) имели цис-конфигурацию, однако среди1,5 тыс. связей Хаа—Pro1 цис-изомеров оказалось 6,5%. В качестве примера ука-жем цис-пептидные связи, образованные остатками Pro-93 и Pro-114 в пан-креатической рибонуклеазе, Pro-168 в субтилизине и связь Ser-197 — Туr-198 вкарбоксипептидазе А.

Таким образом, пространственное строение полипептидной цепи может бытьпредставлено как последовательность плоских элементов — пептидных группи-ровок, соединяющихся между собой через Сα -атомы, которые служат своего родашарнирами. Вращение плоских пептидных группировок может происходить во-круг двух простых связей, которые соединяют атом азота с Сα -атомом (N — Сα ) иСα -атом с углеродом карбонильной группы (Сα — С(О)). Жестких запретов длявращения вокруг этих связей нет, однако есть некоторые предпочтительные кон-формации.

5.2. СТЕРИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ И ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕП-ТИДНОЙ ЦЕПИ

Углы вращения вокруг связей N- Cα и Cα-С(О) называют соответственноуглами j и y (рис. 5.2). Для отсчета этих двугранных углов Прибегают к следующе-му приему. Если представить, что наблюдатель смотрит вдоль связи N— Cα, то«следующая» связь Cα-С(О) может оказаться заслоненной «предшествующей» свя-зью C(O)-N.

1 Хаа — обозначение любой аминокислоты.

Такой конформации (заслонен-ной или цисоидной, очевидно,невыгодной стерически)

Соответствует угол ϕ = 0°. Еслисвязь Cα -С(О) не заслонена и для дости-жения заслоненной конфигурациисвязь C(0)-N нужно вращать по часовойстрелке, угол j считает положительными возрастает до 180°. В последнем слу-чае достигается трансоиднаяконфигурация. В противоположномнаправлении отсчитываются отрица-тельные значения угла ϕ от 0° до -180°.Аналогично, для определения углаy смотрят вдоль связи Cα-С(О), приэтом заслоненной конформации (ко-гда связь N— Cαзакрывает связь С(О)-N) приписывается угол ψ =0°, атрансоидной – угол + или - 180°.

Значения углов ϕ и ψ для како-го-либо аминокислотного остатка ха-рактеризуют его положение во вто-ричной структуре. Если указать эти зна-чения для всей последовательностиаминокислот, то ими определится свер-тывание данного полипептида в про-странстве. Как отмечалось, принципи-ально возможны любые наборы значе-нии двугранных углов ϕ и ψ, однако мно-гие из них сопряжены со значительны-ми стерическими помехами и отвеча-ют весьма невыгодным энергетическимконформациям.

Для описания стереохимии ами-нокислотных остатков в белках удобнакарта Рамачандрана, представляющаясобой квадрат, по одной стороне кото-ро-го отложены значения угла ϕ от -180°до +180°, а по другой — значения угла ψ(рис. 5.3, 5.4). Если бы не накладыва-лось никаких ограничений на стереохи-мию полипептидной цепи, то углы ϕ и ψмогли бы принимать любые значения и

Рис.5.2. Двугранные углы полипептид-ной цепиУголy определяется поворотом связи

αiCiN − вокруг связи

'iCiC −α , если

смотреть по ходу пептидной цепи, т.е. от

αiC к углеолду карбонильной группы

'iC , как показано стрелкой. Принято

считать, что если первая связь закрыва-

ет связь 1'

+− ii NC (цисоидная конфи-

гурация), то угол равен 0, если же этисвязи находятся в наиболее удаленныхположениях (трансоидная конфигура-ция), то угол y равен + или -180° . Поло-жительным считается вращение по ча-совой стрелке. Угол определяется пово-

ротом связи 'iC вокруг связи

αiCiN − .

Цисоидной конфигурации, при кото-

рой связи, примыкающие к αiCiN − ,

закрывают одна другую, соответствует

ϕ=0 , трансоиднойo180±=− ϕ . На ри-

сунке изображена так называемая вытя-нутая конформация пептида, при кото-

рой углы ϕ и ψ рав ны + o180

точка, характеризующая их набор, а значит, и конформацию того или иного ами-нокислотного остатка, могла бы оказаться в любом месте карты.

В действительности допустимы вовсе не любые комбинации углов ϕ и ψ. Этосвязано тем, что при изменении обоих углов изменяется и положение атомов всоседних аминокислотных остатках друг относительно друга. Сближение в про-странстве атомов, особенно объемистых (кислорода, углерода, азота) приводит ких взаимному отталкиванию. Преодоление этого отталкивания требует значитель-ных энергетических затрат, что делает такую конфигурацию полипептидной цепинеустойчивой. Карты Рамачандрана подобны географическим, на них нанесеныгоризонтали, соответствующие тому или иному энергетическому уровню. Болеевыгодной конформации соответствует меньший энергетический уровень, кото-рый на карте Рамачандрана выглядит как долина, впадина; наименее выгоднойотвечает гребень, хребет.

Рассмотрим карту Рамачандрана для остатков глицина, не имеющих боко-вой группы (см. рис. 5.3). В этом случае разрешена довольно большая часть карты,возможен широкий набор углов ϕ и ψ. Однако случаи, когда эти углы близки кнулю, невыгодны: это отвечает заслоненной конфигурации, при которой особен-но сказывается перекрывание атомов кислорода карбонильных групп. Конфор-мацион-ная карта Рамачандрана для глицина проста — она показывает крестооб-разную «запрещенную» возвышенность вдоль осей с ϕ = 0°, ψ = 0° и довольнообширные понижения, охватывающие не менее половины общей поверхности.

Эта особенность глицина как остатка с наименьшими конформационымиограничениями играет специфическую роль в формировании пространственнойструктуры белка. Характерно, что на картах Рамачандрана для реальных белковточки, соответствующие остаткам глицина, не сгущаются в двух главных долинах,как это свойственно для других аминокислот, а распределяются почти по всемуполю. Очевидно, что остатки глицина используются в тех точках пространствен-ной структуры белка, где необходима нестандартная конформация, в частностипри резких поворотах пептидной цепи. Не случайно, что остатки глицина, ка-залось бы, не способные из-за отсутствия боковой цепи непосредственно участво-вать в функционировании белка, чаще других оказываются инвариантными в се-мействах эволюционно родственных белков, что указывает на их незаменимостьв структурообразовании.

Очевидно, что набор разрешенных конформации существенно умень-шится, если отойти от рассматривавшейся до сих пор упрощенной схемы и учестьстерическое влияние боковых цепей аминокислот. Было бы нелегко проанали-зировать вклад всех 19 боковых цепей, однако в этом нет необходимости. Наи-более значительные ограничения на конформационную свободу аминокислотныхостатков накладывает появление простейшего заместителя у Cα-атома — метиль-ной группы в остатке аланина. Дальнейшие усложнения боковой цепи происхо-дят сравнительно далеко от главной цепи и мало влияют на выбор ею оптималь-ной кон формации. Карта Рамачандрана для аланина в достаточном приближенииверна и для других аминокислот.

Рис. 5.3. Карта Рамачандрана для глицина

Отложена потенциальная энергия для парыпептидных звеньев с остатком глицина меж-ду ними (изоэнергетические линии). Для гли-цина неблагоприятны конформации, зани-мающие на этой карте крестообразную воз-вышенность вдоль значений ϕ иψ, близких к0°, что соответствует заслоненной конфигу-рации; обширные понижения (затемнены)отвечают разрешенным областям. Ср. рис.5.13, на котором показано, что остатки гли-цина в реальных белках позволяют прилегаю-щим пептидным связям занимать друготносительно друга весьма различныеконформации

На этой карте (рис. 5.4) выявляются две долины, отвечающие стабильнымконформациям, т.е. оптимальным сочетаниям углов ϕ и ψ, и неглубокая впадина.Одна из долин соответствует правой α-спирали, характерной для белков (ϕ = - 57°,ψ = - 47°), другая — параллельной β-структуре (ϕ = -119°, ψ = +113°) и антипарал-лелъной β -структуре (ϕ = -139°, ψ = +135°).

Рис. 5.4. Карта Рамачандранадля L-аланина

Показано распределение потенциаль-ной энергии для остатка аланина, ок-руженного двумя пептидными звень-ями в координатах ϕ и ψ (см. подпись крис. 5.3), Глубокая долина в верхнемлевом квадранте соответствует кон-

формации, характерной для β -струк-

туры; соединенная с ней переваломдолина в левом нижнем квадранте -

правой α-спирали ( Rα ), обычно

встречающейся в белках. Небольшоепонижение в правом верхнем квадран-те соответствует крайне редкой левой

α-спирали ( αL). Следует обратить

внимание, что карту можно сверты-вать относительно осей ϕ, ψ = 0°, по-этому, например, долина, соответст-вующая β -структуре, продолжается унижнего обреза карты слева

То, что для обычных аминокислот разрешены лишь две области, две долинына конформационной карте, а значит, и два набора (с известными допусками) углов jи y, в какой-то мере предопределяет и ограниченность набора периодических вто-ричных структур. Так, присоединяя к аминокислотному остатку с набором ϕ = -57°, ψ = —47° другой остаток с примерно такими же двугранными углами, затем тре-тий и т.д., получим периодическую вторичную структуру — α-спираль.

Точно так же, соединяя в цепь остатки с двумя другими разрешенныминаборами углов, придем к двум известным типам β-структуры.

5.3. РОЛЬ ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ ВТОРИЧНОЙСТРУКТУРЫ

До сих пор, обсуждая вторичную структуру, мы рассматривали упрощеннуюмодель поведения аминокислотного остатка в пептидной цепи, концентрируя вни-мание на стерических ограничениях, которые могут быть вызваны его ближай-шими соседями. Следующий шаг, усложняющий картину и вместе с тем прибли-жающий ее к реальности,

— учет нековалентных взаимодействий между ближними остатками в пе-рио-дической вторичной структуре. При этом мы по-прежнему абстрагируемся отвклада боковых групп и пренебрегаем дальними взаимодействиями с другими час-тями молекулы.

Главная цепь полипептида содержит только один периодически повторяю-щийся элемент, способный устанавливать водородные связи,

— пептидную группировку, которая при этом может выступать и как донор,и как акцептор.

Насколько существенной может быть стабилизация вторичной структурыза счет водородной связи? Для ответа на этот вопрос следует учесть фактор, кото-рый до сих пор не рассматривался, — влияние окружающей белок воды. Вода спо-собна эффективно конкурировать за образование водородных связей, имея воз-можность быть и донором и акцептором:

Можно предвидеть, что влияние воды будет снижаться при формированиикомпактной пространственной структуры белка, росте содержания пептидных свя-зей, повышении вероятности их взаимодействия друг с другом. Действительно, изу-чение простейшей модельной системы N-метилацетамида (СH

3 –СО– NH– СН

показало, что при малых его концентрациях образование димеров, например за

счет возникновения межмолекулярных водородных связей практически не наблю-дается. Лишь при очень высокой концентрации N-метилацетамида (до 10 М) он прак-тически полностью димеризуется. В отсутствие же воды, например в тетрахлоридеуглерода, полная димеризация достигается уже при 0,2 М концентрации амида.

В белке реализуются оба эти эффекта — пептидные связи сближены, нахо-дясь в свернутой цепи, вероятность их встречи примерно такая же, как в 9Мрастворе N-метилацетамида. Разумеется, очень существенно и то, что сближениепептидных связей в белке происходит не случайным образом, как в концентрирован-ном растворе амида, а в кооперативной системе. В то же время в компактнойбелковой глобуле полярность окружения пептидной связи значительно меньше,чем в воде. Сложение этих двух факторов и делает водородную связь между пеп-тидньши группировками весьма важным структурообразующим фактором.

Таким образом, стабильность вторичной структуры существенным образомзависит от ее включения в компактную третичную структуру белка. Напротив, впептидах из-за меньшего их размера вторичная структура не обеспечивает необ-ходимой стабильности. Так, даже довольно длинный природный пептид — глюка-гон, содержащий 29 аминокислотных остатков, — существует в растворе как рав-новесная смесь конформеров, и только при образовании комплекса с белком-рецептором, т.е. при включении в компактную структуру за счет нековалентныхвзаимодействий, он образует α-спиралъ.

5.4. α -СПИРАЛЬ

В 50-х годах Л.Полинг и Р.Кори, основываясь на данных о структуре кри-сталлов аминокислот и простых пептидов, рассмотрели возможные периоди-чес-кие конформации полипептидной цепи и пришли к выводу, что наиболее вероят-на структура, названная ими α-спиралъю. При этом в основу выбора именно этойвторичной структуры были положены следующие критерии:

1. Образование плотноупакованной компактной структуры без пустот иперекрывания атомов.

2. Максимальная насыщенность структуры водородными связями с тем ус-ловием, чтобы геометрия водородной связи O—H—N была близка к линейной.

3. Соблюдение межатомных расстояний и углов, свойственных аминокис-ло-там и простым пептидам.

Рис.5.5. Правая α -спираль. А - показаны только -атомы; Б - все атомы скелетапептидной цепи; В - более полная структура

Пептидная цепь (от N- к С-концевому остатку) направлена сверху вниз. Водородные связи соединяюткарбонильный кислород i-ого остатка с водородом NH-группы (i+ 4)-го. В пространстве соседствуютбоковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками. Размещение атомов в спираликажется свободным толькр потому, что они для наглядности показаны в уменьшенном масштабе. С уче-том реальных радиусов атомов a-спираль представляет собой плотно упакованную структуру, лишеннуювнутреннего канала и не проницаемую даже для воды. В проекции на ось спирали расстояние междусоседними Сa атомами составляет 1,5 А°, угол поворота, приходящийся на один остаток, равен 100°. Наполный поворот спирали (360°) приходится 3,6 остатка

С соблюдением этих условий можно построить как правую, так и левую

α-спирали, однако правая α-спираль оказывается энергетически несколько вы-годнее левой, если пептидная цепь образована L-аминокислотами. Левой α−спирали отвечает на карте Рамачандрана небольшая впадина с углами ϕ = +57° и ψ= +47°. Теоретические выводы Полинга И Кори в дальнейшем полностью оправ-дались. α-Спираль, действительно, представляет собой один из основных, хотя ине единственный тип вторичной структуры.

α-Спираль характеризуют следующие параметры. Теоретически предсказан-ные величины двугранных углов ϕ = - 58°, ψ = - 41°; средние значения, по даннымрентгеноструктурного анализа 57 белков, ϕ = - 62°, ψ = - 41°. Ее радиус равен 2,3 А1,высота подъема спирали, I приходящаяся на один аминокислотный остаток, — 1,5А, среднее число остатков на один оборот — 3,6, шаг спирали (т.е. высота, на кото-рую пептидная цепь поднимается за один оборот) — 5,4 А. Все карбонильные груп-пы в отпирали ориентированы в одном направлении — вперед, если считать по ходупептидной цепи, от аминного конца к карбоксильному, a N—Н-группы — назад.

Между С=O- и N-H-группами устанавливаются водородные связи (рис. 5.5.)так, что карбонильная группа j-го остатка образует связь с N—Н-группой (i + 4)-го, карбонильная группа (i + 1)-го — с N—Н-группой (i + 5)-го и т.д. То, что«над» карбонильной группой 1-го остатка оказывается NH-группа, а не карбонил(i + 4)-го остатка, примерно и соответствует 3,6 остатка на оборот спирали.

Каждая пептидная группа поляризована и характеризуется определеннымдипольным моментом, причем отрицательный заряд концентрируется на кисло-роде карбонильной группы, а положительный — на атоме азота. Из-за однона-правленности пептидных групп в α-спирали их дипольные моменты согласуютсяи сеспираль как целое приобретает дипольный момент, на ее концах концентри-руются частичные отрицательный и положительный заряды, что может играть вбелке существенную функциональную роль.

Возможности образования водородных связей между пептидными группа-ми в α-спирали использованы сполна. В этом смысле α-спираль является как бынасыщенной, внутренне замкнутой. Она не способна (в отличие от α-структуры) квзаимодействию с другими элементами вторичной структуры за счет образованияводородных связей между пептидными группами.

В формировании пространственной структуры белка важную роль играютнековалентпные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот,входящих в α-спираль. При этом существенно, что на поверхности α-спирали ока-зываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тре-мя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобныеаминокислоты, они образуют своеобразный гидрофобный гребень, Взаимодейст-вие между такими гребнями используется как способ упаковки α-спиралей в про-странственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и может бытьчисто гидрофобной, что характерно для трансмембранных участков белков, илиамфифильной, т.е. обладающей как гидрофобной, так и гидрофильной сторонами(рис. 5.6).

Рис. 5.6. Распределение гидро-фильных и гидрофобных аминокислотна поверхности одной из α-спиралейаполипопротеина С-1:

I - гидрофильная поверхность, II -гидрофобная поверхность, на которой легкопроследить гребень, который образуют (сни-зу вверх) боковые цепи лейцина, валина,двух остатков фенилаланина, метионина иснова лейцина

гидрофилъфитные, в частности заряженные, поверхности. Поэтому a-спиральможет быть чисто гидрофобной, что характерно для трансмембранных участковбелков, или амфифильной, т.е. обладающей как гидрофобной, так и гидрофиль-ной сторонами. (рис. 5.6)

Длина a-спиральных участков в глобулярных белках относительно невелика иобычно составляет 5—15 аминокислотных остатков, редко превышая 3—4 оборотаспирали; в фибриллярных белках она гораздо протяженнее. Иногда наблюдаютсяизломы α-спирали, обычно в местах включения остатков пролина, прерывающихсистему водородных связей. При этом ось спирали отклоняется на 20—30°.

5.5. β-СТРУКТУРА

Набор углов, отвечающий этой структуре, соответствует на карте Рамачанд-рана обширной глубокой впадине. В отличие от α-спирали β-структура ста-билизируется взаимодействиями между соседними отрезками пептид-ной цепи, т.е. несколько более далекими контакта ми.

Эти отрезки могут быть направлены в одну сторону — параллельная струк-тура (угол ϕ = —119°, ψ = +113°) — или в противоположную — антипараллельная -структура (ϕ = —139°, ψ = +135°).

Рассмотрим систему водородных связей между двумя отрезками пептид-ной цепи, образующими параллельную β-структуру. В этом случае (рис. 5.7)NH-группа какого-либо остатка в отрезке А дает водородную связь с карбониль-ной группой i-го остатка пептидной цепи S а карбонильная группа того же амино-кислотного остатка цепи А — с NH-группой (i + 2)-го остатка в параллельнойцепи В. Важно, что (i + 1)-й остаток цепи В при этом как бы пропущен и его М-и карбонильная группа во взаимодействии с цепью А не участвуют. Точно так жедалеко не все С=O и NH-группы цепи А участвуют во взаимодействии с цепью В.

Таким образом, два отрезка параллельной β-структуры соединяются водо-родными связями, что приводит к формированию больших циклов из 12 атомов.

Еще раз подчеркнем, что в каждой из цепей во взаимодействии с соседней участ-вует только половина групп, которые могли бы образовать водородные связи.

Рис. 5.7. Параллельная β-структура

Показана модель параллельного β-складчатого слоя в флаводоксине. Водо-родные :связи (пунктирные линии) образуют 10-членные циклы. Стрелкиуказывают направление хода пептидных цепей

Следовательно, каждый из этих участков пептидной цепи может образо-вать такую же систему водородных связей еще с одним отрезком, тот, в свою оче-редь, с другими и т.д. В отличие от α-спирали, насыщенной водородными связя-ми и не способной поэтому взаимодействовать с другими участками белка науровне вторичной структуры, каждый отрезок пептидной цепи в β-структуре от-крыт для формирования более протяженной системы водородных связей.

В антипараллелъной β-структуре (рис. 5.8) водородные связи образуются ме-жду противоположно направленными пептидными группировками соседних отрез-ков, что приводит к чередованию 8- и 14-членных циклов. И в этом случае во взаи-

модействии с соседней пептидной цепью участвуют не все, а каждый второй амино-кислотный остаток. Половина пептидных групп остается свободной, что дает воз-можность присоединить к каждому из двух антипараллельно направленных отрезковеще по одному отрезку пептидной цепи, и т.д. Таким образом, и антипараллельнаяβ-структура не насыщена водородными связями и способна давать весьма протя-женные образования, в которые включено несколько участков пептидной цепи.

Рис. 5.8. Антипараллельная β-структура

Показан антипараллельный β-складчатый слой в супероксиддисмутазе. Во-дородные связи (пунктирные линии) образуют чередующиеся 8- и 14-член-ные циклы

Число аминокислотных остатков в отрезке пептидной цепи, образующемβ-структуру, обычно колеблется от 3 до 8. Протяженная β- структура, так называе-мый β-слой, или β-складчатый лист (рис. 5.9), чаще всего состоит из 2—6цепей, хотя иногда их число достигает и десяти.

Боковые группы аминокислотных остатков, соседних в пептидной цепи, приобразовании β-структуры оказываются по разные стороны ее поверхности. Сама жеповерхность имеет складчатую форму, причем складки заданы α-углеродными ато-мами остатков, находящихся в соседних цепях. Отходящие от α-углеродных атомовбоковые группы образуют своего рода гребни.Это позволяет формировать доволь-

но протяженные поверхности, насыщенные однотипными (например, гидро-фобными) боковыми радикалами. Гидрофобные поверхности β-складчатого слоя,взаимодействуя между собой или с гидрофобными же гребнями α-спиралей, могутучаствовать в построении внутримолекулярных гидрофобных ядер, стабилизирую-щих пространственную структуру бе

Рис. 5.9. β-Складчатый слой.

А - антипараллельный β-складчатыйслой; вид “сверху” ; прерывистымилиниями обозначены водородныесвязи.зачернены β-атомы боковыхгрупп; Б - вид “сбоку”; хорошо видны склад-чатость и размещение боковых групппо обе стороны слоя

Рис. 5.10. Протяженный β-склад-чатый слой (в карбангидразечеловека)

Десять отрезков β-структуры преиму-щественно антипараллельной) закру-чены друг относительно друга, образуясупервторичную структуру, котораянапоминает винтовую лестницу. Уголмежду первым и последним отрезкамиблизок к 220°. Показаны ацетилиро-ванный аминный AcNH-и карбок-сильный СООН-концы полипептид-ной цепи

Следует иметь в виду, что поверхность β-складчатого листа редко являетсяплоской, чаще она закручена влево, если смотреть перпендикулярно ходу отрезков.Угол между соседними отрезками цепи составляет при этом около 25°. Много-кратное повторение такого мотива приводит к закручиванию листа в структуру,подобную винтовой лестнице. В результате угол между крайними отрезками пеп-тидной цепи в β-листе колеблется от 0° в структуре конканавалина А до 70—80° в дезоксирибонуклеазе I, 100° в нуклеотидсвязывающем домене дегидроге-наз и даже достигает 220° в карбангидразе (рис. 5.10).

Рис. 5.11. Схема вторичных структур в NAD-связывающем домене глицеральдегидфосфатде-ги дрогеназы

Тонкими линиями показаны водородные связи в α-спиралях (например, от NH-группы остатка19 к С=O остатка 15 и т.д.), участках параллельной (от NH и С=O остатка 3 к соответственноС=О остатка 27 и NH остатка 29) и антипараллельной β-структуры (отрезки 56-61 и 62-67). Естьи участки последовательности,например 134-141, которые не образуют системы водородныхсвязей

Описаны также «барабаны», получающиеся при сворачивании протяженногоβ-листа, когда крайние отрезки пептидной цепи смыкаются, формируя между со-бой систему водородных связей, которая свойственна β-структуре. Очевидно, чтоβ-структура в таких случаях утрачивает характер локального образования, подчаспронизывая всю белковую глобулу (и перерастает рамки данного в начале главыопределения вторичной структуры). Учитывая это, к протяженным β-складча-тым листам, играющим важную роль в формировании третичной структуры бел-ка, применяют термин супервторичная структура.

На рис. 5.11 приведена схема NAD-связывающего домена глицеральде-гидфосфатдегидрогеназы, иллюстрирующая многообразие вторичных структур вэтой молекуле.

5.6. β-ИЗГИБ

Как сеспираль, так и β-структура обычно представлены в глобулярных бел-ках сравнительно короткими отрезками, поэтому значительная часть вторичнойструктуры белка приходится на разного рода петли, позволяющие изменить на-правление пептидной цепи. Наиболее экономный структурный элемент, позво-ляющий повернуть полипептид на 180°, используя всего три пептидные группи-ровки, получил название β-изгиба (рис. 5.12). β-Изгиб стабилизируется одной во-дородной связью. Его образованию могут мешать объемистые боковые цепи ами-нокислот, поэтому предпочтительно включение в него остатка глицина. Заметим,что β-изгиб практически всегда оказывается на поверхности белковой глобулы,поэтому нередко он играет существенную роль в ее взаимодействии с другимимолекулами, например с йммуноглобулинами.

Приведенная на рис. 5.13 карта Рамачандрана для реального белка, осно-ван-ная на данных рентгеноструктурного анализа, показывает, что большинствоаминокислотных остатков имеет; конформацию, свойственную α-спирали илиβ-структуре. Лишь точки, соответствующие углам ϕ и ψ для остатков глицина, ока-зываются мало связанными конформационными ограничениями и распределеныпочти по всему полю карты.

Относительное содержание вторичных структур различного типа в белкахменяется в очень широких пределах (табл. 5.1), причем доля нерегулярных струк-тур подчас оказывается весьма значительной.

Рис. 5.12. β-Изгиб (две возможные структуры)

Поворот пептидной цепи на 180° происходит на отрезке, содержащем четы-ре аминокислотных остатка, причем между кислородом карбонильной груп-пы 1-го остатка и водородом NH-группы 4-го образуется стабилизирую-щая изгиб водородная связь

Рис. 5.13. Карта Рамачандрана для глутатионредуктазы:

А - точки, отвечающие конформации 419 аминокислотныхостатков (исключая глицин), сгущаются в понижениях, до-линах, которые соответствуют α-спирали (нижний левый квад-рант) и β-структуре (верхний левый квадрант), встречаются ина перевале между ними. Небольшая группа остатков имеетконформацию, характерную для левой α-спирали (ϕ = 60°, ψ =40° ); Б - точки, отвечающие 41 остатку глицина, из которых 29соответствуют наборам углов ϕ и ψ, не разрешенным для другихаминокислотных остатков

Таблица 5.1. Относительное содержание в глобулярных белкахаминокислотных остатков, принадлежащих различным типам вторичнойструктуры (по данным рентгеноструктурнрго анализа)

Содержание аминокислот, %

Б е л о к

α-спираль

β-структура

β-изгиб

нерегулярные

участки

Миоглобулин 79 0 5 16 Парвальбумин 62 5 17 16 Аденилаткиназа 54 12 19 15 Инсулин

13 Лактатдегидрогеназа

25 Лизоцим 41 16 23 20

Цитохром с

37 Карбоксипептидаза А

Термолизин

24 Субтилизин BPN

Ингибитор трипсина

36 Папаин

Нуклеаза

43 Рибонуклеаза А

α-Химотрипсин

23 Эластаза

15 Конканавалин

5.7. ОБ УСТОЙЧИВОСТИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Оценивая факторы, которые определяют стабильность вторичной структу-ры, следует учитывать, что стерические ограничения, делающие благоприятнымине любые, а только определенные наборы двугранных углов ϕ и ψ, отнюдь не запре-щают иных сочетаний. В то же время система водородных связей, типичная для эле-ментов вторичной структуры, в воде достаточно уязвима, поскольку и группы NH,и карбонильные группировки могут взаимодействовать не только между собой, но ис молекулами воды; что приводит к дестабилизации структуры. К тому же вглобулярных белках протяженность участков вторичной структуры ограничена, акооперативность в рамках отдельного ее элемента невысока.

Таким образом, взятые сами по себе, в отдельности от компактной белко-вой глобулы, элементы вторичной структуры не должны обладать значительнойстабильностью. Это подтверждает ряд экспериментов, в которых наблюдали за струк-турообразованием сравнительно коротких пептидов, воспроизводивших после-довательность аминокислот в α-спиральных участках белка. Обнаружено, что такиепептиды, в частности фрагменты глобинов или спиральный участок миогемэрит-рина, в водных растворах содержат лишь флуктуирующие зародышевые α-спира-ли, причем равновесие, как правило, смещено в сторону развернутых структур.Устойчивость α-спиралей заметно возрастает при понижении полярности средыпутем добавления органических растворителей. Например, фрагмент 69—87 мио-гемэритрина, полностью спирализованный в белке, в смеси вода — трифторэтанолсодержал около 50% α-спирали, причем спирализованной оказывалась преиму-щественно С-концевая половина пептида, тогда как в воде наблюдалось лишьвременное образование отдельных оборотов пептидной цепи, быстро распа-давшихся. Отмечалось также образование β-изгибов в водных растворах короткихпептидов.

Следовательно, элементы вторичной структуры приобретают устой-чивость только после их объединения в компактную белковую глобулу, посколькув последней резко повышается кооперативность системы нековалентных взаимо-действий, а значительная часть структуры оказывается погруженной в среду сполярностью гораздо меньшей, чем у воды. Наконец, немаловажно, что в компакт-ной структуре значительная часть внутримолекулярных водородных связей скры-та от воздействия воды и вероятность их разрыва гораздо меньше. Итак, вторич-ная структура как устойчивое образование существует К только в рамках компакт-ной белковой глобулы. Однако флуктуирующие мерцающие элементы вто-ричной структуры, которые могут возникать уже на коротких участках пеп-тидной цепи, очень важны как предпосылка формирования пространственнойструктуры, повидимому, начинающегося со взаимодействия, «схлопывания»соседних α -спиралей, β-изгибов, а затем и элементов β-структуры.Такие ассоциаты, еще недостаточно стабильные, могут служить зародышамивозникновения компактной структуры, единицами ее свертывания.

5.8. О СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМИ

Как уже говорилось, при описании вторичной структуры пренебрегают бо-ковыми радикалами аминокислот и ролью дальних взаимодействий. Однако помере уточнения картины эти факторы необходимо учитывать: так, уже переход отглицина к аминокислоте с простейшей боковой цепью — аланину — резко сужаетвыбор возможных конформаций, еще резче уменьшается он для пептидных свя-

зей, включающих иминный азот пролина. Более тонкий учет влияния индивиду-альных особенностей аминокислот выявляет некоторые предпочтения в образо-вании той или иной вторичной структуры.

Это обусловлено не только стереохимическим влиянием боковых цепейна стабильность конформации, но и тем, как они укладываются на поверхностивозникающей структуры, каков образующийся при этом рисунок. Например, еслигидрофобные остатки распределены в первичной структуре так, что разделяютсядвумя-тремя остатками полярных аминокислот, то образуется своеобразный гре-бень из гидрофобных радикалов α-спирали, направленных по одну сторону. За счетвзаимодействия таких гребней может начаться формирование пространственнойструктуры, которая, в свою очередь, стабилизирует вторичную. Таким образом,предпочтительное образование того или иного типа регулярной вторичной струк-туры может определяться не только природой аминокислотных остатков, но и ха-рактером их размещения на данном участке пептидной цепи.

Весьма полезным оказался статистический анализ установленных прост-ранственных структур белка, который позволил приписать отдельным аминокис-лотным остаткам параметры, характеризующие их большую или меньшую склон-ность встраиваться в α-спираль, β-структуру или образовывать β-изгиб. Если про-сматривать вновь определенную первичную структуру, используя «окно», соответ-ствующее нескольким идущим подряд остаткам, то удается, например, выявитьхарактерные скопления остатков, склонных встраиваться в α -спирали. Это по-зволяет предполагать, что в данном белке они свернуты в α-спираль. Такое пред-положение проверяется соответствием остатков, расположенных на концах спи-рали, аминокислотам, обычно занимающим такое положение. Дальнейшие уточ-нения дают соображения стереохимического характера.

Разработано несколько приемов предсказания вторичной структуры бел-ков по их первичной структуре, из которых наибольшее распространение полу-чили методы, предложенные П.Чоу и Дж.Фасманом, О.Птицыным и А.Финке-лыптейном, а также В.Лимом. Как показала проверка на ряде белков, вероят-ность предсказания α-спиральных участков достаточно велика, хуже предсказы-ваются β-структурные элементы и изгибы.

Трудность однозначного предсказания вторичной структуры понятна, таккак после образования какого-либо ее элемента он должен включиться в третич-ную структуру, т.е. войти в систему дальних взаимодействий. Последние могутстабилизировать вторичную структуру, но могут и нарушить ее. Ввиду этого всегдасуществует некоторая вероятность, что предсказание не оправдается. Действи-тельно, анализ большого числа пространственных структур белков показал, чтоодни и те же короткие аминокислотные последовательности могут образовывать вразных белках одинаковые вторичные структуры, что установлено, например, длявосьми гепта- и гексапептидных участков. Однако нередки и такие случаи, когдаидентичные последовательности дают разные вторичные структуры в белках раз-

личного строения. Это найдено для семи гексапептидных отрезков. В частности,одна и та же последовательность

Asn—Ala—Ala—Ile~Arg—Ser

имеет в фосфофруктокиназе конформацию α-спирали, расположенной между дву-мя другими α-спиралями, тогда как в термолизине она входит в β-складчатый слойвместе с четырьмя другими фрагментами пептидной цепи.

Итак, дальние взаимодействия в рамках третичной структуры могутвносить заметные коррективы в соотношение первичная структура — вторичнаяструктура, делая его далеко не всегда однозначным. Важно, однако, что успешноепредсказание ряда вторичных структур, в особенности α-спиральных участков, сопределенностью указывает на то, что это соотношение реально существует. Пред-сказание вторичных структур помогает при сравнении белков, в частности в такихслучаях, когда сопоставление первичных структур не выявляет значимого процентасовпадающих аминокислотных остатков (например, их меньше 15%), однако естьоснования заподозрить, что эти белки тем не менее родственны и обладают сходнойпространственной структурой. В отсутствие прямых данных по укладке полипеп-тидных цепей таких белков сходство предсказываемых элементов вторичной структу-ры может служить полезным аргументом. Нередко предсказание вторичной струк-туры позволяет выявить характерные особенности отдельных участков белка: на-пример, гидрофобные α-спирали могут оказаться трансмембранными.

5.9. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Наиболее надежным является определение вторичной структуры по резуль-татам рентгеновского анализа пространственного строения белка. Однако этотметод сложен и требует значительного времени, существенно уступая в скоростисовременным способам установления первичной структуры, поэтому важно хотябы примерно оценивать содержание отдельных типов вторичной структуры в бел-ке. Кроме того, рентгеноструктурный анализ не позволяет следить за изменени-ями пространственной, а значит, и вторичной структуры белка в растворе в усло-виях, особенно интересных для изучения функции.

Для такого рода задач используют оптические методы — исследованиекругового дихроизма или дисперсии оптического вращения. Оба эффекта осно-ваны на электронных взаимодействиях между хромофорами — карбонильнымигруппами соседних пептидных связей. Такие взаимодействия существенно зави-сят от взаимной ориентации карбонильных групп в пространственной структуре,а значит, от конформации соответствующих участков полипептидной цепи белка.

Так, набору углов ϕ и ψ, свойственному тому или иному типу вторичной струк-туры белка, отвечает характерный спектр кругового дихроизма. В наблюдаемыхспектрах реальных белков вклады отдельных типов вторичной структуры сумми-руются. Сопоставление спектров кругового дихроизма для ряда белков, имеющих,по данным рентгено-структурного анализа, существенно разное содержание α-спи-ралей, β-структурных элементов, β-изгибов, участков с нерегулярной структурой,позволяет найти базисные спектры, свойственные этим видам вторичной струк-туры. Спектр кругового дихроизма изучаемого белка может быть представлен каксумма базисных спектров. Вклад каждого из них пропорционален содержаниюсоответствующего типа вторичной структуры в данном белке.

Такой способ обычно дает результаты, неплохо согласующиеся с даннымирентгеноструктурного анализа. Как правило, легче предсказывается содержаниеα-спиралей, обладающих более выраженными особенностями спектра круговогодихроизма, несколько сложнее — содержание β-структурных элементов и β-изги-бов. Однако главное достоинство метода — не в определении абсолютного содер-жания отдельных типов вторичной структуры. Он особенно ценен для наблюденияза тем, как изменения условий сказываются на вторичной, а значит, и на третич-ной структуре белка. Метод незаменим при исследовании денатурации белков,характеристике белковых фрагментов и фибриллярных белков.

ГЛАВА 6 ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА

Третичной структурой называют распределение в пространстве всех атомов бел-ковой молекулы. При этом не учитывают взаимодействия этой глобулы c соседни-ми глобулами или субъединицами. Часто понятие третичной структуры сужают,концентрируя внимание на наиболее устойчивом ее элементе — свойственномданному белку способе укладки полипептидной цепи в пространстве. Харак-терно, что для больших групп эволюционно родственных белков, подчас оченьзначительно отличающихся по первичной структуре и, значит, по распределениювсех атомов в пространстве, способ укладки полипептидной цепи остается в глав-ных чертах неизменным. Это показывает, что допускаемое упрощение оправдано,так как оно отражает существенные черты третичной структуры.

Известное сходство приведенного определения третичной структуры с поня-тием вторичной структуры лишь внешнее, поскольку вторичная структура характе-ризует относительно небольшой участок белка и определяется локальными некова-лентными взаимодействиями, тогда как третичная структура зависит от всей сум-мы взаимодействий — ковалентных и нековалентных — в белковой глобуле. Тре-тичная структура — основа функциональности белка, которая требует точной про-

странственной организации больших ансамблей, построенных из множества амино-кислотных остатков и их боковых групп. Такие ансамбли формируют активные цен-тры ферментов, зоны связывания других биологических молекул, эффекторные цен-тры белков и т.д., поэтому нарушение третичной структуры белка (денатурация) не-изменно приводит к утрате им способности функционировать.

6.1. СТАБИЛЬНОСТЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙСТРУКТУРЫ БЕЛКА

Стабильность третичной структуры зависит от системы нековалентныхвзаимодействий внутри белковой глобулы. Некоторые белки дополнительно ста-билизируются ковалентными — дисулъфидными — связями; однако немало бел-ков, в том числе достаточно стабильных, вовсе их лишены.

Среди нековалентных взаимодействий, реализующихся при образованиипространственной структуры белка, наибольшую точность в фиксировании меж-атомных расстояний и углов обеспечивают водородные связи. Им, как известно,принадлежит решающая роль в формировании вторичной структуры, в особен-ности периодических ее элементов: α-спиралей и β-структур. В дополнение к это-му водородные связи соединяют между собой и с главной цепью множествофункциональных групп боковых цепей аминокислотных остатков, например

Существенно, что внутри белковой глобулы реализуется не менее 90% воз-можных водородных связей.

Система водородных связей наряду с другими нековалентными взаимодей-ствиями — ван-дер-ваальсовыми связями и электростатическими контак-тами — чрезвычайно важна для стабилизации компактной нативной белковой

глобулы. Действительно, изменение свободной энергии и, значит, константа Кравновесия пептидная цепь -> белковая глобула в первом приближении опреде-ляется уравнением

цепьSTцепь∆HRTlnKцепь∆G ∆−==

(Подчеркнем, что ролью воды, окружающей белок, мы пока пренебрегаем,рассматривая белковую молекулу как бы находящейся в вакууме, на это и указы-вают индексы «цепь».)

В этом выражении величина ∆ НЦЕПЬ

отрицательна; что отражает вклад неко-валентных взаимодействий, устанавливающихся внутри белковой глобулы. Длястабилизации глобулы эта величина должна компенсировать энтропийный член— Т∆ S, который положителен, так как свертывание неупорядоченного клубка —неструктурированной полипептидной цепи — в глобулу упорядочивает структуруи влечет за собой убыль энтропии пептидной цепи, а следовательно, ∆ S отрица-тельна. Если такая компенсация достигнута, то К окажется равной единице и, зна-чит, доли нативных и денатурированных молекул белка станут равными. Для тогочтобы равновесие отчетливо сдвинулось в сторону образования компактной струк-туры, понадобится существенное превышение ∆ Н

ЦЕПЬ над - Т∆ S.

Соотношение же этих двух величин зависит прежде всего от числа неко-валентных связей, устанавливающихся при свертывании полипептидной цепи в гло-булу, а значит, от длины пептидной цепи. Этим объясняется обсуждавшаяся уже гра-ница между пептидами и белками. В то же время видно, что с ростом температуры Тчлен Т∆ S рано или поздно превысит по абсолютной величине ∆ Н и пространствен-ная структура утратит стабильность — произойдет тепловая денатурация белка.

Реальная картина, однако, существенно Зависит от учета взаимодействия бел-ка с растворителем, обычно с водой. Действительно, вода cпособна образовыватьводородные связи как с пептидными группировками, так и с функциональными груп-пами белка, конкурируя с формированием внутримолекулярных связей.

Если сравнить развернутое, денатурированное состояние белка со сверну-тым, нативным, то окажется, что при упаковке внутрь глобулы полярной группы:

1) последняя дает водородную связь с какой-либо другой полярнойгруппой белка; 2) разрываются водородные связи, которые обе эти группы — донор и ак-

цептор — в развернутой цепи имели с водой; 3) устанавливаются водородные связи «освободившихся» молекул воды с

другими ее молекулами.Рассмотрим, например, поведение двух полярных групп — гидроксила се-

рина и амидной группы аспарагина, образующих внутримолекулярную водороднуюсвязь при свертывании цепи в компактную структуру:

В целом никакого выигрыша в числе водородных связей при свертыванииглобулы произойти не может, так как одновременно утрачиваются водородныесвязи цепь — вода. Важно, чтобы неизбежный проигрыш — снижение числа водо-родных связей в результате того, что при свертывании какие-тo полярные группы,погрузившись в глобулу, не найдут партнера и не смогут образовывать водороднойсвязи, — не оказался слишком значительным (этим-то и диктуется необходимостьобразовать максимально высокое их число внутри глобулы: как уже отмечалось,не менее 90%). Понятно, что столь высокая степень насыщения глобулы водород-ными связями не может быть реализована хаотически. Гораздо эффективнее в этомсмысле регулярные элементы вторичной структуры.

При свертывании глобулы убывает энтропия пептидной цепи, ноодновременно происходит возрастание энтропии растворителя — воды. По-следнее играет решающую роль в стабилизации третичной структуры белка, чтообъясняется следующими соображениями.

Рис. 6.1. Додекаэдр, образованный молекулами во-ды, соединенными водородными cвязями

Внутри додекаэдра образуется полость диаметром около 5А, в которой может быть размещено гидрофобное, т.е. недающее водородных связей с водой, соединение.Формирование додекаэдра или аналогичных правильныхструктур с более крупными полостями требует упорядо-чения молекул воды, тем большего, чем больше поверх-ность разместившегося в полости соединения. Это при-водит к понижению энтропии системы и делает выгод-ным объединение гидрофобных элементов белка в ядро

Как известно, вода представляет собой весьма необычный, в высокой мереструктурированный растворитель. Каждая ее молекула способна участвовать в об-разовании четырех водородных связей с другими молекулами воды. В результате вводе сосуществуют, находятся в динамическом равновесии со свободными молеку-лами относительно протяженные квазикристаллические льдоподобные структуры.Полярные соединения, в том числе полярные группы белка, относительно легковключаются в такие структуры, устанавливая водородные связи с окружающейбелок водой.

Сложнее обстоит дело при взаимодействии с водой неполярных боковых це-пей белка. На модельных соединениях — простейших углеводородах — показано, чтоони могут в небольшой степени растворяться в воде. При этом их молекулы, неспособные устанавливать водородные связи, включаются в своеобразные пусто-ты в динамической структуре воды - полости, ячейки. Последние образованымолекулами воды, связанными между собой водородными связями (рис. 6.1).

По существу, это напоминает так называемые соединения включения. Возник-новение таких ячеек означает упорядочение, выключение из хаотического движе-ния значительного числа молекул воды, т.е. уменьшение энтропии растворителя —воды. Уменьшение энтропии, которое оказывается тем большим, чем большеповерхность раздела неполярные группировки — вода, ограничивает растворениеуглеводородов в воде: термодинамически выгодным оказывается расслоение систе-мы, образование двух фаз - водной и углеводородной.

Нечто аналогичное сопровождает и растворение в воде пептидной цепи, не-сущей неполярные боковые группы. Каждая из таких групп оказывается в ячейке,окруженной структурированными молекулами воды, что приводит к уменьшениюэнтропии системы. «Отслаивание» углеводородных радикалов в этом случае, понят-но, невозможно, — они нанизаны на скелет Полипептидной цепи. Поэтому реализу-ется другой процесс — свертывание глобулы, при котором значительная часть (неменее половины) гидрофобных боковых цепей оказывается скрытой от контактас окружающей белок водой. При этом нередко наблюдается образование своеоб-разных внутримолекулярных «капель» из гидрофобных боковых цепей амино-кислот, «гидрофобных ядер» более или менее сложной формы. Иногда такие ядравытянуты, напоминая полумесяц, иногда распадаются на два-три самостоятельныхнебольших ядра. Важно, что уменьшение поверхности соприкосновения гидрофоб-ных групп с водой приводит к установлению между ними так называемых гидро-фобных контактов. Заметим, что сближение неполярных групп влечет за собойустановление ван-дер-ваальсовых контактов между ними, в определенной меретакже стабилизирующих белковую глобулу. Однако вклад этих весьма слабыхвзаимодействий в энергетику процесса свертывания белка невелик, тогда как рольгидрофобрных контактов, иными словами, роль изменения энтропии раствори-теля при свертывании белка очень значительна.

Термодинамика свертывания белковой глобулы характеризуется тем, что фак-

торы, способствующие образованию компактной нативной структуры, и фак-торы, действующие в противоположном направлении, почти сбалансированы.Изменение свободной энергии при свертывании белка, содержащего примерно 100аминокислотных остатков, составляет около 10 ккал/моль, или всего лишь 0,1 ккалв расчете на один аминокислотный остаток. Для сравнения укажем, что энергия :водородной связи составляет около 3 ккал.

Еще важнее, что эта удивительно небольшая величина оказывается разно-стью двух достаточно крупных, но сбалансированных величин. Последнее приво-дит к тому, что белковая глобула может утрачивать стабильность, разворачиватьсяуже при относительно небольшом изменении указанных величин. Например, утрататолько одной водородной связи при замене в лизоциме фага Т4 треонина изолей-цином снижала температуру денатурации белка на 11°. Существенно, что деста-билизация третичной структуры белка может быть вызвана не только воздействи-ем на белок, но и изменением структуры растворителя — воды.

Известно несколько способов оценки гидрофобности боковых цепей амино-кислот, входящих в состав белка. Согласно одному из них, предложенному Р. Воль-фенденом, определяют распределение соединений, моделирующих боковую цепьтого или иного остатка между водой и находящимся в равновесии с ней паром. Так,боковая цепь треонина аппроксимировалась этиловым спиртом, радикал аланина— метаном и т.п. В этих условиях гидрофобные соединения будут стремиться по-кинуть воду и перейти в пар.

Оказалось, что по величине константы равновесия паровая фаза/вода (т.е.по склонности перехода в пар) боковые цепи аминокислот могут быть собраны вследующие группы:

1. Константа порядка 102 — глицин, лейцин, изолейцин, валин, аланин.2. Константа порядка 101 — фенйлаланин, цистеин, метионин.3. Константа порядка 10-4 — треонин, серии, триптофан, тирозин.4. Константа порядка 10-8 — аспарагин, лизин, глутамин, глутамат, гисти-

дин, аспартат.5. Константа 10-14 — аргинин.Первые две группы включают в себя гидрофобные аминокислоты, боко-

вые цепи которых стремятся избежать контакта с водой. Помещение глицина впервую группу объясняется тем, что молекула водорода плохо моделирует атомводорода в глицине. В действительности при упаковке остатков глицина в белкеособенно значителен вклад пептидной группировки –NH-CH-С0- , поэтому гли-цин трудно отнести к гидрофобным остаткам. Впрочем, известны случаи, когда вфиксированной третичной структуре белка метиленовая группа остатка глицина—СН

2— выполняет роль гидрофобного звена.Третья—пятая группы включают гидрофильные аминокислотные остатки.

Для пролина в рамках данного подхода нельзя предложить модели. Анализ простран-ственных структур множества белков показывает, что указанное отнесение амино-

кислот к гидрофобным или гидрофильным в общем коррелирует с их распределениемпреимущественно внутри или на поверхности белковой глобулы (табл. 6.1, 6.2).

6.2. ГИДРОФОБНОЕ ЯДРО

Как правило, гидрофобное ядро состоит исключительно из гидрофобныхбоковых цепей, лишь изредка в него оказывается погруженным гидрофильный,тем более заряженный аминокислотный остаток. Принято считать, что такиеисключения обусловлены какими-то функциональными требованиями.

В гидрофобное ядро, которое, как уже отмечалось, вовсе не обязательноприближается к сферической конфигурации, но более или менее компактно, обыч-но входит 20—30% общего числа аминокислотных остатков. В нем особеннопредставлены объемистые остатки гейцина, изолейцина, фенилаланина, валина.Так, ДНКаза I, полипепидная цепь которой состоит из 259 аминокислотных ос-татков, при формировании структуры образует три гидрофобных ядра, в которыхсдержится 70% имеющихся в этом белке гидрофобных остатков, тенденцию кпогружению гидрофобных боковых цепей (прежде всего ланина, валина, изолей-цина, лейцина, фенилаланина и метионина) внутрь глобулы этого фермента, ти-пичную и для других белков, иллюстрирует табл. 6.1.

Таблица 6.1. Доступность для воды боковых цепей аминокислотных остатковДНКазы I

Аминокислота

Всего

остатков Недоступны для

воды

Частично и полностью

Процент доступных

доступны

Val 25 17 8 32 Ile Leu

0 12 ^

0 52 Phe 11 8 3 27

25 Pro 9 2 7 78

Trp 3 0 3 100 Gly 9 3 6 67

Продолжение табл. 6.1.

Общность тенденции к погружению гидрофобных боковых цепей внутрьглобулы подтверждает анализ пространственных структур 9 белков, которые со-держат в общей сложности 2000 аминокислотных остатков, в том числе 587 (29%)скрытых, т.е. образующих гидрофобные ядра (табл. 6.2).

Упаковка боковых цепей аминокислот в гидрофобном ядре, как правило,близка к плотной (рис. 6.2), что делает эффективными ван-дер-ваальсовы взаи-модействия между углеводородными структурами — дополнительный факторстабилизации пространственной структуры. У эволюционно родственных белковс однотипной третичной структурой объем гидрофобного ядра, обычно меняетсямало — появление более крупных боковых групп компенсируется мутациями, ко-торые приводят к уменьшению объема находящихся с ними в контакте боковыхрадикалов. Все же было бы неправильным сводить стабилизирующее действиегидрофобного ядра только к его объему — структурная организация имеетнемалое значение.

Примером может служить весьма тонкая зависимость стабильности белкагена V бактериофага φ 1 и его мутантов от природы аминокислот, образующих гид-рофобное ядро. Так, замена изолейцина-47 на валин устраняет одну метильнуюгруппу из гидрофобного ядра, замена валина-35 на изолейцин, напротив, вводитдополнительную метильную группу. Следовательно, в двойном мутанте Ilе-47 ->Val;Val-35 -> Ilе объем гидрофобного ядра остается таким же, как и в белке дикоготипа, хотя упаковка гидрофобных групп во внутреннем ядре белка, естественно,должна несколько измениться; оба мутанта, содержащие одиночные замены

Всего

остатков

Недоступны для воды

Частично и полностью

Процент доступных

доступны

Ser T h r Т у г A s n

4 31 14 15 12

1 4 3 3 2

3 27 11 12 10

75 87 79 80 83 Gin

Asp 9 20

80 His

100 Lys

100 92

Ilе-47 ->Val и Val-35 ->Ilе, как и двойной мутант, о котором говорилось выше,похожи на исходный белок по строению и функции, однако значительноменее стабильны.

Таблица 6.2. Доля аминокислотных остатков, которые после свертывания белкаоказываются скрытыми, практически недоступными растворителю

Гидрофобное ядро окружено наружной оболочкой, имеющей контакт сводой. В ней содержатся гидрофильные аминокислотные остатки, но наряду с ниминемало и боковых цепей гидрофобных аминокислот — до половины их общегосодержания. Нередко образуются своего рода гидрофобные пятна, «лоскуты», ко-торые придают поверхности белка мозаичный характер, чередуясь со строго гид-рофильными участками. Такие гидрофобные выходы могут иметь функцио-

Процент скрытых остатков

от общего числа остатков данного

типа

от суммы скрытых остатков

12 Val 56 15

Met 50 2 Cys 50 2 Phe 48 5 CyS H 47 3 Leu 41 10 Ala 38 12 Gly 37 10 Thr 25 5,5 Ser 24 8 Pro 24 3 Trp 23 1,5 Glu 20 2 His 19 1 Asp 14,5 3 Туr 13 2 Asn 10 2 Gln

2 Lys 4 0,1

нальное значение — они формируют гидрофобные участки зон - связываниясубстратов и других лигандов, участвуют в белок-белковых взаимодействиях, вчастности в стабилизации четвертичной структуры.

ÐИС. 6.2. Поперечное сечение(скол)модели лизоцима куриного яйца:

1- отчетливо полярные группы, 2 -умереннополярные, 3 - гидрофобные. Видно, что по-следние сконцентрированы внутри глобулы,но могут выходить на поверхность, в частно-сти во впадине активного центра (слева -вверху). Полярные остатки формируют обо-лочку, изредка (например, слева внизу) про-никая внутрь глобулы

Разумеется, границы между гидрофобным ядром и поверхностным слоембелка не так уж резки, более того, нередко обнаруживаются включенные в про-странственную структуру молекулы воды, участвующие в поддержании системывнутримолекулярный водородных связей путем образования мостиков междуфункциональными группами боковых цепей аминокислот.

6.3. РОЛЬ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ В СТАБИЛИЗАЦИИ ТРЕТИЧНОЙСТРУКТУРЫ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ

Дисульфидные связи встречаются далеко не во всяком белке, более того,известны весьма стабильные, в том числе термостабильные, белки, совсем ли-шенные их. Таким рбразом, наличие в белке дисульфидных связей вовсе не явля-ется непременным условием его стабильности, однако роль этих связей нельзя инедооценивать.

Вклад дисульфидной связи в конформационную стабильность белкасущественно зависит от ее расположения в пространственной структуре. Полу-ченные для ряда белков (панкреатической рибонуклеазы; лизоцима, легкой цепииммуноглобулинов) оценки вклада дисульфидных связей в энергию стабилиза-

ции нативной пространственной структуры находятся в пределах 2,3 — 5 ккаль/моль.Значимость этих величин очевидна, если сравнить их с небольшой — порядка 10ккал/моль — энергией стабилизации белковой глобулы. По-видимому, стабилизациябелковой структуры дисульфидными связями объясняется прежде всего тем, что они,сохраняясь в денатурированном белке, резко сокращают число возможных конфи-гураций развернутой полипептидной цепи, понижая тем самым ее энтропию.

Как следствие, переход от такой развернутой цепи, содержащей дисуль-фидные связи, к нативной компактной структуре оказывается сопряженным сменьшей убылью конформационной энтропии и, следовательно, более выгодным,чем при отсутствии дисульфидных связей. Вероятно также, что сохранение в раз-вернутой цепи ковалентных дисульфидных связей между участками, которым над-лежит быть сближенными в нативной глобуле, облегчает поиск правильного путиобразования пространственной структуры, благоприятно сказывается на кинети-ке ренатурации белковой молекулы.

Очевидно, что оба эти фактора, способствующие ренатурации белковой гло-булы и препятствующие ее денатурации, могут действовать только после форми-рования пространственной структуры белка. Образование же дисульфидных свя-зей в ходе биосинтеза не предшествует :вертыванию полипептидной цепи в глобу-лу, а как бы сопутствует этому процессу, идет параллельно с ним.

При формировании белковой глобулы, вероятно, могут возникать фомежу-точные состояния, где некоторые дисульфидные связи «неправильны», т.е. обра-зованы не теми остатками цистеина, между которыми они устанавливаются в на-тивной структуре белка. Лишь на конечной стадии может происходить их «кор-ректировка».

Опыты по введению дополнительных дисульфидных связей в некоорые бел-ки методами белковой инженерии показали, что далеко не сегда это приводит кповышению стабильности белка.

В большинстве случаев трудно судить с достаточной определенногью, поче-му для стабилизации некоторых белков используются дисульфидные связи, тогдакак другие белки вполне устойчивы толька за счет нековалентных взаимодействий.По-видимому, дисульфидные связи важны для «кинетической» стабилизации (ус-тойчивости к внешним факторам) секреторных белков, функционирующих внеболее или. шенее постоянной внутриклеточной среды. Ясно, что дисульфидныемвяз», часто множественные, особенно важны для стабилизации маленьких бел-ков, в которых не может возникнуть обширной системы нековалентных взаимо-действий. Таковы, например, многие ингибиторы протеина», в частности панкреа-тический ингибитор трипсина. Его пептидная цепь, состоящая всего из 54 амино-кислотных остатков, так хорошо стабилизирована четырьмя дисульфидными свя-зями, что этот белок, несмотря на малые размеры, сохраняет компактную груше-видную форму при нагревании до 95 ° С.

Впрочем, эти соображения не могут рассматриваться как сколько-нибудьжесткие правила, так как нетрудно указать секреторные, а также небольшие бел-ки, не имеющие дисульфидных связей и тем .не менее вполне стабильные.

6.4. ФОРМА, КОМПАКТНОСТЬ И ДИНАМИКАМОЛЕКУЛЫ БЕЛКА

Геометрическая форма глобулярных белков в первом приближении можетбыть аппроксимирована эллипсоидом, вращения, у которого отношение полу-осей, как правило, не превышает 2:1. В то же время поверхность глобулярныхбелков никак нельзя считать гладкой: она как бы изрыта, содержит впадины; аиногда весьма глубокие щели. Такая изрытость существенна для функционирова-ния белка. Например, сорбция субстрата в достаточно хорошо сформированнойщели в глобуле фермента переводит реакцию с его участием в совершенно новуюсреду.Как следствие, субстрат изолируется от воды, дегидратируются его функ-циональные группы, процесс протекает в среде с диэлектрической постояннойоколо 4—5, тогда как диэлектрическая постоянная воды составляет 80.

Внутреннее гидрофобное ядро белков нередко описывали как «жир-ную каплю», уподобляя ее структуру гидрофобному ядру мицеллы мыла или дру-гого поверхностно-активного вещества. Хотя такое сравнение неплохо отражаетфизиче-скую сущность сил, диктующих погружение гидрофобных элементовбелка внутрь его глобулы, оно неточно. Боковые цепи гидрофобных аминокис-лот, образующие внутреннее ядро, не свободны, а достаточно плотно упакованы,приближаясь скорее к кристаллу, чем к жидкой капле. Это особенно справедливодля ядра, но свойственно и пространственной структуре белка в целом.

Анализ белковых кристаллов показывает, что плотность упаковки атомов вбелковой глобуле, т.е. отношение суммы ван-дер-ваальсовых объемов аминокислот-ных остатков к объему глобулы, лежит в пределах 0,72—0,77, что вполне сравнимо стипичным диапазоном плотности упаковки в кристаллах органических соединений0,68-0,80 и выше интервала 0,60—0,65, характерного для органических жидкостей.сепредставление о белковой глобуле как о квазикристаллическом образовании такжене вполне точно, поскольку для пространственной - структуры белка, включая ишготноупакованные ее участки, характерна определенная динамика. Системаводородных и других нековалентных связей в белке дойускает локальные флуктуа-ции, например частичное и обратимое «расстегивание» α-спиралей или β-структур. Очевидно, этим объясняется и большая подвижность аминокислотных ос-татков, расположенных на концах упорядоченных элементов вторичной структуры,по сравнению с «внутренними» остатками, перемещение которых потребовало бысерьезных нарушений кооперативной системы нековалентных взаимодействий. В со-четании с наличием небольших пустот все это позволяет молекулам малого размера,например воде, перемещаться внутри пространственной структуры, несмотря наотмеченную пдотность ее упаковки. Это делает возможным, в частности, обменатомов водорода скрытых внутри, глобулы «внутренних» пептидных связей с окру-жающей белок водой. Известны и функционально важные миграции молекул внут-ри белка.

Рис. 6.3. Динамика пептидного скелета в глутатион-редуктазеΒ-Фактор характеризует (в первом приближении) под-вижность аминокислотных остатков (их номера нанесенына оси абсцисс). Первые 17 аминокислот вообще нефиксированы. Пики соответствуют участкам с высокойподвижностью, минимумы - остаткам, вовлеченным в ка-талитический механизм и потому менее подвижным, в ча-стности Glu-47, Cys-58, Cys-63, Lys-66, Тут-197, Glu-201,Val-370, His-46

Понятно, что аминокислотные остатки, расположенные на поверхностибелка, еще более динамичны. Это особенно справедливо для длинных и, как пра-вило, хорошо гидратированных боковых цепей лизина. Они нередко оказывают-ся «невидимыми»при рентгенрструктурном анализе, так как образующие ихметиленовые группы по мере удаления от α-углеродного атома описывают окруж-ности все большего радиуса. Вследствие этого их электронная плотность оказыва-ется как бы «размазанной», распределенной в довольно большом, объеме. Прирентгеноструктурном анализе миоглобина боковая цепь остатка Lys-98, направлен-ная в раствор, прослеживается только до β-углеродного атома, тогда как в Lys-77, аминогруппа которого фиксирована солевой связью с остатком Glu-18, отчет-ливо выявляются все атомы углерода и азота. Нередко значительной подвижно-стью (до 10 А) обладают петли нерегулярной структуры на поверхности белка. Вцелом поверхностный слой белка характеризуется значительно большей подвиж-ностью, чем внутреннее ядро.

В то же время многие элементы структуры белков, содержащие компонен-ты каталитического центра или иные функционально важные остатки, нередкооказываются менее подвижными, чем наружные петли. Этим, видимо, обеспечива-ется точность их взаимодействия с субстратами и другими лигандами, что, конеч-

но, не отрицает возможности перемещений с небольшой амплитудой (рис. 6.3).Разумеется, известны и гораздо более значительные изменения про-

странственной структуры белка, индуцируемые теми или иными факторами кон-формационные перестройки, которым принадлежит немалая роль в функцио-нировании белковых молекул. Однако следует учитывать и описанную выше «мик-роскопическую» динамику пространственной структуры белка. Так, проникновениемолекулы кислорода к месту его связывания гемом в миоглобине не могло быпроизойти за разумные времена, поскольку доступ к этой точке белка закрытбоковыми цепями аминокислот. Лишь их флуктуации позволяют кислороду про-никать внутрь миоглобина и выходить наружу, видимо, за счет механизма, близ-кого к диффузионному (см. гл. 8). Более того, атомные флуктуации могут выпол-нять роль своего рода «смазки» при перемещениях крупных участков структуры,препятствуя их «залипанию», а также помогать «причаливанию», взаимной под-гонке поверхностей белковых глобул при образовании ими четвертичной структу-ры, формировании комплексов ферментов с субстратами и ингибиторами.

В табл. 6.3 обобщены данные о динамике, свойственной молекуле белка.

Таблица 6.3. Основные типы движений в белковой молекуле

Заметим, что источником первых двух типов движений могут быть тепло-вые колебания, тогда как движения третьего типа — крупные перестройки, — какправило, происходят за счет энергии взаимодействия белка с теми или инымилшандами. Необходимо подчеркнуть, что динамика структуры белка не толькоотражает физические особенности его организации, но и играет большую роль вего функционировании.

Для изучения динамических возможностей, заложенных в молекулах бел-ка и их отдельных участках, прибегают к методу молекулярно-динамического

Тип движения

Амплитуда, А

Время, с

Атомные флуктуации (несогласо -

0,01 - 1

-15 - 10-11

ванные перемещения отдельных ато - мов, например повороты на 20-60° вокруг простых связей пептидного скелета и боковых групп)

Коллективные (согласованные) пе-

0,01 - 5

10-25 - 10-3

ремещения групп атом ов (от несколь- ких до сотен) Индуцированные внешними факто-

0,5 - 10

10-9 – 103

рами (например, связыванием субст- рата) изменения конформации

моделирования. Используя распределение атомов в пространстве, полученное ме-тодом ренттеноструктурного анализа, приписывают атомам небольшие значенияскоростей, распределенные случайным образом, и рассчитывают положение ато-мов и скорости, которые они приобретут через очень короткий интервал времени— порядка 10-15 с. При этом учитывают взаимодействия каждого атома с его сосе-дями, используя мощные ЭВМ. Далее переходят к следующему интервалу време-ни и т.д. Затем изменяют набор скоростей, как бы переходя к более высокой тем-пературе, тогда как начальное распределение скоростей выбиралось близким тому,которое отвечало бы абсолютному нулю. Постепенное приближение к распреде-лению скоростей, свойственному температуре его реального функционирования,позволяет судить о динамических возможностях структуры в целом и его отдельныхфрагментов за времена порядка 10-10 с.

6.5. ОСОБЕННОСТИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА КАК ГЛАВНОГО ИСТОЧНИКА ИНФОРМАЦИИ

О ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЕ БЕЛКА

Рентгеноструктурный анализ кристаллов белков является доминирующимметодом определения их пространственной структуры. В последнее время разви-вается также изучение пространственного строения белков в растворах методомядерного магнитного резонанса (ЯМР), однако эти исследования, значение кото-рых нельзя переоценить, пока ограничиваются сравнительно небольшими белка-ми. Не вдаваясь в обсуждение техники рентгеноструктурного анализа, кратко рас-смотрим возможные его ограничения. Поскольку с помощью рентгенострук-турного анализа изучают строение белковой молекулы в кристалле, важнейшийвопрос состоит в том, насколько точно состояние этой молекулы в кристаллеотражает ее строение, а значит, и поведение в растворе, которое существен-но для ее биологической роли. Казалось бы, взаимодействия между белковымиглобулами, обязательно возникающие при кристаллизации, способны сильно ис-казить строение белка, что существенно уменьшило бы ценность метода. Однако,как показали многочисленные наблюдения, этого не происходит.

Такое заключение подтверждается, во-первых, тем, что данные о простран-ственной структуре белков в растворе, полученные методом ЯМР, согласуются срезультатами рентгеноструктурного анализа. Во-вторых, в кристаллах некоторыхферментов удалось наблюдать каталитическую активность, что указывает на со-хранение в кристалле конформации, присущей нативному белку. Более того, про-питывание кристаллов раствором субстрата (а чаще — его аналога), ставшее стан-дартным приемом кристаллографии белков, приводит к его связыванию в актив-ном центре. Это опять-таки указывает на сохранение нативной структуры в кри-сталле. В-третьих, для белков, в кристаллах которых содержатся по-разному ори-ентированные молекулы, последние, несмотря на различие в контактах с «соседя-ми», имеют практически идентичные пространственные структуры, если пренеб-

речь некоторыми, обычно небольшими, отличиями в положении функцио-наль-ных групп на поверхности контакта.

Заметим, что изменение конформации или отбор одной из нескольких кон-формации при кристаллизации небольших органических соединений — событияне столь уж необычные. Сохранение же конформации при кристаллизации бел-ков обусловлено особенностями строения белковых кристаллов. Последниеобяза-тельно содержат большой объем воды, буферных солей — растворителя, изкоторого велась кристалли зация. Доля растворителя в белковых кристаллах дос-тигает 50 % и - более к общему объему. Поэтому белковая молекула в кристалле,хотя и имеет целый ряд нековалентных контактов с соседними, остается как быпогруженной в ту же среду, где она находилась до кристаллизации. В частности,удается выявить слой из нескольких сотен молекул воды, непосредственно свя-занных с поверхностью белка и составляющих его гидратную оболочку. Таким об-разом, в силу своеобразия белковых кристаллов их образование не вызывает зна-чительных структурных изменений в белке и метод рентгеноструктурного анализадает, как правило, картину, правильно отражающую строение белковой молекулыв растворе.

Следует, однако, указать на весьма существенное ограничение, связанное с тем,что динамика белковой структуры в кристалле ограничена контактами с соседнимимолекулами. Это особенно верно для крупных структурных перестроек, поэтому не-обходимо иметь в виду известную тенденцию приуменьшать динамические возмож-ности белка, базируясь на результатах рентгеноструктурных исследований.

6.6. ДОМЕНЫ В БЕЛКАХ

Свойственный белкам способ организации пространственной структуры —формирование гидрофобного ядра и мозаичной поверхности, содержащей как гид-рофильные, так и гидрофобные элементы, — на первый взгляд, ограничивает раз-меры глобулы, поскольку с увели чением ее объема строго гидрофобное ядро будетсоставлять все меньшую долю. В какой-то мере это так, но ограничение затраги-вает лишь размеры данным способом организованной структуры, а не молекулы вцелом. Действительно, начиная примерно с молекулярной массы 14 — 16 кДа про-слеживается тенденция к формированию белковой молекулы из двух (и более) втой или иной степени независимо образованных глобул, каждая из которых имеетсвое гидрофобное ядро. Такие глобулы — домены — формируются различнымиотрезками одной и той же полипептидной цепи.

Доменами в белках называют области в третичной структуре, которым свой-ственна определенная автономия структурной организации. Автономия эта под-час столь значительна, что домены могут независимо от других частей белковоймолекулы поддерживать и даже формировать пространственную структуру. Вомногих случаях удается разделить домены, подвергнув белок ограниченному про-теолизу.

В рамках биологической функции данного белка домены нередко, хотя и невсегда, выполняют собственные задачи, и тогда структурная автономия доменадополняется функциональной. Например, нуклеотид связывающий домен де-гидрогеназ,имеющий независимо от конкретной функции того или иного фермен-та одинаковый способ укладки, полипептидной цепи, ответствен за взаимодей-ствие с одним из субстатов реакции — коферментом NAD или NADH. Аминокон-цевые домены (кринглы) ферментов системы свертывания крови обеспечиваютсвязывание с липидами мембраны и другими белками (рис. 6.4), аминоконце-вые домены иммуноглобулинов формируют центр связывания антигена.

Однако в ряде случаев для доменов нельзя указать отдельной функцио-нальной роли. Например, в структуре протеолитического фермента папаина хо-рошо различимы два домена, каждый из которых имеет гидрофобное ядро. В N-концевом домене оно содержит два остатка валина, два - изолейцина, один — лей-цина, в С-концевом — два остатка валина, два лейцина, пять — изолейцина, два— фенилаланина.

Рис. 6.4. Третичная структура одного издоменов протромбина

При активации этот домен - первый «кри-нгл» (остатки 66-144) - обеспечивает связы-вание протромбина с фосфолипидом. Изломы«ленты» соответствуют углеродным атомамаминокислотных остатков; зачернены дисуль-фидные связи. По-ввдимому, такова же третич-ная структура других «кринглов» - функцио-нально специализированных доменов в фер-ментах системы

гемостаза (в тромбине их два, в

плазминогене - пять)

Между доменами, соединенными непрерывной пептидной цепью, устанавли-вается ряд гидрофобных контактов. Во впадине, разделяющей домены, расположенкаталитический центр, причем образующие его функциональные группы размеще-ны в обоих доменах. Быть может, на ранних этапах эволюции папаина домены иимели какую-то функциональную автономию, но в современном ферменте она пол-ностью утрачена (рис. 6.5).

Чаще всего домены формируются автономным свертыванием последовательнорасположенных участков полипептидной цепи, хотя известны случаи, когда простран-ственная структура домена образована двумя далеко отстоящими друг от друга от-резками первичной структуры белка.

Наличие доменов, видимо, создает структурные предпосылки для большей,чем в рамках единой пространственной структуры, внутренней гибкости, динамикибелковых молекул, достигаемой смещением доменов относительно друг друга. Зоны,прилегающие к междоменному контакту, представляют собой в первом приближе-нии впадину, опоясывающую белок. Это облегчает размещение участков специфи-ческого связывания белком различных лигандов, дегидратацию последних.смеще-нием доменов относительно друг друга. Зоны, прилегающие к междоменномуконтакту, представляют собой в первом приближении впадину, опоясывающуюбелок. Это облегчает размещение участков специфического связывания белкомразличных лигандов, дегидратацию последних.

Рис. 6.5. Домены в структуре протеолитического фермента папайи - папаина

Прерывистыми линиями намечено направление впадины между двумя доменами, в ко-торой связывается субстрат и размещен каталитический центр. Пептидная цепь завер-шает построение N-концевого домена к 110-му остатку и начинает формирование С-концевого со 111-го. Взаимодействие между доменами усиливается тем, что участок 1-16 N-концевого домена контактирует с С-концевым доменом, а С-концевой фрагментпоследнего (остатки 208-212) - с N-концевым доменом. В каталитический центр вхо-дят остаток Cys-25 (в N-концевом домене), His-159 и Asn-175 (оба - в С-концевомдомене). Заштрихованными прямоугольниками обозначены дисульфидные связи

Предполагают, что домены соответствуют раннему этапу эволюции прос-транственной структуры многих белков,образовавшихся из глобул существен-но меньшего размера. Например, необычно маленькая протеиназа вирусаиммунодефицита человека (ВИЧ), пептидная цепь которой состоит всего лишь из99 аминокислотных остатков, по способу свертывания похожа на домены пепсина- протеиназы, действующей по сходному механизму. Поскольку протеиназа ВИЧактивна только как димер, можно думать, что она эволюционно родственна како-му-то древнему предшественнику доменов пепсина. Интересно, что границы до-менов часто соответствуют границам экзонрв. Это опять-таки позволяет предпо-лагать, что они могли выступать как своеобразные блоки в процессе эволюциибелков.

Домены составляют подуровень структурной организации белка на пути отвторичной к третичной структуре, и свертывание достаточно крупных белковыхглобул при биосинтезе белка проходит, вероятно, через стадию формирования до-менов.

6.7. ОБРАЗОВАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА ИЗ ЭЛЕМЕНТОВВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Укладка элементов вторичной структуры: α-спиралей, β-структурyых от-резков, β-изгибов — в третичной структуре подчиняется, по-видимому, опреде-ленным правилам.

Упаковка α -спиралей. Для поверхности α -спиралей характерно образованиегребней, разделенных впадинами — «канавками». Чаще всего такой гребеньобразуется боковыми радикалами аминокислот, которые разделены тремя амино-кислотными остатками — боковая цепь i-го остатка оказывается в контакте с бо-ковой цепью (i + 4)-го остатка, последняя — с боковой цепью (i + 8)-го остатка ит.д. Реже встречаются гребни, образованные i -, (i + 3)-, (i + 6)-м остатками. Вхож-дение гребня во впадину соседней α -спирали требует, чтобы угол между осямиспиралей был близок соответственно —50° для гребня типа i + 4 или 20° для типаi + 3. Это обеспечивает достаточно плотный контакт между боковыми цепями,наблюдаемый в реальных белках. Расстояние между осями контактирующихα-спиралей составляет 6,8 — 12 Аo в зависимости от длины боковых цепей (в сред-нем 9 А); среднее «захождение» боковых цепей друг за друга в контакте 2,3 А.Таким образом, при упаковке α-спиралей в пространственной структуре непосред-ственно взаимодействуют только концы боковых цепей аминокислотныхостатков.

Упаковка α-спирали и β-структуры. β-Слои в белках часто закручены. Боко-вые группы аминокислот, входящих в такую структуру, образуют гребни — i -йостаток взаимодействует с (i + 2)-м, тот с (i + 4)-м и т.д. Во впадину между двумя

такими гребнями может укладываться любой из описанных выше гребней α-спи-рали. Именно так сформировано около 90% реально наблюдаемых контактов a-спираль — β-структура, причем направления их осей параллельны.

Упаковка β -листов. Известны два типа взаимодействия β-листов. Один изних состоит в укладке одного листа поверх другого с поворотом на —30°, другой (такназываемая ортогональная упаковка) сводится к тому, что, по существу, непрерыв-ный β -слой перегибается и складывается сам на себя, причем угол между его отрез-ками приближается к 90°. Иногда такой способ укладки описывают как барабан илицилиндр. Поверхности b-складчатых листов, обеспечивающие контакт с другимиэлементами вторичной структуры, на 60—70% образованы гидрофобными боковы-ми цепями валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, аланина. Видимо, раз-ветвленные цепи особенно подходят для организации гидрофобных контактов.

6.8. ТОПОЛОГИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ В БЕЛКАХИ КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ

СТРУКТУР

Выше были рассмотрены различные способы установления некова-лентныхконтактов между элементами вторичной структуры. Существуют правила, ко-торым подчиняется укладка периодических элементов вторичной структуры впространственной структуре белков.

1. Элементы вторичной структуры, образованные соседними участками пеп-тидной цепи, обычно соседствуют и в пространственной структуре. Типичны сле-дующие соединения элементов вторичной структуры: αα — две антипараллельноупакованные α-спирали; ββ — два антипараллельных отрезка β-структуры; βαβ —α-спираль, окруженная двумя отрезками β-структуры. Такие структуры — едини-цы свертывания — являются, по существу, первым шагом от вторичной к третич-ной структуре, на их долю приходится до 2/

3 белковой глобулы.

2. Соединения между отрезками периодической вторичной структуры в еди-ницах свертывания типа βХβ, где Х — α-спираль или отрезок β-структуры, почтинеизменно являются «правыми», т.е. направлены по часовой стрелке, если смот-реть по ходу пептидной цепи,

3. Эти соединения не пересекаются и, не образуют узлов пептидной цепи.Физические основы этих правил не вполне ясны. Возможно, сближение в

пространственной структуре соседних элементов пептидной цепи объясняетсяэнтропийными факторами.

При всем многообразии пространственных структур белков удается выде-лить относительно небольшое число типов укладки полипептидной цепи, при-чем, к одному типу могут принадлежать белки, вовсе не имеющие эволюционно-го родства. Очевидно, что ограниченность набора типов пространственной струк-

туру диктуется существованием определенных правил, которые управляютсвертыванием полипептидной цепи в компактную глобулу.

Рис. 6.6. Третичная структура миоге- Рис. 6.7. Третичная структура суперок-мэритрина — белка, представляюще- сидцисмутазы— β-структурного белкагособой пучок четырех α-спиралей Восемь отрезков β-структуры соединены по- воротами или петлями, есть небольшой уча- сток α-спирали. Кружками показано распо- ложение ионов металлов

Выделены следующие главные типы пространственной структуры:1.α-Спиралъные белки, построенные преимущественно изα-спиралей. Про-

стейший структурный мотив в таких белках — пучок четырех α-спиралей, оси ко-торых более или менее параллельны. Именно такую структуру имеют миогемэ-ритрин (рис. 6.6), Н-субъединица ферритина. (Типично α-спиральными белкамиявляются глобины.

2. β-Белки, образованные преимущественно β-складчатыми слоями.В боль-шинстве таких белков b-слои наложены под небольшим углом или ортогональны.Примерами таких белков могут служить пепсин и другие аспартильные протеина-зы, супероксиддисмутаза (рис. 6.7), большое семейство белков—переносчиков мета-болитов (например, жирных кислот).

3. α /β-Белки, в которых α-спирали и отрезки β-структуры чередуются.Обычно это приводит к формированию центрального β-складчатого листа, окру-женного с обеих сторон α-спиралями, экранирующими его от воды. Этот тип прост-ранственной структуры очень распространен. К нему принадлежат NAD-связы-

вающие домены дегидрогеназ, триозофосфатизомераза (рис. 6.8) и около десяткадругих белков, структурно близких к этому ферменту.

4. (α +β)-Белки, в которых окщйрали и отрезки β-структуры не чередуют-ся, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретаетпространственную укладку чисто ◊-спирального типа (тип 1, см. выше), другая —чисто β-типа (тип 2), нередко с элементами (α /β)-структуры. К этому типу отно-сится лизоцим куриного яйца (рис.6.9).

Рис. 6.8. Третичная структура триозо- Рис. 6.9. Третичная структурафосфатизомеразы — типичного α /β лизоцима — α + β−белка

Характерно чередование восьми отрезков α-Спиральный и β-структурныйβ-структуры и восьми α-спиралей, экрани- домены (последний— в левой верх-рующих β-слой от воды ней части рисунка) отчетливо раз- делены

6.9. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Сказанное выше справедливо для глобулярных белков, функционирующихв водном окружении, — белков цитозоля и секреторных. Иные закономерностиуправляют формированием структуры мембранных белков, точнее, интеграль-ных белков, пронизывающих мембрану. Белки, локализованные на поверхностимембраны, содержат специализированный гидрофобный домен, выполняющийроль якоря, или иную гидрофобную структуру, например ковалентно связанный

липидный фрагмент, в остальном же их пространственное строение определяетсяобычными для всех белков правилами. Интегральные белки, включение которыхв мембрану происходит котрансляционно, видимо, вообще не могут удерживатьнативную структуру в чисто водном окружении. Они содержат несколько трансмем-бранных фрагментов, преимущественно образованных отрезками α-спиралей, со-держащих гидрофобные аминокислоты. Последние соединяются внемембраннымипетлями, направленными как в цитозоль, так и во внешнюю среду (рис. 6.10).

Рис. 6.10. Гипотетическая схема ориентации структурных элементовтрансмембранного белка— β

2-адренэргического рецептора в мембра-

не:А— мембрану (заштрихована) пронизывают семь α-спиральных участков,очень богатых гидрофобными аминокислотами. Петли, показанные в верхнейчасти рисунка, выступают во внеклеточное пространство и участвуют в свя-зывании эффектора, в нижней—направлены в цитозоль и обеспечивают взаи-модействие с G-белком, передающим сигнал. Зачернены остатки цистеина;Б - та же схема, рассматриваемая со стороны внеклеточного пространства; Sобозначает атомы серы цистеина или цистина. Сплошными линиями показа-ны внеклеточные участки полипептидной цепи, прерывистой—внутриклеточ-ные

Внешние петли в мембранных белках эукариот, как правило, сильно гликози-лированы, что усиливает их гидрофильность. Внутримембранные α-спирали мо-гут контактировать друг с другом, образуя пучки; однако внутреннего гидрофоб-ного ядра они не формируют. Отсутствует и фактор, вызывающий его образова-ние, — трансмембранныё участки белка контакта с водой не имеют. Тем большаяроль в поддержании единой структуры может принадлежать ван-дер-ваальсовымсилам (которые действуют между боковыми цепями аминокислот, образующихα-спирали), электростатическим взаимодействиям погруженных в неполярнуюсреду ионизованных групп и диполей, присущих α-спиралям. Определенную рольиогут играть и дисульфидные связи, соединяющие трансмембранные спирали. На-конец, внемембранные домены, формируя свою структуру по Обычным прави-лам, могут стабилизировать целостность третичной структуры этих белков, вы-полняя роль своеобразных организаторов. Трансмембранными могут быть и уча-стки β-структуры. Исследование строения трансмембранных белков, которымпринадлежат столь важные функции, как транспорт молекул внутрь клетки, меж-клеточные взаимодействия, образование ионных каналов и переда ча внешнихсигналов в клетку, весьма сложно. В отдельных случаях удается получить их крис-таллы, заменив их естественное окружение — липиды — синтетическим поверх-ностноактивным веществом. Дальнейшее изучение таких кристаллов идет обыч-ным путем. В более сложных ситуациях прибегают к ограниченному протеолизу,расщепляющему внемембранные участки полипептидной цепи, химической моди-фикации, направленной на эти же участки. Общую укладку элементов вторич-ной структуры удается наблюдать, используя электронный микроскоп.

6.10 ДЕНАТУРАЦИИ. БЕЛКА

Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной сфук-туры белка, т.е. нарушение, разупорядочение системы нековалентных взаимодей-ствий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация, как пра-виле, сопровождается утратой белком функциональных свойств, его инактиваци-ей. Однако инактивация сама по себе не может служить надежным критерием де-натурации. К денатурации не следует относить конформационные переходы в бел-ке, при которых одна кооперативная система нековалентных взаимодействий пе-рестраивается в другую. Принципиальная разница состоит в, том, что в этом слу-чае оба состояния упорядочены, тогда как характерным признаком денатурацииявляется именно утрата упорядоченности, которая приводит к возрастанию эн-тропии системы. Понятие «существенности» изменения пространственной струк-туры в приведенном выше определении денатурации не поддается количественнойоценке. Чаще всего приходится иметь дело с достаточно резким, скачкообразнымпереходом от нативного состояния к денатурированному, что

диктуется кооперативностью третичной структуры белка. Однако встречаются, по-видимому, и случаи, когда белок претерпевает частичную денатурацию, напримервследствие утраты пространственной организации одним из образующих его до-менов или нарушения системы нековалентных взаимодействий в каком-либо уча-стке супервторичной структуры.

Качественное рассмотрение показывает, йто денатурация белка может бытьвызвана действием ряда факторов. Так, повышение температуры приводит квозрастанию вклада энтропийного фактора, что обусловливает тепловую дена-турацию, происходящую, как правило, скачкообразно. Температура денатура-ции белков весьма различна и существенно зависит от других условий, например,многие белки заметно стабилизируются ионами кальция. Некоторые белки отли-чаются термостабильностью. Это особенно свойственно белкам термофиль-ныхорганизмов, адаптировавшихся к жизни при повышенных температурах. Напри-мер, протеолитический фермент, секретируемый термофильными бациллами, —термолизин — сохраняет активность до 80 °С.

Денатурации способствует воздействие на белок реагентов, нарушающихнековалентные взаимодействия, прежде всего систему водородных связей. Какуже отмечалось, стабильность пространственной структуры белка требует образо-вания не менее 90% возможных водородных связей внутри белковой глобулы.Понятно, что разрыв значительной их части вызовет кооперативный переход на-тивной структуры в денатурированное состояние. Чаще всего для денатурации белкаприменяют концентрированные (6-8 М) растворы мочевины. Молекула мочеви-ны как бы имитирует пептидную связь и способна выступать и как донор, и какакцептор водородных связей, конкурируя с пептидными группировками и други-ми функциональными группами белка, образующими в нативной структуре внут-римолекулярные водородные связи:

Денатурация белка при увеличении содержания мочевины в растворе проис-ходит скачком, как правило, в небольшом интервале ее концентрации. Напри-мер, денатурация лизоцима наблюдается при переходе от 3,2 к 4,0 М растворумочевины. Заметим, что. денатурирующее действие высоких концентраций мо-чевины может быть связано и с нарушением структуры воды опять-таки за счетобразования ею водородных связей с молекулами мочевины. Это должно привес-ти к резкому ослаблению стабилизирующей роли гидрофобных контактов.

Еще более сильным денатурирующим агентом является солянокислый гуа-нидин (обычно 6 М раствор)

B этом случае действуют те же факторы, что и при использовании мочеви-ны: конкуренция с пептидными и функциональными группами белка за водо-родные связи и нарушение структуры воды. В дополнение к ним сказывается иочень высокая ионная сила — гуанидин является очень сильным основанием ипрактически всегда полностью протонирован, поэтому в концентрированных егорастворах исключаются внутрибелковые электростатические взаимодействия и,следовательно, устраняется еще один из факторов, способных стабилизироватьпространственную структуру.

Денатурирующим действием на белки обладают и органические раство-рители. Они способны устанавливать контакты с гидрофобными аминокислот-ными остатками белка, лишая гидрофобное ядро его стабилизирующей роли.Одновременно многие растворители, например спирты, формамид, муравьинаякислота, как бы переключают на себя водородные связи, поддерживающие тре-тичную структуру. С дальнейшим повышением концентрации растворителя мо-жет нарушиться и структура воды, что устранит фактор, от которого зависитформирование внутримолекулярных гидрофобных контактов в белковой глобуле.

Денатурирующее действие органических растворителей весьма индивиду-ально и зависит от природы растворителя, белка, других условий (например, тем-пературы). Учет этих факторов позволяет в ряде случаев избежать Денатурации иприменять органические растворители при фракционировании белков, их хрома-тографии, а иногда и проводить реакции с участием ферментов в органическихрастворителях. В таких случаях, по-видимому, важно, чтобы белок сохранял темолекулы воды, которые связаны водородными связями с функциональными груп-пами на его поверхности, т.е. гидратную оболочку. Известны и белки, легко пере-носящие высокие концентрации органических растворителей.

Эффективными денатурирующими агентами являются ионные детерген-ты, среди которых особенно часто используют анионный детергент — додецил-сулъфат натрия:

Его длинная гидрофобная цепь образует контакты с гидрофобными остат-ками белка, что при концентрации детергента около 0,5 мМ приводит к полномуразвертыванию третичной структуры. Взаимное отталкивание практически все-гда отрицательно заряженных сульфатных групп влечет за собой вытягивание ком-плекса додецилсульфат — белок в палочковидную структуру, несущую столь боль-шое число отрицательных зарядов додециясульфата, что вклад собственных ион-ных групп белка оказывается, как правило (но не всегда!), малосущественным.Такой способ денатурации нашел широкое применение при элёктрофоретическихисследованиях белков в полйакриламидном геле.

Как и при действии других денатурирующих агентов, развертывание белкав присутствии додецилсульфата происходит скачкообразно. Например, бактери-альная рибонуклеаза — барназа — при 0,65 мМ детергента и 37 °C связывает сразу14 молекул додецилсульфата на одну молекулу белка, состоящую из 110 амино-кислотных остатков. При меньших концентрациях реагента белок сохраняет ста-бильность и комплекса с детергентом практически не образует.

Подвижность отрицательно заряженных комплексов додецилсульфат — бе-лок в силу примерно одинаковой плотности заряда (как правило, связываетсяпрактически постоянное количество додецилсульфата: примерно 0,4 г на 1 г бел-ка), а также одинаковой (палочковидной) формы комплексов определяется толь-ко длиной, полипептидной цепи. Это сделало электрофорез в присутствиидодецилсульфата наиболее распространенным способом определения молекуляр-ной массы полипептидных цепей. Сказанное справедливо, если в белке нет дисуль-фидных связей, которые не позволят цепи развернуться в линейную структуру.Ввиду этого денатурацию до децил сульфатом натрия обычно дополняют восста-новлением дисульфидных связей меркаптоэтанолом или дитиоэритритом. Ино-гда обработку детергентом ведут при 100 °C добавляя в смесь концентрированнуюмочевину, с тем чтобы эбеспечить наиболее полную денатурацию белка.

Денатурация белка может происходить и при экстремальных значениях рН.Так, в сильно кислых растворах полностью протонируются рицательно заряжен-ные карбоксильные группы остатков глутаминовой аспарагиновой кислот. Этоприводит к тому, что на поверхности белка— сохраняются только положительныезаряды катионных групп, рваимное отталкивание которых приводит к разверты-ванию глобулы, повременно протоны разрывают ряд водородных связей. В ще-лоч-растворах (при рН 11 и выше) утрачивают положительные заряды аминогруппылизина и приобретают отрицательные — фенольные руппы тирозина, что опять-таки ведет к резкому преобладанию отрицательных зарядов и развертыванию

глобулы. Этому же способствует разрыв ряда водородных связей, в том числе об-разованных водородом фенольных групп тирозина. Известны, однако, белки, адап-тированные, например, к высокой кислотности. Так, пепсин сохраняетсвою структуру и активность при рН 1—2. Этому, видимо, благоприятствует поч-ти полное отсутствие катионных групп в этом белке.

Установить полноту денатурации, т.е. полное исчезновение системы неко-валентных взаимодействий, свойственных нативной структуре, довольнотрудно. Обычно ограничиваются тем, что наблюдают за «изменениемкакого-либо характерного для пространственной структуры белка физическогопараметра, например дисперсии оптического вращения или спектра флуорес-ценции, при углублении условий денатурации — повышении концентрации мо-чевины, росте температуры и т.п. Полагают, что денатурация завершилась, еслинаблюдаемый параметр достигает некоторого предельного значения, напри-мер если спектр флуоресценции перестает изменяться, достигнув формы, харак-терной для белка, в котором все остатки триптофана и тирозина равно доступнырастворителю. Разумеется, это не дает полной гарантии исчезновения всехнековалентных контактов, однако можно надеяться на отсутствие протяженныхэлементов третичной структуры, сохраняющих кооперативйость.

Денатурация белка нередко осложняется повреждением его ковалентнойструктуры. Так, продолжительное действие мочевины при повышенной температуреможет сопровождаться карбамилированием аминогрупп лизина:

(В действительности реакция, видимо, протекает с участием циановойкислоты HNCO, находящейся в равновесии с мочевиной.)

Довольно часто наблюдается гидролиз амидных групп аспарагина и глута-мина (дезамидирование), в особенности если в белке есть последовательностьAsn—Gly. К целому ряду повреждений, в том числе к расщеплению остатков цис-тина с образованием дегидроаланина, ведет щелочная обработка белков. Все этифакторы следует контролировать, что становится критически важным, если оесостояние.

6.11. РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА

Денатурацию белка в определенных условиях in vitro удается обратить, пе-рейдя от развернутой полипептидной цепи к компактной глобуле, имеющей вполнеопределенную пространственную структуру. Этот процесс, называемый ренатура-цией, моделирует, хотя и не в полной мере, свертывание полипептидной цепи вглобулу в ходе трансляции при биосинтезе белка.

Как известно, пространственная структура белка определяется егопервичной структурой. Известное соотношение один ген — один белок в сущно-сти эквивалентно утверждению, что генетически детерминированнойпоследовательности аминокислот достаточно для тою, чтобы однозначнопредопределить ее свертывание в свойственную тому или иному белку тре-тичную структуру. Разумеется, в общем случае такое заключение справедливолишь для условий, близких к существующим в данной клетке при биосинтезе дан-ного белка, которые могут включать в себя определенный диапазон рН, присутст-вие некоторых ионов, например ионов кальция, а также кофакторов, присущихэтому белку, например коферментов, тема и т.п.

При соблюдении указанных условий будет достигнуто рассмотренное вышесоотношение факторов, от которого зависит стабильность белковой глобулы, т.е.создадутся термодинамические предпосылки формирования нативной структуры— ренатурации белка.

Это положение было подтверждено успешными опытами по ренатурации бел-ков in vitro, проведенными впервые К. Анфинсёном и сотрудниками в 60-х годах, напанкреатической рибонуклеазе и лизоциме, а затем и на ряде других объектов.

Многие белки, в том числе обладающие внутримолекулярными дисульфид-ными связями, полностью денатурируют в присутствии высоких концентрациймочевины или солянокислого гуанидина с одновременным расщеплением дисуль-фидных связей восстанавливающими агентами (меркаптоэтанолом, меркап-тоуксусной кислотой или тиоэритритом). Это, естественно, сопровождается ихполной инактивацией.

При медленном удалении денатурирующего агента и восстановителя (напри-мер, диализом или гель-фильтрацией) происходят формирование нативной струк-туры, замыкание дисульфидных связей (для чго часто достаточно окисления ки-слородом воздуха) и полное восстановление активности белка. В специальныхопытах была подтверждена правильность образования дисульфидных связей, чтосвидетельствует, в дополнение к реактивации, о восстановлении нативной струк-туры. На примере одного из белков — лизоцима — этот вывод был прямо под-твержден методом рентгеноструктурного анализа. Табл. 6.4 иллюстрируетэффективность ренатурации ряда белков.

Может показаться, что вывод о предопределенности пространственнойструктуры последовательностью аминокислот, подтверждаемый указанными вышеопытами, не вполне строг. Дело в том, что экспериментальное доказательство пол-ноты разрушения всех нековалентных взаимодействий при денатурации белка за-труднено, поэтому нельзя исключить сохранения какой-то части ядра нативнойструктуры. Этот довод опровергается, однако, тем, что целый ряд (правда, не-больших) белков удалось получить химическим синтезом их полипептидных це-пей из производных аминокислот. Такие пептидные цепи неизменно давали приренатурации хороший выход активного (и, значит, нативного) белка (см. гл. 2).

Таблица 6.4. Ренатурация белков, денатурированных обработкой8 М мочевиной или 6 М солянокислым гуанидином с одновременным восстановлени-

ем дисульфидных связей

*Теоретический выход рассчитан в предположении, что дисульфидные связи образу-ются случайно.

**α-Амилаза Aspergil lus oryzae.

Несмотря на успешное образование нативной структуры, ренатурация бел-ков in vitro протекает весьма медленно, что не соответствует высокой скоростисвертывания третичной структуры в физиологических условиях. По-видимому,наиболее существенна трудность выбора оптимального, кинетически выгодногопути перехода от развернутой полипептидной цепи к компактной пространствен-ной структуре. Число всех возможных способов свертывания достаточно длиннойполипептидной цепи настолько велико (среди них окажется множество непро-дуктивных, тупиковых), что переход к правильной структуре простым переборомразличных конформаций потребовал бы огромного времени.

Реальное свертывание белка, очевидно, происходит по одному, во всякомслучае немногим путям, что резко сокращает время формирования нативнойструктуры. Свертывание полипептидной цепи in vivo по необходимости синхро-низировано с ее биосинтезом, что уже открывает возможность выбора определен-ного пути, так как формирование пространственной структуры может происхо-дить котрансляционно. Более того, при свертывании белка в физиологических ус-ловиях может быть существенной та конформация, в которой полипептидная цепьпокидает пептидилтрансферазный центр рибосомы, и даже темп образования цепи— есть данные о задержках трансляции на участках цепи, являющихся границамимежду элементами вторичной структуры.

Понятно, что при ренатурации белка in vitro оба указанных фактора рабо-тать не могут и она (хотя и в этом случае протекает не случайным образом, а поограниченному числу путей) требует для поиска этих путей гораздо более значи-тельного времени, чем in vivo.

Выход, %

Белок

Молекуляр - ная масса,

Число S - S связей

теорети - ческий*

достиг- нутый

Рибонуклеаза

18 000 4

Лизоцим 12 000 4 1 50-80 Такаамилаза* * 40 000 4 + SH 0,3 48 Трипсиноген

25 000 4

60 Пепсиноген 38 000 3 6,7 50

Сывороточный альбумин 65 000 17 - 50

Существование определенного пути свертывания полипептидной цепи,считавшееся до недавнего времени весьма вероятной гипотезой, поддерживает рядэкспериментальных фактов. Так, дисульфидные связи в панкреатическом инги-биторе трипсина и рибонуклеазе замыкаются в определенном порядке, причем необязательно сразу происходит образование «правильных» связей, т.е. тех, которыесуществуют в конечной форме — нативном белке. Иногда наблюдается времен-ное образование дисульфидной связи между остатками цистеина, которые, види-мо, сближаются в промежуточном соединении. Впоследствии такая дисульфиднаясвязь вступает в реакцию обмена с другими, еще не окисленными остатками цис-теина и расщепляется, уступая место связям, характерным для нативной конфор-маций.

Применение метода направленного мутагенеза (белковой инженерии) по-казало, что наряду с аминокислотными остатками, критически важными для фор-мирования устойчивой пространнной структуры белка встречаются и такие,замена которых иными не сказывается на стабильности белковой глобулы, но серьезновлияет на кинетику свертывания полидтидной цепи. Следовательно, эти ами-нокислотные остатки важны для возникновения промежуточных структур напути к нативной, устойчивой глобуле.

Так, при свертывании α-субъединицы триптофансинтетазы (рис. 6.11) на-блюдается промежуточная ступень, на которой крупный N-концевой домен (со-держащий аминокислотные остатки 1-188 и образованный шестью отрезками па-раллельной β-структуры и пятью α-спиралями) уже свернут, тогда как С-конце-вой фрагмент (начинающийся со 189-го остатка и формирующий в нативном бел-ке два отрезка β-структуры и три омщирали; всего 80 аминокислотных остатков)еще денатурирован, неупорядочен. Заметим, что в этом белке нет пространствен-но отграниченных доменов — его структура достаточно компактна, речь идет одоменах как промежуточных формах свертывания α-субъединицы.

Рис. 6.11. Тритичная структураα-субъединицы триптофансин-тетазыОбразована, как и триозофосфати-зомера, чередующимися α-спира-лями (цилиндры) и отрезками β-структуры (стрелки). Маленьки-ми кружками в центре показаноместо связывания ингибито-ра.Стрелкой обозначена границамежду N- и С-концевыми домена-ми, в этом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипси-ном, который приводит к разделе-нию доменов.Номера указываютпорядок расположения элементоввторичной структуры

Среди мутантов этого фермента были отобраны такие, которые затрагива-ют контакты между N- и С-концевым доменами. Phe-22 N-концевого домена,контактирующий с 8-м β-структурным отрезком в С-концевом домене, был за-менен на Leu. При этом замедлились скорости :денатурации и ренатурации, но небыла затронута стабильность белка. Очевидно, что это обусловлено понижениемстабильности переходного состояния при свертывании. Замена Gly-234 в С-кон-цевом домене на аспарагиновую кислоту замедлила развертывание в большей мере,чем свертывание. Поскольку первый и восьмой β-структурные отрезки, в кото-рые включены соответственно фенилаланин и глицин сближены в третичной струк-туре свернутой субъединицы, их взаимное «причаливание» играет, по-видимому,важную роль, в формировании промежуточного продукта свертывания, ускоряяпроцесс ренатурации.

Исследование кинетики ренатурации ряда белков позволяет в первом при-ближении так описать этот процесс. Сначала быстро образуются короткие отрез-ки вторичной структуры — α-спирали, β-листы, β-изгибы. Понятно, что каждыйтакой участок сам по себе, до образования компактной глобулы, недостаточно ста-билен, поэтому соответствующие элементы вторичной структуры то возникают,то распадаются, «мерцают» (рис. 6.12).

Затем такие участки относительно организованной структуры, Ставляющиев совокупности фрагмент полипептидной цепи из —150 аминокислот (будущийдомен белка), как бы «схлопываются» счет нековалентных взаимодействий. Приэтом образуется так называемая расплавленная глобула, которая в целом близка кнативной юстранственной структуре и отличается от нее меньшей компактнотьюи иным размещением боковы цепей аминокислотных остатков, лее происходитуточнение структуры на уровне доменов, после чего станавливается контакт меж-ду последними. Этими относительно ведленно протекающими стадиями завер-шается формирование белковой глобулы, и она приобретает активность.

В свете обсужденных данных о ренатурации белков in vitro очевидно, чтосвертывание белка, предопределенное его первичной структурой, может быть вомногих случаях воспроизведено с достаточно орошим выходом. Помимо рас-смотренных выше кинетических ограничений следует учитывать и то, что in vivoпространственная структура в норме формируется каждой вновь синтезируе-мой молекулой в отдельности без накопления развернутых, денатурированныхструктур.

Роль последнего фактора стала особенно очевидной при сверхсинтезе чуже-родных белков в микробных клетках. В таких системах нередко наблюдается на-копление внутри клеток-продуцентов так называемых тел включения, которыепредставляют собой агрегаты денатурированных пептидных цепей. Если белоксодержит дисульфидные связи, в таком агрегате они образуются беспорядочно вомногих случаях межмолекулярно. Возникновение агрегатов можно объяснить тем,что при интенсивно протекающем сверхсинтезе одновременно на многих

рибосомах образуются лишенные структуры пептидные цепи, появление которыхзначительно опережает процесс свертывания. Как следствие, молекула не успева-ет «перебрать» промежуточные конформации и найти путь свертывания. Вместоэтого она агрегирует с соседними, также еще не свернутыми полипептиднымицепями.

Рис. 6.12. Конформационные состояния фрагмента 69-87, соответствующего С-концевой α-спирали миогемэритрина (по данным ЯМР):

а - набор неустойчивых конформаций, которые пептид принимает в воде; б - пре-имущественная конформация пептида в менее полярной среде (смесь вода - трифторэта-нол), при которой С-концевая часть образует α-спираль; в - конформация пептида в ком-пактной структуре миогемэритрина - α-спираль охватывает арю последовательность; циф-рами обозначены номера остатков в пептиде а и б и соответствующем фрагменте миогемэ-ритрина (в)

Как правило, отделение тел включения от других компонентов клетки про-ходит без затруднений, что облегчает их очистку. Однако в дальнейшем возникаетнепростая проблема ренатурации полученного белка, для которой во многих слу-чаях так и не удается отыскать удовлетворительное решение. Обычный прием со-стоит в том, что агрегированный белок сначала переводят в раствор и добиваютсяполного разрушения агрегатов, применяя концентрированные мочевину или со-лянокислый гуанидин в присутствии соединений, восстанавливающих дисуль-фидные связи (например, меркаптоэтанола). Затем прибегают к более или менееплавному удалению денатурирующего реагента и восстановителя, создавая усло-вия постепенной ренатурации белка, причем поддерживают низкую концентра-цию последнего. Для образования дисульфидных связей применяют мягко дейст-вующую окислительно-восстановительную систему, например смесь 10 мМ окис-ленного и 1 мМ восстановленного слутатиона. В ряде случаев такой прием даетхорошие результаты: так, практически количественно проходит ренатурация ин-терлейкина-2, полипептидная цепь которого состоит из 133 аминокислот и со-держит одну дисульфидную связь и один «непарный» остаток цистеина.

Ренатурация мембранных белков представляет собой отдельную задачу.Трансмембранный белок — бактериородопсин — после его экстракции из мембра-ны и хроматографической очистки в смеси органических растворителей удалосьренатурировать, поместив в смесь фосфолипида и поверхностно-активного соеди-нения. Очевидно, что и в этом случае самосборка белка в присутствии липидаприводит от денатурированной молекулы к структуре, свернутой так же, как на-тивный белок.

Таким образом, ренатурация белка принципиально возможна и во многихслучаях практически осуществима, однако ряд препятствий, преимущественнокинетических, может серьезно затруднить, а иногда полностью остановить этотпроцесс. Необходимо подчеркнуть, что способность полипептидной цепи белкасамопроизвольно образовывать пространственную структуру еще не означает, чтов реальных условиях биосинтеза этот процесс протекает без участия внешнихфакторов, в том числе ряда белков, выступающих как катализаторы свертыва-ния полипептидной цепи.

Одной из причин замедленного формирования пространственной структу-ры белка in vivo могла быть задержка в образовании дисульфидных связей. Суще-ствует так называемый перегруппировывающий фермент — протеиндисулъфиди-зомераза, — ускоряющий перебор возможных дисульфидных связей и тем самымпоиск правильно образованных. В его присутствии ренатурация протекает гораздобыстрее. Так, 70%-ная ренатурация панкреатической рибонуклеазы при действийэтого фермента, выделенного из печени, происходит уже за 30 мин, тогда как спон-танная реактивация за это время так мала, что еще не обнаруживается.

Протеиндисульфидизомераза в эукариотических клетках содержится в эн-доплазматическом ретикулуме и является димерным белком, каждая из субъеди-

ниц которого содержит два домена, структурно близких тиоредоксину, небольшо-му белку, участвующему в окислительно-восстановительных процессах. Каждыйиз этих доменов, видимо, и содержит каталитический центр, в котором имеетсягруппировка из двух остатков цистеина (восстановленная форма), способных рас-цеплять дисульфидную связь в белке-субстрате, образуя за этот счет собственнуюдисульфидную связь (окисленная форма). В свою очередь, окисленная форма про-теиндисульфидизомеразы, реагируя со вободными SH-группами цистеина в суб-страте, вызывает образование в этом белке дисульфидной связи, чем и обуслов-лен быстрый перебор в нем всех возможных дисульфидных мостиков:

Видимо, такую же роль может играть и сам тиоредоксин, причем in vivoкатализируемый этими ферментами дисульфидный обмен сочетается с образо-ванием все большего числа дисульфидных связей в белке-субстрате за счетдействия системы восстановленный глутатион - окисленный глутатион по схеме

В ряде случаев медленной стадией, лимитирующей скорость ренатурациибелка, оказывается цис,транс-изомеризация отдельных пептидных связей, пре-жде всего образованных иминогруппой пролина. Как уже отмечалось при обсуж-дении вторичной структуры (см. гл. 5), разница в энергии таких цис- и транс-пептидных связей невелика, поэтому переход одного изомера в другой при дена-турации белка вполне вероятен. Обратный переход из цис-формы, как правило,неблагоприятной для свертывания, в трансформу — ту, в которой и существуетподавляющее большинство пептидных связей в белке, также требует определен-ной энергии активации. Ввиду этого молекула, еще не завершившая образованиепространственной структуры, вынуждена как бы «дожидаться» благоприятнойизомеризации пептидной связи пролина.

Существует весьма распространенный фермент — пролил-цис,транс- изо-мераза (в эукариотических клетках это циклофилин, способный специфическисвязывать антибиотик — иммунодепрессант циклоспорин). Он катализирует цис,транс-изомеризацию пептидных связей пролина и тем ускоряет свертывание цепив компактную структуру.

Заметим, что два упомянутые фермента, катализирующие ренатурациюбелка, все же далеко не обеспечивают тех скоростей свертывания полипептиднойцепи, которые соответствовали бы скорости трансляции. Установлено, что приформировании пространственной структуры белка in vivo полипептидная цепь непредоставлена сама себе, а взаимодействует с целым рядом специализированныхбелков, получивших название шаперонов, функция которых — обеспечить бы-строе нахождение правильной пространственной структуры.

Известен ряд семейств шаперонов, которых особенно много среди так на-зываемых белков теплового шока. Последние названы так, потому что они син-тезируются клетками в больших количествах в ответ на воздействия, небла-гоприятные для эффективного свертывания третичной структуры белков, в част-ности на повышение температуры. Однако они образуются и действуют и в нор-мальных условиях.

Одно из семейств шаперонов составляют так называемые стресс-белки 70эукариотических клеток, имеющие молекулярную массу около 70 кДа. Они обра-зуют комплексы с еще не завершившими свертывание полипептидными цепями,предотвращая их взаимодействие между собой и нежелательную агрега-цию. Этибелки состоят из двух взаимодействующих между собой доменов. Один из доме-нов образует комплекс с участками развернутой полипептидной цепи, другой — свя-зывает АТР и способен расщеплять его, являясь медленно действующей АТРазой.При гидролизе АТР белок переходит в другое конформационное состояние и егокомплекс с полипептидной цепью распадается.

Полипептидные цепи белков, которые подлежат транспорту из цитоплаз-мы, за счет образования комплексов со стресс-белками 70 удерживаются в развер-нутом, наиболее приспособленном для переноса через мембрану состоянии.Продолжительность жизни таких комплексов задается, по-видимому, временем,требующимся для внутримолекулярного гидролиза АТР, связанного стресс-бел-ками 70 (ср. гл. 12). Пока не ясно, катализируют ли эти белки непосредственносамо образование вторичной или третичной структуры. Не исключено, что их зольограничивается предотвращением нежелательных для этого процecca межмолеку-лярных взаимодействий, агрегации еще не свернутых юлипептидных цепей.

Еще одну группу широко распространенных белков, вовлеченных в фор-мирование третичной структуры, составляют так называемые шаперонины — бел-ки, кодируемые генами GroEL и GroES у E.coli. Белки GroEL образованы субъе-диницами с молекулярной массой около 60 кДа, которые формируют своеобраз-ную четвертичную структуру, построенную из двух лежащих одно на другом колец по

семь субъединиц в каждом. Предполагают, что частично свернутая полипептид-ная шь располагается на поверхности такого кольца. Отдельные ее участий, свя-занные субъединицами шаперонина с различной прочностью, могут высвобож-даться из комплекса и формировать свойственную им горичную структуру, не встре-чая помех со стороны соседних участков ли других полипептидных цепей, удержи-ваемых в связанном состоянии. В таких условиях формирование регулярных эле-ментов вторич-ой структуры происходит как бы поочередно. По завершении это-го юцесса комплекс распадается, что зависит, как и в рассмотренном выше случае,от расщепления АТР, связанного GroEL-белком. Белки BroES с молекулярноймассой 10 кДа ассоциируют с белком GroEL и каким-то образом регулируют егоАТРазную активность и, значит, Время жизни комплекса.

6.12. О СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРАМИ

БЕЛКА

Положение о том, что последовательность аминокислотных остат-ков полипептидной цепи белка несет в себе всю информацию, необходимую идостаточную для формирования однозначной пространственной структуры,относится к числу фундаментальных принципов молекулярной биологии. Грани-цы приложимости этого принципа и некоторые особенности его реализации тре-буют комментариев.

Прежде всего этот принцип еще не означает, что любая случайно заданнаяпоследовательность аминокислот обязательно даст устойчивую компактную струк-туру — ведь богатый экспериментальный материал, который обобщен в этом по-ложении, относится к эволюционно отобранным первичным структурам, а не кслучайным последовательностям аминокислотных остатков. Пока, видимо, труд-но дать решение этой проблемы в общем виде, она все еще остается дискуссион-ной. Распространено мнение, что однозначное соотношение между последователь-ностью аминокислот и пространственной структурой является уникальным свой-ством относительно небольшой доли всех возможных первичных структур — именнотех, которые были отобраны в ходе эволюции белков.

Согласно иной точке зрения, круг последовательностей, способных к свер-тыванию в компактную глобулу, гораздо шире. Очевидно лишь, что таким свой-ством обладает далеко не любая последовательность аминокислот. Так, фраг-мент 1—126 нуклеазы стафилококков (белка, содержащего 149 аминокис-лотных остатков в пептидной цепи) не образует сколько-нибудь устойчивойпространственной структуры, хотя по размеру он вполне сравним с множествомнебольших белков. Панкреатическая рибонуклеаза (содержит 124 аминокислот-ных остатка в полипептидной цепи) после отщепления четырех остатков с карбок-

сильного конца утрачивает способность к ренатурации. По-видимому, не являет-ся компактным, хотя и содержит элементы вторичной структуры, β-казеин. Из-вестно немало мутантов природных белков, в которых одна аминокислотная за-мена полностью дестабилизирует структуру. Следовательно, существуют полипеп-тидные цепи, не способные в обычных условиях свернуться в компактную одно-значную пространственную структуру.

Однако тенденция к образованию более или менее компактной, пусть ещенесовершенной, пространственной структуры присуща, по-видимому, достаточ-но широкому набору последовательностей аминокислот.

В то же время нет полной уверенности, что данной последовательностиаминокислот обязательно соответствует одна и только одна пространственнаяструктура, единственный минимум свободной энергии. Иными словами, вопроссводится к возможности существования двух (или более) альтернативных простран-ственных структур для одной и той же последовательности аминокислот. В боль-шинстве изученных случаев ренатурация приводит к восстановлению нативнойструктуры белка; имеются лишь указания на возможность образования третичнойструктуры, отличающейся от нативной, при ренатурации яичного альбумина. Еслипоследний факт и верен, то он выглядит исключением.

Учитывая это, следует полагать, что для полипептидных цепей существую-щих в природе белков соответствие первичная структура — пространственная струк-тура в подавляющем большинстве случаев, действительно, однозначно. Это, разу-меется, не означает, что тот или иной белок не может под воздействием внешнихфакторов, например образования комплекса с каким-либо лигандом, приниматьразличные конформации. Такая ситуация вполне реальна, более того, типична.Обсуждается иное — возможно ли, чтобы в одинаковых условиях белок мог обра-зовывать две пространственно различные формы.

Необходимо иметь в виду и еще одну особенность соотношения между пер-вичной и третичной структурами белка. Если данной последовательности амино-кислот отвечает, как правило, единственный способ свертывания в пространстве,единственная третичная структура белка, то обратное положение неверно. Данномуспособу, свертывания полипептидной цепи соответствует, как показывает опыт, неодна а целое семейство последовательностей аминокислот. Иными словами, спра-ведливо соотношение

Семейство первичных структур Пространственная структура

Очевидно, что должны существовать определенные закономерности, {пра-вила, своего рода стереохимический код, управляющий формированием про-странственной структуры из данной последовательности аминокислот. Раскры-тие этого кода — важнейшая задача физической химии белка, решениекоторой еще не достигнуто, несмотря на наличие ряда интересных подходов.

Тем не менее некоторые особенности стереохимического кода могут бытьобсуждены. Прежде всего он вырожден, т.е. одной третичной структуре, одномуспособу укладки пептидной цепи отвечает, как уже отмечалось, набор последо-вательностей аминокислот. Так, весьма близкую пространственную структуру име-ют глобины

1 — содержащие тем белки, связывающие кислород, в том числе гемо-глобины и миоглобины различных видов животных, легглобин растений и т.д. Этипептидные цепи, отличающиеся составом и последовательностью аминокислот,состоят примерно из 140—150 остатков (см. гл. 8).

Поскольку все они дают при свертывании однотипную пространственнуюукладку полипептидной цепи, отличающуюся лишь в деталях, очевидно, что да-леко не все аминокислотные остатки в равной мере ответственны за образованиетретичной структуры. Такое заключение подтверждается многими эксперимента-ми по направленной замене аминокислотных остатков в отдельных позицияхполипептидной цепи методом сайт-специфического мутагенеза. Так, замена ос-татка Pro-86 в лизоциме фага Т4 на Gly, Ser, Cys, Leu, Asp, Arg и His влекла засобой небольшие по величине, хотя и простирающиеся иногда на 20 А измененияв структуре. Тем не менее все эти мутантные белки почти не отличались от исход-ного по температурной стабильности и сохраняли в целом тот же способ уклад-ки полипептидной цепи в пространстве.

Интересно, что гораздо значительнее изменилась их ферментативная ак-тивность, несмотря на то что точка замены отстоит на 24 А от каталитическогоцентра. Впрочем, нередки и такие случаи, когда замена единственного остаткарезко влияет на стабильность белка. Показано, например, что замена в аденилат-киназе E.coli Ser-87 на Рrо снижает содержание α-спиралей с 50 до 39% и делаетструктуру белка неустойчивой при 40°С, что приводит in vivo к глубокому проте-олитическому расщеплению и полной утрате фермента.

Можно было бы думать, что существует определенное число аминокислотныхостатков, которые решающим образом влияют на образование пространственнойструктуры. Однако число инвариантных остатков, т.е. аминокислот, неизмен-но занимающих одно и то же положение в полипептидных цепях достаточно мно-гочисленного семейства эволюционно родственных белков, обычно невелико,подчас 20—30% или значительно меньше. Так, в белках оболочки вирусов расте-ний, близких вирусу мозаики табака, из 158 остатков инвариантны 25 (16%), а всемействе карбоксипептидаз, включающем ферменты животных и некото-рых микроорганизмов, примерно из 310 аминокислотных остатков — только 42(13%). В семействе глобинов инвариантных остатков удивительно мало — всегошесть. Было бы чрезвычайно трудно представить себе, чтобы весь наборэлементов вторичной структуры (в глобинах это α-спирали), а также все спосо-бы их укладки в третичную структуру могли диктоваться столь малым числом инва-риантных аминокислотных остатков даже с учетом довольно крупной инвариантнойструктуры — тема.

Таким образом, следует искать какие-то другие общие черты в семействахпервичных структур белков. Достаточно устойчивым признаком оказывается рас-пределение по последовательности гидрофобных и гидрофильных аминокислот-ных остатков. В особенности важно непременное наличие в определенных пози-циях гидрофобных аминокислот (инвариантно гидрофобных остатков).

Например, в гемоглобинах млекопитающих 33 позиции в первичной струк-туре всегда заняты гидрофобными аминокислотами — инвариантно гидрофобны.Столь высокая значимость инвариантных гидрофобных остатков в первом при-ближении понятна — почти все они необходимы для формирования гидрофоб-ного ядра. Гидрофобные остатки важны для организации контактов между эле-ментами вторичной структуры при свертывании. Наконец, характерное распреде-ление гидрофобных и гидрофильных остатков нужно для воспроизведения эле-ментов вторичной структуры.

Разумеется, инвариантными гидрофобными остатками не исчерпываютсяте характерные черты, которыми определяется формирование пространственнойструктуры данной последовательностью аминокислот. По-видимому, существен-но сохранение последовательностей определенного типа, задающих поворотыпептидной цепи. Часто инвариантны остатки глицина, включение которых при-дает цепи гибкость, снимая многие ограничения на набор углов j и y. Наконец,инварианты и те аминокислотные остатки, которые, возможно, не участвуя вформировании пространственной структуры, незаменимы для харакернойфункции белка, например входят в его активный центр.

Удивительно, что в некоторых случаях для образования правильной прост-ранственной структуры не обязательна целостность собственно полипептиднойцепи. Так, продукт ограниченного протеолиза панкреатической рибонуклеазы суб-тилизином — рибонуклеаза S — содержит один разрыв полипептидной цепи по-сле А1а-20. Пептидный фрагмент 1—20 может быть отделен от остаточного белка(21—124), однако при смешении они вновь формируют активную рибонуклеазуS, третичная структура которой лишь в точке разрыва цепи отличается от строе-ния исходной рибонуклеазы.

Та же панкреатическая рибонуклеаза, в полипептидной цепи которой содер-жится 124 аминокислотных остатка, после отщепления четырех аминокислот с кар-боксильного конца утрачивает способность к свертыванию. Дисульфидные связипри окислении предварительно восстановленного фрагмента 1—120 образуются не-правильно, не в том порядке, который свойствен нативному белку. Однако в при-сутствии С-концевого пептида 105—124 происходит регенерация структуры и актив-ности фермента. Для нуклеазы стафилококков (149 аминокислотных остатков) по-казано, что при смешивании фрагментов 1—126 и 49—149 их взаимодополняющиеучастки, например 1—48 и 49—149, образуют глобулу, а оставшийся лишним фраг-мент 49—126 не входит в компактную структуру и может быть отщеплен трипси-ном, если ренатурированный фермент стабилизирован присутствием аналога суб-

страта.Ренатурация белка из двух фрагментов, иногда перекрывающихся, может

быть, видимо, объяснена тем, что соответствующие участки первичной структуры спо-собны, каждый сам по себе, образовывать элементы «мерцающей» вторичной струк-туры, которые при взаимодействии фрагментов быстро находят путь к закреплениюуже значительно более стабильной пространственной структуры. Разумеется, нель-зя считать, что ренатурировать, образуя единую третичную структуру, могут фраг-менты, полученные каким угодно способом, — разрыв цепи должен происходить наразрешенном участке, выбранном так, чтобы фрагменты могли с известной вероят-ностью автономно формировать элементы вторичной и, возможно, третичной струк-туры. Ренатурация белка из крупных фрагментов пептидной цепи, видимо, близкакомплементации — восстановлению активности белка при смешивании двух неак-тивных полипептидных цепей, несущих мутации в разных сайтах.

Итак, код, определяющий однозначность соотношения между способомукладки полипептидной цепи в пространстве (третичной структурой) и целым се-мейством аминокислотных последовательностей, несомненно, вырожден. Однакомеру этой вырожденности не следует переоценивать, поскольку речь идет об ус-тойчивости важной, но не исчерпывающей специфику белка характеристики — спо-соба свертывания полипептидной цепи в пространстве. Эта устойчивость позво-ляет, пользуясь одной и той же третичной структурой, иметь множество прост-ранственных структур, .отличающихся распределением функциональных групп наповерхности белка и, значит, имеющих различные функциональные возможности.Заметим, что однотипность способа пространственной укладки пептидных цепей,принадлежащих одному семейству, не означает идентичности — возможны отли-чия в деталях, которые опять-таки могут оказаться функционально значимыми.

Сказанное иллюстрируют данные по мутантам хорошо изученного белка —лизоцима. У птиц отряда Galliformes в структуре лизоцимов яичного белка содер-жится неподалеку от активного центра кластер. который образован одним из двухнаборов аминокислотных остатков:

Thr-40... Ile-55 ... Ser-91

или

SeMO ... Val-55 ... Thr-01

В этих позициях другие аминокислотные остатки не встречаются, юлее того,неизвестны и природные лизоцймы, которые отвечали бы гереходным наборамаминокислотных остатков, например Ser-40, Ile-i5, Ser-91 и т.п. Полученные ме-тодом направленного мутагенеза все юзможные переходные формы оказались ка-чественно весьма похожими нa оба исходные варианта, в частности обнаруживали

близкую удельную активность. Рентгеноструктурный анализ показал, что струк-тура шелковой глобулы достаточно пластична и может адаптировать небольше измене-ния в строении боковых цепей. Так, при замене Ser-91 на hr дополнительная металь-ная группа треонина частью заполняет имевшуюся в структуре «пустоту», частью ис-пользует пространство, высвобождающееся после вызванного этой заменой поворотабоковой руппы Ile-55 вокруг связи С α - Сβ. Вместе с тем такие обобщенные характери-стики устойчивости белковой глобулы, как температура тепловой денатурации или тем-пературная стабильность активности, у переходных форм, как правило, не оказывают-ся промежуточными, а выходят за пределы этих же характеристик у исходных фермен-тов, таким образом, не вызывая драматических изменений в свойствах, замены амино-кислот в указанных позициях не безразличны для функдиональных свойств фермен-та, и не могут рассматриваться как вполне «нейтральные».

Меру вырожденности стереохимического кода, связывающего первичнуюи третичную структуру белка, позволяют оценить опыты М.Пташне и сотрудни-ков. Методами белковой инженерии был проведен обмен α-спиралями, узнаю-щими ДНК, между двумя белками-репрессорами: cro и 434. Ниже сравниваютсяфрагменты, кодирующие гомологичные α-спиральные участки в этих белках:

crо Gin Gin Ser Ile Glu Gin Leu Glu Asn Gly Lys

* * * * * *

434 Gin Gin Ser lie Gin Leu lie Glu Ala Gly Val

(звездочками отмечены идентичные остатки)

Замена указанного участка в репрессоре 434 на последовательность cro-реп-рессора дала устойчивый гибридный белок — репрессор*, функционально похо-жий на сrо-репрессор. Таким образом, вполне удалась пересадка большого фраг-мента — α-спирали — в структурно родственный, но далеко не идентичный бе-лок, где эта α-спираль смогла, очевидно, установить нековалентные взаимо-действия с оставшейся структурой репрессора 434. Этот результат хорошо под-тверждает вырожденность соотношения между третичной и первичной структу-рами. Однако, казалось бы, симметричная операция — пересадка α-спиральногофрагмента репрессора 434 в сrо-репрессор — привела к нестабильному белку, неспособному существовать в клетке. Выяснилось, что остаток лейцина, имеющий-ся в α-спирали cro-белка, мешает установлению ее контакта с остаточной структу-рой белка 434. Лишь после замены одного этого остатка на свойственный репрес-сору 434 изолейцин структура гибридного белка стабилизировалась, и он получилвозможность существовать и функционировать. Эти данные, не отрицая вырожден-ности стереохимического кода, указывают на ее существенные ограничения.

Несмотря на то что код, определяющий соотношение между первичной итретичной структурами белка, не расшифрован, делаются попытки предсказанияпространственной структуры белка по известной первичной структуре, а такжерешения обратной задачи — подбора такой последовательности аминокислот,которая обеспечивала бы формирование третичной структуры заданноютипа. Такое решение получено пока для относительно простых структур. Удалосьсконструировать аминокислотные последовательности, не существующие в при-роде и не являющиеся близкими аналогами природных, которые тем не менееспособны формировать компактную пространственную структуру заранее задан-ного типа. Иными словами, сделаны первые шаги к синтезу белков de novo.

Один из таких белков представляет собой пучок из четырех α-спиралей, со-единенных петлями. По такому же типу образована про-странственная структураприродных миогемэритрина и цитохрома с’. Последовательность α-спиральных уча-стков этого белка такова: Glu—Leu—Glu—Glu—Leu—Leu—Lys—Lys—Leu—Lys—Glu-Leu—Leu—Lys— y, а соединяющих их петель —Pro—Arg—Arg—. Распределение жеучастков вторичной структуры в пептидной цепи следующее: Met- α-спираль—пет-ля— α-спираль—петля— α-спираль—петля— α-спираль—СООН.

Этот белок, ген которого был синтезирован и клонирован в бактериальныхклетках, удалось выделить. Показано, что он достаточно устойчив, например дляего развертывания при комнатной температуре требуется 7М раствор солянокислогогуанидина.

Другой белок, полученный de novo, также представляют собой пучокα-спиралей, образованных последовательностями, содержащими олько серии илейцин. Он способен встраиваться в мембраны и формировать каналы, проводя-щие катионы через фосфолипидную бислойную мембрану. Таким образом, уда-лось создать заново структуру, обладающую хотя бы несложной функцией. Описани синтезирован de novo β-структурный белок. Делаются попытки созданияферментов de novo.

ГЛАВА 7ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА

Четвертичной структурой называют размещение в пространстве взаимодействую-щих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепямибелка.

В формировании четвертичной структуры участвуют не пептидные ши самипо себе, а глобулы, образованные каждой из этих цепей в отдельности. Таким обра-зом, понятие четвертичной структуры относятся к ансамблю глобул. Взаимо-действие между последними достаточно сильно, так. что ансамбль выступает какединая молекула, в то же время каждая из объединившихся глобул — субъединиц

— сохраняет значительную автономию, как правило, выраженную гораздо ярче, чемтономия домена в рамках третичной структуры.

Известны, однако, случаи, когда два или несколько полипептидов ставля-ют единую глобулу. Как правило, это является следствием ограниченного протео-лиза — локального расщепления на отдельные отрезки первоначально целостнойполипептидной цепи, образовавшей глобулу по обычным правилам формирова-ния третичной структуры. Такие белки, естественно, не следует относить к числуимеющих четвертичную структуру.

Примером может служить инсулин. Его мономер построен из двух пептидныхцепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков. Од-нако эти цепи образуют единую структуру, получающуюся после «вырезания» со-единяющего их пептида С из молекулы проинсулина, поэтому нет оснований счи-тать их субъединицами. Другой пример — конканавалин А (молекулярная масса26 кДа). Этот растительный белок относится к лектинам и специфическисвязывается с углеводными компонентами на поверхности клеток. Очищенныйконканавалин представляет собой смесь целых и поврежденных протеолизоммолекул, причем в последних пептидная цепь расщеплена на два фрагмента с мо-лекулярными массами 20 и 6 кДа. Понятно, что такие поврежденные молекулыпо структурной организации не отличаются принципиально от неповрежденных инет оснований приписывать им четвертичную структуру, несмотря на наличие двухпептидных цепей.

Следует еще раз подчеркнуть, что речь идет о белках, формирующих еди-ную глобулу. В некоторых белках полипептидная цепь образует при свертываниинесколько глобул (доменов), между которыми устанавливается система некова-лентных взаимодействий. Последующее протеолитическое разрезание участковцепи, соединяющих домены между собой, делает их вполне автономными, пере-водит в ранг субъединиц, формирующих четвертичную структуру. Иногда в лите-ратуре используют термин «агрегат» как синоним понятия «четвертичная структу-ра», с чем трудно согласиться, поскольку последнее подразумевает весьма высо-кий уровень организации — объединение субъединиц в молекулу, стабилизиро-ванную системой нековалентных взаимодействий. Точно так же нет основанийклассифицировать как четвертичную структуру надмолекулярные (например, муль-тиферментные) комплексы или протяженные структуры, такие, например, какоболочки фагов (рис. 7.1) или белковые кристаллические тела включения в неко-торых бациллах, хотя в механизме их образования немало общего с формированиемчетвертичной структуры. Четвертичная структура — последний уровень в органи-зации белковой молекулы, к тому же не обязательный — до половины известныхбелков ее не имеют. Граница между белками, имеющими четвертичную структуруи лишенными её, не всегда вполне определенна. Некоторые белки сравнительнолегко диссоциируют на субъединицы уже в обычных условиях. В то же время из-вестно возникновение более или менее стабильных димеров в растворах некото-

рых белков, которые не классифицируются как обладающие четвертичной струк-турой: такова, например, панкреатическая рибонуклеаза. Заметим, что поверхно-сти белков, насыщенные функциональными группами и весьма неровные, склон-ны к образованию хотя бы слабой системы взаимодействий, на чем основана, вчастности, кристаллизация белков. Такие взаимодействия следует, по-видимому,рассматривать как своеобразный зародыш, способный послужить в эволюции белкаисходной точкой для развития достаточно совершенной четвертичной структуры.

Рис. 7.1. Расположение белков (F, G, Н), об-разующих оболочку капсида фага φx174

Зачерненные пятиугольники соответствуют осям сим-метрии пятого порядка, треугольники - третьего по-рядка, «линзы» - второго порядка

7.1. СТЕХИОМЕТРИЯ И ГЕОМЕТРИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ

Субъединицы, образующие четвертичную структуру белка, могут быть со-вершенно различными как по строению, так и по функциональным свойствам.Такие белки относят к гетеромерным. Они встречаются довольно часто, позво-ляя объединить в одной структуре несколько взаимосвязанных функций, создать

полифункциональную молекулу. К гетеромерам относится, например, протеинки-наза, в которой одна из субъединиц (С — каталичеекая) ответственна за собствен-но ферментную активность и катализирует перенос фосфата АТР на белок,а другая является регулятор ной (R). В отсутствие циклического AMP последняясвязана с С-субъединицей в комплекс R—С и ингибирует ее. При образованиикомплекса с сАМР четвертичная структура распадается и С-субъединица оказы-вается способной фосфорилировать белковые субстраты. Ярким примеромгетеромерного белка может служить РНК-полимераза.

В гомомерных белках субъединицы одинаковы. С ними сходны и такие,строго говоря, гетеромерные белки, субъединицы которых не одинаковы, но дос-таточно сходны как по способу свертывания поли-пептидной цепи, так и функ-ционально.

Частоты, с которыми встречаются белки, построенные из двух, трех, четы-рех и т.д. субъединиц, весьма различны. Так, для более или менее случайной вы-борки из примерно 200 белков с молекулярной массой не более 300 кДа оказалосьдимеров 102, тетрамеров 58, гексамеров 23, тогда как тримеров только 9, пента-меров ни одного, октамеров 3. Таким образом, подавляющая часть белков, имею-щих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, при-чем последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа.

Геометрия симметричных димеров очевидна. То же относится и к триме-рам, которые весьма редки, однако встречаются. В частности, они могут игратьсущественную роль при образовании трансмембранных каналов, поскольку сво-его рода пучок, из трех субъединиц сам по себе образует внутренний канал. В тет-рамерных белках субъединицы могут размещаться в вершинах квадрата, что встре-чается редко; или же занимать вершины тетраэдра (рис. 7.2). Последний типчетвертичной структуры, в котором каждая субъединица взаимодействует с тремяостальными с различной силой, а молекула в целом оказывается весьма компакт-ной, наблюдается особенно часто. Для гексамерных белков характерна октпэд-рическая упаковка, гораздо реже встречаются плоские гексагональные структуры.

Субъединицы, образующие симметричную четвертичную структуру, быва-ют идентичными, но могут и отличаться, будучи в то же время однотипными, эво-люционно родственными белками, которые обладают одинаковым способом свер-тывания пептидной цепи в пространстве. В этих случаях формирование четвер-тичной структуры имеет характерные особенности. Если, например, тетрамерныйбелок образован структурно гомологичными однотипными субъединицами a и b,то в зависимости от степени их отличия возможны две ситуации. В первом случае,когда контакты a — a, b — a. и b — b отличаются существенно, образуется чет-вертичная структура типа a

2 другие же наборы субъединиц нестабильны и

практически не обнаруживаются. Так, в частности, построены молекулы гемо-глобинов. Если же межсубъединичные контакты практически равно ценны, ока-зывается возможным образование набора всех возможных четвертичныхструктур,

т.е. a4, a

3 и b

4, причем доля каждой из этих множественных форм

(заметим, что это далеко не единственная причина появления множественныхформ белков) определяется относительным содержанием субъединиц a и b.

Рис. 7.2. Четвертичная структураальдолазы скелетных мышц кроли-ка

Фермент состоит из четырех одинаковыхсубъединиц, расположенных в вершинахтетраэдра (две, выделенные жирнымилиниями, расположены ближе кчитателю).Межсубъединичные взаимо-действия в этом случае обеспечиваютсягидрофобными контактами между боко-выми радикалами аминокислот, обра-зующих α-спирали

Типичным примером является лактатдегидрогеназа человека, постро-енная из четырех субъединиц. Последние могут быть двух типов: М- (от англ. muscle— мышечная) субъединица, преобладающая в гладких мышцах, и Н- (от англ,heart — сердечная) субъединица, преимущественно синтезируемая в сердечноймышце. Для лактатдегидрогеназы возможен следующий набор множественныхформ: М

4. Заметим, что множественные формы, различия

между которыми обусловлены генетически, а не вызваны посттрансляцион-ными модификациями или повреждением белка, принято называтьизоформами.Разница в первичной структуре субъединиц отражается на соот-ношении катионных и анионных групп, что приводит к различиям в заряде изо-форм и позволяет легко разделить их методом электрофореза. Такой анализизоферментного состава лактатдегидрогеназы крови позволяет следить за поступ-лением в кровь лактатдегидрогеназы некоторых органов, в частности сердца приразвитии соответствующей патологии, например при некрозе сердечной мыш-цы. В последнем случае возрастет содержание изоформ, обогащенных Н-субъе-диницей. Этот подход нашел применение в медицинской диагностике ибиохимической генетике.

7.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ СУБЪЕДИНИЦАМИ, СТАБИЛИЗИ-РУЮЩИЕ ЧЕТВЕРТИЧНУЮ СТРУКТУРУ

Межсубгединичные контакты, которые определяют существование чет-вертичной структуры, представляют собой весьма развитую систему некова-лентных взаимодействий. Ковалентные дисульфидные связи весьма редко ис-пользуются для стабилизации четвертичной структуры (например, они соединяютлегкие и тяжелые цепи в иммуноглобулинах), причем даже в этих случаях онииграют подчиненную роль, дополняя нековалентные контакты.

В организации сети межсубъединичных контактов важная роль принадле-жит водородным связям. Очень часто система таких связей соединяет в одну оченьпротяженную структуру β-складчатые листы контактирующих субъединиц. Еслина поверхность субъединицы выходит крайний отрезок β-складчатого листа, тотакой же отрезок будет занимать соответствующее положение в другой субъеди-нице. Поворот последней на 180° позволит сблизить упомянутые отрезки так, чтомежду ними установится характерная для антипараллельной β-структуры системаводородных связей. Например, в четвертичной структуре алкогольдегидрогеназылошади, фермента, катализирующего превращение различных спиртов в альдеги-ды, две субъединицы, контактируя, образуют протяженный β-складчатый слой,который состоит из 12 пептидных отрезков. В зоне контакта в общей сложностиустанавливается 8 водородных связей между С=O- и N-Н-группами главной цепи:

В дополнение к этой системе могут возникать и отдельные водородные связимежду функциональными группами разных субъединиц.

Как ни значима роль водородных связей, сами по себе они не смогли быобеспечить поддержание достаточно устойчивой четвертичной структуры, особеннов водных растворах. Как и при образовании

третичной структуры, большое значение имеют при этом контакты ме-жду гидрофобными группами и целыми гидрофобными участками на поверх-ности взаимодействующих субъединиц. Уже упоминалось, что около половиныгидрофобных аминокислотных остатков локализовано в поверхностном слое бел-

ка, поэтому возникновение таких контактов вполне объяснимо. Так, четвертич-ная структура алкогольдегидрогеназы кроме водородных связей стабилизируетсягидрофобными контактами, в которых со стороны каждой из двух субъединицучаствуют два остатка метионина, один — лейцина, три — изолейцина, два — про-лина, один — триптофана, в общей сложности 18 остатков, размещенных на пло-щади 600 А2. Гидрофобные боковые группы этих остатков в изолированной субъ-единице имели бы термодинамически невыгодные контакты с водой, упорядочиваяее структуру. Поэтому формирование межсубъединичного контакта приводит квозрастанию энтропии системы, и равновесие оказывается сдвинутым в сторонуолигомера.

Сочетание системы водородных связей и гидрофобных контактов делаеточень прочным связывание субъединиц алкогольдегидрогеназы. Диссоциация чет-вертичной структуры этого белка достигается только в 8 М мочевине.

Межсубъединичные контакты нередко содержат ионные пары, в которыхустанавливаются электростатические взаимодействия между противополож-но заряженными функциональными группами субъединиц, например между кар-боксилат-ионами остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот и катионнымигруппами боковых цепей лизина или аргинина. При этом вовсе не обязательнообразование только ионных пар — нередко возникают целые системы, кластерыпространственно сближенных разноименных зарядов. Исключение воды из меж-субъединичного контакта делает такие взаимодействия, не слишком устойчивыена поверхности белка, весьма значимыми.

Анализ четвертичной структуры нескольких белков показал, что среди ами-нокислотных остатков, обеспечивающих межсубъединичные контакты, 67% яв-ляются неполярными, 20 — полярными, 13% несут заряженные группы.

В целом зона контакта между субъединицами представляет собой коопера-тивную систему нековалентных взаимодействий, стабильность которой сущест-венно зависит от внешних условий и, что особенно важно, даже от небольших изме-нений в пространственной структуре каждой из взаимодействующих субъединиц.Здесь кроется молекулярный базис одной из наиболее специфичных функций чет-вертичной структуры — ее способности передавать структурные перестройки од-ной субъединицы на другие.

Прочность четвертичной структуры может колебаться в широких пределах. Ее ино-гда измеряют долей поверхности субъединиц, которая участвует в межсубъединичном кон-такте и оказывается скрытой от воды при формировании структуры.

Заметим, что стабилизация четвертичной структуры обусловлена качест-венно теми же нековалентными взаимодействиями, от которых зависит и устой-чивость третичной структуры, хотя вклад гидрофрбных контактов несколько мень-ше. Различие носит скорее количественный характер: как правило, третичнаяструктура значительно прочнее четвертичной, поэтому при воздействии фак-торов, нарушающих отмеченные связи, четвертичная структура обычно утрачива-

ется первой, диссоциируя на сохранившие нативность субъединицы. Это правилоимеет исключения, важно, однако, что относительно меньшая стабильность чет-вертичной структуры дает большие преимущества при использовании ее измене-ний как факторов регуляции функциональных свойств белков.

7.3. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТАКТОВ МЕЖДУ СУБЪЕДИНИ-ЦАМИ

Известно несколько типов организации межсубъединичных взаимо-действий, которые характеризуются различной ролью элементов вторичной струк-туры в формировании контакта. Выше, на примере алькогольдегидрогеназы, былподробно рассмотрен довольно часто встречающийся способ, основанный навзаимодействии между собой β-структурных отрезков, которые расположенына периферии соседствующих субъединиц. Это приводит к формированию весьмапротяженного β-складчатого слоя. Межсубъединичные контакты могут образовы-ваться и за счет взаимодействия между функциональными группами, которые раз-мещены на поверхности b-складчатых слоев.

Распространены и другие способы образования четвертичной структуры. Так,в цитоплазматической малатдегидрогеназе димер удерживается в основном неко-валентными взаимодействиями внутри пучка шести параллельных α-спиралей —по три из каждой субъединицы. Понятно, что при этом главная роль принадлежитбоковым группам аминокислотных остатков, соответственно расположенных в α-спиралях. В четвертичной структуре некоторых белков, например триозофосфат-изомеразы, главная роль принадлежит nеnmuдным петлям, участвующим в установ-лении нековалентных взаимодействий между субъединицами.

Особенно характерны белки, которые несут специализированныеструктуры, позволяющие обратимо устанавливать или расщеплять межсубъе-диничные контакты, так называемые лейциновые молнии. В таких белках (к ним,в частности, принадлежит целое семейство регуляторов транскрипции) имеетсяхарактерная последовательность, и которой каждое седьмое положение занимает ос-таток гидрофобной аминокислоты, чаще всего лейцина. При образовании этойпоследова тельностью a-спирали разветвленные гидрофобные группы остаткон лей-цина образуют своеобразный «редкий» гребень, будучи разделены двумя оборота-ми a-спирали. (Напомним, что ее периодичность -3,6 остатка.) Две такие спирали,принадлежащие разным субъединицам и направленные одинаково, свертываютсяв двойную суперспираль (ср. разд. 14.3). Последняя стабилизируется гидрофобны-ми контактами между остатками лейцина, выстраивающимися в плотный гребень.Такой процесс действительно напоминает застегивание «молнии».

7.4 СПОСОБЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Наибольшую информацию о четвертичной структуре белка дает метод рент-геноструктурнрго анализа, однако он применим, как правило, на завершающихэтапах исследования. Между тем хотя бы приближенные сведения об этом уровнеорганизации необходимы с самого начала. Соответственно особое значение име-ют способы мягкой диссоциации четвертичной структуры, позволяющие вы-делить субъединицы или какие-то промежуточные структуры в нативном состоя-нии. Общего решения такой задачи нет, так как прочность четвертичной структу-ры может быть весьма различной. Однако представления о характере сил, кото-рые обусловливают стабильность четвертичной структуры, помогают в поиске ус-ловий, благоприятствующих диссоциации межсубъединичных контактов.

Так, молекула гемоглобина, образованная из четырех субъединиц и имею-щая формулу a

2, уже в 0,5 М NaCl диссоциирует на димеры по схеме a

2 — a b,

что указывает на весьма слабые связи между одноименными субъединицами. Вдругих случаях удается добиться диссоциации четвертичной структуры в присут-ствии умеренных концентраций мочевины или солянокислого гуанидина — реа-гентов, вызывающих расщепление межсубъединичных водородных связей, а так-же гидрофобных контактов. Довольно хорошие результаты дает исчерпывающаямодификация аминогрупп лизина ангидридами дикарбоновых кислот, напри-мер янтарным ангидридом:

В результате такой реакции, затрагивающей практически только ε-амин-ные группы остатков лизина, которые в нормальных условиях полностью протони-рованы и несут положительный заряд, последние заменяются отрицательно заря-женными карбоксилат-ионами сукциноильных группировок. Происходит резкоеизменение поверхностного заряда белковой глобулы (в данном случае субъедини-цы). Появление на контактирующих поверхностях субъединиц одноименныхотрицательно заряженных групп резко ослабляет взаимодействие между ними иприводит к диссоциации четвертичной структуры. Определение молекулярноймассы диссоциированных субъединиц, как и исходного белка, проводят методомседиментационного анализа или чаще гель-фильтрацией.

Впрочем, при первичной характеристике белка обычно прибегают к жест-кой денатурации молекулы, разрушению в ней всех нековалентных взаимодей-ствий, что вызывает, естественно, и полную утрату четвертичной структуры.

Излюбленный прием состоит в обработке белка анионным детергентом —додецилсульфатом натрия. Как уже отмечалось в разд. 6.10, этот детергент проч-но связывается с гидрофобными элементами полипептидной цепи и вызывает ееполное развертывание в палочковидную структуру, заряженную отрицательно,причем количество связавшегося додецилсульфата в расчете на единицу длиныполипептидной цепи, а значит, и плотность отрицательного заряда весьма посто-янны. Ввиду этого электрофоретическая подвижность таких комплексов зависиттолько от длины цепи, что дает возможность выяснить, состоит ли изучаемый бе-лок из одного или нескольких видов субъединиц, отличающихся по молекуляр-ной массе. Сравнение же электрофоретических подвижностей субъединиц и наборастандартных белков с известными молекулярными массами позволяет определитьи молекулярные массы субъединиц.

Заметим, что проведение электрофореза комплексов белок — додецил суль-фат в свободном растворе невозможно, так как зоны разделяемых компонентовбудут перемешиваться из-за неизбежной конвекции. Чтобы снизить этот эффект,электрофорез проводят в гелях полиакриламида, поперечносшитого метилен-бисакриламидом. Полимерная сетка, плотность которой определяется концент-рацией взятого для приготовления геля акриламида и сшивающего компонента,создает препятствия для перемещения к аноду отрицательно заряженных комплек-сов тем большие, чем больше длина пептидной цепи. Регулируя плотность геля,можно подобрать оптимальные условия для определения той или иной величинымолекулярной массы. Точность метода вполне удовлетворительна для анализа чет-вертичной структуры.

Для определения стехиометрии четвертичной структуры требуется знать,из скольких видов субъединиц построен белок и какова их молекулярная масса.Если при этом известна молекулярная масса нативного белка, можно сделать оп-ределенные предположения о его четвертичной структуре. Несколько сложнее об-стоит дело при изучении белков, имеющих разные субъединицы одинаковой илиочень близкой молекулярной массы. В таких случаях используют определение N-концевых аминокислот или последовательностей, которые могут оказаться харак-терными для каждой из субъединиц, или же прибегают к поиску способа диссо-циации белка на субъединицы, сохранившие третичную структуру, что позволяетразделить их каким-либо из хроматографических методов.

7.5. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ БЕЛКА

Подробный анализ функциональной роли четвертичной структуры можетбыть дан только на примере конкретных белков, что выходит за рамки даннойглавы. Мы остановимся поэтому только на некоторых принципиальных положе-

ниях. Нередко утверждалось, что построение крупных белковых молекул из неочень длинных пептидных цепей, образующих четвертичную структуру, позволяетснизить опасность ошибок трансляции. Действительно, даже одна ошибка в био-синтезе достаточно длинной полипептидной цепи, состоящей, например, из 1000аминокислотных остатков, может дестабилизировать его структуру и сделать весьсинтез бессмысленным. В том случае, если белок такого же размера был бы по-строен, например, из четырех субъединиц по 250- аминокислотных остатков каж-дая, такая же ошибка вызовет потерю только одной субъединицы.

Эти соображения, видимо, несправедливы, поскольку, как выяснилось впоследнее время, многие белки синтезируются в виде очень длинных (по несколькутысяч аминокислотных остатков) предшественников, так называемых полибел-ков, в дальнейшем нарезаемых на функциональные глобулы. Следовательно, ошиб-ки трансляции не накладывают серьезных ограничений на размер пептидной цепи,поэтому трудно представить, чтобы четвертичная структура развилась способ за-щиты от них.

Можно предположить, что четвертичная структура способна выполнять однуили несколько следующих функций.

1. Объединение нескольких взаимосвязанных функций в единой структуре.Эта особенность четвертичной структуры лежит в основе пространственной орга-низации, совмещения в единой структуре нескольких функционально активныхцентров, каждый из которых размещается на отдельной субъединице — такова,например, РНК-полимераза. Иногда по сходным принципам, но гораздо болеесложно, организуются очень крупные полиферментные комплексы.

2. Архитектурная функция. Четвертичная структура позволяет формироватьиз сравнительно небольших глобулярных субъединиц пространственные образо-вания весьма сложной конфигурации, обеспечивающие специфические функцио-нальные возможности белка.

Так, у ферритина (белок животных) молекула построена из 24 субъединиц,окружающих большую внутреннюю полость. Эта полость предназначена для хра-нения оксида железа — в ней размещается до 3500 группировок FeO.OH (рис.7.3). Еще один пример такой же функции — формирование двумя субъединицаминебольшого белка утероглобина полости размером 15х7х8 А, которая служит длясвязывания стероидного гормона — прогестерона. Субъединицы фермента трипто-|фансинтетазы E.coli катализируют две реакции:

а-Реащия - Индол-3-глицерофосфат -> Индол + D-Глицеральдегид-З-фосфат

обеспечивается α-субъединицей

b-Реакция - L-Серин + Индол -> L-Триптофан + H2O— β- димером субъединиц.

Объединение этих субъединиц в четвертичную структуру a2 b

2 открывает воз-

можность проводить суммарную a ,b - реакцию:

L-Серин + Индол-3-глицерофосфат -> L-Триптофан + D-Глицеральдегид-З-фос-фат.

Существенно, что продукт первой реакции — индол — служит субстратомвторой, которая протекает с участием другого каталитического центра. Четвертич-ная структура этого фермента, который можно рассматривать как прообраз поли-ферментных комплексов, построена так, что субъединицц образуют своего родатуннель, по которому индол перемещается от одного центра к другому, не перехо-дя в раствор. Этим обеспечивается высокая эффективность суммарного процесса,приводящего к синтезу триптофана. Очевидно, что в рассмотренном случае реали-зуется и принцип объединения функций в единой структуре.

По-видимому, некоторые белки, которые соединяют в единой структуредве взаимосвязанные функции, могли проходить в своей эволюции стадию фор-мирования четвертичной структуры из двух самостоятельных субъединиц: В даль-нейшем произошло слияние их структурных генов и, следовательно, объединениеполипептидных цепей в одну. В результате, как можно предполагать, субъединицыкак бы перешли в ранг доменов в единой молекуле.

Рис. 7.3. Четвертичная структураферритина

Ферритин - гетерополимерный белок, по-строенный из 24 структурно близ-ких легкой и тяжелой субъединиц.Молекула представляет собой полуюсферичесукю оболочку, пронизаннуюканалами, через которые внутрь пос-тупают ионы железа. По-видимому,субъединицы в ходе формированиячетвертичной структуры последова-тельно объединяются в димеры, тетра-меры, гексамеры, октамеры

Заложенные в четвертичной структуре возможности используются и присоздании функциональных центров белков. Так, активные центры ряда дегидро-геназ формируются аминокислотными остатками, расположенными на разныхсубъединицах этих ферментов. Это позволяет организовать активный центр,

охватывающий субстрат со многих сторон, изолировать его от воды. Например, валкогольдегидрогеназе лошади «карман», в котором находится активный центр,образован боковыми цепями аминокислот, принадлежащих двум одинаковым субъ-единицам. Субъединица 1 дает для этого три остатка лейцина, по два — серина ифенилаланина, по одному — валина, изолейцина, пролина и треонина. Субъеди-ница 2 — остатки метионина, лейцина и серина.

В триозофосфатизомеразе зона связывания субстрата также образована дву-мя субъединицами, которые при взаимодействии с фосфатной группой субстратасближаются, закрывая его от окружающего растворителя, так что реакция проте-кает при полном его отсутствии. Центр связывания антигена иммуногло-булиномобразован аминокислотными остатками, расположенными на двух полипептид-ных цепях — легкой и тяжелой — иммуноглобулина.

3. Обеспечение множественных взаимодействий белка с протяженными струк-турами. За счет образования четвертичной структуры два или несколько функ-циональных центров белка могут объединяться в одном крупном образовании иустанавливать кооперативное взаимодействие с какими-либо протяженными био-логическими молекулами, например, за счет существования четвертичной струк-туры иммуноглобулины типа G объединяют в одной молекуле два идентичныхцентра связывания антигена, позволяя в то же время в известных пределах изме-нять расстояние между ними за счет конформационной гибкости, оперативностьвзаимодействия таких антигенсвязывающих центров макромолекулярными ан-тигенами, например бактериальными стенками, делает комплексы антиген-им-муноглобулин гораздо более прочными, чем это наблюдалось бы для мономерногобелка. Не менее важно существование большого семейства ДНК-связывающихбелков в виде димеров, содержащих опять-таки два идентичных участка связы-вания. Такие белки, как следствие, способны прочно связываться с повторяю-щимися последовательностями в двух цепях двуспиральной ДНК. По такому прин-ципу построены по крайней мере некоторые белки-репрессоры, в частности сrо-репрессор фага λ. Для нескольких семейств белков, взаимодействующих снуклеиновыми кислотами, возможно, по-видимому, образование димеров из оди-наковых (гомодимеры) и разных (гетеродимеры) субъединиц. Понятно, что функ-циональная роль гомо- и гетеродимеров существенно отличается, так как оказы-вается различной зона белка, способная связываться с соответствующим участ-ком ДНК. Следовательно, само образование четвертичной структуры регулиру-ет, функцию таких белков.

4. Регуляторная функция. Главная функциональная особенность четвертич-ной структуры, по-видимому, смысл ее существования, состоит в том, что относи-тельно слабые взаимодействия между субгединицами, характер которых сущест-венно зависит от третичной структуры каждой из них, особенно удобны для регу-ляторных воздействий, управления активностью белков. Ввиду относительнойслабости межсубъединичных контактов изменения в третичной структуре какой-

либо субъединицы, вызванные ее взаимодействием с субстратом или иным лиган-дом, передаются на зону ее контакта с другой субъединицей, изменяя характерэтой зоны. Такое изменение приводит к перестройке всей четвертичной структу-ры и обеспечивает передачу эффекта от одной субъединицы к другим, объединен-ным в ее рамках (см., например, гл. 8 и 12).

Зона контакта между субъединицами, будучи относительно слабым элемен-том белковой структуры, легко воспринимает и изменения, происходящие припосттрансляционной модификации белка, например при включении или отщеп-лении фосфатного остатка (см. гл. 11), что опять-таки используется как регуля-торный механизм.

Рис. 7.4.Четвертичная струк-тура аспартаткарбамилтранс-феразы E.coli:

С1-С6 - каталитические субъеди-ницы, образующие два тримера С1-С3 и С4-С6; R1-R2, R3-R4 и R5-R6 - димеры регуляторных субъе-диниц; eg, po , zn и al - домены, изкоторых построены эти субъеди-ницы; стрелками показаны осисимметрии

Примером белка, четвертичная структура которого обеспечивает очень слож-ную регуляцию, будучи и сама весьма непростой, является аспартаткарбамилтранс-фераза E.cali (рис. 7.4). В этом ферменте, ключевом в биосинтезе пиримидинов,шесть каталитических субъединиц С объединяются в два тримера, которые в ответна присоединение субстратов могут в большей или меньшей степени взаимодей-ствовать между собой. Регуляторные субъединицы R образуют три димера,имеющие контакт с каталитическими субъединицами. Это позволяет ингибиро-вать фермент СТР (конечным продуктом пути биосинтеза пиримидинов) иактивировать его АТР, видимо, за счет изменения конформации регуляторных субъ-единиц, которое через перестройку четвертичной структуры передается на ката-литические субъединицы. Стехиометрия четвертичной структуры фермента от-вечает формуле (С3)2(R2)3.

ГЛАВА 8ГЛОБИНЫ

Глобины — семейство эволюционно родственных белков, которые способны об-ратимо связывать кислород и обеспечивают его хранение и транспорт в биологическихсистемах.

Глобины широко распространены в мире животных. Легглобин — белок,содержащийся в клубеньках бобовых растений, — также относится к глобинам,Глобины принадлежат к так называемым сложным белкам и содержат характер-ный небелковый компонент простетическую группу) — гем, представляющий со-бой комплекс двухвалентного железа и порфирина:

Гем играет ключевую роль в функционировании глобинов, так как именнок нему, точнее — к включенному в его структуру иону двухвалентного железа, при-соединяется молекула кислорода.

Особенность глобинов состоит в том, что в норме связывание молекулыкислорода не вызывает окисления железа до трехвалентного. Функциональныйсмысл этой особенности понятен — окисление привело бы к расходованию ки-

слорода и сделало бы невозможным его транспорт и хранение. Таким образом,при анализе строения этих белков следует уделить главное внимание способусвязывания кислотца и молекулярным механизмам, которые позволяют управ-лять его эисоединением и отщеплением.

Существует два главных типа глобинов: миоглобин, содержащийся в мышцахи обеспечивающий хранение кислорода, и гемоглобин — белок,сосредоточенный в эритроцитах и ответственный за перенос кровью кислородаот легких к тканям. Изучение строения и функциональных свойcтв глобинов, в которомособо важная роль принадлежит рентгеноструктурным исследованиям М.Перут-ца, Дж.Кендрью и их сотрудников, оказало большое влияние на формированиесовременных представлений о структуре, функции и эволюции белков.

8. 1. МИОГЛОБИН

Миоглобин и субъединицы гемоглобина имеют очень близкую третичнуюструктуру, их пептидные цепи свернуты в пространстве сходным образом. Вполнеопределенное, хохя и заметно меньшее, сходство обнаруживают и их первичныеструктуры. В то же время миоглобин лишен четвертичной структуры и его функ-ция ограничивается только хранением кислорода. Таким образом, миоглобин —более простой белок, более древний, чем гемоглобин.

Пептидная цепь миоглобина млекопитающих состоит из 153 амино-кислотных остатков. Сравнение первичных структур миоглобинов 24 видов жи-вотных показывает, что 82 положения во всех этих белках занимают одни и те жеаминокислоты. Следовательно, примерно половина остатков в указанной вы-борке миоглобинов неизменна, инвариантна, другие же остатки могут заменять-ся, что, однако, практически, не отражается на укладке полипептидной цепи,ее третичной структуре. Впрочем, многие из замен не изменяют существеннымобразом химической природы данного остатка — гидрофильные аминокислотызаменяются гидрофильными, гидрофобные — гидрофобными, т.е. наблюдаютсяпо преимуществу так называемые консервативные замены.

Миоглобин, как и другие глобины, — четко выраженный α-спиральный бе-лок (рис. 8.1). Его пространственная структура образована восемью α-спиралями,последовательно обозначаемыми буквами от А до Н (от аминного к карбоксильномуконцу цепи). В α-спиралях содержится 75% всех аминокислотных остатков, осталь-ные приходятся на повороты и неупорядоченные концевые остатки пептидной цепи.Неспиральные участки обозначают двумя буквами, соответствующими спиралям,между которыми расположен поворот, или спирали и аминному (N) либо карбок-сильному (С) концу пептидной цепи. Например, НС соответствует участку междупоследней спиралью Н и С-концевой аминокислотой. Для аминокислотных остат-ков миоглобина принято указывать буквенное обозначение α-спирали, в которойданный остаток находится, и его порядковый номер в ней.

Около 30 аминокислотных остатков, точнее — их боковые цепи, образуютвнутреннее гидрофобное ядро миоглобина, стабилизирующее его пространст-венную структуру. Ядро, в котором можно выделить три сегмента, или «кластера»,содержит остатки валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и аланина. Упа-ковка боковых цепей этих аминокислот в кластерах достаточно плотна и в то жевремя допускает опреленную свободу их движения друг относительно друга. В од-ном из «кластеров есть впадина, достаточная, например, для размещения, атомаксенона.

Рис. 8.1. Пространственная структура миоглобина

Показаны только Сα -атомы. Между спиралями E и Fрасположен гем (указан стрелкой). Близкую структуруимеют субъединицы гемоглобина

Кластеры объединяет в гидрофобное ядро планарная молекула гема, как бывставленная внутрь структуры миоглобина. При этом с водой контактирует толькоребро молекулы тема, погружной в белок, как в своего рода корзинку, образованнуюдвумя α-спиралями (Е и F) и выстланную гидрофобными боковыми цепями амино-

кислот. Гем не имеет ковалентных связей с белком, удерживаясь ковалентными взаи-модействиями. Всего насчитывается 80 межатомных контактов между белком игемом, что обеспечивает достаточно прочное удерживание последнего.

С обеих сторон плоскости тема, «над» и «под» атомом железа, сполагаютсяимидазольные кольца двух остатков гистидина (рис. 8.2). Один из них, занимаю-щий восьмое положение в α-спирали F (His F8) и наиболее приближенный к ато-му железа, называют проксимальным. Атом азота его имидазольного кольца на-ходится в контакте с атомом железа, так что можно думать об образовании междуними овалентной связи. Другой остаток гистидина, занимающий седьмое поло-жение в α-cпирали Е (His E7), называют дистальным, так как он относительноудален от атома железа. Между последним и имидазольной группой, этого остаткаесть свободное, пространство, в котором и размещается связываемая миоглоби-ном молекула кислорода, причем один из ее атомов непосредственно подходит кжелезу, другой — к имидазолу His E7. Замена дистального гистидина глициномухудшает связывание кислорода в 1000 раз.

Рис. 8.2. Зона присоединения кислорода в миоглобинеи субъединицах гемоглобинов

Находящийся в центре порфирина атом железа (Fе2+) связан сатомом азота имидазольного кольца проксимального гисти-дина F8. Молекула кислорода располагается при связываниимежду группой N-H имидазольного кольца дистального гис-тидина Е7 и атомом железа под углом к плоскости гема

В миоглобине некоторых моллюсков положение Е7 занято не гистидином, авалином, что также приводит к значительному понижению сродства к кислороду.Очевидно, что водородная связь, образуемая шидазольной группой дистального гис-тидина с кислородом, способствует связыванию последнего. Таким образом, вокругдвухвалентного железа гема пять координационных мест заняты атомами азота (четы-ре из них принадлежат порфирину, пятый — His F8), одно — кислородом.

Пространство, в котором связывается молекула кислорода, не имеет одна-ко, постоянного выхода в окружающую миоглобин воду. Предполагают, что овыегруппы остатка His E7 и соседнего с Arg CD3 могут занимать несколько разных положе-ний, образуя своего рода «дверцу». Ее открытие позволяет молекуле кислородаподойти к гему. Неясно, «дожидается» ли кислород случайного открывания «двер-цы» в результате тепловых колебаний или как-то его индуцирует. Очевидно, чтодинамика молекулы миоглобина играет существую роль в его функции.

Рис. 8.3. Кривые зависимости сте-пени насыщения кислородом миог-лобина (1) и гемоглобина (2) в за-висимостти от парционального дав-ления кислорода

Напомним, что в нормальных условиях в иоглобине и других глобинах приприсоединении кислорода окисления железа не наблюдается. Судя по модель-ным опытам, это как-то связано с огружением комплекса гем—кислород вгидрофобную среду, каковой яется окружение гема в глобинах. Бели все же окис-ление Происходит и железо переходит в трехвалентное состояние, то бразуетсятак называемый ферримиоглобин, уже не способный функционировать. Местосвязывания кислорода в нем занято водой. Заеметим, что ту же впадину междуатомом железа и дистальным ястидином могут занимать и другие молекулы.Например, СО язывается с гемом примерно в 200 раз прочнее кислорода, лишаяглобин возможности функционировать.

Кислород легко связывается миоглобином — полное насыщение белка достига-ется уже при парциальном давлении около 10 мм рт.ст., а 50 %-ное — при 1 мм рт.ст.1

(рис. 8.3). Таким образом, миоглобин хорошо приспособлен к хранению кислородав мышцах, насыщаясь им уже при весьма низких парциальных давлениях, харак-терных для тканей. Однако он не мог бы обеспечить транспортной функции: насы-тившись кислородом в легких, он с трудом отдавал бы его в капиллярах. Эту зада-чу решает родственный миоглобину, но построенный более сложно белок— гемо-глобин.

1 1 мм рт.ст. = 1,3 гПа.

8.2. ГЕМОГЛОБИН

Все гемоглобины млекопитающих имеют четвертичную структуру и состо-ят из четырех субъединиц. Практически всегда это две пары одинаковых субъеди-ниц, так что гемоглобины стехиометрически могут быть представлены формула-ми вида a

2 и т.д. Пептидные цепи, соответствующие субъединицам

гемоглобинов, обнаруживают сходство первичных структур, являются гомологич-ными. Так, при сравнении первичных структур α- и β-цепей гемоглобина А чело-века, которые состоят соответственно из 141 и 147 аминокислот, совпадает околополовины остатков. Гомология выявляется и при сравнении последовательно-стей гемоглобинов и миоглобинов, хотя она менее выражена.

В то же время третичная структура и способ укладывания полипеп-тидных цепей в пространстве у миоглобинов и субъединиц гемоглобинов весьмаблизки, что отражает их эволюционное родство, происхождение от одного пред-шественника:. Таким образом, субъединицы гемоглобина построены почти также, как описанная выше молекула миоглобина: α-субъединйца образована семью,β — восемью α-спиралями. Присоединение молекулы кислорода к субъединицамгемоглобина, каждая из которых содержит гем, в первом приближении протекаеттак же, как и при насыщении миоглобина.

Главное различие функциональных свойств миоглобина и гемоглобина со-стоит в том, что четвертичная структура сообщает молекуле гемоглобина способ-ность регулировать присоединение и отщепление кислорода, придает ей коопера-тивные свойства, которых лишен миоглобин. С учетом этого дальнейшее рассмот-рение свойств гемоглобина будет посвящено анализу четвертичной структуры этогобелка и ее функциональной роли.

8.2.1. Четвертичная структура гемоглобина

В четвертичной структуре гемоглобина субъединицы образуют тетраэдр,стабилизированный межсубъединичньши контактами — системой нековалентныхсвязей. Эти контакты, на которые приходится в общей сложности примерно 1/5для всей поверхности четырех субъединиц, весьма различны по числу нековалент-ных взаимодействий и, следовательно, по прочности (рис. 8.4). Наиболее развит инаиболее устойчив контакт между α-субъединицей и одной из β-субъединиц —так называемый контакт α1 — β1. В его образовании участвует 34 аминокислот-ных остатка, 110 атомов сближены в нем на расстояние, меньшее 4 А. Если при-нять общую площадь межсубъединичных контактов за 100%, то на контакт α1 —β1 и идентичный ему α2 — β2 придется 60%, что отвечает весьма сложной сети попреимуществу гидрофобных взаимодействий и нескольких водородных связей. Кон-такт той же α1 -субъединицы с другой α-субъединицей, так называемый контакт

α1 — β2, выглядит иначе, так как его образуют другие участникики поверхностиглобул.

Рис. 8.4. Модель четвертичной структуры гемоглобина

Диски, помеченные буквой Н, - гемы. Видны контакты α1/β2 иα2/β1 Показано, что слабый контакт α1α2 зависит от взаимодей-ствия N-концевых остатков валина и С-концевых – аргинина

В его формировании участвует 19 остатков аминокислот, образующих гид-рофобные контакты и водородные связи. На его долю (вместе с таким же контак-том α2—β1) приходится 33% общей поверхности межсубъединичных контактов.Как следствие, он значительно слабее контакта α1 —β1.

Еще слабее контакты между одноименными субъединицами α1— α2 и β1—β2, которые, представлены немногими, преимущественно ионными, взаимодей-ствиями. На них приходится около 7% общей поверхности контактов, стабили-зирующих четвертичную структуру. Таким | образом, два контакта, т.е. α1 —β1и α2—β2, доминируют в структуре молекулы гемоглобина. В определенных усло-виях, например в 2М NaCl, гемоглобин диссоциирует на димеры α1—β1,сохраняющиеся благодаря прочному контакту α1—β1. Практически четвертич-

ная структура гемоглобина как бы образована двумя относительно жестко связан-ными димерами α—β, которые удерживаются вместе более слабыми взаимо-действиями (димер димеров).

Рис, 8.5. Поворот и смещение α /β-диме-ров в четвертичной структуре гемогло-бина друг относительно друга при пе-реводе белка из дезокси- в оксиформу

Поворот составляет примерно 15°, смещение- 0,8 А. Димеры фиксируются в новой Пози-ции за счет изменений контакта α1β2 (см. рис,8.9)

В определенных условиях взаиморасположение димеров может изменяться засчет изменения характера менее прочных контактов α1— β2 и особенно α1— α2 иβ1—β2. Не следует думать, что слабые контакты между субъединицами, не слиш-ком значимые для поддержания целостности молекулы, не важны функциональ-но. Наоборот, именно сочетание слабых и сильных взаимодействий обусловли-вает кооперативностъ четвертичной структуры гемоглобина, что, по-видимо-му, характерно и для многих других белков, обладающих этим уровнем организа-ции.

Как показал рентгеноструктурный анализ, четвертичная структура моле-кулы гемоглобина может находиться в одном из двух состояний, отличающихсяповоротом димеров α—β друг относительно друга (рис. 8.5), Одно из них устой-чиво, если еубъединицы насыщены кислородом и молекула гемоглобина содер-жит четыре молекулы кислорода, — оксигемоглобин. Другое стабильно, если субъ-единицы кислорода не содержат, — дезоксигемоглобин. Промежуточные формынеустойчивы, их содержание в любой момент времени невелико. Существованиюдвух взаимопревращающихся форм четвертичной структуры гемоглобин и обязанкооперативностью связывания и отщепления кислорода, а также рядом другихфункционально важных свойств.

8.2.2. Присоединение кислорода к гемоглобину и сопровождающиеего изменения третичной структуры

Принято следующее, весьма огрубленное, описание цепи событий, сопро-вождающих присоединение молекулы кислорода к какой-либо из субъединиц ге-моглобина.

Рис. 8.6. Изменения конформациивблизи тема, сопровождающие прис-единение кислорода к атому железа ипереход субъединицы гемоглобина издезокси- в оксиформу

Атом железа втягивается в плоскость порфи-ринового кольца, что вызывает смещениесвязанного с ним остатка гистидина F8, закоторым следует движение всей спирали F иповорот

Молекула кислорода проникает внутрь субъедияицы и размещается междуатомом железа тема и имидазольной группой дистального гистидина, которая,видимо, образует с одним из атомов кислорода водородную связь.

Присоединение кислорода изменяет электронное состояние атома железа,который до этого находился как бы «над» плоскостью гема, а теперь смещается на0,4 —0,8 А, приближаясь к кислороду и втягиваясь в плоскость порфириново-кольца (рис. 8.6). Это движение приводит к соответственному смещению имидазо-ла проксималъного гистидина, образующего с железом связь, близкую к ковалент-ной. Смещение имидазола вызывает далее смещение всего остатка гистидина Hisи всей α-спирали F, в которой этот статок расположен. Понятно, что вменениеструктуры, начатое небольшим перемещением атома железа, хватывает немало ато-мов белка.

Важным последствием такого структурного перехода является то, что боко-вая р-оксибензильная группа остатка тирозина Туr НС2, располагавшаяся вдезоксигемоглобине йежду спиралями F и Н, из-за их сближения вынуждена по-кинуть это место в структуре и выйти на поверхность молекулы (рис. 8.7). Заме-тим, что остаток Туr НС2 предшествует С-концевому Arg HC3.

Резкое изменение позиции соседнего тирозина влечет за собой и измене-ние в расположении этого остатка аргинина, а значит, сразу двух заряженныхгрупп: α-карбоксилат-иона и гуанидиниевой группировки, — которыми он обла-дает. До присоединения кислорода заряженные функциональные группы С-конце-вого остатка Arg HC3 одной из α-цепей (α1-цепи) участвовали в образованиидвух солевых связей. Карбоксилат-ион взаимодействовал с протонированнойα-аминогруппой N-концевоцо остатка другой α-цепи (α2), обслуживая α1—α2-контакт. Катионная гуанидогруппа образовывала соль с карбоксилатионом Asp-126 в той же цепи α1. После присоединения кислорода С-концевой аргинин утра-чивает обе эти связи и приобретает способность практически свободно вращать-ся. То же происходит и с C-концевым аргинином цепи α2, так что в оксигемогло-бине контакт между одноименными субъединицами α1— α2, и без того слабый,становится мало существенным.

Рис. 8.7. Передача эффекта смещенияспирали F на С-концевой аргинин

Боковая цепь тирозина Туг НС2 из-за сбли-жения спиралей F, и G оказывается «вытолк-нутой» из пространства между ними, что при-водит в движение С-концевой остаток арги-нина (показано пунктиром). Это влечет засобой разрыв солевых мостиков, в которыхучаствуют концевые остатки аминокислот

Рис. 8.8. Схема электростатических взаимодействий (показанытонкими линиями) в молекуле гемоглобина

Субъединицы условно изображены стрелками, направленными к С-концам.При присоединении кислорода (оксигенировании) эти связи утрачиваются

Аналогично, в результате присоединения молекулы кислорода к C-конц уβ-субъединицы (β2) происходит конформационная перестройка, начинающая-

ся со сближения дистального гистидина с железом тема. Ее итогом оказыва-ется разрыв солевых связей С-концевого остатка Нis-146. Одна из них —между карбоксилатионом С-концевого гистидина и протонированной ами-ногруппой лизина Lys-40 цепи другая — между имидазолий-катионом His-146 и карбоксилатом Asp-94 же цепи β2. Это влечет за собой ослабление кон-такта α1—β2 (рис. 8.8).

8.2.3. Функциональная роль четвертичной структуры гемоглобина

В общей сложности при переходе от дезоксигемоглобина к полностью ок-сигенированной, насыщенной кислородом молекуле утрачивается восемь ионныхсвязей как внутри субъединиц, так и между ними, причем затрагиваются относи-тельно слабые контакты α1— α2 и β1—β2. Ослабление последних приводит к ре-лаксации молекулы гемоглобина и дает возможность ее половинам — α—β-димерам— изменить свою ориентацию друг относительно друга. Это смещение достигает 7А (см. рис. 8.6); при этом наиболее прочный контакт α1—β1 практически не затра-гивается.

Перемещение димеров α—β происходит как бы скачком, так как суще-ствует два способа организации нековалёнтных взаимодействий на контактеα1—β2. Его поверхность можно огрубление представить в к»иде ласточкинахвоста (рис. 8.9), причем в одной (дезокси- или Т) (форме относительноерасположение субъединиц стабилизируется, в частности водородной свя-зью между ТугС7 α1-субъединицы и карбоксилом AspGl субъединицы β2. Припереходе в окси(R)-форму эта связь утрачивается, зато карбоксильная группаAspGl α1-субъединицы, ока завшись в стерически благоприятном положе-нии после перемещения димеров друг относительно друга, дает водород-ную связь с AsnG4 субъединицы β2. Таким образом, контакт α1— β2работает как своеобразный переключатель, способный принимать одноиз двух состояний в зависимости от того, присоединился или нет кислород ксоответствующим субъединицам.

Итак, присоединение молекулы кислорода к субъединице гемоглобина вы-зывает целую последовательность структурных изменений, распространяющихсяот тема к периферии глобулы и смещающих ионизованные группы на ее поверх-ности. Речь идет о типичном для третичной структуры белка явлении — передачеэффекта на значительные расстояния. Если бы такой эффект оставался только врамках третичной структуры, его вклад был бы не столь значительным. Однако вгемоглобине он приводит к изменению ионных взаимодействий в слабом контак-те между субъединицами, изменяя его и способствуя кооперативному переходу чет-вертичной структуры в иное состояние.

Следовательно, изменения, происшедшие в одной из субъединиц приприсоединении кислорода, могут быть переданы на остальные субъединицы,которым будет выгодно изменить конформацию так, чтобы их третичная струк-тура соответствовала перемировавшейся четвертичной, а значит, стала быблагоприятной для присоединения молекул кислорода. Понятно, что такаяперестройка четвертичной структуры, ее переход из свойственной дезоксигемог-лобину Т (от англ. tight — стянутый) формы в характерную для оксигемоглобинарелаксированную R (от. англ. кеlахеd)-форму маловероятны (хотя в какой-то мереи возможны), если молекула кислорода присоединилась только к одной того,необходимость описанных противоречащих Т-структуре из четырех субъединиц.Более изменений третичной структуры гемоглобина, препятствует, присоедине-нию первой молекулы кислорода и благоприятствует ее отщеплению.

Рис. 8.9. Переход α1/β2-контакта приоксгенировании гемоглобина

Контакт, имеющий форму «ласточкина хвоста»,при оксигенировании и переходе молекулы изТ- в R- состояние может также находиться водном из двух состояний. Утрата водороднойсвязи Туг С7—Asp G1 между α1- и β2-субъ-единицами компенсируется установлением свя-зи между Asp Gl и Asn G4

Следовательно, присоединение первой ив меньшей мере второй молекулы кис-лорода будет протекать с трудом. Для негопотребуется заметно большее парциаль-ное давление кислорода, чем для насы-щения миоглобина, где таких задержекнет. Действительно, этот процесс — на-чало насыщения гемоглобина кислоро-дом — происходит в альвеолах легких, гдепарциальное давление кислорода велико.

Очень важно, что после присоединения двух молекул кислорода к гемоглобинучетвертичная структура с примерно с равной вероятностью может оказаться как в Т-,так и в R-форме. Последняя способствует присоединению третьей молекулы ки-слорода, после которого вероятность перехода всей структуры, в том числе и четвер-той субъединицы, пока не «заряженной» кислородом, в структуру, облегчающую

присоединение к ней кислорода, становится весьма высокой. Это ведет к востро-му завершению процесса насыщения всей тетрамерной молекулы кислородом. Та-ким образом, присоединение кислорода к гемоглобину, будучи кооперативнымпроцессом, как бы следует принципу «отдай имеющему», что обеспечивает полноту«нагрузки» молекул-переносчиков кислородом в легких.

В тканях первая молекула кислорода отщепляется с определенными затруд-нениями, так как это требует изменений в контакте субъединиц, противоречащихсвойственной оксигемоглобину четвертичной руктуре. Однако эти затруднения пре-одолеваются благодаря низкому парциальному давлению кислорода, которое де-лает обратную реакцию маловероятной. Отщепление последующих молекул кисло-рода облегчается с каждым шагом, что приводит к полной «разгрузке» транспорт-ной молекулы. Так, кооперативность обеспечивает эффективный перенос кислоро-да от легких к тканям. Как полагают физиологи, в отсутствие кооперативных эф-фектов, например, если бы эритроциты содержали миоглобин вместо гемоглоби-на, животные погибали бы от кислородной недостаточности в тканях.

8.2.4. 2,3-Дифосфоглицерат — эффектор, регулирующийфункцию гемоглобина

Очевидно, что кооперативность присоединения и отщепления кислородагемоглобином зависит от того, насколько легок или, наоборот, труден координи-рованный переход четвертичной структуры из Т- в R-состояние. Оказалось, что 2,3-дифосфоглицерат, содержащийся в эритроцитах, способен избирательно взаимо-действовать с дезоксигемоглобином, стабилизируя его четвертичную структуру (Т-форму). 2,3-Дифосфоглицерат несет пять отрицательных зарядов, которые могутбыть распределены между восемью атомами кислорода. Его молекула связываетсяво впадине, образованной обеими β-субъединицами, где она взаимодействует сразус семью катионными группами этих цепей. Это α-аминогруппы N-концевых Val-1, имидазольные кольца His-2 и His-143 обеих β-субъединиц, а также амино-группа остатка Lys-82 какой-либо одной из них (рис. 8.10).

Стабилизация дезоксиформы понижает сродство к кислороду гемоглобина,образовавшего комплекс с 2,3-дифосфоглицератом. В отсутствие эффектора —2,3-дифосфоглицерата — гемоглобин А взрослого человека насыщается кислоро-дом на 50% при 12 мм рт.ст., в присутствии же дифосфоглицерата для 50%-ногонасыщения гемоглобина кислородом необходимо уже его парциальное давление,равное 50 мм. рт.ст. 2,3-Дифосфоглицерат — соединение, структурно ничего об-щего не имеющее с кислородом и связывающееся участком гемоглобина, дале-ким от места присоединения кислорода. Тем не менее оно существенно влияет навзаимодействие кислорода и гемоглобина. Обладающие такой способностью со-единения, которым принадлежит большая роль в регули-

Рис. 8.10. Связывание дифосфоглицерата (DPG) с катионными группамиβ-субъединиц гемоглобина

Электростатические взаимодействия анионных групп 2,3-дифосфоглицерата с ка-тионными группами дезоксигемоглобина (заштрихованы) существенно усиливаютконтакт между субъединицами, прежде всего очень слабый β1β2 контакт. Стабили-зация дезоксиформы эквивалентна понижению сродства к кислороду. Сродство мо-жет быть повышено у гемоглобинов, способных связывать кислород при низком пар-циальном давлении, за счет ослабления взаимодействия с эффектором. Так, в гемо-глобине ламы связывание ослаблено заменой His-2 на Asn-2, в гемоглобине F (плода),- заменой His-143 на Ser-143, что уменьшает число катионных групп белка, взаимо-действующих с анионными группировками эффектора

ровании функции белков в организме, получили название аллостерических струк-турно далеких) эффекторов. Важно отметить, что сама возможность такого воз-

действия эффектора на структурно удаленный функциональный центр белка ос-нована на способности четвертичной структуры отвечать на относительно слабыевоздействия.

Изменения зоны связывания 2,3-дифосфоглицерата способны значитель-но влиять на сродство гемоглобина к кислороду. Так, в β-цепях гемоглобина юж-ноамериканской ламы, живущей на больших высотах и нуждающейся в адаптациик пониженному парциальному давлению кислорода, остатки His-2 заменены ос-татками аспарагина, которые не несут катионной группы и не могут участвовать всвязывании 2,3-дифосфоглицерата. Как следствие, дезоксиформа гемоглобиналамы оказывается менее стабилизированной и сродство к кислороду повышается.50%-ное насыщение гемоглобина ламы наступает уже при парциальном давлениикислорода, равном 24 мм рт.ст. Функциональный смысл такой замены вполнеочевиден, тем более что у одногорбого верблюда (эволюционного предка ламы),живущего на равнине, место связывания 2,3-дифосфоглицерата представлено се-мью катионными группами, включая и остатки His-2 β-цепей.

Гемоглобин F плода человека (феталъный) синтезируется только во времябеременности и должен обеспечивать перенос кислорода от плаценты, где его пар-циальное давление составляет всего около 12 мм рт.ст., к тканям плода (по выра-жению физиологов, «плод дышит на высоте Эвереста»). Понятно, что гемоглобинF должен обладать большим сродством к кислороду, чем гемоглобин взрослогочеловека. Это также достигается за счет замены His-143 в β-цепи гемоглобина Fна серин, что ослабляет связывание 2,3-дифосфоглицерата и уменьшает стабили-зацию дезоксиформы гемоглобина.

8.2.5. Участие гемоглобина в транспорте СО2 и ионов водорода

Кооперативные эффекты четвертичной структуры определяют способностьгемоглобина выполнять помимо переноса кислорода ряд других транспортныхфункций, важных для физиологии кровообращения.

Гемоглобин переносит ионы водорода и CО2 направляющиеся в тканях, к лег-

ким. Перенос ионов водорода обусловлен так называемым эффектом Бора. Какуже говорилось, при насыщении гемоглобина кислородом рвутся, а при его от-щеплении — восстанавливаются ионные связи между отдельными функцио-нальными группами. Разрыв или, наоборот, образование ионных связей сказыва-ется на способности функциональных групп связывать протон. Это особенно ха-рактерно для сравнительно слабых оснований, рKa которых близок к физиологи-ческому значению рН. В таком случае уже небольшие изменения рKa

существенновлияют на способность группы присоединять и, значит, переносить протон. Таки-ми группами являются α-аминогруппа и имидазольная группа гистидина. Так, воксигемоглобине имидазольная группа С-концевого His-143 β-цепей свободна и имеет,

по-видимому, нормальный рK a для гистидина, близкий 6. После отщепления кисло-рода в тканях эта имидазольная группа восстанавливает ионную связь скарбоксилатанионом остатка Asp-94 той же цепи, т.е. оказывается в поле отрица-тельного заряда. Понятно, что протон с большим трудом может покинуть имида-золий-катион, если положительный заряд последнего компенсирован сближен-ной с ним отрицательно заряженной группой.

Таким образом, способность имидазольного кольца С-концевого гистидина ксвязыванию протона регулируется положением этого кольца в пространственнойструктуре, его участием или неучастием в ансамбле с карбоксильной группой. Какследствие, дезоксигемоглобин, а котором основность имидазольной группы His-143 возрастает, присоединяет протон и переносит его от тканей к легким, где принасыщении гемоглобина кислородом и переходе его четвертичной структуры в ре-лаксированную R-форму ион водорода отщепляется.

Перенос СO2 гемоглобином обусловлен его способностью присоединяться к

α-аминогруппам белка с образованием так называемой карбаминовой кислоты —полуамида угольной кислоты:

Эта реакция протекает в тканях с аминогруппами дезоксигемогло-ина.Появившиеся отрицательно заряженные остатки карбаминовой ислоты вступаютв ионные взаимодействия с катионными группами елка, дополнительно стабили-зируя дезоксиформу. В легких при асыщении гемоглобина кислородом протекаетобратная реакция, оторая ведет к выделению СО

8.2.6. Аномальные гемоглобины

В популяции человека господствует нормальный гемоглобин А, однакос частотой примерно 1/1000 встречаются аномальные гемоглобины — мутантныебелки, в которых произошла одиночная замена аминокислотного остатка другим.Такие замены могут происходить во многих положениях — известно около 200 ано-мальных гемоглобинов, тогда как α и β -цепи в сумме содержат 288 аминокислотныхостатков. Функциональные последствия замен весьма различны. Многие из них, вособенности происходящие на поверхности и не связанные с радикальным изме-нением природы аминокислотного остатка, безразличны для функциональныхсвойств, нейтральны и никак не выявляются клинически. Известно, однако,немало аномальных гемоглобинов, носители которых в большей или меньшейстепени страдают от недостаточности функции гемоглобина. Тяжесть таких моле-

кулярных болезней различна и обычно снижается за счет присутствия у гетерози-гот нормального гемоглобина А.

Аномальные гемоглобины принято называть по местности, в которой былавпервые обнаружена данная мутация. Во многих случаях удается, основываясь наданных о строении гемоглобина, объяснять молекулярные механизмы того илииного нарушения, структурных функциональных свойств гемоглобина.

В гемоглобине Вена остаток Туr-130 в β-цепи заменен аспарагиновой ки-слотой. Ее карбоксильная группа втягивается в гидрофобное ядро, занимая в немместо фенильного кольца тирозина, что дестабилизирует молекулу. Носители дан-ной мутации страдают гемолитической анемией.

В гемоглобине Хаммерсмит замена Phe-42 в β-цепи серином приводит кутрате весьма важного гидрофобного контакта с гемом. Более того, в гидрофобноеокружение тема вторгается гидрофильная группа, а вслед за ней — вода. В резуль-тате дестабилизации гидрофобного ядра β-цепь оказывается неустойчивой, легкотеряет гем, происходит нежелательное окисление железа.

В гемоглобине Бостон дистальный His E7 -цепи заменен тирозином, фе-нольная группа которого образует ионную связь с ионом железа тема, не оставляяместа для связывания молекулы кцслорода. Аналогичная замена дистального гис-тидина на тирозин в β-цепи приводит к образованию аномального гемоглобинаСаскатун.

К весьма серьезным последствиям приводят замены аминокислот в зонахконтактов между субъединицами. Так, замена Туг-35 в b-цепи на фенилаланиндезорганизует α1—β1-контакт, так что белок распадается на мономеры.

Как уже отмечалось, нейтральными нередко оказываются мутации, затра-гивающие аминокислотные остатки на поверхности молекулы. Однако в гемогло-бине. S (серповидно-клеточная анемия) замена поверхностного остатка Glu-6 вβ-цепи валином приводит к образованию дезоксиформой надмолекулярных агре-гатов — протяженных пучков, а затем и кристаллических структур. По-видимому,появление гидрофобной аминокислоты в этой позиции недопустимо, так как еебоковая группа находит какую-то контактную площадку в другой части молекулыгемоглобина, что и вызывает неконтролируемую агрегацию. Следует учитывать, чтоконцентрация гемоглобина в эритроцитах очень велика и приближается к 35%, по-этому угроза образования агрегатов и даже осадков весьма реальна. Агрегаты ге-моглобина S вызывают искажение формы эритроцитов, нарушая кровообраще-ние в капиллярах.

Есть основания полагать, что мутация, приведшая к образованию гемоглобинаS вместо гемоглобина А, произошла в средние века на Аравийском п-ве, откуда рас-пространилась по путям миграции. В некоторых тропических районах распростране-ния малярии эта мутация стала закрепляться, поскольку возбудитель малярии пло-хо адаптируется к существованию в эритроцитах, измененных присутствием агрега-тов аномального гемоглобина. Это явление может служить простейшей моделью за-крепления мутантных белков в популяции под давлением отбора.

Разумеется, аномальными могут быть не только гемоглобины, но и любыедругие белки. В частности, описан ряд аномальных альбуминов сыворотки кровичеловека.

ГЛАВА 9 ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

Химическое модифицирование, т.е. проведение химических реакций,изменяющих ковалентную структуру белка, представляет собой один из важ-нейших приемов, используемых при характеристике функциональных групп бел-ка. Метод долгое время доминировал в изучении структурно-функциональныхотношений в белках, однако в последнее »ремя он утратил монопольное положе-ние, уступая во многих отношениях быстро развивающемуся сайт-специфиче-скому мутагенезу. Тем нe менее он в полной мере сохраняет значение как способпервичною поиска функционально значимых группировок в белковой молекуле,в собенности таких, которые наделены аномальной реакционной способностью(хотя на завершающих стадиях исследования метод сайт-специфического мутаге-неза имеет серьезные преимущества).

Вместе с тем реакции химического модифицирования лежат в основе соз-дания необратимых ингибиторов ферментов, используются при иммобили-зациибелков, особенно ферментов и антител, для биотехнотогических задач, а такжедля изучения топографии поверхности белков и их локализации в сложных струк-турах, например мембранах и других надмолекулярных образованиях.

Реакции химической модификации белков очень многочисленны,лишь немногие, наиболее представительные из них, будут рассматриваться далее.

9.1. ОСОБЕННОСТИ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГОМОДИФИЦИРОВАНИЯ

Обсуждая особенности метода, прежде всего следует подчеркнуть яркуюспецифичность белков как объектов химического модифицирования. Нередко,приступая к химическому модифицированию, исследователь вынужден исходитьиз упрощенного представления о белке как носителе определенного набора функ-циональных групп, принадлежащих боковым цепям аминокислотных остатков.При этом химические свойства последних как бы приравниваются к хорошо опи-санным и достаточно просто предсказываемым свойствам соответствующих группв низкомолекулярных соединениях, в частности в пептидах и аминокислотах.Обзор реагентов, применяемых для модификации белков, который будет дан ниже,по существу основан именно на таком упрощении.

Не следует, однако, забывать об ограниченности этого подхода. Действи-тельно, часть функциональных групп, главным образом те, что расположены наповерхности глобулы, окружены водой и не входят в систему контактов с другимигруппировками белка. С достаточным приближением они могут рассматриватьсякак аналогичные по реакционной способности таким же группам в малых моле-кулах, в частности пептидах. Однако число таких «канонических» групп не стольуж велико и, главное, не ими определяется химическая специфичность, особен-ность белковой молекулы.

Можно указать три основные причины радикального изменения химиче-ской активности функциональных групп, включенных в макромолекулу белка.

1. Часть функциональных групп скрыта внутри глобулы и, следова-телъно, недоступна для химических реагентов (до тех пор, пока белок сохраняетнативную структуру). Так, в сравнительно небольшом белке — карбоксипептидазеА — полностью скрыты внутри глобулы один остаток тирозина и два триптофана; 13остатков тирозина и 6— триптофана находятся в поверхностном слое и частичнодоступны растворителю. Только четыре остатка тирозина погружены в окружающуюбелок воду и могут проявлять такие же химические свойства, как тирозин в неболь-ших пептидах. Реакции химической модификации, рассчитанные на полное заме-щение всех доступных групп данного типа, используют для подсчета и идентифика-ции скрытых (англ, buried) функциональных групп.

2. Многие функциональные группы контактируют с соседними группи-ровками в белке, образуя, своеобразные ансамбли. Участие в таких ансамбляхспособно сильно, подчас до полной неузнаваемости, изменить реакционную спо-собность партнеров. Это подтверждается, в частности, тем, что константы диссо-циации и соответствующие им рКа

ионогенных групп белка лежат в весьма широ-ких диапазонах, иными словами, кислотно-основные свойства этих групп сильнозависят от их микроокружения.

Так, в небольших пептидах α-карбоксильные группы боковых цепей аспа-рагиновой и глутаминовой кислот имеют рКа, близкий 4,7, Зудучи похожими вэтом отношении на карбоксил уксусной и других алифатических карбоновызскислот. Во всей совокупности белков, однако, их рКа охватывают огромный ин-тервал: от 1,5 (одна их карбоксильных групп активного центра пепсина) до 7,5(карбоксильная группa остатка Glu-49 в субъединице триптофансинтетазы). Та-ким образом, в белках карбоксильные группы могут выступать и как весьма силь-ные кислотные группировки, практически полностью диесоциированные вфизиологическом диапазоне рН, и как очень слабые, диссоциированные едва линаполовину даже в нейтральной среде, а их константы диссоциации могут изме-няться на шесть порядков.

Изменение реакционной способности той или иной функциональной руп-пы может быть вызвано не только ее взаимодействием с какой-то другой группой(например, со второй карбоксильной группой, одна из которых становится силь-

ной, а другая — слабой кислотой), но и локальным изменением полярности микро-окружения данной группы, например, полагают, что погружение β-карбоксиль-ной группы остатка Glu-35 в гидрофобный участок лизоцима куриного яйца за-трудняет диссоциацию протона, поскольку образующийся при этом анион не го-жет стабилизироваться гидратацией; рКа этой группы близок 6.

3. Поверхность белковой глобулы далеко не безразлична к реагентам,применяемым при модификации. Даже если эти реагенты не cодержат специаль-но подобранных структур, способствующих избирательному связыванию в той илииной зоне белка (так называемая аффинная модификация), они с большой ве-роятностью будут связываться белком за счет взаимодействия с заряженнымигруппами, ридрофобными участками поверхности, донорами или акцепторамиводородных связей и т.п. Таким образом, собственно модификации предшествуетсвязывание реагента определенным участком белковой структуры. Это при-водит как бы к локальному концентрированию реагента в данной точке бел-ковой молекулы и резко повышает (вероятность вступления в реакцию функ-циональных групп, возможно, случайно соседствующих с участком связыванияреагента.

Нетрудно видеть, что отмеченные выше особенности поведения белкав реакциях химической модификации не случайны, а отражают фундаментальныесвойства его структурной организации и функционирования. С методической точкизрения это означает, что при трактовке результатов химической модификациинельзя полагаться на сведения о реакционной способности соответствующихгрупп в модельных соединениях. Строго говоря, в каждом случае после проведе-ния реакции и выделения продукта модификации (или разделения, если их не-сколько) необходимо прямыми методами установить, какие именно функциональ-ные группы данного белка подвергались модификации, и определить, какимаминокислотным остаткам в полипептидной цепи белка они принадлежат. Та-ким образом, приводимый далее обзор реагентов и их реакций с функциональ-ными группами белка дает лишь общую ориентировку относительно возможно-стей применения метода химического модифицирования.

9.2. ТИПОВЫЕ РЕАКЦИИ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИО-НАЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКА

9.2.1. ε−Аминогруппы

ε-Аминогруппы принадлежат боковым цепям остатков лизина. Они распо-лагаются, как правило, на поверхности глобулы, достаточно доступны и обладаютхимическими свойствами, характерными для алифатических первичных аминов.рКа этих групп обычно близок 10, поэтому реакции с этими группами проводят в

слабощелочных средах при рН 8 и выше, т.е. в условиях, когда они хотя бы частичнодепротонированы и могут выступать в качестве нуклеофильных агентов. Заметим,что α-аминогруппы реагируют сходным образом, однако на их реакционной способ-ности сказывается несколько меньшая основность (рКа около 8).

Ацилирование. Эти группы легко ацилируются, для чего могут быть исполь-зованы многие реагенты, например активированные эфиры кислот:

Однако близкие по нуклеофильности фенолят-ионы остатков тирозина,как правило, вступают параллельно в ту же реакцию. Для более избирательногоблокирования аминогрупп можно воспользоваться гораздо меньшей стабиль-но-стью к гидролизу сложных эфиров, получающихся при ацилировании фенольногогидроксила тирозина. Эта неустойчивость особенно значительна в случае моно-эфиров дикарбоновых кислот, которые образуются при ацилировании тирозинаангидридами, например янтарной или цитраконовой кислот. В этих случаях про-дукты модификации тирозина настолько нестабильны, что практически не обна-руживаются, так что удается достигнуть специфического ацилирования ε-ами-ногрупп лизина:

В полученном производном катионная в обычных условиях аминогруппазаменена анионным карбоксилат-ионом. Существенно, что фодукты ацилирова-ния аминогрупп лизина ангидридами дикарбоновых кислот вследствие сближен-ности высвободившейся при реакции сарбоксильной группы с вновь образован-ной амидной связью стабильны и в кислой среде остатки дикарбоновых амино-кислот отщепляются, высвобождая ε-аминогруппы остатков лизина. Такую воз-можность тратимого блокирования ε-аминогрупп лизина используют для того,пюбы проводить гидролиз трипсином модифицированного, например детрако-нилированного, белка сначала только пo остаткам аргинина, а после разделенияполучающихся крупных фрагментов и деблокирования ε-аминогрупп — по остат-кам лизина.

Арилирование. ε-Аминогруппы остатков лизина могут выступать в качест-ве нуклеофильных агентов в реакциях с 2,4-динитрофторбензолом и другимиароматическими активированными галоидными соединениями:

В образующемся динитрофенил-производном характерного желтого цвета(λ mах > 350-360 нм) азот аминогруппы полностью утрачивает основные свойства, агидрофильная аминогруппа заменяется весьма гидрофобной структурой.

Образование оснований Шиффа. Аминогруппы реагируют с альдегидами,взаимодействуя с карбонильной группой в два этапа по следующей схеме:

Эта реакция избирательна, однако основания Шиффа малоустойчивы илегко, особенно в кислой среде, расщепляются с регенерацией свободных амино-групп и альдегида. Учитывая это, прибегают к закреплению образовавшейся струк-туры путем восстановления двойной связи —CH=N— боргидридом натрия NaBH

Превращение в амидины. Модификация ∑-аминогрупп лизина указаннымиреагентами приводит к изменению заряда в данной точке белковой молекулы, аиногда к введению гидрофобного заместителя. Реакция с имидоэфирами отлича-ется тем, что в ее результате катионная аминогруппа замещается также катионнойамидиновой — основность которой несколько выше, чем у аминов:

Если заместитель R невелик, то такая модификация приведет только к заме-не аминогруппы на амидиновую — ни заряд, ни гидрофильность при этом заметноне изменятся, что позволит с большей уверенностью интерпретировать результатымодификации. По этим же соображениям бис -имидоэфиры охотно используют длясоединения двух белковых молекул друг с другом. При обработке производногобелка, модифицированного имидоэфиром по описанной схеме, большим избыткомпервичного амина, например метиламина, происходит перенос амидиновых группна этот амин, остатки лизина высвобождаются и белок удается регенерировать.

9.2.2. Фенольные группы тирозина

Гидроксильные группы тирозина в белках располагаются частично внутри,частично на поверхности белковой глобулы. В последнем случае для них характеренрКа >>10, соответствующий полупереходу:

Образующийся при этом фенолят-ион весьма активно вступает в реакции,свойственные также и ε-аминогруппам лизина, в частности в реакцию ацили-ро-вания.

Адилирование. Эта реакция может проводиться различными реагентами,например ацетилимидазолом:

Гораздо характернее для тирозина, однако, реакции замещения в фома-ти-ческом ядре, рассматриваемые далее.

Иодировапие. Эту реакцию особенно часто применяют как способ шеде-ния радиоактивных изотопов иода в белковую молекулу. Источником атомов иодаможет служить комплекс иода и йодистого калия; в секоторых случаях используютиод, образующийся при окислении иодид-иона в присутствии фермента перокси-

дазы. Последний способ делает реакцию более избирательной, так как образова-ние свободного йода происходит там, куда может проникнуть крупная молекулаперсидазы. Иодирование приводит к образованию как моно-, так и диодтиро-зина, причем замещение происходит в o-положении:

Результат введения иода в остаток тирозина неоднозначен: наряду с вклю-чением в структуру одного или двух объемистых атомов йода становится значи-тельно более кислым гидроксил фенольной группы. Эту реакцию нередко исполь-зуют для мечения белка радиоактивным иодом, причем модификации могут под-вергаться различные остатки тирозина, локализованные на его поверхности.

Нитрование. Нитрование достигается действием тетранитрометана C(N02)

причем в роли активной частицы обычно выступает нитроний-катион +N02:

И в этом случае возможно, хотя и проходит со значительно большим тру-дом, введение второй нитрогруппы (также в о-положение).

Гидроксильная группа в o-нитротирозине, по существу, такая же, как во-нитрофеноле, имеет выраженные кислотные свойства. Наряду с нитроний-ка-тионами тетранитррметан образует и частицы со свойствами свободных радика-лов -NO

2. Они также реагируют с образованием о-нитротирозина, однако неспа-

ренный электрон, делокализовайный в ароматическом ядре, вызывает, ряд по-бочных реакций, в частности димеризацию остатков о-нитротирозина.

Азосочетание. Реакция остатков тирозина с ароматическими солями диа-зония, также, являющимися катионными реагентами, опять-таки приводит к об-разованию моно- и ди-о-замещенных продуктов с достаточно протяженной сис-темой сопряженных двойных связей, что придает им глубокое, обычно красно-оранжевое окрашивание (так называемая реакция Паули, иногда применяемаядля обнаружения белков и пептидов, содержащих тирозин или гистидин):

Эта реакция также приводит к усилению кислотных свойств гидроксиль-ной группы тирозина. Она достаточно специфична, затрагивая юмимо тирозиналишь остатки гистидина. Однако иногда наблюдаетcя реакция солей диазония саминогруппами лизина, дающая чрезвычайно нестабильные триазены. Для ана-литического определения о-нитро- и азотирозина иногда прибегают к восста-новлению соответственно нитро- или азогрупп до аминогруппы. Получаю-щийсяпри этом о-аминотирозин сохраняется при полном кислотном гидролизе белка игожет быть определен с помощью аминокислотного анализатора.

9.2.3. Реакции карбоксильных групп

ω-Карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, какправило, весьма многочисленны и в большинстве своем размещены поверхност-ном слое белка. Как уже упоминалось, их реакционная пособность существен-ным образом зависит от микроокружения. Наиболее часто применяютследующие методы модификации этих групп.

Реакция с аминами в присутствии карбодиимидов. Эту реакцию проводят вводе, используя водорастворимые карбодиимиды, например -этил-N -тримети-ламинопропилкарбодиимид:

Реакция с этим или другими карбодиимидами протекает по следующейсхеме (R

1-N=C=N-R

2 - карбодиимид, R

2 - алифатический амин, часто мети-

ловый эфир глицина):

Если провести исчерпывающее замещение карбоксильных групп в белке,используя в качестве амина метиловый эфир глицина или лучше метиловый эфирнебелковой аминокислоты, например норвалина, то по аминокислотному составупродукта реакции можно определить число карбоксильных групп, которые в неевступили и, следовательно, число доступных для реагента карбоксильных групп.

Как правило, оно велико и скрытыми оказываются лишь единичные группы.Следует иметь в виду, что продукт активации карбоксильной группы —

o-ацилизомочевина — может не только вступать в реакцию с амином, но и стабили-зироваться в результате внутримолекулярного переноса ацильного остатка с ато-мом кислорода на азот. Это приводит к образованию весьма стабильной N-ацил-мочевины:

Реакции с алифатическими диазосоединениями. Стабильные алифатическиедиазосоединения, например производные диазоацетамида, в присутствии ионовмеди реагируют с некоторыми карбоксильными группами, например с карбок-сильной группой одного из остатков аспарагиновой кислоты в активном центрепепсина или других аспаргильных протеиназ:

Алкилирование карбоксильных групп. В качестве агентов, алкилирующихнекоторые карбоксильные группы в белках, могут использоваться α-галоидке-тоны, например р-бромфенацилбромид (Br—СН

2СО—С

4Вr и его аналоги, а также

α-галоидкислоты. Реакция с p-бромфенацилбромидом протекает следующим об-разом:

9.2.4. Модификация остатков метиошша

Остатки метионина в белках и особенно пептидах легко окисляются до ме-тионинсульфоксида

В ряде случаев эта реакция протекает даже под действием кислорода возду-ха. В более жестких условиях, например при действии надмуравьиной кислоты,окисление проходит глубже и приводит к метионинсульфону:

Для модифицирования остатков метионина чаще, однако, применяют ал-килирующие агенты, например уже упоминавшийся р-бромфенацилбромид илигалоидзамещенные кислоты, в частности иодуксусную кислоту или ее амид. Приэтом характерно, что сера метионина реагирует с такого рода соединениямидаже в слабокислой среде, когда большинство других нуклеофильных групп бел-ка, в частности имидазольные группы гистидина, в реакцию не вступают,будучи протонированы:

Аналогично протекает реакция остатков метионина с α-бромкетонами.

9.2.5. Модификация остатков цистеина

Сульфгидрильные группы остатков цистеина весьма реакционноспособныи могут участвовать как в реакциях замещения в качестве нуклеофильного компо-нента, чему благоприятствует их диссоциация с образованием тиолят-иона (рКа около8), так и подвергаться окислению или образовывать прочные соли с ионами тяже-лых металлов.

Алкилирование тиоловых групп. Тиоловые группы легко алкилируются в сла-бощелочной среде. Например, при действии иодуксусной кислоты остатки цис-теина превращаются в S-карбоксиметилцистеин, при действии иодацетамида — вS-карбоксамидометилцистеин:

Тиоловая группа цистеина легко присоединяется к двойным связям, еслиони активированы сопряженной карбонильной группой или другим способом:

Окисление сульфгидрильных групп. Сульфгидрильные группы остатковцистеина могут окисляться с образованием дисульфидных рупп, т.е. превра-щаться в остатки цистина в сравнительно мягких словиях, в частности под дейст-вием кислорода воздуха. Эта реакция сецифична и может сопровождаться лишьокислением серы в метионине. Иногда, в частности при ренатурации белков,для перевода статков цистеина в остатки цистина прибегают к реакции дисуль-фидного обмена, для чего особенно подходящей считается окисленная формаглутатиона:

Разумеется, эта реакция обратима, однако равновесие может быть практическиполностью сдвинуто в сторону образования дисульфидной (как правило, внутримо-лекулярной) связи в белке за счет большого избытка окисленной формы глутатиона.На реакции дисульфидного обмена основано использование так называемого реак-тива Эллмана — 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойной) кислоты для количественногоопределения свободных сульфгидрильных групп в белках. При взаимодействии с по-следними происходит восстановление дисульфидной связи в реактиве. Образующаяся5-меркапто-2-нитробензойная кислота за счет диссоциации сульфгидрильной груп-пы в щелочной среде дает характерное желтое окрашивание и может быть количест-венно определена спектрофотометрически:

Образование меркаптидов металлов. Сульфгидрильная группа, будучи иони-зована, т.е. в форме меркаптид-иона, специфически взаимодействует с катиона-ми многих тяжелых металлов и металлорганическими соединениями, Образуя весь-ма прочные меркаптиды. Аналитическое значение имеют реакции с катиономдвухвалентной ртути

Связь Hg—S в таких соединениях занимает промежуточное положение ме-жду ионной и ковалентной и, как правило, достаточно прочна. Образование мер-каптида р-меркурбензойной кислоты сопровождается характерным изменением УФ-спектра, что может быть использовано для количественного определения свобод-ных сульфгидрильных групп в белках и пептидах,, хотя этот способ менее удобен,чем реакция Эллмана.

9.2.6. Модификация имидазольной группы гистидива

Алкилирование. Имидазол гистидина легко вступает в реакции лкили-рования, например с иодуксусной кислотой или ее амидом в ейтральной или сла-бощелочной среде, причем в зависимости от микроокружения этой группы в белкеили способа связывания алкилирующего реагента реакция может происходить поодному или пo другому атому азота (по N-1 или N-3):

Следует учитывать, что двойная связь в системе N=C——N имидазола гис-тидина способна перемещаться и занимать любое из двух положений. Реакцияалкилирования не является характерной только для гистидина, она может проте-кать также с остатками метионина, лизина и даже с некоторыми карбоксильнымигруппами, что зависит от рН и в значительно большей мере от особенностей мик-роокружения модифицируемого остатка.

Азосочетание. Реакция азосочетания может затрагивать в имидазольнойгруппе гистидина как атом С-2, так и атом С-4.

Продукты азосочетания гистидина с различными солями диазония (на схе-ме показана реакция с амидом диазосульфаниловой кислоты) имеют интенсив-ную, обычно красно-оранжевую окраску (реакция Паули).

Для избирательной деструкции остатков гистидина прибегают к фотоокис-лению кислородом в присутствии сенсибилизирующих красителей.

9.2.7. Модификация гуанидогруппы аргинина

Эта задача является особенно трудной, поскольку δ-гуанидогруппа аргини-на является очень сильным основанием (рКа » 14) и может быть депротонирова-на, что позволило бы ей выступать в качестве нуклеофила лишь в крайне жесткихусловиях, при такой,концентрации щелочи, которая обрекает белок на глубокуюденатурацию. Удается, однако, использовать для избирательной модификацииаргинина способность гуанидогруппы вступать в реакции образования гетероцик-

лов с некоторыми дикетонами или альдегидокетонами:

9.2.8. Модификация индола в триптофане

Индольная группировка весьма лабильна, в частности она претерпеваетдеструкцию при фотосенсибилизированном окислении. Среди химических мето-дов упомянем реакцию с о-нитрофенилсульфенилхлоридом, которая протекаетпо α−углеродному атому пиррольной части индола:

Заканчивая краткий обзор реагентов, используемых при модификации от-дельных аминокислотных остатков в белках, отметим, что ко многим амино-кислотам этот метод вовсе неприменим. Таковы все гидрофобные аминокисло-ты, глицин, пролин. Нет общих подходов в модификации серина, треонина, ас-парагина и глутамина.

9.3. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГО МОДИФИЦИ-РОВАНИЯ

Необходимо еще раз подчеркнуть, что приведенные выше данные о реак-циях функциональных групп белка ориентировочны. За исключением, возможно,образования меркаптидов, эти реакции не могут рассматриваться как строго спе-цифичные. Ввиду этого истолкование результатов химического модифи-цирования представляет большие возможности. Как правило, необходимо раз-деление продуктов модификации, за которым должна следовать локализациямодифицированных аминокислотных остатков путем фрагментации белка и вы-деления пептидов, содержащих остаток реагента. Экстраполяция результатов, по-лученных при действии тех или иных реагентов на функциональные группы в мо-дельных структурах — аминокислотах, пептидах и даже белках, весьма опасна, осо-бенно если речь идет о компонентах активных центров, поскольку химическиесвойства таких групп могут быть сильно видоизменены вследствие их участия всистеме нековалентных взаимодействий.

9.3.1. Химическое модифицирование как способ выявления роли функциональныхгрупп белка

Как отмечалось, в исследовании структуры и функциональных свойств бел-ка данный метод в значительной мере вытесняется сайт-специфическим мутаге-незом (белковой инженерией). Тем не менее при изучении механизма действиямногих белков начальные сведения о функционально значимых аминокислотныхостатках были получены именно методом химического модифицирования. Так,участие карбоксильных групп двух остатков аспарагиновой кислоты в аспартиль-ных протеиназах было впервые продемонстрировано при помощи специфическихреакций с производными диазоацетамида и диазокетонами, при изучении сери-новых протеиназ огромную роль сыграло выявление особой роли остатка серина,специфически реагирующего с диизопропилфторфосфатом и т.д. Эти результа-ты в дальнейшем подтвердились рентгеноструктурвыми исследованиями и сайт-специфическим мутагенезом. Нет сомнения, что метод химической модифика-ции будет и в дальнейшем играть ответственную роль, в особенности при поиске

функционально важных структур в новых семействах белков.Это обусловлено тем, что функционально активные центры, как прави-

ло, содержат ансамбли групп, функциональные группы в необычном окружении,что изменяет, делает нестандартными их химические свойства. Именно поэтомупоиск аминокислотных остатков, обладающих аномальной реакционной способ-ностью, составляет важный этап следования белка.

В то же время следует учитывать еще одну трудность, внутренне присущуютрактовке результатов, полученных любым методом модифицирования. Получивданные о том, что присоединение к некоей группе белка заместителя R вызы-вает характерное изменение его функциональных свойств, например утратуактивности, нелегко определить, произошло ли это вследствие блокирования дан-ной функциональной группы или же в результате введения остатка R в дан-ную рчку белка, где его присутствие недопустимо (например, из-за вызываемыхэтим заместителем стерических осложнений). Расчет на то, что применение реа-гентов с очень небольшими радикалами R снимет проблему, вряд ли оправдан,так как помехи вовсе не обязательно связаны размерами. Это делает результатыхимического модифицирования не сегда однозначными. Заметим, что и ме-тод сайт-специфического мутагенеза сопряжен с такой же неопределенностью.Впрочем, это усложнение может быть снято, если удается использовать не один,а серию реагентов с принципиально различными R.

9.3.2. Аффинные реагенты

Как бы ни был построен реагент, используемый при химической модифи-кации, его взаимодействие с той или иной функциональной группой всегданачинается с того, что он связывается в ее окрестности. Таким образом, специфич-ность, избирательность реакции определяется не только химическими особеннос-тями, внутренне присущими данной функциональной группе в белковой струк-туре, но и наличием вблизи нее благоприятных (или, наоборот, неблагоприят-ных) условий для связывания модифицирующею реагента. Для изучения функ-цио-нальных групп в активном центре белка выгодно использовать такие соеди-нения, в которых собственно химически активная группа присоединена к струк-туре, «узнающей» активный центр, точнее ту его часть, к которая ответственна засвязывание специфического лиганда (например, субстрата или эффектора). Такиеадресованные реагенты с большой вероятностью сорбируются в активном цен-тре и затем образуют ковалентную связь с теми или иными функциональнымигруппами, локализованными в нем. Протеканию реакции благоприятствует сбли-жение химически активной группы реагента и модифицируемого аминокислот-ного остатка, поэтому собственная реакционная способность первой может и небыть высокой.

В качестве примера можно указать на целый ряд пептидилбромметилке-тонов, построенных следующим образом:

Пептидная (адресующая) часть такой молекулы специфически присоеди-няется к протеиназе за счет образования системы водородных связей между пеп-тидными группировками аналога субстрата и фермента, а также взаимодействиябоковых радикалов R

2 и R

3 с зоной связывания. В результате реакционноспо-

собная группировка СОСН2Вr оказывается пространственно сближенной с актив-

ным центром. В сериновых протеиназах она избирательно реагирует с имидазоль-ной группой гистидина, принадлежащего активному центру:

9.3.3. Химическое модифицирование в изучениимежмолекулярных комплексов и синтезе

конъюгатов белков

Важной областью применения химической модификации является соеди-нение, «сшивка» белковой молекулы с Другими молекулами, сближенными с нейв биологических структурах. Это открывает возможность изучения геометрии под-час весьма сложных межмолекулярных комплексов. Так, бифункциональный реа-гент, диметил-3,3 -ди-тиобис-пропиоимидат

способен модифицировать, подобно монофункциональному имидоафиру, ε-ами-ногруппы лизина, отстоящие друг от друга примерно на 12 А. Это позволяет«сшивать» соседние белки в субъединице рибосом, F-актин и фрагмент миозина,

белки в мембранах эритроцитов и т.д. существенно, что «сшивка» содержит в этомслучае дисульфидную вязь, которая может быть в дальнейшем расщеплена мягкимвосстановлением. Это приводит к разделению белков, образовавших конъюгат, иоблегчает их идентификацию. Образуемые при помощи таких же или аналогичныхреагентов внутримолекулярные сшивки иногда используют для оценки расстояниймежду функциональными группами на поверхности белковой глобулы.

Разумеется, бифункциональные сшивающие реагенты могут содержать инеодинаковые реакционноспособные группы. Это особенно удобно при полученииконъюгатов, объединяющих белки с разными функциональными свойствами, на-пример иммуноглобулины и ферменты (обычно пероксидазу или фосфатазу), чтонеобходимо для иммуноферментного анализа. Одним из таких реагентов являет-ся N-оксисукцинильный эфир т-малеимидобензойной кислоты:

Его малеимидная группа способна присоединять сульфгидрильные группыцистеина, а N-оксисукцинильный эфир ацилирует ε−аминогруппы остатков ли-зина. Поскольку эти реакции протекают в различных условиях, можно избежатьобразования случайных пар белков.

Получили распространение модифицирующие реагенты, содержащие фотоактивируемую фенилазидную группировку. При освещении замещенных фени-лазидов УФ-светом с длиной волны 265—275 нм эти, в обычных условиях вполнеустойчивые, вещества распадаются с образованием промежуточных аренов — со-единений с высокой реакционной способностью. Последние, будучи пространственносближенными, могут реагировать с различными функциональными группами бел-ка, включая и такие, которые принято считать инертными. В принципе возможнадаже реакция нитрена с С-Н-группами, однако чаще затрагиваются функциональ-ные группы Н-Х:

Встраивание фенилазидных группировок в структуру реагента, имеющегоеще одну химически активную группу, позволяет сначала модифицировать белокза счет последней. После этого фотоактивация создает в уже модифицированномбелке новый высокоактивный центр (арен), способный образовывать ковалент-ные связи как с соседними молекулами белка (полисахаридами, липидами и т.д.),так и с пространственно близкими группировками внутри той же молекулы. На-пример, показанный ниже бифункциональный реагент дает возможность присое-динить фотоактивируемую группу к аминогруппам белка:

9.3.4. Другие области применения химическогомодифицирования белков

Реакции химического модифицирования позволяют образовывать кова-лентные связи между белками и нерастворимой матрицей, например полиса-харидами (агароза и ее производные, в том числе «сефарозы», целлюлоза), орга-ническими полимерами (полиакриламид, поливиниловый спирт «тойоперл»),неорганическими материалами (макропористое стекло и силикагель). Для этойцели используют целый ряд реагентов. Так, при иммобилизации на полисахаридахприменяют предварительную активацию матрицы бромцианом, после чего полу-чившийся эфир циановой кислоты образует амидин с ε-аминогруппой белка. Этуреакцию используют и как способ присоединения лигандов к матрице при синте-зе аффинных сорбентов (см. гл. 3):

Часто иммобилизацию белков проводят, используя диальдегид (обычноглутаровый диальдегид) для сшивания свободной ε-амино-группы белка с амино-группой носителя:

Для большей стабильности иммобилизации малоустойчивые связи —СН=N— гидрируют боргидридом натрия NaBH

4, переводя их в очень

прочные связи —CH2—NH—.

Модификация позволяет изменить растворимость белка. Например, При-соединение к химотрипсину нескольких гидрофобных полимерных цепочек —СН

2O—СН

2—O— делает этот фермент растворимым в орга-

нических растворителях, что открывает возможность его ипользования как ката-лизатора в органическом синтезе.

ГЛАВА 10ФЕРМЕНТЫ

Обмен веществ был бы невозможен без резкого ускорения реакций, кото-рых он основан, без согласования во времени и пространстве ножества биохими-ческих процессов, т.е. без участия биологических катализаторов — ферментов.Биокаталитически ускоряются самые различные превращения, в том числе и та-кие, которые с точки зрения традиционной химии, казалось бы, не нуждаются вкатализе. Например, спонтанно протекающее отщепление воды от угольной ки-слоты с образованием СO

2 оказывается слишком медленным для регулирования

рН крови, и эта, на первый взгляд простая, реакция катализируется специфиче-ским ферментом — карбангидразой.

Как известно, катализаторы не создают той или иной реакции, а лишьускоряют достижение равновесия, увеличивая скорости как прямого, таки обратного превращения. Как и любые катализаторы, ферменты ускоряют био-химические реакции за счет снижения энергии активации — того энергетическогобарьера, который отделяет одно состояние системы (исходные соединения) от дру-гого (продукты реакции). При этом, строго говоря, несколько изменяется путь,по которому протекает реакция. Разница в эффективности ферментов и тради-ционных катализаторов, используемых в химии, казалось бы, чисто количествен-ная. Так, энергия активации распада пероксида водорода на кислород и воду со-ставляет 18 ккал/моль, мелкодисперсная платина снижает ее до 12 ккаль/моль, афермент каталаза — до 5,6 ккал/моль, что ускоряет реакцию соответственно на 6и 12 порядков.

Столь высокая эффективность ферментов определяет их роль как органи-заторов биохимических процессов. Действительно, благодаря каталитическомудействию ферментов в организме становятся возможными такие реакции, кото-рые в отсутствие эффективного катализа были бы неуловимы за разумные време-на наблюдения.

Таким образом, ферменты как бы создают, делают осуществимыми многиепревращения веществ, не мыслимые в отсутствие биокатализа. Более того, неред-ко фермент ускоряет один из нескольких термодинамически возможных путейпревращения вещества, тем самым избирая его. Следовательно, ферменты высту-пают не только как ускорители, но и как своеобразные организаторы обменныхпроцессов, чему также способствует и возможность регулирования их активности.

Роль биокатализа была выявлена еще в прошлом веке при изучении про-цессов брожения. Именно с брожением связаны оба установившиеся в литературеназвания биокатализаторов — энзим и фермент. Из этих синонимов в русскоя-зычной литературе применяется лишь последний наряду, впрочем, с терминамиэнзимология и энзиматический. Ферменты имеют белковую природу, однакообнаружена способность некоторых форм РНК катализировать реакции, т.е. вы-ступать в качестве ферментов. Предполагают, что эта способность молекул РНКсыграла большую роль в эволюции биокатализа до того, как ферментативная функ-ция перешла к белкам — биополимерам, более приспособленным к выполнениюэтой задачи.

Во многих случаях молекула белка использует в ходе биокатализа небелко-вые соединения — кофакторы, в частности ионы металлов, которые выступаюткак компоненты каталитического центра фермента. Отделение таких кофакто-ров, обычно связанных с белком нековалентно, приводит к апоферментам, ком-плекс же фермента и кофактора носит название голофермента.

10.1. СИСТЕМАТИКА ФЕРМЕНТОВ

Каждая из примерно 2—3 тыс. реакций обмена в клетке катализируетсясвоим ферментом; следовательно, даже без учета видовых раз-личий существуетне менее 2—3 тыс. ферментов. Это число значительно вырастет, если учесть, чтореакции одного и того же типа могут катализироваться ферментами различнойприроды, а также рассматривать ферменты, вовлеченные в передачу сигналов ипроцессы, свойственные многоклеточным (например, ферменты системы сверты-вания крови). Вероятно, общее число видов ферментов приближается к десятитысячам.

Для строго обоснованной классификации столь большого числа ерментовпока недостаточно данных. Рациональной была бы систематика, основанная наэволюционных соотношениях между ферментами, убоком знании их структур-ных и функциональных особенностей, позволило бы объединять в таксонысоответствующих рангов ферменты,возникшие в ходе эволюции одногопредшественника. Такая систематика в настоящее время создается для некоторыхгрупп ферментов, в частности для протеиназ.

Однако для практического применения систематики, базирующейся на

эволюционных предпосылках, требуется не только предварительное Изучениемножества родственных ферментов, но и получение большого объема данных освойствах и, главное, структуре классифицируемого рермента, на что трудно рас-считывать на первых этапах исследования.

Ввиду этого принятая официально классификация ферментов используетв качестве основного отличительного признака их субстратную специфичность,характер проводимых ими реакций, т.е. именно то свойство, которое определя-ется первым при обнаружении и выделении фермента. Этот признак практическиудобен, однако следует учитывать, что он может объединять ферменты различногопроисхождения, структуры и даже механизма действия.

Международная классификация ферментов (КФ) разделяет ферменты в со-ответствии с типом катализируемых ими реакций на следующие шесть классов.

Оксидоредуктазы. К этому классу принадлежат все ферменты, катали-зирующие окислителъно-врсстановителъные реакции. Субстрат, подвергаю-щийся окислению, рассматривают как донор водорода, поэтому к ферментам дан-ного класса нередко применяют термин дегидрогеназа, хотя это название отра-жает только одно из двух возможных направлений реакции. Термин оксцдаза упот-ребляют только в тех случаях, когда О

2 выступает как непосредственный акцептор

водорода.Травсферазы. Ферменты этого класса переносят ту или иную группу от

одного соединения к другому. К их числу принадлежат, например, киназы — фер-менты, переносящие фосфорильный остаток АТР на различные субстраты, ами-нотрансфераэы (трансаминазы), переносящие аминогруппу аминокислот накетокислоты.

Гидролазы. Эти ферменты можно рассматривать как трансферазы, перено-сящие ту или иную группировку на молекулу воды. Выделение их в особый классоправдано чрезвычайно широкой распространенностью гидролаз, вовлеченных, вчастности, в процессы деградации биополимеров. Известны гидролазы, катали-зирующие гидролиз С—О, C—N, С—С, О—С и ряда других связей. Иногда один итот же фермент способен катализировать гидролиз связей разной природы. Так,некоторые протеиназы, расщепляющие пептидные связи в белках, могут даже сбольшей эффективностью гидролизовать сложные эфиры, выступая как эстера-зы. Выбор термина протеиназа в таких случаях основан на представлениях офизиологической роли данного фермента и, следовательно, о характере его при-родного субстрата.

Лиазы. К ним относят ферменты, разрывающие связи С—С, С—О, С—Nи некоторые другие путем элиминирования соответствующей молекулы содновременным образованием двойной связи. В обратной реакции лиазы катали-зируют присоединение молекул воды, аммиака и т.д. по двойной связи. Таков,например, гистидин-аммиак-лиаза — фермент, отщепляющий аммиак от гисти-дина с образованием ненасыщенной урокаиновой кислоты:

Изомеразы. Ферменты этого типа катализируют геометрические илиструктурные перестройки, изомеризации в пределах одной молекулы. К ним,в частности, относятся рацемазы, таутомеразы, циклоизомеразы. В качествепримера укажем на рацемазу лактама лизина, катализирующую взаимный пере-ход L- и D-изомеров этого соединения (см. гл. 1), триозофосфатизомеразу, ката-лизи-рующую взаимопревращение фосфоглицеринового альдегида и диоксиаце-тонфосфата.

Лигазы (синтетазы). К этому классу относятся ферменты, катализирующиесоединение двух молекул, сопряженное с гидролизом АТР. Они играют ключе-вую роль в процессах биосинтеза, обеспечивая за счет энергии гидролиза АТР про-текание таких реакций, которые сами по себе были бы термодинамически невы-годными. Примером могут служить аминоацил-РНК-синтетазы.

Каждый из перечисленных шести классов ферментов разбивают опять-таки по признаку специфичности) на подклассы и подпод-шассы, которымприсваиваются порядковые номера в соответствий с Международной класси-фикацией. Например, гидролазы, расцепляющие эфиры карбоновых кислот,относятся к классу 3 (гидролазы), подклассу 3.1 (ферменты, действующие насложноэфирные связи) и подподклассу 3.1.1 (гидролазы эфиров карбоновых ки-слот). Конкретный фермент внутри подподкласса получает свой порядковый номер.Так, липаза, гидролизующая триацилглицерины, имеет номер 1.1.3.

10.2. ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

При анализе способа действия ферментов прибегают к ряду упрощений,в определенной мере отражающих существенные черты этого процесса. Преж-де всего учитывают, что с субстратом непосредственно контактирует не всямолекула фермента, а лишь ее часть — активный центр. Последний не мо-жет быть очерчен строго определенными границами, поскольку каждый егокомпонент так или иначе взаимодействует с другими участками молекулыбелка. Эти взаимодействия обычно весьма существенны для каталитическогомеханизма, изменяя реакционную способность функциональных групп актив-ного центра, фиксируя их в структуре белковой глобулы или создавая благо-приятствующее катализу специфическое микроокружение. Таким образом,

понятие активный центр является в определенном смысле абстракцией, которая отражает существенные особенности фермента, но в то же времякак бы огрубляет описание катализа.

Упрощая картину далее, активный центр подразделяют на зону связыва-ния субстрата и собственно каталитический центр. При этом предполагает-ся, что зона связывания ответственна за формирование комплекса фермент —субстрат (так называемого комплекса Михаэлиса), за выбор субстрата, его за-крепление и правильную ориентацию относительно каталитического центра. Функ-циональные группы каталитического центра непосредственно участвуют в превра-щении субстрата. И это, упрощение полезно, если не забывать о его относитель-ности, условности. В реальных фермент-субстратных комплексах группы катали-тического центра обычно используются для связывания субстрата, а белковыеструктуры, образующие зону связывания, нередко участвуют в динамических про-цессах, вмешиваясь в каталитический механизм.

Условность понятия активный центр подчеркивается и тем, что послед-ний не удается физически отделить от остальной части молекулы фермента. Нарубеже 50—60-х годов появлялись сообщения об удачном «вырезании» активныхцентров из ферментов, в частности протеиназ. Все они, однако, оказались резуль-татом экспериментальных ошибок. С установлением пространственного строениямножества ферментов стало, ясно, что, как правило, их активные центры фор-мируются из аминокислотных остатков, далеких друг от друга в последова-тельности аминокислот, но сближающихся при образовании третичнойструктуры.

Например, в активном центре пепсина ключевая роль принадлежит остат-кам аспарагиновой кислоты 35 и 215, которые сближаются при свертывании по-липептидной цепи, состоящей из 321 аминокислотного остатка, в пространствен-ную структуру. Очевидно, что при попытке «вырезать» из белковой глобулы те уча-стки последовательности, которые включают компоненты активного центра, по-лучилось бы крайне неустойчивое образование, состоящее из нескольких пептид-ных фраг ментов, а главное, было бы утрачено специфическое окружение функ-циональных групп каталитического центра, которое определяет их химическиеособенности.

В то же время структуру фермента в целом нельзя считать неприкасаемой.Молекулы многих ферментов способны противостоять довольно значительнымповреждениям, в том числе отдельным разрывам полипептидных цепей, адапти-ровать целый ряд замен аминокислотных остатков другими; иногда удается за-метно уменьшить их размеры без утраты активности. Принципиально возможнои получение относительно небольших каталитических активных структур, при том,однако, непременном условии, что они сохранят стабильность пространственно-гр строения, т.е. будут соответствовать по размерам и стабильности по меньшеймере рангу домена.

10.3. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Основы кинетики ферментативных реакций были заложены Л.Михаэли-сом и М.Ментен еще в 1913 г. Предложенное ими уравнение, связывающее ско-рость реакции с концентрациями фермента и субстрата, в дальнейшем преобразо-вывалось, однако подход в принципиальных чертах сохранился и за уравнениемостались эти имена.

Согласно модели Михаэлиса—Ментен, фермент Е и субстрат S взаи-модействуют со скоростью, характеризуемой константой k

+1, образуя фермент-

субстратный комплекс ES, получивший название комплекс Михаэлиса. Этот ком-плекс, в котором субстрат, присоединенный к ферменту нековалентными связя-ми, еще сохраняет свою химическую природу, распадается с константой скоростиk

-1на фермент и субстрат, но может и превратиться в продукт (или продукты) Р,

высвободив фермент Е, со скоростью, характеризуемой константой k+2

Как правило, фермент-субстратный комплекс ES чаще распадается на ис-ходные компоненты, чем превращается с образованием продукта реакции Р, т.е.

. Конечно, именно превращение субстрата в продукт представляет глав-ный интерес при изучении ферментативных акций. Накоплением продукта в еди-ницу времени и определяется скорость реакции.

При выводе уравнения Михаэлиса— Ментен необходимо прежде всегонайти зависимость концентрации фермент-субстратною комплекса от кон-центраций фермента и субстрата, поскольку скорость образования продуктапропорциональна концентрации комплекса ES.

Скорость образования ES равна k+1

[E][S], скорость же его распадаопределяется суммой двух процессов: диссоциации фермент-субcтратного ком-плекса на компоненты со скоростью k

-1 [ES] и его распада с образованием продук-

та со скоростью k+2

[ES] .Итак, скорость распада комплекса ES по двум путям равна сумме этих ско-

ростей (k-1 + k+2

) [ES] . Кинетика Михаэлиса— Ментен приложима к уже устано-вившимся, стационарным, процессам, когда скорости образования и распадакомплекса Михаэлиса равна, т.е. сохраняется его постоянная концентрация. Длятакого процесса справедливо равенство

преобразуя которое получим

Дробь называют константой Михаэлиса Кm. Легко видеть, что

она характеризует соотношение скоростей распада (числитель) и образования (зна-менатель) комплекса Михаэлиса ES. Если k

+2 мала по сравнению с k-1

, т.е. распадкомплекса на исходные компоненты — фермент и субстрат — оказывается значи-тельно вероятнее, чем его распад с образованием продукта Р, величиной k

+2 можно

пренебречь и константа Михаэлиса оказывается равной константе диссоциациисубстрата

Как уже отмечалось, это соотношение часто оказывается справедливым,поэтому константу Михаэлиса К

т нередко приравнивают К

S. Следует, однако, пом-

нить об условности такого упрощения. Заменяя дробь в знаменателе предыдущегоуравнения на К

т, получаем

Заметим, что в приведенное уравнение входят текущие концентрациисвободного фермента и субстрата, которые, строго говоря, не совпадают с их на-чальными концентрациями, гораздо легче поддающимися определению. Впро-чем, различиями в начальной [S

T] и текущей концентрациях субстрата можно пре-

небречь, приняв [ST] » [S], поскольку уравнение Михаэлиса—Ментен справедливо

только для небольших степеней превращения субстрата (о чем нельзя забывать,определяя активность ферментов). Напротив, текущая концентрация ферментасущественно отличается от его полной концентрации [Е

T] вследствие связывания

большей или меньшей доли молекул фермента в комплекс Михаэлиса:

Подставляя это выражение для текущей концентрации фермента в приве-денное выше уравнение, после преобразований получаем

Это уравнение описывает зависимость концентрации фермент-субстратногокомплекса от исходных концентраций фермента и субстрата. Так как скоростьобразования продукта реакции V равна k

+2 [ES], то

Уравнение Михаэлиса—Ментен

Следует иметь в виду, что это уравнение определяет начальную скоростьстационарной реакции V

0, индекс «0» опущен для упрощения. Из выведенного

уравнения следует, что скорость реакции пропорциональна общей концентрациифермента, тогда как ее зависимость от концентрации субстрата оказывается зна-чительно более сложной.

Рассмотрим, как выглядит эта зависимость в наиболее характерных случа-ях. Напомним, что

и если (что наблюдается достаточно часто), то в первом приближенииК

т » К

S , иначе говоря, константа Михаэлиса равна константе диссоциации фер-

мент-субстратного комплекса — «субстратной константе».

1. Если концентрация субстрата много меньше Кm

, т.е. (случай, соответствующий действительно низкой концентрации, субтрата илиплохому его связыванию ферментом — большому значению К

m), то величиной

[S] в знаменателе уравнения Михаэлиса—Ментен можно пренебречь и скоростьреакции оказывается пропорциональной рсонцентрации и субстрата, и фермента,а само уравнение приобретает вид

Это выражение соответствует уравнению скорости бимолекулярной реак-

ции. Дробь , которая отвечает константе скорости бимолекулярной реакции,

иногда называют бимолекулярной константой скорости и используют соответ-ствующие величины при сопоставлении эффективности действия однотипныхферментов.

2. Если концентрация субстрата много больше (концентра-

ция субстрата сама по себе велика или фермент хорошо связывает субстрат, чемусоответствует низкая К

т), то величиной К

т в знаменателе можно пренебречь и ско-

рость реакции V = k+2

[ЕT] оказывается пропорциональной концентрации фермен-

та, а от концентрации субстрата не зависит. Иными словами, фермент оказывает-ся насыщенным субстратом, свободного фермента в реакционной смеси нет. Сто-ит обратить внимание на то, что концентрация субстрата в ферментативных реак-циях важна не сама по себе, а в сопоставлении с константой Михаэлиса, характе-ризующей соответствие данного субстрата ферменту.

Сказанное иллюстрирует рис. 10.1. При небольших концентрациях субстратаскорость реакции пропорциональна его содержанию в реакционной смеси, затемнаблюдается все возрастающее отклонение зависимости от линейной и, наконец,при концентрациях субстрата, значительно превышающих K

m, зависимость скоро-

сти реакции от концентрации субстрата практически исчезает, причем сама ско-рость достигает максимального (при данной концентрации фермента) значения

Рис. 10.1. Зависимость скорости Vкатализируемой ферментом реакцииот концентрации субстрата [S]

Следовательно, .

Это другая форма уравнения Михаэлиса — Ментен.3. Если концентрация субстрата равна константе Михаэлиса, то

Приведенное соотношение показывает физический смысл константы Ми-хаэлиса для пары фермент — субстрат: она численно равна концентрации суб-страта, при которой скорость реакции достигает половины максимальнойвеличины.

Необходимо иметь в виду, что кинетика Михаэлиса— Ментен справедливадля многих, но не для всех реакций, катализируемых ферментами. Существенныеотклонения от нее обнаруживают, в частности, ферменты, активность которыхвозрастает с увеличением концентрации субстрата.

Величины Vmax

очень важны для характеристики ферментных реак-

ций; разработан ряд приемов их определения. Наиболее популярен способ расчетаданных в соответствии с преобразованным уравнением Михаэлиса — Ментен —так называемый метод двойных обратных величин, предложенный Г. Лайнуиве-ром и Д.Берком. Уравнение Михаэписа — Ментен преобразуют так, чтобы оновыражало величину, обратную скорости реакции 1/V (т.е. время, необходимое дляпревращения эпределенного количества субстрата) в функции обратнойконцентрации субстрата (его разбавления) 1/S:

В такой форме уравнение Михаэлиса—Ментен эквивалентно уравнениюпрямой вида у = aх + b, где у = 1/V, x = 1/S,

т.е. описывает прямую, отсекающую отрезки на координатных осях рис. 10.2). Еслипри возрастании концентрации субстрата до очень ысоких значений 1/[S] стре-мится к нулю, то 1/V оказывается равным 1/V

max- Таким образом, измерив отре-

зок, отсекаемый прямой на оси /V, можно вычислить Vmax

. Если же 1/V равно нулю,то

и Km оказывается равной - [S] .

Известны и другие, в том числе и более удобные для обработки данных,преобразования уравнения Михаэлиса— Ментен, использование которых опи-сано в специальных руководствах. В последнее время расчеты на ЭВМ вытесня-ют графические методы.

Рис. 10.2 Зависимость величины, об-ратной скорости реакции 1/V время,затрачиваемое на превращение едини-цы вещества), от величины, обратнойконцентрации субстрата 1/[S] (разве-дение):

- отрезок, отсекаемый на оси х; 1/V

max - отрезок, отсекаемый на оси у

Применение уравнения Михаэлиса-Ментен позволяет количественнохарактеризовать эффективность действия ферментов, сравнивать их действие наразличные субстраты. Как уже говорилось, значение К

m с определенными ого-

ворками позволяет оценить сродство различных ферментов к их субстратам. Ве-личины К

т лежат в весьма широком интервале концентраций, обычно начинаясь с

милли-молярных. Встречаются и значительно большие значения Кm

, что можетбыть связано с использованием субстратов, не вполне отвечающих специфично-сти фермента. Понятно, что для небольших субстратов, например НСОд, нелегкоорга-низовать достаточно развитую систему взаимодействия с ферментом, поэтомувеличины К

m, вероятно, будут высокими.

Константы Михаэлиса становятся значительно ниже, связывание — эф-фективнее, если субстрат является протяженным и с ним возможно установлениебольшого числа нековалентных контактов. Так, панкреатическая эластаза (фер-мент, природными субстратами которого являются белки или пептиды) весьмаслабо связывает простейший модельный субстрат — метиловый эфир ацетил-L-аланина. К

m составляет в этом случае 170 мМ. С удлинением пептидной цепи К

быстро понижается, связывание улучшается. Так, для метилового эфира ацетил-аланил-аланина К

m равна 22 мМ, для метилового эфира ацетил-аланил—аланил-

аланина — 0,4 мМ.Впрочем, не следует думать, что в процессе эволюции ферментов действуют

факторы, направленные на постоянное понижение Кт и улучшение связывания суб-

стратов. По-видимому, достигается оптимальное связывание, характерное для каж-дой пары фермент—субстрат. В клетке субстраты многих ферментов содержатся вконцентрациях, существенно меньших K

m, а следовательно, ферменты не работают

в режиме насыщения. Таким образом, для природных систем типична ситуация,когда скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата и по-вышение последней не требует непременно усиления биосинтеза фермента.

А.Фершт и сотрудники, изучая свойства тирозил-РНК-синтетазы, обрати-ли внимание на то, что К

m для одного из субстратов — АТР — равна 2,5 мМ, что на

несколько порядков выше констант диссоциации, известных для комплексов АТРс другими белками. Так, К

m миозина по АТР равна 10-10 мМ. Совершенно очевид-

но, что прочное связывание такой крупной молекулы, как аденозинтрифосфат,способной образовывать целую сеть нековалентных связей с белком, вполне осу-ществимо. Эта возможность не реализована в тирозил-тРНК-синтетазе не пото-му, что фермент несовершенен. Видимо, прочное связывание АТР с участием боль-шого числа фермент-субстратных контактов привело бы к жесткой системе, в ко-торой перемещения субстрата относительно каталитического центра были бы край-не затруднены, что снизило бы эффективность катализа. К тому же такое «совер-шенство» излишне, поскольку внутриклеточная концентрация АТР близка к 2—3мМ, а значит, «идеальный» фермент с лучшим связыванием вряд ш получил бысерьезный выигрыш за счет снижения К

Важной характеристикой эффективности действия фермента являйся кон-станта k

+2, описывающая распад фермент-субстратного комплекса с образованием

продукта реакции. Как было показано выше, Vmax

[ЕT]. Зная общую концен-

трацию [ЕT] (для этого необходимо не просто знать концентрацию белка в раство-

ре, а определить, юльзуясь специально разработанными методами, концентрациюактивных центров), можно рассчитать число молекул субстрата, превраща-ющихся в продукт за единицу времени (1 с) при полном насыщении эерментасубстратом. Эта величина, которую называют число оборотов, весьма различна уразных ферментов. Так, для карбангидразы на равна 60 000, для лизоцима — всеголишь 0,5. Следует подчеркнуть, что число оборотов характеризует максимальновозможную скорость работы фермента, но не его эффективность в реальных усло-виях, огда насыщения субстратом нет.

Если механизм превращения ES в продукт более сложен, в чаетно-та мно-гостадиен, константу k

+2 заменяют константой реакции первого порядка К

КАТ. Бо-

лее точной мерой эффективности в условиях, приближающихся реальным, даетбимолекулярная константа скорости k

m. Подставляя в это выражение

= (К-1

)/К+1

, получим

Анализируя это выражение, можно видеть, что его величина существеннозависит от величины К

+1, т.е. от скорости образования комплекса Михаэлиса, а

последняя имеет свой предел, определяемый скоростью диффузии частиц в рас-творе, и не может превышать числа столкновений субстрата и фермента. Действи-тельно, известны ферменты, например карбангидраза и ацетилхолинэстераза, длякоторых величина К

КАТ/K

m близка к пределу и ограничивается только частотой

столкновений фермента и субстрата.

10.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Ингибирование, т.е. полное или частичное подавление активности ферментовпри сохранении их первичной и пространственной структуры, — один из важнейшихпутей регуляции биохимических процессов и в то же время продуктивный способизучения биокатализа. Различают обратимые и необратимые ингибиторы.

К необратимым относят такие ингибиторы, которые инактивируют фер-мент, образуя с ним связь, достаточно устойчивую и практически не диссоции-рующую в условиях, типичных для его действия. Обычно это ковалентная связь содной из функциональных групп каталитического центра.

Заметим, что нередко удается подобрать такие условия, при которых инак-тивирующая группировка отщепляется и фермент реактивируется, однако посколь-

ку эти условия принципиально отличны от тех, при которых происходило ингиби-рование, последнее все же считается необратимым.

Для примера рассмотрим ингибирование протеолитического фермента паж-гаиа, имеющего в каталитическом центре тиоловую группу цистеина, соедине-ниями ртути. Реакция иона двухвалентной ртути с этой тиоловой группой приво-дит к образованию трудно диссоциирующего меркаптида:

Фермент утрачивает в результате этой реакции активность, и ингибированиев данных условиях необратимо. Однако в присутствии избытка других тиоловыхсоединений, например меркаптоэтанола, происходит перераспределение ионовртути между ними и цистеином в активном центре папаина, вследствие чего по-следний высвобождается и папаин полностью восстанавливает свою активность:

Такую последовательность превращений используют на практике как спо-соб хранения папаина, предотвращающий его саморасщепление, автолиз. Тем неменее ингибирование папаина ионами ртути рассматривают как необратимое.

С возможностью действия необратимых ингибиторов следует считаться, вчастности, при выделении ферментов. Так, ионы ртути, свинца, меди и ряда дру-гих тяжелых металлов, блокируя сульфгидрильные группы некоторых ферментов,могут их инактивировать, что требует тщательного их удаления из растворов, аиногда применения комплексонов.

Среди необратимых ингибиторов выделяются специфические реагенты нафункциональные группы каталитического центра ферментов. Избирательностьих действия повышается, если они содержат структуры, способствующие их свя-зыванию в активном центре или, что еще эффективнее, воспроизводят строениепереходного фермент-субстратного комплекса. Например, при действии диизопро-пилфторфосфата на трипсин или другие сериновые протеиназы ингибитор аци-лирует активную гидроксильную группу серина в активном центре фермента, од-нако образующееся соединение, будучи структурным аналогом переходного со-стояния, устойчиво к дальнейшему гидролизу, поэтому фермент не может регене-рироваться и оказывается необратимо ингибированным. Диизопропилфторфосфатнеобратимо ингибирует также холинэстеразы, что делает его сильным ядом.

Необратимое ингибирование встречается и в природе. Именно так пени-циллины инактивируют В,В-карбоксипептидазу — фермент, вовлеченный в био-синтез муреина — полимера, который входит в структуру стенок бактериальныхклеток. Пенициллины, в известной мере имитирующие строение субстрата этогофермента, связываются с ним и ацилируют с раскрытием Д-лактамного цикла гид-

роксильную группу серина в активном центре фермента, что вызывает его необра-тимое ингибирование.

Взаимодействие обратимых ингибиторов с ферментом по схеме

описывается константой ингибирования К, которая представляет собой константудиссоциации комплекса фермент—ингибитор EI:

Очевидно, что К; численно равна концентрации ингибитора, при которойполовина молекул фермента оказывается связанной в комп лекс фермент—ин-гибитор.

Обратимые ингибиторы в свою очередь подразделяют на конкурентные инеконкурентные. К конкурентным относятся ингибиторы, взаимодействующиес той же зоной поверхности фермента, кбторая связывает субстрат, а следователь-но, способные конкурировать с ним за фермент. Впрочем, участки связываниясубстрата и конкурентного ингибитора вовсе не обязательно совпадают — для кон-куретных отношений достаточно их частичного перекрывания. Ввиду этого ингиби-тор химически может быть и не похож на субстрат, поскольку зоны связываниянередко поливалентны. Так, индол и β-нафтол конкурентно ингибируют протеи-назу α−химотрипсин, хотя в них трудно усмотреть какую-либо аналогию с пепти-дами. Речь, видимо, идет об использовании в обоих случаях одного и того же гид-рофобного участка химотрипсина.

Уравнение скорости ферментативной реакции в присутствии конкурентногоингибитора несколько сложнее уравнения Михаэлиса— Ментен:

Введение «кажущейся» константы Михаэлиса при-водит уравнение к канонической форме уравнения Михаэлиса—Ментен. Такимобразом, присутствие в системе конкурентного ингибитора эквивалентно увели-чению константы Михаэлиса, причем степень этого увеличения определяется ве-личиной отношения концентрации ингибитора к константе ингибирования, т.е. кпараметру, характеризующему прочность взаимодействия данного ингибитора сферментом.

Понятно, что максимальная скорость и соответствующая константа Ккат

характеризуют скорость превращения в продукт уже образовавшегося фермент-субстратного комплекса, поэтому на них присутствие конкурентного ингиби-тора повлиять не может. Изменение же кажущейся константы Михаэлиса учи-тывает снижение эффективной концентрации фермента, поскольку комплексфермент—конкурентный ингибитор с субстратом не взаимодействует:

Конкурентное ингибирование распространено в природе, его используют впрактических целях для регулирования активности, ферментов. По этому меха-низму действуют, например, природные ингибиторы протеиназ и амилаз, ком-плементарность которых соответствующим активным центрам так велика и свя-зывание столь сильно, что их действие нередко выглядит как практически необ-ратимое ингибирование из-за очень малых величин констант диссоциации ком-плексов фермент— ингибитор. Многие лекарственные препараты, нацеленные наподавление нежелательной активности фермента, конструируются как конку-рентные ингибиторы, причем подбираются такие их структуры, которые макси-мально соответствуют строению зоны связывания фермента, чтобы понизить K

Так, аналоги субстратов ренина — протеиназы, вовлеченной в регуляцию давле-ния крови, — которые вместо расщепляемой ферментом пептидной связи —СО—NH — содержат устойчивую к гидролизу структуру, например, —СО—СН

2 — , име-

ют Ki порядка 1·109 М и могут иметь терапевтическое значение.

Неконкурентное ингибирование принципиально отличается от кон-курентного: в этом случае ингибитор не затрагивает зону связывания субстрата, априсоединяется к ферменту по иному пути, вызывая инактивацию каталитиче-ского центра. Поскольку ингибитор и субстрат связываются в таком случае раз-личными участками фермента, ингибитор может присоединяться как к свободно-му ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу, в обоих случаях ин акти-вируя фермент. Именно независимость зон связывания делает невозможнойконкуренцию между субстратом и ферментом; следовательно, неконкурентноешгибирование не может быть снято избытком субстрата.

Итак, для неконкурентного ингибирования справедлива следующая cхема:

Уравнение скорости ферментной реакции в присутствии неконку-рентно-го ингибитора выглядит следующим образом:

Как уже говорилось, характер связывания субстрата ферментом в присутствиинеконкурентного ингибитора не изменяется, отсюда и сохранение К

m. Напротив, ве-

личина Vmax корректируется множителем Ki/([I] + Ki), величина которого тем мень-ше, чем больше концентрация ингибитора по сравнению с константой ингибирова-ния. Здесь снова концентрация действующего вещества, в данном случае ингибитo-pa, сравнивается с характерной для него константой ингибирования. Уменьшениеэффективной максимальной скорости соответствует снижению активности катали-тического центра при связывании неконкурентного ингибитора.

Неконкурентное ингибирование может быть следствием нескольких спосо-бов взаимодействия фермента и ингибитора. Возможно, ингибитор, связывающий-ся с функциональными группами каталитического центра, настолько мал, что невызывает помех связыванию субстрата,— так, например, могут вести себя ионы во-дорода, протонирующие функциональные группы, которые участвуют в катализе.

Ингибитор может связываться на участке, примыкающем к катали-тическому центру, и перекрывать последний, практически не затрагивая зоны свя-зывания субстрата. Такие ситуации особенно вероятны для ферментов с несколь-кими субстратами, которые связываются каждый на своем участке. Наконец, в осо-бенности для ферментов сложной структуры, возможно, что присоединение инги-битора к участку, отдаленному от каталитического центра, вызовет такие измене-ния в структуре фермента, которые передадутся в активный центр и нарушат егостроение, вызвав инактивацию фермента. Это частный случай аллостерическогоингибирования ферментов, весьма распространенного механизма регуляции ихактивности.

Принципы функционирования, общие для всех ферментов, реализуются вкаждом случае в свойственный данному ферменту способ связывания субстрата икаталитический механизм. Если связывание субстратов и обусловленная им спе-цифичность ферментов получили в последние годы достаточно подробное описание,

то способ действия каталитического центра практически ни в одном случае неможет считаться окончательно установленным, хотя для ряда ферментов предло-жены механизмы, весьма близкие к реально существующим. Мы рассмотрим дан-ные о механизме функционирования некоторых ферментов, уделяя особое вни-мание чертам, имеющим общее значение и типичным для биологических катали-заторов различной природы.

10.5. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ

Сериновые протеиназы, названные так по аминокислотному остатку, ха-рактерному для их активных центров, широко распространены в природе и вме-сте с протеолитическими ферментами других классов (аспартилъными, цистеи-новыми и металлопротеиназами) обеспечивают глубокое расщепление белков— основу их катаболизма — и целый ряд реакций ограниченного протеолиза, имею-щих регуляторное значение. Известно несколько семейств, объединяющих эво-люционно родственные сериновые протеиназы. Для животного мира очень харак-терны многообразные сериновые протеиназы, принадлежащие к семейству хи-мотрипсина, т.е. сходные с химотрипсином (наиболее изученным ферментом этоготипа) по пространственной структуре, строению и механизму действия каталити-ческого центра. К этому же семейству относятся некоторые сериновые протеина-зы стрептомицетов. Сериновые протеиназы другого семейства — субтилизины —особенно характерны для прокариот, но встречаются также в растениях и живот-ных. Известно и третье семейство — сериновые карбоксипептидазы, проду-цируемые животными, грибами, дрожжами и растениями. Однотипность строе-ния каталитических центров и глубокое сходство механизмов действия фермен-тов этих семейств, совершенно не похожих друг на друга по пространственной струк-туре, объясняются, по-видимому, конвергентной эволюцией белков-предшест-венников.

В дальнейшем изложении обобщены данные о механизме действия сери-новых протеиназ.

10.5.1. Связывание субстрата

Зона связывания субстрата в протеиназах, участвующая в образованиикомплексов с белками или их фрагментами, достаточно протяженна. Обычно сней могут взаимодействовать 5—8 аминокислотных остатков — по 2—4 по обестороны расщепляемой пептидной связи. Наблюдать связывание истинных суб-стратов — пептидов значительной длины — методами рентгеноструктурного ана-лиза не удается из-за чрезвычайно малых времен существования таких комплек-

сов, в которых субстрат быстро расщепляется. Ввиду этого исследуют комплексыферментов с аналогами субстратов. Так, подробно описано взаимодействиеальдегидопептидов (соединений, в которых С-концевой остаток заменен амино-альдегидом) с ферментом семейства химотрипсина — протеиназой А стрептоми-цетов:

При взаимодействии с сериновой протеиназой альдегидная группа образу-ет полуацеталъ с гидроксилом серина активного центра. Эта связь служитмоделью переходного фермент-субстратного комплекса, получающегося привзаимодействии с гидроксильной группой остатка серина в активном центре икарбонила расщепляемой пептидной связи:

Образующийся весьма стабильный комплекс позволяет описать системувзаимодействий между ферментом и субстратом на участке, предшествующем ата-куемой пептидной связи. Взаимодействия фермента и С-концевой части субстра-та изучали на других моделях, в частности на комплексах ферментов и природныхбелковых ингибиторов протеиназ.

На участке, предшествующем атакуемой пептидной связи, фермент форми-рует с субстратом своего рода антипараллельную β-структуру, образуя три водород-ные связи. Их дополняют еще четыре водородные связи с функциональными груп-пами каталитического центра. Укладывание пептидного субстрата в зоне связываниясопровождается небольшим смещением окружающих ее участков фермента, а также

отщеплением цепочки молекул воды, которые гидратировали функциональные груп-пы свободного фермента, образуя с ними водородные связи.

Система водородных связей между субстратом и ферментом дополняетсярядом гидрофобных контактов. Важнейшие из них образует боковая цепь тогоаминокислотного остатка, карбонильная группа которого принадлежит атакуемойферментом пептидной связи. Согласно принятой номенклатуре, такой аминокис-лотный остаток обозначают Р

1, предшествующий ему — Р2 , далее Р3 , Р4 и т.д., сле-дуя к аминоконцевому остатку субстрата. Остаток, чья аминогруппа образуетатаку емую связь, обозначают Р

1' следующий —Р

2' и т.д. Соответствующие этим

остаткам участки зоны связывания субстрата обозначают S4 ,

S2 , S1 , S1

', S2'.

Протеиназа А стрептомицетов, гидролизующая пептидные связи, в которыхучаствует карбоксильная группа гидрофобных аминокислот, т.е. близкая по специ-фичности к химотрипсину, образует с боковой цепью остатка P1 около 40 нековалент-ных контактов. Связывание этой гидрофобной группы сопровождается вытеснениеммолекул воды из гидрофобной впадины S

1. Столь развитая система нековалентных

контактов придает особо важное значение остатку P1 , природа которого в основномопределяет выбор расщепляемой пептидной связи сериновыми протеиназами, ины-ми словами, специфичность этих ферментов, хотя последняя зависит (пусть в мень-шей степени) и от соседних аминокислотных остатков.

Интересно, что в образовании гидрофобных контактов с субстратом участ-вуют остатки аланина, глицина, треонина, глутамина, пролина, выстилающие зонуS

1 фермента. На первый взгляд, участие этих, в большинстве своем гидрофильных,

аминокислот в построении гидрофобной зоны связывания парадоксально, однако вэтом сказывается принципиальная разница в поведении одних и тех же остатков врастворе и при включении в фиксированную пространственную структуру белка. Впоследней даже метиленовая группа глицина, будучи как бы отделенной, изолиро-ванной от гидрофильных пептидных связей, способна вести себя как гидрофобныйэлемент. Такие небольшие сами по себе элементы, закрепленные в пространствеводородными связями соседних групп, образуют своего рода гидрофобную мозаику,выстилающую впадину, «карман» в зоне связывания субстрата.

Видимо, такой способ формирования гидрофобных зон даже эффектив-нее, чем использование для этой цели отчетливо гидрофобных аминокислот с круп-ными боковыми группами, поскольку зафиксировать последние в поверхностнойструктуре белка, в частности лишить их способности вращаться, сложнее, чемфиксировать маленький гидрофобный элемент.

У сериновых протеиназ, специфически расщепляющих пептидные связи,которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина — трипси-на и его аналогов — также реализуются множественные контакты между поли-пептидной цепью субстрата и ферментом. И в этом случае особенно важно уста-новление системы водородных связей между пептидной цепью субстрата и фер-ментом:

Связывание остатка P1 в основном определяется электростатическими взаи-

модействиями между катионными группами в боковой цепи (субстрата –NH3+- в

случае лизина или гуанидиниевой группой в случае аргинина - и

карбоксилат-анионом остатка аспарагиновой кислоты, расположенного на днегидрофобной впадины S

1 (Asp-189 в трипсине) (рис. 10.3). Такому электроста-

тическому [взаимодействию благоприятствует изоляция ионной пары от контак-та с водой.

Кроме того, оно дополняется системой водородных связей между гуанидоили аминогруппой субстрата и карбоксилат-ионом Asp-lS9, также кислороднымиатомами ряда С=O-групп фермента. Замена остатка Asp-189 на остаток лизина втрипсине, проведенная методами белковой инженерии, радикально изменила спе-цифичность фермента, который перестал гидролизовать пептидные связи арги-нина и лизина, но приобрел (правда, слабую) способность расщеплять связи,образованные гидрофобными остатками фенилаланина, лейцина, тирозина, т.е.по специфичности стал близким другому ферменту того же семейства — химо-трипсину.

Рис. 10.3. Размещение боковой цепи остатка P1 субстрата в зоне S

1 трипси-

на. А - взаимодействия NH3+-группы лизина, Б - гуанидогруппы аргинина:

полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота, W - моле-кулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, циф-рами -их длина в ангстремах

Иногда остаток P1 не столь доминирует в определении специфичности, и

больший вес приобретают взаимодействия с ферментом других аминокислотныхостатков субстрата. Например, специфичность калликреина — аналога трипсина,вовлеченного в регуляторные механизмы у животных, — определяется присут-ствием аргинина в положении P

1 и гидрофобного остатка в положении P

2 субстра-

та и оказывается, таким образом, гораздо более узкой.При действии протеиназ на нативные белковые субстраты специфичность

гидролиза определяется не только и даже не столько последовательностью амино-кислот расщепляемого участка, сколько его пространственной, стерической дос-тупностью. Так, погружение всего активного центра калликреина в своего родавпадину за счет удлинения прилегающих к нему пептидных петель фермента де-лает практически невозможным гидролиз обычных белковых субстратов, даже еслиони содержат последовательность гидрофобный остаток — аргинин. Калликреинатакует только такой белок, в котором соответствующая его специфичности по-следовательность расположена на выступе белка-субстрата, комплементарномвпадине активного центра фермента. Так достигается очень узкая, практическиуникальная специфичность калликреина — фермента, участвующего в отщепле-нии вазоактивных пептидов от белковых предшественников, но практически недействующего на другие белки.

Отметим еще одну особенность связывания белковых субстратов в актив-ном центре протеиназ. При образовании комплексов с достаточно длинными пеп-тидами, перекрывающими активный центр, укладка полипептйдной цепи в зонесвязывания требует, как предполагают, Определенного ее «перекручивания», не-которого искажения плоскостной структуры атакуемой ферментом пептидной свя-зи, что создает благоприятные условия для ее перехода из плоской в пирамидаль-ную конфигурацию, близкую к переходному состоянию. Следовательно, уже настадии образования комплекса Михаэлиса при связывании Субстрата подготав-ливается стереохимический переход, имеющий ключевое значение для эффек-тивного катализа. Характерные для сериновых протеиназ черты связывания суб-страта — множественность взаимодействий, точность ориентации относительногрупп каталитического центра и преимущественное связывание конформации,стереохимически приближенной к той, которая существует в переходном комплек-се, — типичны для многих ферментов. Необходимо подчеркнуть, что две важ-нейшие стадии катализа — связывание субстрата и собственно каталитическоепревращение, хотя — и рассматриваются раздельно, в действительности слиты вединый механизм.

10.5.2. Каталитический механизм

Топография каталитического центра сериновых протеиназ описана доста-точно подробно. Изучение структуры комплексов ферментов этого класса с раз-личными аналогами субстратов и ингибиторами в сочетании с данными по кине-тике катализа, химической модификации отдельных групп фермента, метода ЯМРи белковой инженерии привели к следующим представлениям о механизме дей-ствия сериновых протеиназ.

В превращении субстратов наибольшая роль принадлежит гидроксильной груп-пе серина-195 (здесь и далее нумерация остатков дается по последовательности наибо-лее изученного фермента — α-химотрипсина), имидазолу His-57, β-карбоксильной группеAsp-102, а также пептидным группам остатков Ser-195 и Gly-193. Таким образом, всериновых протеиназах, как и в других ферментах, активный центр собран из амино-кислотных остатков, расположенных в совершенно разных участках полипептидной цепи,но сближенных в пространственной структуре фермента (рис. 10.4).

Как правило, компоненты каталитического центра взаимодействуют с со-седними группами фермента, что закрепляет их в определенной ориентации ивидоизменяет химические характеристики. Например, карбоксильная группа ос-татка Asp-102 образует с соседями четыре водородные связи, которые стабилизи-руют ее анионную форму и, как следствие, смещают рKa

этого остатка к 2—3 вме-

сто 3,6 (величины, характерной для обычной β-карбоксильной группы аспараги-новой кислоты). Соседство этого карбоксилат-иона стабилизирует протон на од-

ном из атомов имидазольной группы гистидина — именно на том, который обра-щен к Asp-102, — и вместе с тем определенную электронную структуру имида-зольного кольца His-4). Последнее очень характерно для функциональных группбелка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имида золь-ной, в небольших молекулах.

Окружение функциональных групп в белке анизотропно.

Рис. 10.4. Расположение функциональ-ных групп в каталитическом центре се-риновых протеиназ

Показаны компоненты катали-тическогоцентра - остатки серина, гистидина и аспа-рагиновой кислоты; зачернены атомы азо-та и кислорода, участвующие в механизмекатализа. Прерывистыми линиями обозна-чены водородные связи. Нумерация дана поаминокислотной последовательности хи-мотрипсина; в других сериновых протеина-зах эти аминокислоты могут занимать дру-гие места в первичной структуре фермен-та, но их относительное расположение впространстве строго сохраняется

Влияние микроокружения на поведение функциональных групп в фермен-те весьма существенно, и все же реакционная способность компонентов активно-го центра сериновых протеиназ б отсутствие субстрата не обнаруживает рез-ких различий, которые выходили бы за рамки обычных вариаций в химическихсвойствах функциональных групп на поверхности белка. Так, сообщения о том,что имидазол His-57 и карбоксил Asp-102 в активном центре белка как бы поме-нялись свойствами, причем имидазол оказался более кислым, чем карбоксиль-яая группа, оказались ошибочными. Точно так же нельзя думать, что в свободномферменте происходит эстафетный перенос отрицательного заряда от карбокси-лат-иона Asp-102 на Ser-195 и гидроксил последнего превращается в гидроксид-ный ион — чрезвычайно сильный нуклеорил. Такая передача заряда была бы сразуже обесценена реакцией гидроксид-иона с водой:

Напротив, в фермент-субстратном комплексе химические свойстваучастников каталитического процесса, в том числе функциональных группкаталитического центра, меняются очень существенно, что определяется не толь-ко развитой системой нековалентных взаимодействий, охватывающей фермент -субстратный комплекс, но и изоляцией всей системы от воды.

Рис. 10.5. Механизм действия сериновых протеиназ:

А - функциональные группы в активном центре фермента. В левой полусфере -имида-зол гистидина, за которым расположен карбоксил остатка аспарагиновой кислоты, фиксиро-ванный системой водородных связей, в правой - боковая цепь серина и две водородные связиоксианионной впадины;

Б - в правой полусфере - продукт взаимодействия субстрата (показан тирозин в положении PJ),кислород размещен в оксианионной впадине; протон, покинувший кислород гидроксильной группысерина, перемещается к азоту имидазрла и далее - к атому азота расщепляемой пептидной связи;

В - молекула воды разместилась вблизи атома углерода карбонильной группы, причем еепротон переместился к азоту имидазола гистидина;

Г - гидроксильная группа воды присоединилась к углероду карбонильной группы,чем завершилось расщепление пептидной группы

По справедливому замечанию М.Дьюара, само связывание фермента и суб-страта предполагает как необходимую предпосылку отделение молекул воды, ок-ружающих до.реакции субстрат и заполняющих зону активного центра фермента.Вследствие этого каталитическая реакция переносится в совершенно иную среду.Это соображение еще раз подчеркивает неразрывную связь обеих сторон биоката-литического процесса — связывания и собственно превращения субстрата.

Гипотетический механизм действия сериновых протеиназ может быть опи-сан следующим образом (рис. 10.5). Необходимо учитывать, что происходящиепоследовательно процессы в действительности могут протекать синхронно.

Связывание полипептидного субстрата в активном центре ставит карбо-нильную группу атакуемой пептидной связи в такую позицию, что ее кислородоказывается в так называемой оксианионной впадине. Образование этим атомомдвух водородных связей с соответствующим образом ориентированными N—Н-группами, принадлежащими пептид-ным связям остатков Ser-195 и Gly-193, спо-собствует поляризации связи С=О и ее переходу в +С — О-, стабилизирует оксиа-нион. Положительный заряд на углероде карбонильной группы за счет точногосвязывания субстрата ферментом пространственно сближен с кислородом гидрок-сильной группы серина. Это вызывает поляризацию гид-роксильной группы, ко-торая принимает структуру, близкую к —СН

2—О-... Н+, что резко усиливает нук-

леофильность атома кислорода серина.Таким образом, в рассматриваемой схеме увеличение нуклеофильности се-

рина происходит под влиянием соответственно ориентированного и поляризован-ного за счет взаимодействия с ферментом карбонила субстрата, причем послед-ний экранирует нуклеофил, защищая его от воды.

Далее образуется ковалентная связь между углеродом субстрата и кислородомсубстрата, вероятно, более длинная и менее прочная, чем обычно (рис. 10.5, Б):

Протон, отщепившийся от гидроксила серина, перемещается по раектории,которая задана имидазольной группой His-57, приближаясь к непротонированному ато-му азота, а затем переходит к —NH-группе расщеплямой пептидной связи. Как известно,атом азота в пептидных группах практически лишен основных свойств из-за смещениясвободной электронной пары, обслуживающей связь С—N, которая носит характерчастично двойной. Однако после поляризации карбоксильной группы в оксианионнойвпадине плоскостной характер ептидной связи утрачивается, связь C—N становится про-стой и атом ййота приобретает свойства весьма сильного основания. Ввиду этого протон

от имидазольной группы — слабого основания — переходит к гpynne —NH—, описавсвоего рода дугу. Связь C—N разрывается и фрагмент пептидного субстрата высвобо-ждается (рис. 10.5, В):

Таким образом, выполнена первая задача катализа — расщеплена пептид-ная связь и высвобожден С-концевой фрагмент пептида. Оставшаяся часть пеп-тида (от остатка P

1 до аминного конца) пока сохраняет связь с ферментом через

остаток серина. По-видимому, эта связь может в определенных условиях стабили-зироваться за счет восстановления карбонильной группы, взаимной компенсацииположительного и отрицательного зарядов, так что фрагмент пептида образует сферментом сложноэфирную связь — образуется так называемый ацилфермент:

Действительно, при действии сериновых протеиназ на некоторые аналоги субстра-тов удается наблюдать, а иногда и выделить достаточно устойчивый ацил-фермент. Пригидролизе обычных субстратов, однако, такая стабилизация, видимо, не обязательна игидролизу подвергается производное с поляризованной карбонильной группой. Во вся-ком случае, после ухода С-концевого фрагмента пептида молекула воды занимает освобо-дившееся место и располагается так, что образует водородную связь с азотом имидазоль-ной группы, тогда как ее атом кислорода оказывается сближенным с положительнозаряженным атомом углерода карбонильной группы. Это приводит к отщеплению прото-на, присоединяющегося к имидазолу, и образованию гидроксильного иона, легко взаимо-действующего с положительно заряженным углеродом карбонила. Протон мигрирует к

кислороду серина, в результате чего с расщеплением связи С—О восстанавливается гидро-ксильная группа активного центра и высвобождается N-концевой фрагмент пептида, чеми завершается каталитический цикл (рис. 10.5, Г):

Эта стадия реакции протекает в целом аналогично первой, однако роль гид-роксильной группы серина переходит к молекуле воды.

Если принять, что происходит стабилизация промежуточного продукта иобразуется ацилфермент, механизм гидролиза последнего окажется практическитаким же. Следует лишь предположить поляризацию С-связи в сложноэфирнойгруппе ацилфермента за счет водородных связей в оксианионной впадине, чтоприведет к появлению положительного заряда на атоме углерода карбонильнойгруппы, т.е. к образованию того же самого промежуточного продукта, судьбакоторого прослежена выше.

Важнейшей чертой рассмотренного механизма действия сериновых протеи-наз, по-видимому, типичной и для других ферментов, является стабилизациятетраэдрического переходного состояния в фермент-субстратном комплек-се. Характерно, что весьма эффективными ингибиторами сериновых протеиназявляются алкилборные кислоты, в которых предсуществует тетраэдрическаяконфигурация заместителей — трех гидроксильных групп и алкильного остатка,— имитирующая структуру переходного состояния. Особенно эффективныпроизводные боронатного аналога фенилаланина, который связывается в участкеS1за счет бензильной группы и в каталитическом центре; соответствующая кон-станта ингибирования K

i составляет 10-8 М:

Альдегидonептиды — ингибиторы сериновых протеиназ, как упоминалось,образуют с серином активного центра ковалентную полуацетальную связь — струк-туру, аналогичную в известной мере ацилферменту. При этом свободный гидро-ксйл связывается в оксианионной впадине так же, как это происходит с кислоро-дом карбонильной группы в фермент-субстратном комплексе.

Хорошо известны ингибиторы сериновых протеиназ, которые при взаимо-действии с ферментом проходят первую фазу каталитического процесса и образуютацилфермент. Некоторые такие производные гидролизуются с измеримой скоро-стью, однако другие, в частности производные арилсульфофторидов и ряд фосфор-органических соединений, оказываются стабильными, что приводит к необратимо-му ингибированию фермента. Ниже показаны структуры стабильных ацилфермен-тов, получающихся при ингибировании сериновых протеиназ фенилметилсульфо-нил-фторидом (слева) и диизопропилфторфосфатом (справа):

Изложенные выше представления о механизме действия сериновых про-теиназ подтверждены методами белковой инженерии. Замена серинa активногоцентра в ряде ферментов этого семейства (при помощи сайт-специфичного мута-генеза) на аланин неизменно приводит к практически полной утрате активности.Замена компонентов каталитичекого центра в субтилизине (протеиназе бацилл)дала следующие результаты. Замена серина Ser-221 (остатка, соответствующегоSer-195 химотрипсине) аланинвм снижала активность фермента примерно в 106

раз, причем практически весь эффект приходился на снижение аталитическойконстанты k

KAT, а константа Михаэлиса сохраняла свое зачение. Такие же результа-

ты давала замена гистидина каталитического центра аланином. Несколько мень-шим, но все же очень значительным, было падение k

KAT при замене Asp-32 алани-

ном, kKAT в этом случае составляла 4-10

6 от величины, характеризующей исходный

ферментТаким образом, все компоненты «триады» каталитического центра крити-

чески важны для эффективного катализа. Роль остатка аспарагиновой кислоты,которая может показаться менее значимой с учетом приведенного выше механиз-ма, видимо, состоит в том, что карбоксилат-анион этого остатка, во-первых,фиксирует в пространстве имидазольное кольцо гистидина каталитического цен-тра и, во-вторых, обеспечивает закрепление приведенного выше на схемах тауто-мерного состояния имидазольной группы.

Труднее анализировать этим методом роль N—Н-групп, образующих ок-сианионную впадину, так как в химотрипсине и гомологичных ему ферментах обеони принадлежат пептидному скелету. Однако в субтилизине роль одного из ком-понентов оксианионной впадины выполняет амидная группа аспарагина. Заменаэтого остатка лейцином снижает эффективность поляризующего действия оксиа-нионной впадины на С=О-группировку субстрата, вследствие чего активностьснижается примерно в 103 раз, сохраняя тем не менее вполне заметный уровень.

10.6. ЛИЗОЦИМ

Лизоцим относится к нительно небольшой фермент, избирательно гидро-лизующий гликозидные связи в муреине — сложном биополимере, из которогопостроены стенки бактериальных клеток. Структурную основу муреина (рис.10.6) составляют полисахаридные цепи чередующихся остатков N-ацетилглюко-замина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных 1,4-β-гликозидными свя-зями. К карбоксильным группам лактильных остатков N-ацетилмурамовой ки-слоты присоединены своеобразно построенные пептидные цепочки, поперечно соеди-няющие полисахаридные цепи в протяженную двумерную структуру. Известны ли-зоцимы животных, содержащиеся преимущественно в секрете слизистых оболочек,которые они защищают от микроорганизмов, лизоцимы бактериофагов, используе-мые для проникновения в бактериальную клетку и выхода из нее зрелого фага. Наи-более подробно изучен лизоцим белка куриною яйца, который и будет рассматри-ваться далее. Он состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 129 аминокис-лотных остатков.

Рис. 10.6. Повторяющеесядисахаридное звено в полиса-харидной цепи муреина

К карбоксильной группе лактиль-ного фрагмента N-ацетилмурамо-вой кислоты (NAM) присоединя-ются поли-пептидные мостики, со-единяющие полисахаридные цепи.Лизоцим атакует β-гликозиднуюсвязь между остатками NAM и N-ацетилглюкозамина (NAG), так чтоатом кислорода этой связи оказы-вается у N-ацетилглюкозамина

Имеющиеся сведения о механизме действия лизоцима основаны по преи-муществу на данных рентгеноструктурного анализа фермента и его комплексов саналогами субстрата — олигосахаридами, построенными из. N-ацетилглюкозамина.

Рис. 10.7. Связывание субстрата в активном центре лизоцима

Показана система водородных связей (обозначены стрелками), обеспе-чивающих связывание части субстрата, - колец А, В, С. Эти связи до-полняются ван-дер-ваальсовыми контактами, в частности с индоль-ным кольцом триптофана

Образование комплекса протяженного полисахарида и фермента являетсярезультатом множественных нековалентных взаимодействий Между фермен-том и шестью последовательно расположенными моносахаридными звеньями А—В—С—D—E—F, укладывающимися в зоне связывания субстрата (рис. 10.7).

По-видимому, наиболее прочно связывается звено С субстрата, расположен-ное неподалеку от расщепляемой гликозидной связи. С ним фермент образует че-тыре водородные связи — две за счет ацета-мидной группировки субстрата, кото-рая формирует нечто вроде β-структуры с карбонильной группой остатка 107 иNH-группой остатка 59, и еще две связи за счет NH-групп индольных колец трип-тофана Тrр-62 и Тrр-63. Предшествующие звену С звенья А и В образуют с фер-ментом по одной водородной связи.

Определенную роль в формировании фермент-субстратного комплекса иг-рают и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, в частности между кольцом В и остат-ком Тrр-62. Впрочем, мутанты лизоцима, в которых этот остаток заменен на ти-розин, фенилаланин или гистидин, обладают даже несколько большей активно-стью. Характерно, что укладка первых трех звеньев полисахаридной цепи — А, В иС — требует локальных изменений в прилегающих участках фермента. Так, ин-дольное кольцо Тrр-62 перемещается на 0,7 А, освобождая место для плотногоукладывания субстрата.

Есть основания полагать, что образование фермент-субстратного комплек-са начинается со связывания моносахаридных звеньев А, В и С, вслед за которы-ми во впадину на поверхности фермента укладываются еще три звена: D, Е и F.Непосредственно наблюдать связывание этой части субстрата не удается, посколькугексасахарид быстро расщепляется лизоцимом. Однако размещение модели гек-сасахаридного субстрата на пространственной модели фермента показало, что звеньяЕ и F не только легко укладываются, но и образуют ряд нековалентных взаимо-действий в зоне связывания.

Сложнее обстоит дело с остатком D, а именно его β-гликозидная связь состатком Е атакуется ферментом в гексасахариде. Это звено нельзя разместить взоне связывания фермента в обычной для моносахаридов конформации «крес-ла» — оно не укладывается в субстратную щель из-за помех, вызываемых слиш-ком близкими контактами атомов С-6 и О-6 этого звена с лизоцимом. Эти поме-хи, однако, полностью снимаются, если звено D изменит свою конформацию иперейдет в напряженную конформацию «полукресла» (рис. 10.8). Таким образом,связывание субстрата должно благоприятствовать искажению конформации вблизиатома углерода С-1 звена D, который непосредственно участвует в реакции. Ха-рактерно, что аналоги субстрата, содержащие концевой глюконолактон, такжеимеющий конформацию полукресла, очень прочно связываются ферментом ивыступают в качестве его ингибиторов.

Рис. 10.8. Конформация «полукресла», свойственная шестичленнымциклам (в тоы числе моносахаридам) с двойной связью в цикле

Предполагают, что дальнейшее действие лизоцима (рис. 10.9) обусловленосближением гликозидной связи, соединяющей звенья D и Е, и сарбоксильнойгруппой остатка Glu-35, который входит в активный дентр фермента. Эта карбо-ксильная группа находится в гидрофобном кружений, поэтому ее диссоциацияпривела бы к энергетически невыгодному образованию отрицательно заряженно-го карбоксилат-аниона в геполярной среде, где затруднена его гидратация. Какследствие, карбоксильная группа остатка Glu-35 является более слабой кислотойю сравнению с другими карбоксильными группами лизоцима (ее рKa

близок к 6)и, как правило, в свободном ферменте она удерживает протон.

При сближении с гликозидной связью субстрата в фермент-субстратномкомплексе эта группа выступает как донор протона, присоединяющегося к глико-зидному атому кислорода с образованием неустойчивого положительно заряжен-ного оксониевого иона:

Рис. 10.9. Механизм действия лизоцима

Протон карбоксильной группы Glu-35 переносится на сближенный с ним кислород гли-козидной связи, образуя оксониевый ион. Далее электронная пара, обслу-живавшая связьатома С-1 NAG и этого атома кислорода, переносится на последний, что приводит к разры-ву гликозидной связи. В результате атом С-1 оказывается заряженным положительно, т.е.приобретает свойства карбокатиона, имеющего плоскую структуру, чему благоприятствуетконформация полукресла. Дополнительно заряд стабилизируется взаимодействием с отри-цательно заряженной карбоксилатной группой остатка Asp-52. На завершающей фазереакции молекула воды занимает место ушедшего кислорода гликозидной связи, поляри-зуется за счет взаимодействия с анионной формой Glu-35 и образовавшийся гидроксил-ион атакует несущий положительный заряд атом С-1 (остальные пояснения см. в тексте)

Далее оксониевый ион стабилизируется за счет перемещения к гаму кисло-рода электронной пары, обслуживавшей его связь с С-1-атомом звена D. Следуетразрыв связи между этими атомами и вместе с эм между звеньями D и Е, причемположительный заряд переносится а атом С-1 с образованием карбониевого иона.

Дисахарид Е— F или аналогичный фрагмент более длинного субстрата поки-дает после этого зону связывания субстрата, так как его соединяют с ней лишьнемногие нековалентные взаимодействия, а связь с фрагментом А—В—С—D утрачена.

Остаток Glu-35 критически важен для каталитического механизма — егозамена на глутамин, проведенная методом сайт-специфичного мутагенеза, лиша-ет фермент активности.

Положительный заряд на С-1 стабилизируется двумя факторами:1. Устанавливается электростатическое взаимодействие между ним и от-

рица-тельно заряженным карбоксилат-анионом Asp-52, весьма эффективноев отсутствие воды, которая вытесняется с поверхности рермента при связыва-нии субстрата. Заслуживает внимания то, что кислотные свойства карбоксиль-ной группы этого остатка в отличие IT карбоксила Glu-35 усилены его гид-рофильным окружением. Это объясняется тем, что анионная форма карбок-сила Asp-52 стабилизирутся путем включения в систему водородных связей ссоседними остатками.

Следует обратить внимание на столь характерное для белков вообще изме-нение свойств функциональных групп за счет разницы в их микроокружении. Рольэтой группы нельзя недооценить, но она, видимо, не абсолютно необходима —замена Asp-52 на аспарагин снижает дельную активность фермента примерно до5% от исходной, но не риводит к полной его инактивации.

2. Положительный заряд на атоме С-1 частично компенсируется мощени-ем электронной пары от соседнего с ним атома кислорода в цикле. При этом связьО — С+ приобретает характер частично двойной, что приводит к плоскостной кон-формации всего этого участка кольца и переходу атома С-1 из обычной тетраэд-рической в тригональную структуру:

Но как раз такая конформация, необходимая для стабилизации карбокатио-на, соответствует структуре полукресла и реализуется в фермент-субстратном ком-плексе за счет отмеченного выше искажения стереохимии кольца D при связыва-нии олигосахарида. По-видимому, небходимая для этого энергия заимствуется»из энергии связывания ютяженного субстрата.

Таким образом, электростатические и стереохимические эффекты, в ката-литическом центре лизоцима действуют согласованно, стабилизируя структуруплоского карбокатиона, характерную для переходного стояния в фермент-суб-стратном комплексе.

Далее карбокатион подвергается атаке молекулой воды, которая связываетсяанионом остатка Glu-35, занимая примерно то же место; котором находился ки-слород гликозидной связи перед ее расщеплением.

Анион Glu-35 поляризует молекулу воды, отрывая протон, что соответ-ствует свойствам карбоксильной группы этого остатка как слабой кислоты. Обра-зующийся сильный нуклеофил — ОН--ион — атакует положительно заряженный атомуглерода С-1 с одновременной нейтрализацией зарядов. Поскольку молекула водыприближается к плоскому карбокатиону с той же стороны, где находился кисло-род гликозидной связи, стереохимия атома С-1 полностью восстанавливается и гид-роксильная группа при этом атоме занимает, подобно кислороду гликозидной свя-зи, b-положение:

Этим завершается цикл ферментативной реакции, в результате которогоβ-гликозидная связь в муреине оказывается гидролизованной, а лизоцим — гото-вым к последующим циклам каталитического механизма.

Характерно, что лизоцим фага Т4 действует на полисахарид бактериальныхстенок аналогично, также используя перевод моносахаридного звена при атакуе-мой связи в конформацию полукресла, однако в каталитическом механизме это-го фермента принимают участие иные функциональные группы. Искажение кон-формации субстрата как существенный элемент каталитического меха-низма предполагают и для некоторых других ферментов, атакующих гликозид-ные связи, в частности для фосфорилазы.

В заключение отметим главнейшие черты механизма действия лизоцима:— организация системы нековалентных взаимодействий, фиксирующих

протяженный субстрат;— стерические ограничения на связывание именно того звена в субстрате, гли-

козидная связь которого расщепляется, и, как следствие, перевод его в необычнуюконформацию, выгодную для стабилизации карбокатиона в переходном состоянии;

— согласованное действие двух карбоксильных групп, одна из которых вы-ступает в качестве донора протона, а другая в анионной форме способствует ста-билизации карбокатиона в переходном комплексе.

10.7. АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗА

Как ни велики возможности ансамблей, образованных функциональнымигруппами белка, в ряде случаев они недостаточны, напримep при катализе неко-торых окислительно-восстановительных реакций. Такие затруднения, однако,могут быть преодолены путем вовлечения в механизм действия ферментов небел-ковых лигандов — ионов юталлов или коферментов. Примером такого механизмаявляется действие алкоголъдегидрогеназы печени.

Этот фермент катализирует перенос гидрид-иона Н- от группы СН2ОН

первичных спиртов различной структуры на никотинамидную часть офермента— никотинамидадениндинуклеотид (NAD). Схематически эта реакция может бытьпредставлена следующим образом:

Тот же фермент, как обычно, способен катализировать и обратную закцию— восстановление альдегида до спирта.

Хорошо изученная алкогольдегидрогеназа печени лошади построена из двуходинаковых субъединиц, каждая из которых содержит в одной полипептиднойцепи 374 аминокислотных остатка и образует за домена. Каталитический до-мен, в котором локализованы все компоненты активного центра фермента, в томчисле и остатки, связывающие еще один небелковый лиганд — участвующий вкатализе ион цинка, — объединяет N-концевой (остатки 1—175) и С-концевой(остатки 319—374) фрагменты полипептидной цепи.

Кофермент (нуклеотид)связывающий домен сформирован центральнымфрагментом (остатки 176—318). По вторичной и третичной струкуре он очень схо-ден с нуклеотидсвязывающими доменами других зрментов, хотя их первичныеструктуры не обнаруживают сколько-нибудь существенных соответствий.

Предполагают, что характерная пространственная структура нуклеотидсвя-зывающего домена возникла на весьма ранних этапах эволюции и многократноиспользовалась как готовый функциональный модулъ, который мог объединятьсяс соответствующими каталитическими центрами, образуя различные ферменты,содержащие NAD в качестве кофермента. Понятно, что такой путь эволюцииферментов эффективнее создания всякий раз de novo функционально однотип-ной структуры.

Контакт между субъединицами определяется преимущественно взаимодей-ствием нуклеотидсвязывающих доменов, которые образуют своего рода «ядро»димера. Как это нередко бывает при образовании четвертичной структуры,β-складчатый лист одной субъединицы «стыкуется» с такой же структурой другойсубъединицы, образуя весьма протяженный β-складчатый слой. Это взаимодейст-вие дополняется развитой сетью гидрофобных контактов, в которых участвует около30 аминокислотных остатков, что делает диссоциацию димера весьма трудной дажев 8 М мочевине.

Связывание кофермента. Аденозиндифосфатрибозный фрагмент NAD даетмножество нековалентных контактов с ферментом. Аденин располагается в гидро-фобном кармане, 2-гидроксил рибозы аденозина образует водородную связь с кар-боксилом Asp-223, пирофосфатная группировка — солевую связь с гуанидином Arg-47, принадлежащего каталитическому домену. «Концевой», т.е. ближайший к нико-тин-амиду, остаток рибозы образует водородные связи с карбонильными группамиGly-293 и Пе-269. Множественность нековалентных связей обеспечивает точное раз-мещение кофермента в активном центре алкогольдегидрогеназы.

Связывание субстрата. Зона связывания субстрата располагается в глубо-ком «кармане», канале между каталитическим и нуклеотидсвязывающим доме-нами одной из субъединиц, но в нее входят и отдельные аминокислотные остаткивторой субъединицы. Этот канал как бы выстлан гидрофобными боковыми це-пями, что позволяет установить гидрофобные контакты с радикалом В спирта.

Интересно, что формирование этого канала завершается после связывания NADи вызванного этим изменения конформации фермента. Алкогольдегидрогеназапечени может связывать весьма различные спирты — от этанола до производныхбензилового спирта С

2ОН, ω-оксикислот и даже стероидных спиртов. Важ-

но лишь, чтобы они содержали гидрофобный фрагмент в своей структуре. Средиостатков, участвующих в связывании бчнзилового спирта, Leu-116 и Leu-57, Val-294 и Phe-93. Сорбируясь, субстрат выталкивает из зоны связывания несколькомолекул воды и в определенной мере стягивает прилегающую часть фермента вболее компактную структуру. Не исключено, что это весьма небольшое изменениестроения фермента, наведенное связавшимся субстратом, играет существеннуюроль в катализе.

Рис. 10.10. Размещение субстрата в ак-тивном центре алкогольдегидрогеназы

При связывании субстрата (спирта) их) гид-роксильная группа сближается : ионом цин-ка и утрачивает протон, превращаясь в ал-коголят. В отщеплении протона и стабили-зации алкоголята участвует система водо-родных яязей с Ser-48 и His-51

Компоненты каталитического центра. Каталитический центр алко-гольдегидрогеназы содержит ион цинка, который окружен четырьмя лиганда-ми, расположенными в вершинах неправильного тетраэдра. Три из них при-надлежат белку — это тиоловые группы остатков Cys-46 Hii-н и Cys-174 и ими-дазол His-67. Четвертое координационное место занимает кислород субстрата, а вего отсутствие — молекула воды. Гидроксильная группа остатка Ser-48 способнаобразовать водородную связь с кислородом лиганда — воды или спирта.

Вероятный механизм действия фермента. Предполагают, что спирт, гидро-фобная цепь которого связана в гидрофобном канале фермента, ориентируетсятак, что его кислород танавливает непосредственную связь с ионом цинка, вытес-няя из твертого координационного положения находившуюся там молекулу ды(рис. 10.10). Это приводит к отщеплению протона гидроксильной группы, причемсвязь с ионом цинка образует алкоголят-анион спирта R-СН

Понятно, что существование такой структуры, чрезвычайно чувствительной кгидролизу, возможно только внутри каталитического центра, где реакция разыгрыва-ется в отсутствие контактов с водой. В этом еще раз проявляется характерная особен-ность ферментативного катализа — перенос реакции в благоприятную среду.

Алкоголят-анион далее стабилизируется путем смещения электронной плот-ности от атома кислорода алкоголята к связи С—О, которая в конечном счетепревращается в двойную, а гидрид-ион от атома углерода переносится, видимо,по структурно детерминированному пути в положение 4 никотинамидного ядракофермента, причем NAD+ превращается в восстановленную форму NADH:

При обратной реакции перенос гидрид-иона происходит от NADH к угле-роду альдегидной группы, двойная связь которой оказывается поляризованной засчет влияния связанного с ферментом иона цинка на атом кислорода. Такая поля-ризация усиливает частичный положительный заряд на атоме углерода карбониль-ной группы, что благоприятствует присоединению к этому атому гидрид-иона.

Рассмотренный пример показывает возможность обогащения функцио-нальных свойств ферментов путем включения лигандов — иона металла и кофак-тора — в структуру активного центра.

10.8. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

Описанный механизм не является единственным для дегидрогеназ. Извест-ны ферменты, которые способны катализировать сходную реакцию, не прибегаяк использованию иона цинка или другого металла. Таковы, например, лактат- ималатдегидрогеназы. Каталитический центр лактатдегидрогеназы описан доста-точно хорошо, что подтверждается успехом направленного изменения субстрат-ной специфичности лактатдегидрогеназы термофильной бактерии Bacillusstearothermophilus.

Связывание пирувата в активном центре лактатдегидрогеназы определяет-ся в первую очередь электростатическим взаимодействием между карбоксилат-ной группой субстрата и гуанидогруппой остатка Arg-171 (рис. 10.11). Другие функ-циональные группы фермента, участвующие в связывании пирувата, одновре-менно выполняют и собственно каталитическую функцию — частый случай длянебольших субстратов.

Рис. 10.11. Каталитический центр лактатдегидрогеназы

При связывании пирувата в активном центре образуется ионная пара между карбокси-лат-анионом субстрата и гуанидиниевой группой Arg-171. Взаимодействие протониро-ванной имидазольной группы остатка His-193 с С=О-группировкой субстрата усилива-ет поляризацию последней, а образующийся дефицит электронов у углерода кетогруппыкомпенсируется переносом гидрид-иона Н- от сближенного с субстратом никотинамид-ного кольца кофермента. Замена Gin-102 аргинином и введение мутаций, несколько уве-личивающих впадину зоны связывания, дает ферменту возможность связать оксалоаце-тат, и он становится малатдегидрогеназой

Существенно, что образование ионной пары индуцирует характерное из-менение конформации в активном центре — петля, включающая остатки 98—110, смещается, прикрывая каталитический центр и связанный в нем субстрат.Этим достигается перенос реакции из воды в благоприятную для процесса сре-ду, приближение к центру реакции — карбонильной группе субстрата сразу не-скольких функциональных групп фермента.

Еще одним следствием такого переноса является значительное усилениевзаимодействия между карбоксильной группой субстрата и гуанидином Arg-171,а также образование достаточно плотного окружения пирувата, что способствуетповышению субстратной специфичности лактатдегидрогеназы. Этот фермент натри порядка активнее в отношении пирувата, чем оксалоацетата — субстрата ма-латдегидрогеназы, хотя оба фермента родственны, используют в качестве кофер-мента NAD, имеют сходную пространственную структуру и действуют по одно-типному механизму.

В связанном пирувате карбонильная группа поляризуется под влияниемкатионной гуанидогруппы Arg-109, принадлежащей подвижной петле. Это при-водит к возрастанию частичного отрицательного заряда на кислородном атоме иположительного — на атоме углерода группы С=O субстрата. Последнее облегчаетперенос гидрид-иона от дигидропиридиновой формы никотинамидного фрагментаNADH на углерод карбонильной группы, в то время как протон пространственносближенного с субстратом имидазола His-193 переносится на отрицательно заря-женный кислород, чем и завершается восстановление карбонильной группы ипревращение пирувата в лактат.

Заметим, что роль имидазольного кольца His-193 как донора протона об-легчается тем, что эта группа находится под влиянием карбоксила Asp-168, кото-рый отдает свой протон имидазолу, компенсируя переход протона от другого ато-ма азота имидазола на карбонильный кислород субстрата. Таким образом, здесьреализуется нечто вроде «эстафеты заряда», впервые обнаруженной для ансамбляAsp—His в сериновых протеиназах.

Как уже отмечалось, фермент обладает весьма высокой субстратной специ-фичностью. Он на три порядка хуже катализирует близкую по характеру реакциювосстановления оксалоацетата. Видимо, связывание субстрата, отличающегося отпирувата присутствием еще одной карбоксильной группы, было бы сопряжено спереносом этого карбоксилат-аниона из воды в зону связывания субстрата, а энер-гетические затраты на его дегидратацию не были бы ничем скомпенсированы. За-мена остатка Gin-102 в подвижной петле фермента на аргинин позволяет ввести взону связывания субстрата модифицированного фермента катионную гуанидино-вую группу, способную в отсутствие воды установить электростатическое взаимо-действие со вторым карбоксилат-ионом оксалоацетата. Этого достаточно для пре-вращения лактатдегидрогеназы в высокоэффективную малатдегидрогеназу: фер-мент катализирует реакцию с оксалоацетатом в 8400 раз эффективнее, чем с пи-руватом, и обнаруживает даже несколько лучшую активность, чем природная ма-латдегидрогеназа.

10.9. ТРИОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗА

Триоэофосфатизомераэа — фермент, относящийся к классу изомераз,катализирует взаимопревращения диоксиацетонфосфата и D-глицеральдегид-3-фосфата:

Фермент относится к числу наиболее эффективных: скорость превращениясубстрата определяется скоростью его диффузии. Хорошо изучено строение трио-зофосфатизомеразы трипаносом, которой структурно близок фермент живот-ных. Триозофосфатизомераза — димер, образованный идентичными субъеди-ницами.Каждая из них представляет собой полипептидную цепь из 250 амино-кислотных остатков, третичная структура которой относится к α/β-типу исодержит правильно чередующиеся восемь α-спиралей и восемь отрезков β-струк-туры. β-Структурные участкиобразуют внутренний цилиндр, защищенныйот воды α-спиралями (рис.10.12). В формировании каждого из двухактивных центров участвуют обе субъединицы, поэтому мономер не активен.

Рис. 10.12. Размещение каталити-ческого центра в пространственнойструктуре триозофосфатизомеразы

Функциональные группы каталитическо-го центра размещены во впадине, котораязакрывается при связывании субстрата засчет перемещения петли, расположенноймежду отрезком β3 и спиралью α3

В то же время между активными центрами нет кооперативности, инымисловами функционирование любого из них не зависит от того, действует ли другойцентр, хотя присутствие второй субъединицы обязательно.

В связывании субстрата важнейшая роль принадлежит фосфатной группе,которая образует с ферментом семь водородных связей, дополняемых ионнымвзаимодействием с аммонийной группой Lys-13. Образование фермент-субстрат-ного комплекса вызывает довольно значительное — на 3 — 5 А — перемещениеподвижной петли, содержащей остатки 167—178. Главным результатом этого из-менения конформации фермента является исключение воды из активного цен-тра, что благоприятствует протеканию изомеризации.

В связанном субстрате (в качестве которого далее рассматриваетсядиоксиацетонфосфат) один из атомов водорода метиленовой группы ока-зывается в поле отрицательно заряженного карбоксилат-иона остатка Glu-167.Этот водород отщепляется от субстрата как протон и переходит к карбоксилуGlu-167. Освободившаяся электронная пара, которая обслуживала связь С-Н, мигрирует к соседней связи С—С, делая ее двойной. Это влечет за собойполяризацию двойной связи C=O с появлением на ее атоме кислорода отри-цательного заряда, стабилизируемого электростатическим взаимодействиемс катионной аммонийной группой остатка Lys-13:

Вся эта цепь превращений переводит субстрат в анионную форму неустой-чивого ендиола:

Далее протон переходит от карбоксильной группы Glu-167 ко второму уг-леродному атому субстрата, присоединяясь к двойной связи С=С.

Одновременно между С-1 и атомом кислорода устанавливается двойнаясвязь за счет отщепления протона от гидроксильной группы при С-1 и его мигра-ции сначала к азоту имидазольной группы His-95, а затем к отрицательно заря-женному кислороду при С-2 субстрата. Путь этой миграции предопределен, как ив механизме действия сериновых протеиназ, присутствием в активном центреимидазольной группы гистидина:

Замена глутаминовой кислоты в положении 167 на аспарагиновую, прове-ден-ная методом белковой инженерии, отодвигает критически важную для катализа кар-боксильную группу от субстрата примерно на 1 А, в результате чего скорость реакцииснижается почти в 103 раз. То, что модифицированный таким образом фермент все жесохраняет активность, можно объяснить колебаниями в структуре фермент-суб-стратного комплекса, которые могут, хотя и с малой вероятностью, сближать карбок-сильную группу аспарагиновой кислоты с углеродными атомами субстрата.

Таким образом, и в механизме действия триозофосфатизомеразы проявля-ются характерные черты ферментативного катализа — перенос реакции из воднойфазы внутрь фермента, что обусловлено перемещением одного из участков струк-

туры в ответ на связывание субстрата; координированное действие ансамбля функ-циональных групп, включенных вместе с прочно связанным субстратом в единуюинтегрированную систему.

10.10. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА («АВЗИМЫ»)

Проверкой правильности понимания принципов ферментативного ката-лиза, в особенности представлений о важнейшей роли, которая в этом процессепринад-лежит стабилизации переходного комплекса путем его избирательногосвязывания в каталитическом центре, явилось создание искусственных фермен-тов, так называемых абзимов. Абзимы (от англ. AntiBody + enZYME) — пред-ставляют собой антитела, специфически связывающие структуры, которые хими-чески близки переходному состоянию, образующемуся в процессе катализа. Ме-тод создания абзимов основан на том, что среди огромного множества возможныхструктур иммуноглобулинов (см. гл. 13) всегда могут быть найдены такие, кото-рые содержат соответствующим образом ориентированные группы и способны из-бирательно связывать стабильные химические соединения, структурно близкиепереходному состоянию той или иной реакции.

При образовании комплекса с таким иммуноглобулином возникнут благо-приятные условия для того, чтобы строение субстрата приблизилось к структурепереходного состояния. Иными словами, будет понижена энергия активации суб-страта, т.е. энергия, которую необходимо затратить на его перевод из основногосостояния в переходное. Соответственно должны возрасти вероятность его пре-вращения в продукт, а значит, и скорость реакции. Разумеется, пока речь идет не осоздании катализаторов, эквивалентных по эффективности ферментам, а о полу-чении их упрощенных моделей, хотя некоторые из них, возможно, и окажутсяпрактически пригодными.

Первый подход к созданию абзимов состоял в получении антител, спе-цифически связывающих и стабилизирующих аналоги переходных состояний,свойственных гидролитическим реакциям. Очевидно, что антитело к соединению(гаптену), напоминающему конфигурацию переходного состояния, будет стаби-лизировать эту структуру и тем самым понижать свободную энергию активации.Хорошо известно (см. разд. 10.5), что гидролиз амидов и сложных эфиров (напри-мер, щелочью) проходит через стадию образования тетраэдрического проме-жуточного продукта:

Анализ механизма действия гидролитических ферментов, в частности се-риновых протеиназ (см. разд. 10.5), показывает, что его существенной чертой,действительно, является стабилизация переходного состояния, структурно близ-кого такому тетраэдрическому промежуточному продукту. Соответствующеесоединение, которое имитировало бы такую структуру и содержало бы у одногоуглеродного атома три атома кислорода (или два атома кислорода и один азотапри моделировании протеиназ), синтезировать не удается — оно слишком неустой-чиво. Однако возможно получение достаточно стабильных тетраэдрических струк-тур, стереохимически близких ему, в которых центральное положение вместо ато-ма углерода занимает атом фосфора. Присоединение такого рода соединений кбелку-носителю в качестве гаптенов и иммунизация этими производными жи-вотных позволяет получить антитела, специфически связывающие молекулы,близкие по структуре и конформации к переходному состоянию, через котороепроисходит гидролиз сложных эфиров или амидов карбоновых кислот. Так, присоздании абзимов, рассчитанных на ускорение гидролиза сложного эфира уголь-ной кислоты — р-нитро-фенил-N,N,N-триметиламмонийэтилкарбоната

— были получены иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с тет-раэдрическими заряженными фосфонатными и фосфатными аналогами переход-ного состояния реакций гидролиза этого соединения, которое выглядит следую-щим образом:

Здесь .Его модель - фосфонатный аналог —

имеет структуру, стереохимически близкую, хотя и отличающуюся рядом деталей,в частности непосредственным присоединением углерода боковой цепи к централь-

ному атому фосфора, длиной этой цепи, плотностью отрицательных зарядов наатомах кислорода и т.п. Фосфонатный аналог был присоединен через карбоксиль-ную группу к белку-носителю. К этой конструкции получены моноклональныеантитела, которые, как оказалось, катализировали гидролиз субстрата — эфираугольной кислоты:

Кинетика этой, как и обычных ферментативных реакций, подчиняется урав-нению Михаэлиса—Ментен. Гидролиз ингибируется соединениями — аналогамипереходного состояния, причем К

i оказывались значительно ниже субстратной К

Следовательно, в соответствии с ожиданием антитело связывает аналог переход-ного состояния (это отражает К

i) прочнее, чем субстрат (что характеризует К

Это подтверждает важность стабилизации переходного состояния для катализа.Скорость реакции зависит от первой степени концентрации гидроксильного ионаи превышает некаталитическую в 103—104 раз. Разумеется, ферментативная реак-ция дала бы на несколько порядков большее ускорение, однако необходимо учи-тывать, что при конструировании абзима моделировалась только одна, хотя и весьмаважная, черта энзиматического катализа — стабилизация переходного состояния.К тому же, как указывалось, связывание фосфонатного аналога лишь приближен-но, а не совершенно точно воспроизводит систему стабилизирующих взаимодей-ствий. Существен принципиальный результат — создание фермента, пусть поканедостаточно эффективного, на основе имеющихся представлений об основныхчертах каталитического процесса.

Для реакции характерна субстратная специфичность — антитело противаналога катализирует гидролиз только указанного выше соединения, но не родст-венного ему метил-р-нитрофенилкарбоната:

Рентгеноетруктурный анализ антитела, связывающего фосфорилхолин и,

вероятно, имеющего что-то общее с рассматриваемым каталитическим антите-лом, показывает, что гуанидогруппа остатка Arg-52 и гидроксил Туг-33 тяжелойцепи могут взаимодействовать с кислородом фосфатной группы. По-видимому, ив каталитическом антителе аналогичным образом стабилизируется переходноесостояние и эти же аминокислотные остатки связываются с атомами кислорода вего структуре. В то же время остаток Glu-35, также находящийся в тяжелой цепи,образует ионную связь с аммонийной группой субстрата, чем, в частности, обес-печивается специфичность абзима.

Иной путь моделирования принципов энзиматического катализа состоит виспользовании антител для надлежающего сближения реагирующих компо-нентов или участков претерпевающей превращение молекулы в активном цен-тре. Так, антитело, специфически связывающее бициклический ингибиторхоризматмутазы, избирательно ускоряет превращение хоризмовой кислоты в пре-феновую в 104 раз k

KАT = = 2,7 мин-1, К

т = 260 мкМ).

Антитело к фосфатному аналогу δ- лактона, формула которого приведенаниже, ускоряет в 167 раз циклизацию фенилового эфира соответствующей δ-окси-кислоты в лактон:

Интересные возможности открывает и введение в каталитические антитела до-полнительных функциональных групп. Таким образом, получение абзимов не только под-тверждает правильность современных представлений о природе ферментативного катали-за, но и открывает принципиальную возможность создания биологических катализаторовнового типа, в том числе и для реакций, не существующих в природе.

ГЛАВА 11ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА

Полипептидная цепь — первичный продукт биосинтеза белка — часто под-вергается химическим превращениям, изменяющим ее ковалентную структуру.Такие превращения могут происходить как в процессе трансляции (котрансля-ционная модификация), так и после ее окончания, нередко уже после сформиро-вания пространственной структуры белка. Многообразие этих реакций, завершаю-щих созревание белка или видоизменяющих его функциональные свойства, оченьвелико — их число достигает 300—400. Иногда реакции посттрансляционной мо-дификации называют процессингом (от англ, processing — обработка), подчер-кивая этим, что они как бы завершают биосинтез белка. Этот термин не вполнеточен, поскольку некоторые реакции, например фосфорилирование, могут про-исходить с одной и той же молекулой неоднократно, регулируя ее активность, дру-гие, вероятно, служат сигналом к расщеплению белка.

Обычно реакции посттрансляционной модификации катализируются специ-фическими ферментами, хотя известны и внутримолекулярные превращения бел-ков, происходящие без участия «внешних» ферментов. Реакции посттрансляционноймодификации, как правило, имеющие функциональный смысл, направленность,принято отличать от более или менее случайных повреждающих реакций, такжевесьма многочисленных, которые происходят с белками in vivo, отражаясь на их струк-турной целостности и функциональных свойствах. К ним относят, например, реак-ции окисления, случайный протеолиз и некаталитическое дезамидирование белка,присоединение глюкозы к аминогруппам некоторых белков, в частности гемоглоби-на, при ее повышенном содержании в крови при диабете и т.п.

Реакции посттрансляционной модификации являются нематричнымипроцессами, они не кодируются непосредственно, поэтому нередко протекаютнеполно, что приводит к образованию множественных форм того или иного бел-ка — продуктов частичного превращения.

Каков функциональный смысл реакций посттрансляционной модификации?На этот вопрос в обобщенной форме можно дать следующий ответ. Во-первых, не-смотря на удивительное богатство структур, образуемых аминокислотными остатка-ми и их ансамблями в пространственной структуре белка, это многообразие далеконе безгранично. Разумеется, образование комплексов с кофакторами (металлами,коферментами и т.п.) резко расширяет функциональные возможности белка. Од-нако и этот путь не всегда оказывается достаточным. В таких случаях структурнаяпалитра белка может быть обогащена путем направленного преобразования боковыхцепей тех или иных аминокислотных остатков, а иногда и молекулы в целом.

Во-вторых, что не менее важно, некоторые реакции посттрансляционноймодификации, в особенности обратимые, позволяют управлять активностью бел-ка или целых групп белков в ответ на изменяющиеся потребности клетки.

Заметим, что реакции посттрансляционной модификации в отличие от пред-шествующих им стадий трансляции очень индивидуальны, иногда свойственны толькоодному белку — к таким относятся, например, гидроксилирование остатков пролинав коллагене, иодирование тиреоглобулина и некоторые другие. Специфич-ностьпосттрансляционной модификации открывает перспективу избирательного воздей-ствия на процессинг и, следовательно, функцию тех или иных белков.

Далее мы рассмотрим некоторые важнейшие реакции посттрансляционноймодификации.

11.1. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПЕРЕГРУППИРОВКИ В БЕЛКАХ

Эта группа превращений стоит особняком, поскольку они не катализируютсякаким-либо ферментом, а являются результатом внутримолекулярной реакции,направляемой, по-видимому, специфической пространственной структурой бел-ка-предшественника. Последнее обстоятельство сближает такие реакции с ката-литическими, поэтому иногда их описывают как автокаталитические процессы,хотя аналогия не вполне справедлива, ибо в этом случае «активный центр» дейст-вует не многократно, как у ферментов, а только однажды.

Профермент гистидиндекарбоксилазы молочнокислых бактерий LactobacilLus,а также Clostridiwn perfringens синтезируется в виде одной полипептидной π-цепи с мо-лекулярной массой 34 кДа. При внутримолекулярной активации она превращается в цепиα- и β с молекулярными массами соответственно 25 и 9 кДа. α-Цепь несет на аминномконце остаток пировиноградной кислоты, который выполняет в активном центре фер-мента роль своеобразного кофактора и взаимодействует с аминогруппой гистидина, под-вергающегося декарбоксилированию. Этот пирувоильный остаток функционально ана-

логичен пиридоксальфосфату — типичному кофактору ферментов аминокислотного об-мена. Заметим, что π-цепь и продукт ее расщепления, построенный из α- и β-цепей, обра-зуют гексамерную четвертичную структуру.

Особенно интересен путь расщепления π-цепи на α- и β-цепи, не являю-щийся гидролитическим. В последовательности аминокислот, которая соединяетбудущие α- и β-цепь

по-видимому, под влиянием пространственно сближенных функциональных групппрогистидиндекарбоксилазы происходит такая перегруппировка, в которой не-посредственно участвуют соседствующие остатки серина. Сначала карбонильнаягруппа предшествующего остатка серина переносится с аминной на гидроксиль-ную группу следующего остатка:

Это, так называния N,O-ацильная миграция. Затем ацильный компонент(β-цепь) негидролитически элиминируется за счет отщепления α-атома водоро-да остатка серина (β-элиминирование), оставляя на аминном конце уже образо-вавшейся цепи весьма неустойчивый остаток дегидроаланина:

Дегидроаланин, по-видимому, изомеризуется в иминопроизводное пиру-воильного остатка, которое затем реагирует с водой, отщепляя аммиак и прев-ращаясь в пирувоильный остаток:

Следует подчеркнуть, что собственно расщепление полипептидной цепипроисходит в этом случае без участия воды, негидролитическим путем. Интерес-но, что у других ферментов аминокислотного обмена — лиаз, отщепляющих ам-миак от фенилаланина или гистидина с образованием соответствующих непре-дельных кислот (коричной в случае фенилаланина или урокаиновой в случае гис-тидина), наблюдается похожее превращение, которое приводит, однако, не к рас-щеплению пептидной цепи, а к образованию дегидроаланина, по-видимому, ста-билизи-рованного в пространственной структуре фермента. Вероятно, предшест-венником дегидроаланина в этих случаях является активированное производноесерина или цистеина. Дегидроаланин в таких ферментах входит в состав катали-тического центра, выступая в качестве электрофильной группы. Заметим, чтоэлектрофильные группы не свойственны традиционно построенным белкам.

11.2. ИОДИРОВАНИЕ ОСТАТКОВ ТИРОЗИНА

Эта реакция характерна для тиреоглобулина — высокомолекулярного бел-ка, содержащегося в щитовидной железе и являющегося источником тироксина— гормона, влияющего на обменные процессы в тканях. Процесс начинается сизбирательного кодирования немногих остатков тирозина в этом белке под дейст-вием иода, который образуется в свою очередь при окислении иодид-иона, катали-зируемом пероксидазой:

Иод далее атакует ОН-грулпу тирозина по радикальному механизму и, от-щепляя водород с образованием HI, оставляет неспаренный электрон на кисло-роде тирозина. Этот электрон способен перемещаться по ароматической системесопряженных связей и может быть локализован в пара-положении, что приводит

к разрыву связи С — СН2 по так называемому гомолитическому пути. Затем весь

ароматический фрагмент, имеющий неспаренный электрон в параположении,внутримолекулярно переносится на кислород пространственно сближенного ос-татка дииод-тирозина:

На модельных пептидах показано, что выход этой реакции, про текающейнеферментативно, зависит от относительного расположения остатков тирозина,которое в тиреоглобулине, видимо, особенно благоприятствует процессу (для чегооба ароматических ядра должны быть копланарны). Иодированию и превраще-нию в тироксин преимущественно подвергаются в этом белке остатки Туг-5, 1291,2555, 2748.

Высвобождение тироксина из тиреоглобулина происходит под действиемспецифической аспартильной протеиназы, содержащейся в щитовидной железе.

11.3. ОБРАЗОВАНИЕ ОСТАТКОВ γ-КАРБОКСИГЛУТАМИНОВОЙКИСЛОТЫ

Такая реакция происходит в некоторых животных белках, функ-ционирование которых требует образования комплекса с ионами кальция. Онасостоит в прямом включении СO

2 в γ-метиленовую группу остатка глутаминовой

кислоты:

Эта реакция, протекающая только в присутствии- витамина К,свойственна протромбину и многим другим белкам системы свертывания крови,в которых карбоксилированию подвергаются несколько (обычно около 10)остатков глутаминовой кислоты в аминоконцевом участке полипептидной цепи.Остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты за счет двух сближенных карбоксиль-ных групп могут образовывать комплексы с ионами кальция, связанными в то жевремя с фосфолипидами клеточных мембран. Таким образом, ионы кальция вы-ступают как своеобразные мостики, способствующие концентрированию белковсистемы свертывания крови на поверхности клеток, что облегчает их взаимодей-ствие друг с другом:

Сходную роль играют остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты и в белкекостной ткани - остеокальцине, который взаимодействует с ионами кальция наповерхности частиц гидроксилапатита - минерального компонента кости. Анало-гично модифицированы остатки глутаминовой кислоты в овокальцине и атеро-кальцине, некоторых белках хрящей, почечных канальцев, а также в некоторыхбелках рибосом, которые содержат и β-карбоксиаспарагиновую кислоту.

Дефицит витамина К или присутствие его специфических ингибиторов,например дикумарина, блокирует γ-карбоксилирование остатков глутаминовойкислоты и приводит к глубоким нарушениям функции соответствующих белков,в частности к торможению свертывания крови.

11.4. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ. ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Гликопротеинами называют белки, содержащие ковалентно связанныйуглеводный компонент. Основываясь на структурной роли углеводного компо-нента, гликопротеины можно разделить на два класса. К одному из них принадле-жат так называемые протеогликаны, их пептидная цепь настолько плотно униза-на олигосахаридными цепочками, что молекула в целом выступает подобноразветвленному полисахариду, ее полипептидный скелет постоянно скрыт. Про-теогликаны играют немалую роль в формировании межклеточного матрикса втканях животных. Ко второму классу относятся такие гликопротеины, в которыхполипептидная цепь формирует пространственную структуру по обычным пра-вилам, свойственным белкам, а углеводные компоненты присоединены к белко-вой глобуле. Далее речь будет идти именно о таких гликопротеинах.

Известны два основных способа ковалентного присоединения олигосаха-ридных цепочек к белкам.

11.4.1. N-Гликопротеины

В этих гликопротеинах углеводный компонент присоединяется N-глико-зидной сеяаъю (отсюда и название) к амидпому азоту остатка аспарагина,включенного в пептидную цепь. Первым моносахаридным звеном, образующимN-гликозидную связь с аспарагином в гликопротеинах этой группы, всегда ока-зывается N-ацетилглюкозамин, так что «узел» присоединения имеет следующуюструктуру:

N-Гликозидная связь легко расщепляется в кислой среде, поэтому N-гли-копротеины кислотолабилъны. В гликопротеинах этого типа к остатку аспараги-на присоединен олигосахарид, в котором к «узловому» остатку N- ацетилглюко-замина присоединен 1-4-связью еще один остаток N-ацетилглюкозамина, далееследуют несколько остатков маннозы, могут встречаться остатки N-ацетилглю-козамина, галактозы, нейраминовой кислоты, фукозы и некоторые другие моно-сахаридные звенья.

Биосинтез N-гликопротеинов происходит в шероховатом ретикулуме, при-чем на амидную группу аспарагина переносится под действием специализи-рованного фермента за один шаг олигосахарид весьма сложной структуры G1с 3

-Маn9G1сNAс

2, где Glc - остаток глюкозы, Man -маннозы, GlcNAc - N-ацетил-

глюкозамина. Далее он подвергается более или менее сложному процессингу -отщеплению концевых моноеаха-ридных звеньев, в частности полному отщепле-нию остатков глюкозы при помощи специфических глюкозидаз, частичному -маннозы маннозидазами. В результате этого остается так называемое «ядро», ккоторому присоединяются другие моносахариды:

За этим следует последовательное включение отдельных моноеахаридныхзвеньев, в результате чего к «маннозному ядру» присоединяются трисахаридныеструктуры NeuNAc -- Gal -- GlcNac--, где NeuNAc -ацетилнейраминовая кисло-

та, Gal - галактоза, иногда и другие моносахариды, например фукоза - Fuc. Этиреакции специфичны, поэтому образующаяся в результате завершенная структу-ра олигосахарида различна у разных белков. Ниже показана типичная развет-вленная структура углеводных компонентов некоторых N-гликопротеинов:

N-Гликозилирование подвергаются лишь немногие из остатков аспарагина, имею-щихся в белках. Например, в панкреатической рибонуклеазе из 34 остатков аспарагинагликозилируется только один, находящийся в последовательности Asn-Leu-Thr, что при-водит к образованию так называемой рибонуклеазы В. Реакция протекает, как это неред-ко случается при посттрансляционной модификации, неполно, и значительная часть мо-лекул фермента остается негликозилированной (рибонуклеаза А).

Исследование множества N-гликопротеинов показало, что присутствиеоксиаминокислоты - треонина или серина через один остаток от аспара-гина - служит сигналом для специфического фермента - олиго-сахаридтрансфе-разы, гликозилирующей аспарагин в последовательности Asn-Xaa-Ser(Thr), гдеХаа - любая аминокислота. Это позволяет предсказать возможные точки N-гликозилирования по первичной структуре белка. Фермент, катализирующий N-гликозилирование, -олшосахаридтрансфераза - «узнает» амидную группуаспарагина, отделенного одним аминокислотным остатком от серина или треони-на, если полипептидная цепь развернута. По-видимому, свертывание соот-ветствующего участка в пространственную структуру препятствует гликози-лированию. Этим объясняется отсутствие гликозилирования одного из двух ос-татков аспарагина в овальбумине in vivo, хотя in vitro удается присоединить оли-госахариды к обоим остаткам, входящим в указанную выше характерную для N-гликозилирования последовательность.

Антибиотик туникамицин блокирует N-гликозирование белков. Фермент -гликопептидаза - избирательно отщепляет олигосахариды от N-гликопротеинов.

N-Гликозилирование характерно для секреторных белков, попадающих в эндо-плазматический ретикулум, хотя оно не является непременной предпосылкой секреции.

11.4.2. O-ГликопротеиныВ гликопротеинах этого типа углеводный компонент присоединяется O-гли-

козидной связью к оксигруппе остатка серина или треонина, причем «узло-вое» положение всегда занимает остаток N-ацетилгалактозамина:

В отличие от N-гликозилирования биосинтез O-гликопротеинов происходитступенчато. Вслед за присоединением тилгалактозамина последовательно действую-щие гликозилтрансферазы присоединяют другие моносахаридные звенья, образуя, напри-мер, следующую структуру:

Однозначного «сигнала» в первичной структуре O-гликопротеинов, кото-рый определял бы подлежащий модификации остаток серина или треонина, необнаружено: Имеются, однако, указания на то, что гликозилируется гидроксиль-ная группа остатка серина или треонина, который следует за остатком пролина ивходит в β-изгиб. Это указывает на то, что гликозилирование происходит уже по-сле формирования пространственной структуры белка.

O-гликозидная связь расщепляется в щелочной среде, причем углеводныйкомпонент отделяется от белкового вместе с водородом, принадлежащим α-угле-родному атому серина, оставляя в полипептидной цепи дегидроаланин:

O-Гликозилирование встречается не столь часто в глобулярных белках, оноболее свойственно муцинам (веществам, определяющим группу крови) — глико-протеинам, относящимся к классу протеогликанов. Однако в иммуноглобулинах,например, одновременно встречаются оба типа гликозилирования.

Весьма сложен вопрос о функциональной роли углеводных компонентов вгликопротеинах. В некоторых, правда немногих, случаях удалось определить про-странственную структуру гликопротеинов. Оказалось, что олигосахаридные цепоч-ки не образуют сколько-нибудь протяженных контактов с белковой глобулой, заисключением немногих водородных связей вблизи точки присоединения к белку, анаправлены в сторону от глобулы и погружены в окружающую гликопротеин воду.

Рис. 11.1. Размещение углеводных цепей, присоединенных к остаткам аспа-рагина Asn-297 (выделены жирными линиями) между доменами СH2 имму-ноглобулина G кроликаУглеводные структуры образуют гидрофильную прокладку между поверхностями доменов

Лишь для одного из иммуноглобулинов G оказалось, что углеводный ком-понент, содержащий шесть моносахаридных звеньев, как бы лежит на поверхно-сти раздела двух доменов С

Н 2 и играет, по-видимому, роль своеобразной гидро-

фильной прокладки площадью около 500 А2, не позволяя слипнуться гидрофобнымповерхностям этих доменов (рис. 11.1). В других изученных случаях трудно гово-рить о структурообразующей роли углеводных компонентов.

Углеводный компонент практически никогда не участвует в главной функ-ции белка, т.е. не входит в состав каталитического центра или зоны связывания фер-ментов, активные участки регуляторных белков и т.п. Активность, измеренная дляпар гликозилированных и негликозилированных ферментов, неизменно оказываетсяодинаковой. Сказанное не относится, впрочем, к случаям, когда функция белка со-стоит в передаче сигнала — в таких белках, например в некоторых гормонах,углеводный компонент нередко критически важен для активности.

Как уже говорилось, гликозилирование сопровождает секрецию белков уживотных, однако секреция может происходить и без гликозилирования; следо-вательно, включение углеводных компонентов есть результат, а не предпосылкасекреции. Это хорошо иллюстрируют данные о доле гликопротеинов среди бел-ков, содержащихся в секрете поджелудочной железы — 4,7%, коровьем молоке —58%, синтезируемых в печени белках сыворотки крови — 59,7%. Однако в кури-ном яйце гликозилировано около 97% суммы белков.

По-видимому, гликозилирование важно не для структуры или функциибелка как такового, а для его взаимоотношений с другими компонентами клеткиили организма, для его «поведения», в этих чрезвычайно сложных системах.Действительно, известно, что фосфорилирование одного из остатков маннозы волигосахаридных структурах цитоплазматических ферментов, например внутри-клеточной аспартильной протеиназы — катепсина D, «адресует» их в лизосомы.Присутствие другого моносахарида — сиаловой кислоты в гликопротеинах крови— способствует их удержанию в кровотоке; белки, подвергшиеся отщеплениюконцевых остатков сиаловой кислоты, быстро удаляются печенью. Например,церулоплазмин, циркулирующий в крови в среднем около 50 ч, после отщепле-ния концевой сиаловой кислоты удаляется за несколько минут.

Несомненна физиологическая роль углеводных компонентов в гликопро-теинах мембран — они неизменно располагаются в той части молекулы, котораянаправлена в окружающую среду, но почти всегда отсутствуют в цитоплазма-тических доменах этих белков. Углеводные компоненты участвуют в процессахмежклеточного «узнавания», дифференциации, трансформации клеток, фагоци-тозе, процессах оплодотворения, во взаимодействии клеток с вирусами, связыва-нии гормонов с рецепторными белками.

Интересны гликопротеины антарктических рыб, понижающие точку замер-зания жидкостей, — их функциональная роль вполне очевидна. В полипептиднойцепи одного из них содержатся многочисленные повторы Ala—Ala—Thr, причем кгидроксильным группам треонина присоединены дисахаридные звенья галакто-зил-N-ацетилгалактозамина.

11.5. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ. ФОСФОПРОТЕИНЫ

Белки фосфорилируют специфические ферменты — протеинкиназы, ко-торые катализируют перенос концевого фосфата АТР на гидроксильные группыостатков серина или треонина. Значительно реже наблюдается фосфорилирова-ние гидроксила тирозина, так что содержание фосфотирозина составляет около0,1% суммы фосфосерина и фосфотреонина; однако физиологическая роль этоймодификации весьма велика.

Фосфоэфирные связи фосфопротеинов могут гидролизоваться специали-зированными ферментами — фосфопротеинфосфатаэами. Таким образом, фос-форилирование — обратимый процесс. Белок за время своего существования мо-жет многократно переходить то в фосфорилированную, то в дефосфорилирован-ную форму. Эта чрезвычайно важная особенность фосфорилирования — возмож-ность обращения модификации — обусловила роль этой реакции как механизма,позволяющего регулировать активность белка и даже целых групп белков вответ на изменяющиеся внутри- и внеклеточные стимулы.

Хорошо изучена роль фосфорилирования в регуляции фосфорилазы — фер-мента, катализирующего фосфоролиз запасного полисахарида — гликогена — собразованием глюкозо-1-фосфата, далее используемого в энергетическом обме-не. Противоположную реакцию — включение остатка глюкозы из глюкозо-1-фос-фата в гликоген — катализирует гликогенсинтетаза. Совместное действие этихдвух ферментов позволяет проводить цикл превращений, показанный ниже:

Такой цикл требует управления, попеременного включения фосфорилаз-ной или синтетазной активности с выключением противоположно направленной.Если бы такого управления не было, цикл превратился бы в бессмысленный. Идействительно, активность гликогенфосфорилазы контролируется целым рядомфакторов, один из которых — фосфорилирование и дефосфорилирование этогофермента. Нефосфорилированная фосфорилиза b практически неактивна, но пре-вращается в активную форму — фосфорилазу а — при фосфорилировании соот-ветствующей протеинкиназой только одного остатка серина

— Ser-14. Чем может

быть объяснена активация фермента, субъединица которого состоит примерно из400 аминокислотных остатков, в результате, казалось бы, небольшого измененияковалентной структуры?

Подвергающийся фосфорилированию остаток серина расположен на гра-нице контакта двух субъединиц фосфорилазы, т.е. в районе относительно слабыхвзаимо-действий, который особенно легко поддается перестройке уже при малыхизменениях ковал ентной структуры. Присоединение фосфата к Ser-14 влечет засобой установление электростатического взаимодействия и появление сразу двухводородных связей между фосфоэфирной группой фосфосериНа и гуанидогруп-пой остатка Arg-69, принадлежащего другой субъединице фермента и также лока-лизованного на поверхности контакта:

Это изменяет систему нековалентных связей на поверхности контакта двухсубъединиц, эффект передается в активный центр фермента. В результате пептид-ная петля, экранирующая активный центр в фосфорилазе b, отгибается и освобо-ждает доступ субстрата к нему, активируя тем самым фермент.

Отщепление фосфата фосфопротеинфосфатазой вновь переводит фосфо-серин-14 в серин и восстанавливает свойственную неактивной фосфорилазе b сис-

тему нековалентных связей на границе между субъединицами, пептидная петлявозвращается на прежнее место, блокируя каталитический центр.

Таким образом, столь значительные функциональные последствия фосфо-рилирования (и дефосфорилирования) обусловлены тем, что эти реакции проис-ходят в относительно лабильной зоне белковой структуры — в области контактасубъединиц (как в рассмотренном случае) или доменов. Интересно, что регуля-торное действие AMP на фосфорилазу основано на похожем принципе — адено-зинмонофрсфат образует прочный нековалентный комплекс с фосфорилазой b,связываясь на поверхности контакта субъединиц. Его фосфатная группавзаимодействует с двумя гуанидогруппами остатков аргинина и вызывает, как и вслучае фосфорилирования Ser-14, цепь перестроек в структурно лабильной зонефермента, опять-таки открывая каталитический центр. Результатом является ак-тивация фосфорилазы b — фермента, практически не активного в отсутствие AMP.Разница в том, что фосфорилирование активирует фермент, переводя его в фосфо-рилазу а, не зависимо от концентрации эффектора (в данном случае AMP) внутриклетки и, следовательно, в определенной мере не зависимо от биохимическогостатуса клетки.

Как уже отмечалось, перенос фосфата АТР на фермент катализируется про-теинкиназой. Активность этого фермента, в свою очередь, контролируется и за-висит от содержания в клетке так называемого «вторичного мессенджера» — сАМР.сАМР-зависимая протеинкиназа состоит из неодинаковых субъединиц: регуля-торной R-субъединицы, способной связывать эффектор, т.е. сАМР, и катали-тической С-субъединицы. Регуляторная субъединица выступает как ингибиторпротеинкиназы, в комплексе с ней каталитическая субъединица лишена активно-сти. При связывании регуляторной субъединицей сАМР, которое происходит засчет нековалентных взаимодействий, она утрачивает способность образовыватьчетвертичную структуру. В результате каталитическая субъединица высвобожда-ется и оказывается способной фосфорилировать белки.

Снижение концентрации свободного сАМР в клетке приводит к тому, чтосинтезируемая в избытке, регуляторная субъединица вновь связывается с катали-тической субъединицей, вызывая ингибирование фермента. Так реализуется ди-намическое равновесие:

Таким образом, концентрация сАМР управляет активностью проте-инкиназы, а через нее — активностью гликогенфосфорилазы, в конечном счете —мобилизацией энергии, запасенной клеткой в форме гликогена. В свою очередь,уровень сАМР определяется соотношением активностей адеиилатциклазы —фермента, превращающего АТР в сАМР, и фосфодиэстеразы, гидролизующейсАМР до AMP. Активность аденилатциклазы зависит от ряда внешних факторов,среди которых особенно важен гормональный контроль. Итак, фосфорилирова-

ние фосфорилазы b и ее превращение в активный фермент — фосфорилазу а —есть результат целого каскада ферментативных реакций, управляемого весьма тон-ко. Как уже упоминалось, фосфорилирование — не единственный путь воздей-ствия на активность фосфорилазы.

Активация фосфорилазы, как видно из рассмотренного выше цикла, долж-на сопровождаться снижением активности гликогенсинтетазы. Этот фермент так-же существует в двух формах, однако в этом случае активная форма не фосфо-рилирована.При фосфорилировании соответствующей протеинкиназой она пре-вращается в неактивную гликоген синтетазу.

Следовательно, изображенный выше цикл синтеза и фосфоролиза глико-гена следует дополнить довольно сложной схемой взаимопревращений активныхи неактивных форм ферментов, катализирующих эти процессы:

Необходимо иметь в виду, что и эта схема сильно упрощена. Выяснилось,что активность протеинкиназы может регулироваться калъмодулином — белком,связывающим ионы кальция, — и, следовательно, зависит от концентрации в клет-ке и этого вторичного мессенджера.

Аналогично, фосфорилированием и дефосфорилированием контролируетсяактивность целого ряда других метаболических ферментов, в частности синтетазыжирных кислот, пируватдегидрогеназы. Важно подчеркнуть, что реакции фосфо-рилирования и дефосфорилирования коренным образом отличаются от аллосте-рической регуляции ферментов, поскольку они не находятся в прямой зависимо-сти от биохимического статуса клетки и, следовательно, могут использоваться для

изменения активности под воздействием внеклеточных сигналов, они удобны длярегуляции на уровне организма. Известны и другие протеинкиназы, фосфорили-рующие остатки серина или треонина в белках, в том числе независимые от сАМРили контролируемые cGMP, диацилглицерином.

Выбор остатка серина, подвергаемого фосфорилированию, может зависетьот последовательности аминокислот, которые его окружают, Так, сАМР-зависи-мая протеинкиназа быка фосфорилирует гидроксильную группу серина впоследовательности Arg-Arg-Ala-Ser-Val (Leu), причем соседствующие остаткиаргинина, видимо, направляют фермент.

Фосфорилирование по остаткам тирозина, которое катализируется специ-фическими протеинкиназами (тирозинкиназами), встречается значительно реже,чем фосфорилирование остатков серина и треонина, — на долю фосфотирозинаприходится около 0,1% всего связанного с белком фосфата. Однако биологиче-ская роль этой реакции очень велика, так как она активно используется для пере-дачи сигналов в биологических системах.

Так, инсулин, связываясь с рецептором — трансмембранным белком, вызыва-ет активацию его домена, направленного в цитоплазму и являющегося тирозинки-назой. Тирозинкиназную активность индуцирует ряд факторов роста — белков, за-пускающих деление клеток по механизму, аналогичному описанному для инсулина.Рецепторы этих факторов,— крупные трансмембранные белки — связывают их нанаружной поверхности мембраны. Образование комплекса фактор — рецептор пере-дает сигнал через трансмембранную часть рецептора на его цитоплазматический до-мен, являющийся тирозинкиназой. Активированная таким образом тирозинкиназамодифицирует внутриклеточные белки, передавая сигнал далее.

Тирозинкиназы фосфорилируют остатки тирозина в некоторых внутрикле-точных белках, вовлеченных в сложную систему регуляции клеточного деления, вкоторой также участвует и фосфорилирование белков по остаткам серина и трео-нина. Нарушение этой весьма сложной регуляторной сети может привести к не-контролируемому делению клеток, опухолевому росту. Характерно, что онкобелки,структурно близкие нормальным белкам животной клетки, но вызывающие еетрансформацию, превращение в опухолевую, нередко оказываются тирозин-киназами.

11.6. АDР-РИБОЗИЛИРОВАНИЕ

Реакция переноса ADP-рибозною остатка NAD на белки, катализируемаяспецифическими ферментами, используется для регуляции активности ряда фер-ментов, в том числе глутаминсинтетазы, где модифицируется остаток тирозина.

Аналогичную реакцию переноса ADP-рибозного фрагмента катализируютнекоторые бактериальные токсины. Каталитический домен дифтерийного токси-на, образующийся в результате ограниченного протеолйза, катализирует присое-динение этого фрагмента к фактору элонгации EF-2 в клетках эукариот и архе-бактерий. Модификации подвергается производное гистидина (содержащееся в

консервативном районе последовательности этого фактора) — дифтамид, в своюочередь образуемый многоступенчатой модификацией остатка гистидина.

На первом этапе аденозилметионин (AdoMet), обычно являющийся доно-ром метильной группы, выступает при алкилировании имидазольного кольца какдонор фрагмента

Затем происходит исчерпывающее метилирование аминогруппы присо-единившегося фрагмента. В этом случае аденозилметионин является источникомметильных групп, превращаясь в аденозилгомоцистеин (AdoHcy). Модификациюзавершает амидирование карбоксильной группы, которое протекает с одно-временным гидролизом АТР и приводит к дифтамиду:

ADP-рибозилирование дифтамида, катализируемое дифтерийным ток-сином, инактивирует фактор элонгации EF, прерывая тем самым трансляцию, чтоприводит к гибели клетки.

11.7. ЛИПОПРОТЕИНЫ

К липопротеинам в строгом смысле этого термина принадлежат белки, со-держащие ковалентно связанные липиды. Однако традиционно к ним относятбелки, участвующие в транспорте липидов и образующие с ними нековалентныекомплексы, например липопротеины крови. Мы рассмотрим только такие липо-протеины, которые отвечают строгому определению.

11.7.1. Липопротеины с С-концевым гликолипидом

Обнаружено около 30 белков, которые встраиваются в мембраны живот-ных клеток за счет гидрофобных, взаимодействий между липидами мембраныи своеобразно организованной С-концевой частью белка, представляющей собойгликолипид (так называемые «PIG-tailed»-белки — «белки со свиными хвостика-ми», от англ. Phospho-Inositol-Glycan). К ним принадлежат щелочная фосфатаза,глобулярная форма ацетилхолинэстеразы, высоковариабельный гликопротеинповерхности трипаносом, адгезионный белк нервных клеток и т.д.

По завершении биосинтеза полипептидной цепи С-концевой участок та-кого белка, содержащий от 17 до 31 остатка преимущественно гидрофобныхаминокислот, отщепляется, заменяясь следующей структурой:

Белок—СО—NH—СН2СН

2O—гликан—глюкозамин—фосфоинозит—диацил-глицерин

Этаноламин

Гликолипидный фрагмент несколько различен у разных белков, отличаясьстроением гликана, содержащего галактозу, набором жирных кислот в диацил-глицериновом звене, среди которых отмечено присутствие пальмитиновой имиристиновой кислот.

Весь гликолипидный фрагмент удается в некоторых случаях удалить придействии протеиназы. Связь между глюкозамином и фосфоинозитом расщепля-ется при действии азотистой кислоты. Особенно характерно отщепление липидапри действии фосфолипаз D или С, которые гидролизуют соответственнофосфодиэфирные связи между инозитом и фосфатидовой кислотой или фосфои-нозитом и диацил-глицерином, что приводит к отделению белка от мембраны.Имеются сведения, что фосфолипаза С каким-то образом участвует в механизмедействия инсулина, отщепляя гликолипидный фрагмент от липопротеинлипазы.

В результате последняя утрачивает связь с наружной мембраной жировых клеток,что сказывается на катаболизме триглицеридов. Во всяком случае, очевидно, чтов рассматриваемых белках гликозил-фосфатидилинозит не является инертным«якорем».

11.7-2. Липопротеины с N-концевой липидной группировкой

Известны два способа присоединения липидной группировки к аминномуконцу белка. Простейший состоит в N-миристоилировании — переносе остаткамиристиновой кислоты — СН

3(СН

12СО— от миристоилкоэнзима А на α-ами-

ногруппу N-концевого остатка глицина белка. Гидрофобный миристоильный ос-таток участвует в удерживании белка в липидном слое мембраны или, возможно,связывается специальным белком-рецептором.

Некоторые белки микроорганизмов, например β-лактамаза Bacilluscereus, взаимодействуют с липидами мембран при помощи своеобразного липид-ного якоря. Последний формируется на аминном конце полипептидной цепи по-сле отщепления от нее сигнального пептида, обеспечивающего перенос полипеп-тидной цепи белка через мембрану. В таких белках аминоконцевое положение не-изменно занимает остаток цистеина. К его сульфгидрильной группе тиоэфирнойсвязью присоединяется остаток диацилглицерина, затем еще один остаток жир-ной кислоты ацилируют α-аминогруппу цистеина, что приводит к следующейструктуре:

Сосредоточение сразу трех остатков жирных кислот у N-концевого цис-теина делает аминоконцевую часть полипептидной цепи белка весьма гидро-фобной, чем и обусловлена возможность его взаимодействия с липидами мем-браны. Вся эта конструкция надежно удерживает белок связанным с мембра-

ной, причем белковая глобула полностью погружена в среду, прилегающую кмембране, например в периплазматическое пространство бактериальныхклеток.

Сказанным не ограничиваются структурные типы липопротеинов. По-ви-димому, белок резус-фактора (Rh-белок), локализованный в мембране эритро-цитов человека, содержит несколько (до четырех) остатков пальмитиновой ки-слоты, присоединенных тиоэфирными связями к сульфгидрильным группам цис-теина, что делает его очень гидрофобным:

11.7.3. Пренилированные белки

Реакции S-пренилирования, заключающейся в присоединении изо-преноидов к атому серы остатка цистеина, который локализован в С-концевомучастке полипептидной цепи, подвергается около 100 белков, в частности белокRas (см. гл. 12). Первоисточником пренильных группировок является изопенте-нил-пирофосфат, изомеризующийся, с перемещением двойной связи в диметил-аллил-пирофосфат:

Конденсация этих двух молекул с элиминированием пирофосфата дает ге-ранил-пирофосфат:

Далее молекула наращивается последовательным присоединением изопен-тенил-пирофосфата по такому же механизму, причем на каждом шаге присоеди-няется C

5-звено. Это приводит к фарнезил-пирофосфату (C15), являющемуся так-

же предшественником стероидов и каротиноидов, и геранил-геранил-пирофос-фату (С

Фарнезильная или геранил-геранильная группы с отщеплением пирофос-фата переносятся на атом серы остатка цистеина, который расположен вблизи С-конца полипептидной цепи в последовательности С—А—А—X (так называемомСААХ-боксе), где С — остаток цистеина, А — остатки алифатических аминокис-лот, X — С-концевая аминокислота, определяющая, какой из двух типов реакциипренилирования осуществится. Если X — серии, метионин или глутамин, то кцистеину присоединяется фарнезил (Cis), если X — лейцин, то происходит при-соединение геранил-геранила (С

Пренилирование белков включает в себя следующую цепь превращений.Пренилтрансфераза переносит пренильный остаток соответствующего пренил-пирофосфата на SH-группу остатка цистеина в белке, имеющем на С-конце СААХ-бокс. Затем специфическая пептидаза отщепляет выполнившую роль сигнала по-следовательность АА—Х, после чего с участием метилтрансферазы метильная груп-па S-аденозилметионина переносится на карбоксил пренилированного цистеина,превращая его в метиловый эфир:

Очевидно, что присоединение к белку крупной гидрофобной пренильной груп-пировки благоприятствует его включению в цитоплазматическую мембрану. Приэтом существенно, что от типа пренильной группы зависит ориентация белка в мем-бране — фарнезилированные белки встраиваются во внешнюю мембрану, белки же,содержащие геранил-геранильный остаток, — во внутреннюю мембрану, обращен-ную к цитоплазме. Впрочем, у этого правила могут быть исключения, кроме того, вадресовании пренилированных белков участвуют, вероятно, и другие элементы ихструктуры. Таким образом, реакция пренилирования — один из процессов, опреде-ляющих локализацию белков в биологических структурах, их топогенез.

11.8. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ

Ограниченный протеолиз — важнейшая реакция посттрансляционноймодификации белка. Обычный «неограниченный», глубокий протеолиз — расще-пление белка протеиназами — протекает по принципу «все или ничего». Ком-пактный белок, как правило, относительно устойчив к действию протеиназ, по-скольку в нем практически нет необходимых для связывания протеолитическихферментов протяженных «открытых» участков полипептидной цепи. Поэтому атакана первых порах ограничивается расщеплением отдельных петель, концевых уча-стков белка. Если же протеолизу подвергается «внутренний» участок поли-пептидной цепи, ставший доступным, например, за счет частичной (и обратимой)денатурации белковой глобулы, то пространственная структура дестабилизируется,белок-субстрат необратимо денатурирует и вся полипептидная цепь оказываетсядоступной протеолитической атаке. Результатом является глубокий гидролиз собразованием коротких фрагментов. При таком ходе протеолиза в гидролизате-присутствуют исходный белок, количество которого постоянно уменьшается, инизкомолекулярные пептидные продукты гидролиза, содержание которых посто-янно нарастает, промежуточные же продукты наблюдать не удается.

Ограниченный протеолиз, при котором процесс задерживается или пол-ностью останавливается на промежуточных продуктах, возможен лишь тогда, ко-гда продукты протеолиза сохраняют компактность, например при отщеплениифрагмента какого-либо из концов пептидной цепи, разрыве петли на поверхно-сти глобулы или при расщеплении пептидной цепи между достаточно стабильны-ми доменами белка.

Ход ограниченного протеолиза, его результат решающим образом зависятот особенностей структуры белка-субстрата. Ввиду этого нередко одинако-вые или очень близкие результаты дает применение различных протеиназ, местодействия которых определяется особенностями пространственного строения суб-страта. Если в разрешенном для атаки участке (шарнирный участок) последо-вательность аминокислотных остатков согласуется со специфичностью атакующей

протеиназы, то эффективность процесса возрастает. Именно так обстоит делопри посттрансляционной модификации белков протеиназами.

Рассмотрим несколько типичных процессов ограниченного протеолиза.

11.8.1. Формирование белка неканонической структуры.Биосинтез инсулина

Инсулин, построенный из двух полипептидных цепей А и В, содержащихсоответственно 21 и 30 аминокислотных остатков и соединенных между собойдисульфидными связями, слишком мал, чтобы сформировать стабильную глобу-лярную структуру с достаточной эффективностью. Действительно, удается полу-чить инсулин рекомбинацией раздельно синтезированных А- и В-цепей, причемостатки цистеина, окисляясь, образуют свойственную нативному белку системудисульфидных связей. Однако такой процесс происходит медленно и дает, какправило, невысокий выход инсулина.

Гораздо легче образует третичную структуру предшественник инсулина —проинсулин, в полипептидной цепи которого «будущие» А- и В-цепи инсулинасоединены пептидом С в последовательности В—С—А. Такой белок, содержащийв одной полипептидной цепи около 90 аминокислотных остатков, сворачиваетсяв компактную структуру, далее следует замыкание дисульфидных мостиков,стабилизирующее молекулу в целом, после чего специальная протеиназа «выреза-ет» пептид С. Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факто-рами — пространственной структурой проинсулина и присутствием в его поли-пептидной цепи двух сигналов — двух пар катионных аминокислот, расположен-ных в последовательности таким образом:

В-цепь—Arg—Arg—С-пептид—Lys—Arg—А-цепь

Процессирующая такой предшественник протеиназа узнает пары амино-кислот с катионными боковыми группами типа Arg—Arg, Lys—Arg и т.п. и расще-пляет пептидную связь на С-конце таких пар. В результате будет вырезан пептидС вместе с последовательностью Lys—Arg на С-конце и освободятся цепи А и В,причем на С-конце цепи В окажутся два остатка аргинина, которые необходимоотщепить. Это выполняет специализированная металлокарбоксипептидаза с оп-тимумом действия в слабокислой среде.

Заметим, что сочетание действия протеиназы, гидролизующей пептидныесвязи после пары катионных аминокислот (такие ферменты обнаружены у живот-ных и дрожжей), и карбоксипептидазы, отщепляющей затем эти аминокислоты(по специфичности фермент близок карбоксипептидазе В), используется в био-синтезе коротких пептидов, например энкефалина. Специфичность действия та-

кой системы достаточно высока, и процессинг длинных предшественников про-исходит, видимо, еще до образования стабильной пространственной структуры.Так, пептидная цепь проопиомеланокортина, содержащая 23.5 аминокислотныхостатков, расщепляется по такому способу в семи местах, образуя эндорфин, ад-ренокортикотропный гормон, α- и γ-меланоцитостимулирующие гормоны и дру-гие физиологически активные пептиды.

11.8.2. Разъединение белковых глобул в полибелках

В ряде случаев несколько структурно и функционально различных белковсинтезируется первоначально как одна полипептидная цепь очень большой дли-ны, отдельные участки которой независимо друг от друга свертываются в белко-вые глобулы, образуя так называемый полибелок. Так, например, синтезируютсяферменты биосинтеза жирных кислот. Особенно характерен синтез полибелковдля ретровирусов. В дальнейшем происходит разрезание специфическими про-теиназами пептидных перетяжек между отдельными глобулами, после чего по-следние функционируют независимо. Так, в частности, разделяются компонентыполибелка вируса иммунодефицита человека. Видимо, точность расщепления по-липептидных перетяжек в полибелке в этом случае столь существенна, что этотпроцесс не всегда может быть доверен протеиназам клетки-хозяина. Полибелоксодержит весьма специфичную протеиназу вируса иммунодефицита человека, от-даленно родственную пепсину, которая узнает характерные последовательностиаминокислот в перетяжках и точно разрезает их. Предполагают, что избиратель-ное ингибирование таких протеиназ может быть использовано как один из спосо-бов борьбы с вирусной инфекцией.

11.8.3. Разделение доменов

Эта реакция используется, в частности, как необходимый этап в механиз-ме действия ряда белковых токсинов, вырабатываемых микроорганизмами. Так,дифтерийный токсин синтезируется как протоксин, построенный из одной поли-пептидной цепи, которая образует по крайней мере два структурно и функцио-нально автономных домена. Один из них ответствен за связывание токсина с ре-цептором мембраны атакуемой клетки, второй — представляет собой фермент,катализирующий перенос аденозиндифосфатрибозного фрагмента NAD на фак-тор элонгации EF, который при этом инактивируется. Комплекс токсин — рецеп-тор, обязанный своим образованием связыванию первого домена с рецептором,после интернализации (втягивания внутрь клетки) оказывается в окруженном мем-браной пузырьке — везикуле.

Для того чтобы получить возможность действия на фактор элонгации EF,каталитический домен должен покинуть везикулу, оказаться в цитоплазме. Ток-син содержит структуру, позволяющую, каталитическому домену проникнуть че-рез мембрану, однако и после этого он еще сохранит связь с «узнающим» доме-ном. Следовательно, он не сможет покинуть везикулу, пока протеиназа подходя-щей специфичности не расщепит междоменный участок пептидной цепи. Этовысвобождает каталитический домен и позволяет ему сблизиться с фактором EF.

Расщепление пептидной связи между α- и β-субъединицами рецептора ин-сулина необходимо для активации этого белка. Соединяющий (шарнирный) уча-сток пептидной цепи содержит очень характерную сигнальную последовательностьArg—Lys—Arg—Arg—Xaa, в который связь Arg—Xaa расщепляется специфическимпротеолитическим ферментом. Найдены носители аномального гена рецептора ин-сулина, в котором отмеченная последовательность заменена на Arg—Lys—Arg—SeiXaa. Замена Arg на Ser делает белок устойчивым к процессирующей протеина-зе, домены не разделяются, что приводит к образованию неактивного рецептора.Ромозиготные носители такого мутантного гена страдают диабетом, который некомпенсируется инсулином.

Интересно, что аналогично построенная сигнальная последовательностьчетырех катионных аминокислот определяет протеолитическую активацию гемагг-лютинина вируса гриппа, а также созревание гликопротеина поверхности вирусаиммунодефицита человека.

11.8.4. Активация предшественников ферментов

Многие ферменты, в особенности гидролазы, синтезируются в виденеактивных предшественников — проферментов, или зимогенов. Наиболее изу-чена активация предшественников панкреатических сериновых протеиназ — трип-синогена и химотрйпсиногена. В обоих случаях пептидная цепь фермента удлине-на с аминного конца на несколько аминокислотных остатков — активационныйпептид, протеолитическое отщепление которого превращает практически неак-тивный зимоген в активную протеиназу. Так, в трипсиногене быка аминоконцеваяпоследовательность имеет такую структуру:

Гидролиз трипсином именно пептидной связи Lys—lie определяется преждевсего ее доступностью — в молекуле трипсиногена содержится целый ряд пептид-ных связей, образованных остатками аргинина или лизина и атакуемых трипси-ном в денатурированном зимогене, однако в нативном белке расщепляется пер-вой именно эта связь. При активации трипсиногена образуется трипсин, способ-ный активировать другие молекулы профермента, так что реакция в целом ока-зывается аутокаталитической и протекает с резким ускорением.

Характерно, что скорость активации, обеспечиваемая трипсином, in vivoвсе же оказывается недостаточной и активация инициируется специальным про-теолитическим ферментом — энтеропептидазой (энтерокиназой), который со-держится в секрете двенадцатиперстной кишки и активирует трипсиноген при-мерно в 1000 раз быстрее трипсина. Столь высокая специфичность энтеро-пептидазы обусловлена тем, что фермент узнает в трипсиногене предшествующуюостатку лизина гроздь из четырех остатков аспарагиновой кислоты.

Отщепление активационного пептида от молекулы трипсиногена влечет засобой цепь изменений в пространственной структуре продукта активации. Анало-гичные изменения претерпевает и продукт активации химотрипсиногена, хотяактивационный пептид в этом случае выглядит совершенно иначе и сохраняетковалентную связь с ферментом за счет дисульфидной связи. Освободившаясяпри активации аминогруппа остатка изолейцина (аминоконцевого в трипсине)протонируется. Катионная аммонийная группа втягивается вглубь глобулы фер-мента вследствие стремления гидрофобных боковых групп остатков изолейцинаи валина уменьшить поверхность контакта с водой.

Этому способствует образование ионной пары между α-аммонийной группойизолейцина и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом боковой группы ос-татка Asp-194, причем разрывается существовавшая в зимогене ионная пара Asp-194 — His-40. Смещение карбоксильной группы остатка Asp-194 приводит к ло-кальным структурным перестройкам вблизи зоны связывания субстрата, в част-ности завершается формирование гидрофобного кармана за счет движения боко-вой цепи остатка Met-192. Видимо, немалую роль могут играть и некоторые уточ-нения в размещении функциональных групп каталитического центра. Заметим,что этот центр, по крайней мере в грубом приближении, предсуществует еще впроферменте, который обнаруживает (по небольшим субстратам) около 0,01% ак-тивности, присущей активному трипсину.

Активация трипсиногена сопровождается как бы фиксацией, более точнойорганизацией около 15% пространственной структуры — соответствующие атомыиспытывают значительные колебания в молекуле профермента, но закрепляются втрипсине. Таким образом, расщепление пептидной связи Lys—Не запускает весьмасложный механизм локальных перестроек, активирующий молекулу. Вслед за опи-санной начальной реакцией, определяющей образование активного фермента, на-

блюдается гидролиз других пептидных связей. Он приводит к образованию новыхмолекулярных форм трипсина, иногда несколько отличающихся от первичного про-дукта активации функциональными свойствами, например деталями специфично-сти. Сходно протекает активация химотрипсиногена, инициируемая также трипси-ном. Последующее расщепление некоторых связей в активном химотрипсине други-ми его молекулами дает целый набор молекулярных форм фермента.

Такой же механизм положен в основу активации протеиназ системы свер-тывания крови, в которых при протеолизе единой полипептидной цепи обнажа-ется α-аминогруппа N-концевого остатка в каталитическом домене активногофермента, что запускает, по-видимому, такую же цепь изменений структуры, ак-тивирующую фермент.

Разница состоит в том, что аминоконцевой район профермента, подчасочень крупная структура, сохраняет связь с собственно каталитическим ядром засчет дисульфидных и, вероятно, нековалентных взаимодействий. Это позволяетсообщить протеиназе новые функциональные особенности, например способностьк связыванию с липидами мембран через ионы кальция за счет остатков γ-кар-боксиглутаминовой кислрты (см. разд. 11.3).

В предшественниках других протеиназ — пепсиногене и прокарбокси-пептидазе — отщепляемый при активации (соответственно, пепсином или трип-сином) пептид содержит около 40 аминокислотных остатков и, видимо, играетроль своеобразного экрана, прикрывающего активный центр фермента. Отщеп-ление этого экрана, которое не требует строго однозначного протеолиза, как в случаерассмотренных выше сериновых протеиназ, и может быть результатом разрывалюбой пептидной связи в последовательности, соединяющей активационный пеп-тид с будущим ферментом. Отсюда неоднозначность активации, которая можетприводить к смеси активных ферментов, различающихся длиной и аминоконце-выми остатками (так называемые растрепанные концы).

Биологический смысл активации проферментов очевиден: она позволяетнакопить значительные количества предшественника, чрезвычайно быстро пре-вращаемого в активный фермент в результате всего лишь одной реакции — рас-щепления единственной пептидной связи. Синтез значительных количеств фер-мента de novo потребовал бы гораздо большего времени, что невыгодно, особеннов процессах пищеварения. В то же время накопление активных протеиназ внутриклетки может оказаться для нее далеко не безобидным. Биосинтез проферментапозволяет снять и эту проблему.

Не следует думать, что активация зимогенов характерна лишь для фермен-тов животных. Обнаружено, что в виде предшественников синтезируются прак-тически все протеиназы бактерий.

11.9. ПРОЦЕССИНГ АМИНОКОНЦЕВОГО РАЙОНА БЕЛКА

У многих белков подвергается модификации аминоконцевой район. Какизвестно, в белках прокариот, в митохондриях и хлоропластах остаток, метиони-на, инициирующий трансляцию, формилирован. N-Формильная группа удаляет-ся ферментом формилазой. У эукариот трансляция инициируется метионином.После того как длина пептидной цепочки, еще связанной с рибосомой, достигнетпримерно 20 аминокислотных остатков, инициирующий метионин можетотщепляться специальной аминопептидазой. (Однако это не обязательно, и при-мерно у половины цитоплазматических белков животных аминоконцевой метио-нин сохраняется.)

Среди других N-концевых остатков доминируют относительно небольшие— аланин, серии и треонин. По-видимому, это обусловлено особенностями ами-нопентидазы, предпочтительно отщепляющей N-концевой метионин, если за нимследует аминокислота с небольшой боковой цепью. В тех случаях, когда амино-кислота, следующая за концевым метионинрм, имеет объемистый радикал, ме-тионин не отщепляется, сохраняясь на аминном конце белка.

Есть основания полагать, что природа N-концевой аминокислоты как-тосвязана с устойчивостью белка к внутриклеточному протеолизу. По-видимому, этимобусловлена и распространенность блокирования аминоконцевого остатка аце-тилированием — в общей сложности ацетилирован аминный конец у примерно50% растворимых белков клеток млекопитающих. В этой реакции, катализируе-мой N-α-ацетилтрансферазой, донором ацетильной группы служит ацетилкоэн-зим А. Чаще всего встречаются на N-конце белков эукариот ацетилсерин, ацети-лаланин, ацетилметионин. В то же время известен и фермент, способный отщеп-лять от N α-ацетилированных белков ацетиламинокислоту, например ацетил ала-нин. Существенно, что отмеченные модификации обеспечивают многообразиеаминных концов полипептидных цепей, которые в отсутствие таких реакций былибы неизменно представлены метионином. Не исключено, что отщепление N-кон-цевого метионина важно и потому, что делает возможным многократное использо-вание этой инициирующей аминокислоты, биосинтез которой весьма не прост.

ГЛАВА 12G-БЕЛКИ

Обширному классу GTP-связывающих, или G-белков, принадлежит особоважная роль в передаче сигналов в клетку и внутри клетки. Их функциональноесостояние, иначе говоря, способность к передаче сигнала другим белкам, опреде-ляется тем, содержат ли они связанную молекулу гуанозинтрифосфата (GTP) илипродукт ее гидролиза — гуанозиндифосфат (GDP). Сами эти белки обладают соб-

ственной GТРаз-ной активностью, поэтому G-белок, активированный некова-лентным присоединением GTP, постепенно гидролизует этот эффектор до GDP,возвращаясь при этом в неактивную форму:

Таким образом, важнейшей особенностью G-белков является способностьудерживать активную конфирмацию и участвовать в передаче сигнала в тече-ние определенною времени, что зависит от их GТРазной активности, а также отдействия белковых факторов, которые либо способствуют обмену GDP на GTP и,следовательно, переводу белка в активное состояние, либо, напротив, усиливаютСТРазную активность G-белка и, значит, ускоряют его переход в неактивный ком-плекс с GDP. Структурно-функциональные особенности G-белков иллюстриру-ются следующими примерами.

12.1. БЕЛОК c-H-ras

К G-белкам принадлежат некоторые онкобелки, в частности c-H-ras-он-кобелок человека. G-белки, кодируемые мутантными генами семейства ras, не-редко обнаруживаются в опухолях. Нормальный ген с-Н-ras кодирует так назы-ваемый белок р21 с молекулярной .массой 21 кДа, локализованный в цитоплаз-матической мембране и являющийся потенциальным предшественником онко-белка — протоонкобелком. Его функция в нормальной клетке сострит, по-види-мому, в том, что он воспринимает извне стимулирующие клеточный рост сигналыи передает их на белки-мишени внутри клетки, инициируя ее рост и деление.

К комплексу белка р21 с GTP присоединяется белок GAP (GTPase Activat-ing Protein), который усиливает присущую этому комплексу GТРазную активность.Именно тройной комплекс р21 — GTP — GAP и является передатчиком сигнала.В то же время в нем происходит гидролиз GTP до GDP, катализируемый белкомр21. Последний сам по себе является очень медленно действующей СТРазой (ус-корение гидролиза гуанозинтрифосфата примерно в 1000 раз, время полужизникомплекса р21 — GTP — около 1 ч). СТРазная активность резко (по некоторымоценкам, в 100 000 раз) возрастает при образовании тройного комплекса с акти-вирующим белком GAP. Существенно, что в результате гидролиза GTP до GDPкомплекс с GAP распадается и передача сигнала прекращается.

Рис. 12.1. Строение c-H-ras бел-ка р21 человека (остатки 1-171)

Видны четыре α-спирали, β-струк-турные участки β1—β6 и петли L1-L8. Прямоугольником, пяти-уголь-ником и двумя кружками показаноположение связанного GDP

Таким образом, от эффективности гидролиза GTP зависит продолжи-тельность действия сигнала, G-белок как бы содержит внутренний датчик време-ни, регулируемый за счет взаимодействия с GAP. Понятно, что применительно котдельно взятой молекуле можно говорить лишь о большей или меньшей вероят-ности расщепления GTR за определенный промежуток времени.

Однако, поскольку ником и двумя кружками показано положение связан-в передаче сигнала в конкретной биологической системе участвует множество та-ких молекул, гидролиз 6ТР как бы задает время действия G-белка, т.е. продол-жительность сигнала.

Белок р21 содержит 189 аминокислотных остатков в одной пептидной цепи.Последняя образует шесть β-структурных отрезков и четыре α-спирали (рис. 12.1),причем для С-концевой половины белка характерна чередующаяся укладка эле-ментов вторичной структуры β�−α�−β�−α�−β, напоминающая структурный мотивнуклеотидсвязывающего домена дегидрогеназ. Из десяти петель, соединяющих a-спиральные и β-структурные участки, пять (LI, L2, L4, L9 и L10) образуют кар-ман, в котором связываются GDP и GTP, причем с белком взаимодействуют иоснование — гуанин, и рибоза, и фосфатные группы.

Петля L1, соединяющая N-концевой β-структурный отрезок и первуюa-спираль

содержит последовательность:

10 11 12 13 14 15Gly-Ala-Gly-Gly-Val-Gly

Она как бы «оседлывает» фосфоэфирную связь между β— и γ—фосфатны-ми группами субстрата, составляя, очевидно, часть СТРазного каталитическогоцентра. В вирусных белках, принадлежащих к тому же семейству и построенныхтаким же образом, концевой (γ) фосфат GTP внутримолекулярно переносится нагидроксил остатка Thr-59, а не на воду (так называемое аутофосфорилирование).Следует подчеркнуть, что с каталитическим центром сближен участок связыва-ния активирующего белка — GAP.

Рис. 12.2. Изменения во взаимодействии между нуклеотидом и G-белком,сопровождающие гидролиз СТР до GDP

Показаны только три- и дифосфатные фрагменты нуклеотидов. Молекула воды, которуюактивируют взаимодействия с остатками глутамина Gin-61 и его окружением, атакуетсвязанную белком молекулу GTP, концевой γ —фосфатный остаток которой связан сNH-группами остатков треонина Thr-35 в петле L2 и глицина Gly-60 в петле L4. Отщеп-ление концевого γ —фосфатного остатка приводит к образованию GDP. В результатеThr-35 и Gly-60, а следовательно петли L2 и L4, утрачивают непосредственный контактс лигандом - молекулой GDP. Это вызывает изменение конформации петель, неблаго-приятное для взаимодействия G-оелка с белком, который участвует в передаче сигнала

В гидролизе гуанозинтрифосфата участвует молекула воды, которая обра-зует водородную связь с карбонильной группой Thr-35 и активируется за счет взаи-модействия с другими функциональными группами каталитического центра. Од-нако в свободном G-белке эти участки активного центра существуют в виде не-скольких конформеров, из которых способен активировать указанную молекулуводы лишь один, чем и объясняется весьма низкая эффективность катализа. По-видимому, в комплексе ras-белка с активирующим белком (GAP) закрепляетсяименно эта кон формация, что и влечет за собой резкое ускорение гидролиза GTP.

Гидролиз GTP, связанного в активном центре G-белка, приводит к локаль-ным изменениям структуры в районе контакта с β- и γ-фосфатными группамиGTP (рис. 12.2). Видимо, за отщеплением γ-фосфатной группы GTP следует при-

ближение подвижных элементов белковой структуры к γ-фосфату GDP, как бызаполнение образовавшегося «зазоРа». Заметно изменяется, в частности, укладкапетель L2 (остатки 26—36) и L4 (остатки 59—65), а также способ связывания ионамагния, взаимодействующего с активным центром белка р21 и GTP или GDP.Поскольку эти же петли обеспечивают взаимодействие с активирующим белкомGAP, такой конформационный переход нарушает контакт р21 — GAP, прерываятем самым передачу сигнала.

С-концевой фрагмент c-H-ras-белка, взаимодействующий, как пред-полагают, с рецептором, находящимся в мембране, соединен с описанным выше«каталитическим» доменом длинной α-спиралью, которая, видимо, участвует впередаче сигнала. У всех белков семейства ras на карбоксильном конце содержит-ся характерная последовательность СААХ (где С — цистеин, А — алифатическаяаминокислота), которая является сигналом для пренилирования тиоловой груп-пы Cys-186 с последующим отщеплением С-концевого трипептида. Такаяпосттрансляционная гидрофобизация С-конца ras-белка (см. гл. 11) необходимадля его присоединения к цитоплазматической стороне клеточной мембраны. ras-Белки, лишенные этой структуры, трансформирующим действием на клетки необладают, хотя и сохраняют способность связывать и гидролизовать GTP.

Белки, обеспечивающие ввод и вывод сигнала, передаваемого белком р21,пока строго не идентифицированы, хотя есть основания полагать, что одним изних является белок GAP, который в свою очередь взаимодействует с рецепторомфакторов роста. Видимо, другой белок катализирует обмен GDP на GTP — про-цесс, весьма медленно протекающий в комплексе р21 — GDP.

Таким образом, сравнительно небольшой c-H-ras-белок вовлечен в сложнуюсистему межмолекулярных взаимодействии, реализация которых решающим обра-зом зависит от присутствия связанной им молекулы GTP и скорости ее гидролиза.Нетрудно понять, что столь сложная функция белка может легко нарушаться мута-циями, затрагивающими отдельные аминокислотные остатки в нормальном белке— протпоонкогене. Вследствие такого нарушения функциональных свойств му-тантный белок может становиться собственно онкогеном.

Так, замещение остатка Gly-12 в петле, входящей в каталитический центр,любой аминокислотой, кроме пролина, резко снижает СТРазную активность, при-чем она перестает усиливаться за счет взаимодействия с GAP-белком. Как пока-зал рентгеноструктурный анализ с применением метода, позволяющего наблю-дать за гидролизом GTP в динамике, мутация не вызывает крупных изменений вконформации зоны связывания GTP. Например, при замене Gly-12 → Val затра-гиваются лишь позиции остатков Gly-60, Thr-38 и Gin-61, окружающих γ-фос-фат GTP. В результате, однако, мутантный белок крайне медленно гидролизуетGTP и как бы перестает «выключаться», продолжая посылать в клетку стимули-рующие сигналы даже тогда, когда они не нужны, в отсутствие внешнего сигнала.Таким образом, белок c-H-ras становится способным трансформировать нормаль-

ные клетки в опухолевые, т.е. приобретает трансформирующую активность.Трансформирующую активность и, следовательно, превращение про-

тоон-когена в онкоген вызывают и замены аминокислотных остатков 116 и 119,участвующих в связывании гуанинового фрагмента GTP, a также остатков 59, 61и 63, которые могут влиять на конформацию петли, включающей остаток гли-цина Gly-12, снижая этим СТРазную активность.

В то же время аминокислотные замены на участке 35—40 снижают способ-ность активированного c-H-ras-белка к трансформации клеток, хотя и не изме-няют СТРазной активности или связывания GTP или GDP. По-видимому, этотучасток вовлечен во взаимодействие с белком-мишенью, на который передаетсясигнал. Нарушение такого взаимодействия лишает смысла активацию c-H-ras-белка при связывания GTP, прерывает передачу сигнала.

Основные черты строения и механизма действия ras 21-белка, по всейвидимости, типичны для других G-белков, во всяком случае для их G-доменов. Вчастности, близкую структуру имеет G-домен фактора элонгации EF—Tu.

12.2. ТРАНСДУЦИН

Трансдуцин — гораздо более сложный G-белок, участвующий в передачесветовою сигналя и, что чрезвычайно важно, в его огромном усилении. Схемаего действия представляется следующим образом (рис. 12.3). Молекула родопси-на, улавливая фотон, переходит в активированное состояние и образует комплексс трансдуцином, G-белком, содержащим связанную молекулу GDP. Образова-ние комплекса активированный родопсин — трансдуцин ускоряет обмен свя-занного с последним GDP на GTP. Образующийся в результате такого обмена ком-плекс активированный родопсин — трансдуцин — GTP распадается с отщепле-нием активированного родопсина, который может взаимодействовать с другоймолекулой трансдуцина и также перевести ее в активное состояние за счет обменаGDP на GTP. Таким образом реализуется первая ступень усиления сигнала —активированная молекула родопсина за время своего существования успеваетвзаимодействовать с несколькими сотнями молекул трансдуцина, переводя ихв активную форму — комплекс трансдуцин — GTP.

Высвобождающийся после отщепления родопсина трансдуцин, активиро-ванный GTP, образует комплекс с неактивной формой фосфодиэстеразы цикли-ческого гуанозинмонофосфата cGMP, в результате чего этот фермент активиру-ется и начинает эффективно гидролизовать cGMP. Действие ферментногокомплекса фосфодиэстераза — трансдуцин — GTP продолжается до тех пор, покане произойдет гидролиз связанного GTP, катализируемый самим трансдуци-ном.

Рис. 12.3. Цикл усиления светового сигнала с участием G-белка трансдуцина

При поглощении кванта света родопсин R* переходит в активированное состояние ки присоединяется к комплексу трансдуцин • GDP (т-GDP). В тройном комплексеR*-T-GDP гуанозиндифосфат быстро обменивается на GTP, после чего родопсин,выполнив свою функцию, но оставаясь активированным, вновь может образоватькомплекс с другой молекулой трансдуцина, что усиливает сигнал примерно в пятьраз. Трансдуцин, изменив свою конформацию за счет образования комплекса с GTP,приобретает способность взаимодействовать с неактивной формой фосфодиэстеразы(PDEi). В результате последняя активируется (PDE *) и тройной комплекс трансду-цин • GTP • активированная фосфодиэстераза (T-GTP-PDE ) действует какэффективный катализатор гидролиза циклического GMP до тех пор, пока в нем непроизойдет внутримолекулярный гидролиз GTR. За это время он успевает в среднемгидролизовать около 1000 молекул cGMP. После гидролиза GTP трансдуцин утрачи-вает способность связывать и активировать фосфодиэстеразу. Последняя переходит внеактивное состояние, а комплекс Т • GDP возвращается в цикл

После этого отщепляется и утрачивает активность фосфодиэстераза,прекращается накопление GMP, а комплекс трансдуцин — GDP оказывается го-товым к новому циклу усиления светового сигнала за счет связывания с активи-рованным светом родопсином. Изложенная выше схема действия трансдуцинаупрощена. В действительности трансдуцин представляет собой белок, построен-ный из трех неодинаковых субъединиц. Одна из них — Тα (39 кДа) — связываетGTP и GDP и катализирует гидролиз GTP. Она содержит структуру, гомологич-ную белку с-Н-ras. Другая субъединица трансдуцина — Тβ (35 кДа) — очень близ-ка субъединицам GI и Gs белков аденилатциклазной системы (см. ниже) и пред-ставляет собой полипептидную цепь, построенную из четырех тандемно повто-

ряющихся участков сходной первичной структуры, длиной около 86 аминокис-лотных остатков каждый. Эта субъединица прочно связана с третьей — γ-субъеди-ницей (8 кДа). Образование комплекса α—β—γ трансдуцина с активированнымродопсином ускоряет обмен GDP на GTP и приводит к отщеплению β- и γ-субъ-единиц, после чего освободившийся комплекс Tα-GTP активирует фосфодиэсте-разу cGMP.

Действие этой системы, состоящей из трех белков с регулируемой активностью,приводит к тому, что поглощение молекулой родопсина единственного фотона вле-чет за собой расщепление примерно 500 000 молекул циклическою гуанозинмоно-фосфата, т.е. коэффициент усиления при передаче сигнала этой системой составля-ет 5-105. Существенно и то, что включение в систему G-белка трансдуцина обес-печивает не только усиление сигнала, но и регулирование его длительности.

12.3. СТИМУЛИРУЮЩИЙ БЕЛОК Gs И ИНГИБИРУЮЩИЙ БЕЛОК Gi

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ

Как известно, аденилатциклаза, катализирующая образование циклическогоаденозинмонофосфата из АТР, определяет внутриклеточный уровень сАМР — вто-ричного мессенджера, который, в свою очередь, регулирует целый ряд биохи-мических процессов. Активность этого весьма важного для физиологии клеткифермента зависит от внеклеточных факторов, в частности адреналина, взаимодей-ствующего со специфическим рецептором в клеточной мембране. Сигнал отрецептора к собственно аденилатциклазе передается стимулирующим белком Gs.Последний является гетеротримером и состоит из трех различных субъединиц.Субъединица Gs-α с молекулярной массой 45 или 52 кДа у животных являетсяпродуктом экспрессии одного и того же гена. Различие в длине ее пептидной цепи,вызвано альтернативным сплайсингом, который не одинаково протекает в раз-личных клетках. Эта субъединица связывает GDP или GTP и катализирует гидро-лиз последнего. Комплекс Gs— GTP растворим в воде и способен активироватьаденилатциклазу без участия других субъединиц.

Способ действия Gs-белка представляется следующим. Комплекс Gs-a-субъединйцы и GDP вступает во взаимодействие с комплексом β- и γ-субъеди-ниц, образуя неактивную форму белка — α-GW-β-γ. Замещение GDP на GTP втаком комплексе идет медленно, однако оно резко ускоряется при взаимодейст-вии Gs-белка со стимулирующим рецептором, находящимся в мембране. В ре-зультате замещения GDP на GTP построенная из трех субъединиц структура рас-падается, отщепляя комплекс в котором γ-субъединица, видимо, играет роль яко-ря, позволяющего белку присоединиться к мембране.

Высвободившаяся α-субъединица, содержащая связанный GTP, представля-ет собой собственно активную форму белка. Она образует комплекс с аденилат-

циклазой, активируя этот фермент. Результатом является возрастание концентрациисАМР внутри клетки в ответ на относительно слабый внеклеточный сигнал, напри-мер присоединение гормона к рецептору. Продолжительность действия этого сигна-ла задается временем, которое необходимо для внутримолекулярного гидролиза о-субъединицей связанного GTP до GDP, после чего комплекс Gs-α-GDP вновь со-единяется с β— γ-комплексом и белок возвращается в неактивное состояние.

Такая схема подтверждается тем, что негидролизующиеся аналоги GTP, свя-зываясь с α-субъединицей, постоянно поддерживают аденилатциклазу в активи-рованном состоянии. С

S-α-Субъединица может подвергаться ADP-рибозилиро-

ванию, которое катализируется холерным токсином и состоит в модификацииодного из остатков аргинина (Arg-207). Это вызывает снижение GTP-азной ак-тивности белка, что влечет за собой постоянную активацию аденилатциклазыи нарушение регуляции метаболических процессов.

Клеточные мембраны содержат и такие рецепторы, которые в ответ на свя-зывание внешних эффекторов посылают сигналы, не активирующие, а, наоборот,ингибирующие аденилатциклазу. Действие таких рецепторов опосредовано осо-бым «итибирующим» G

i-белком и протекает, видимо, следующим образбм. По-

сле связывания эффектора рецептор взаимодействует с Gi-белком, образованнымтремя субъединицами: α, β, γ. Как и в рассмотренном выше случае, это приводитк диссоциации белка на α-субъединицу, сохраняющую связь с рецептором до техпор, пока не пройдет внутримолекулярный гидролиз GTP, и b— g-комплекс. По-следний построен, из β-субъединицы, такой же, как и в активирующем Gs-белке,и γ-субъедивицы, которая точно так же играет роль мембранного якоря, β—γ-Ком-плекс связывает субъединицу стимулирующего белка αG

s в тройной неактивный

комплекс αGs — GDP-β— γ не позволяя ей активировать аденилатциклазу. Такимобразом, ингибирующий Gi-белок действует, высвобождая в ответ на связываниеэффектора ингибитор активирующего Gs-белка — комплекс β— γ. Время, в тече-ние которого этот комплекс свободен от контакта с a-субъединицей, зависит оттого, насколько быстро последняя расщепит связанный GTP.

В заключение отметим распространенность G-белков как передатчиковсигналов со своего рода встроенным таймером. Обнаружено около 150 генов та-ких белков. Для многих из них функция пока неизвестна, не установлено даже,принадлежат ли они к стимулирующему Gs- или ингибирующему Gi-типу; соот-ветственно их относят к G

0-белкам. В то же время возрастает число G-белков,

участвующих в усилении слабых внешних сигналов. Например, найден G-белок,вовлеченный в восприятие запахов.

G-белками являются многие белковые факторы трансляции. Как уже упо-миналось, фактор EF-Tu, состоящий из 393 аминокислотных остатков, содержитG-домен (остатки 1—199). При образовании этим белком комплекса с факторомEF-Ts последний как бы раскрывает молекулу EF-Tu и «вставляет» в нее GTP,выталкивая GDP. Вызванные этим конформационные изменения G-домена (ос-

татки 1—199) передаются двум другим доменам, взаимодействующим с аминоа-цил-тРНК и рибосомой. После образования комплекса EF-Tu—GTP-рибосома—аминоацил—тРНК ускоряется гидролиз GTP в каталитическом центре G-доме-на. Очевидно, что GТРазная активность G-домена в значительной мере зависитот того, изолирован ли EF-Tu-фактор или находится в комплексе с рибосомой иаминоацилтРНК. Иными словами, существует многосторонняя связь между тон-кой структурой каталитического центра G-домена и лигандсвязывающими участ-ками поверхности EF-Tu-белка, которая реализуется, по-видимому, за счет отно-сительно небольших, но функционально важных конформационных изменений.

После гидролиза GTP до GDP связь EF-Tu-фактора с рибосомой и ами-ноацил-тРНК резко ослабевает. Если по каким-либо причинам гидролиз GTPпроизойдет слишком быстро, EF-Tu-фактор не успеет выполнить свою роль орга-низатора комплекса аминоацил-тРНК с рибосомой, что приведет к понижениюточности трансляции.

Таким образом, G-белки представляют собой эффективные регуляторы, спо-собные усиливать внешний сигнал и определять длительность его действия. Они ис-пользуют для этого весьма чувствительные конформационные изменения, сопро-вождающие связывание GTP или GDP, а также способность к внутримоле-куляр-ному гидролизу GTP, причем все эти факторы могут существенным образом из-меняться при образовании комплексов G-белков с другими белками.

ГЛАВА 13ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

Иммуноглобулгты — белки, синтезируемые в организме Позвоночных испособные распознавать и специфически связывать чужеродные молекулы — ан-тигены, а также включать механизм их элиминирования (удаления), выполняятем самым защитную функцию антител. Заметим, что белки, обладающие свой-ством избирательно связывать другие молекулы, не редки. Более того, хорошоизвестны случаи образования белками чрезвычайно прочных комплексов с раз-личными соединениями — лигандами. К ним относятся, например, комплексыавидина или его микробного аналога — стрептавидина — с биотином, комплексыферментов и их природных ингибиторов и т.п. Таким образом, само по себе свя-зывание макромолекул или других лигандов не представляет собой уникальногосвойства иммуноглобулинов.

Необычна способность этого семейства белков, обладающих целым рядомобщих, постоянных для него структурных черт, создавать огромное многообра-зие центров связывания, комплементарных множеству антигенов, совершенноразличных химически. Сразу же заметим, что речь не идет о создании той илииной особью антитела, комплементарного данному антигену. Возникновение та-

кой структуры есть результат более или менее длительного эволюционного про-цесса, на уровне организма происходит лишь отбор клеток, несущих предсущест-вующую генетическую информацию о ней, и, возможно, некоторая ее модифика-ция. Важно, что такая структура практически всегда может быть найдена. Сле-довательно, при описании семейства иммуноглобулинов необходимб в первуюочередь выяснить структурные предпосылки, которые обеспечивают решение этойфункциональной задачи.

13.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА G

Среди известных типов иммуноглобулинов иммуноглобулин G обладаетнаиболее простой структурой и особенно хорошо изучен. Его молекула имеет чет-вертичную структуру и образована двумя тяжелыми (Н) и двумя легкими (L) це-пями (субъединицами), что отражает формула Н

2- Целостность четвертичной

структуры поддерживается как нековалентными взаимодействиями, так и меж-субъединичными дисульфидными связями (рис. 13.1).

Рис. 13.1. Строение молекулы имму-ноглобулина G:

Н - тяжелая цепь, L - легкая цепь, СL и СH -вариабельные области; 1 - гипервариа-бельные участки легкой цепи, 2 - гипер-вариабельные участки тяжелой цепи, 3- шарнирная область, 4 - участок свя-зывания комплемента, 5 - углевод, 6 -внутрицепьевые дисульфидные связи, 7- межцепьевые дисульфидные связи; Fab- фрагмент, связывающий антиген, Fc -кристаллизующийся фрагмент

В пространственной структуре и легкой, и тяжелой цепей иммуноглобулиновчетко прослеживаются домены, отвечающие отрезкам последовательности, кото-рые содержат примерно 110 аминокислотных остатков. Домены сходны по спосо-бу укладки полипептидной цепи и могут быть отнесены к типичным β-струк-турным белкам. Так, в С

L -домене четыре антипараллельных отрезка пептидной

цепи образуют один β-складчатый слой, еще три отрезка — другой, примернопараллельный первому. Между этими слоями, в формировании которых участвует

примерно 60% аминокислотных остатков, расположено гидрофобное ядро, в ко-торое включена и дисульфидная связь, соединяющая эти два β-слоя, будучи при-мерно перпендикулярна им.

Третичная структура других доменов аналогична, отличаясь лишь деталя-ми. В целом же сходство их строения настолько значительно, что домены имму-но-глобулинов принято рассматривать как потомки небольшого прародительскогобелка, который в ходе эволюции был включен в качестве нескольких повторов вгораздо более протяженные и функционально специализированные структуры.Легкие цепи иммуноглобулина G состоят из двух таких доменов, тяжелые — изчетырех (рис. 13.2).

Рис. 13.2. Домены в Fab-фрагменте имму-ноглобулина G

Вариабельные домены легкой (VL) и тяжелой

) цепей объединяются в домен, непосред-ственно взаимодей-ствующий с антигеном.Константные участки (C

H 1 и CL) этих цепей

также образуют домен. Стрелками показаныучастки цепей, протеолиз которых приводит кразделению доменов

Если сравнивать первичные структуры полипептидных цепей целого рядаиндивидуальных иммуноглобулинов (моноклональных антител), то оказывает-ся, что в аминоконцевых доменах как легких, так и тяжелых цепей наблюдаетсяочень высокий процент аминокислотных замен. Соответствующие фрагментыполипептидной цепи получили название вариабелъных и обозначаются V

L (ва-

риабельный домен легкой цепи) и VH (вариабельный домен тяжелой цепи).

Остальные домены, в которых аминокислотные замены встречаются ред-ко, называют константными и обозначают С

L — константный район легкой

цепи, СН1, С

Н 2, С

Н 3 — константные домены тяжелой цепи, номера которых воз-

растают к карбоксильному концу полипептида. Четко выраженная доменная ор-ганизация молекулы иммуноглобулина делает возможным самостоятельное суще-ствование, а в ряде случаев и функционирование отдельных ее частей при усло-вии, что в них сохраняются более или менее сложные ансамбли доменов. Так, дав-но известны аномальные белки Бенс-Джонса, которые представляют собой диме-ры L-цепей.

Домены иммуноглобулинов, соответственно расположенные в разныхцепях, взаимодействуют между собой, как правило, за счет нековалентныхсвязей, что приводит к промежуточным подуровням структурной организации.Например, Вариабельные домены V и V взаимодействуют весьма тесно, образуяединый центр связывания антигена. Такой «сдвоенный» домен (иногда назы-ваемый Fv-модулем) обладает определенной подвижностью как целое относитель-но следующего модуля — сдвоенного домена С

L + С

Н1. Более того, два таких сдво-

енных домена (модуля) VL + V

Н и С

L + С

Н1— объединяются в общую структуру:

Fab’-фрагмент (от англ, Fragment antibody-binding — антиген-связывающий фраг-мент).

Этот фрагмент может быть отщеплен при помощи ограниченного протео-лиза от остальной части молекулы — Fc-фрагмента (от англ. crystallizable — кри-сталлизующийся), в который входят две С-концевые половины тяжелых цепей,образованные доменами С

H2 и С

Fc-фрагмент не участвует непосредственно в связывании антигена, однакоответствен за взаимодействие со специфическими рецепторами иммуноглобули-нов на поверхности клеток и необходим для инициирования целого каскада реак-ций, направленных на элиминирование связанного антителом антигена.

Существенно, что Fab’-фрагмент не только устойчиво удерживает свою про-странственную структуру и может существовать как независимая молекула, нодостаточно автономен и функционально, в полной мере сохраняя способность свя-зывать молекулу антигена. Fab’-фрагменты в составе целой молекулы иммуног-лобулина G способны двигать ся как целое относительно Fc-фрагмента, что при-дает иммуноглобулину так называемую сегментную гибкость. Это позволяеткаждому из двух центров связывания, локализованных в аминоконцевой частиFab’-фрагментов, реагировать с соседними антигенными участками впротяженной структуре, например в бактериальной стенке. Угол между осями Fab’-фрагментов в целых молекулах иммуноглобулина может существенно меняться,приближаясь даже к 180°. Гибкость обеспечивается и специфическими особенно-стями первичной структуры расположенного на стыке С

H1 и С

H2 доменов шар-

нирного участка, богатого остатками пролина (на примере иммуноглобулина g-Gl Daw):

Ограниченный протеолиз в этом случае легко осуществим, так как домен-ная структура продуктов расщепления достаточно устойчива и способна противо-стоять глубокому гидролизу протеиназой. В результате действие последней огра-ничивается междоменным шарнирным участком пептидной цепи. При этом взависимости от условий, в частности от специфичности протеолитического фер-мента, гидролиз проходит то «слева», то «справа» от межсубъединичных дисуль-фидных связей, что приводит в первом случае к Fab ‘-фрагментам, во втором — ких димерам — (Fab)

2-фрагментам. К получению Fab’- и (Fab)

2-’ фрагментов при-

бегают при производстве антитоксических сывороток. Интересно, что специфи-ческий протеолиз шарнирного участка используется Патогенными микроорганиз-мами для инактивации иммуноглобулина А, содержащегося в секрете слизистыхоболочек.

Итак, существование в иммуноглобулине нескольких подуровней структур-ной организации за счет взаимодействия доменов, расположенных в разных це-пях этого белка, является необходимой предпосылкой его функционирования. Этаособенность строения иммуноглобулина не объясняет, однако, возможности об-разования в рамках семейства структурно весьма близких белков огромного мно-жества антител, способных специфически связывать различные антигены.

13.2. ЦЕНТР СВЯЗЫВАНИЯ АНТИГЕНОВ

Как упоминалось, центр связывания антигенов формируют совместновариабелъные домены легкой и тяжелой цепей: V

L и V

H. По способу простран-

ственной укладки пептидных цепей они похожи, образуя, как и другие доменыиммуноглобулинов, два b-складчатых слоя, которые отстоят один от другого при-мерно на 10 А и соединены внутридоменной дисульфидной связью. Пространствомежду слоями заполнено достаточно плотно упакованными гидрофобными боко-выми цепями аминокислот. Все эти устойчивые черты третичной структуры V

и LH-доменов предопределены сходством их первичной структуры. Однако пет-

ли, соединяющие отрезки b-структуры в каждом из этих доменов, резко отлича-ются по последовательности аминокислот, если сравнивать между собой однотип-ные антитела с разной специфичностью — они гипервариабелъны (рис. 13.3, 13.4).

Три гипервариабельные петли каждого из доменов пространственно сбли-жены и объединяются в единую весьма неровную поверхность - зону связыванияантигна. Последняя образована шестью петлями: L1, L2, L3 (из V -домена) иHI, H2 и НЗ (из V -домена). Эти петли почти точно совпадают с гипервариабель-ными участками аминокислотной последовательности V-доменов, так называе-мыми районами, определяющими комплементарностъ (от англ. ComplementarityDetermining Regions, сокращенно CDR).

13.4. Расположение гипер-вариабельных участков вантигенсвязывающей зонеиммуноглобулина

Складчатыми полосками изо-бражены -структурные отрез-ки; L1, L2, L3 - гиперва-риабельные петли, соединяю-щие эти отрезки (соответстуютрайонам, определяющим ком-плементарность, - CDR)

Замены аминокислот в этих петлях (рис. 13.5) приводят к замещениюодних боковых цепей другими и, следовательно, к изменению рельефа и всего ха-рактера антигенсвязывающей зоны, чем и определяется ее способность бытькомплементарной молекулам самой различной природы. Поверхность антиген-связывающего района изменяется еще и потому, что замены аминокислот в ги-первариабельных участках влияют на конформацию образуемых ими петель. Мо-жет изменяться и длина петель, в особенности петли НЗ.

Рентгеноструктурный анализ комплексов антиген — антитело (по техни-ческим причинам обычно исследуют комплекс, образованный Fab-фрагментом, ане целой молекулой иммуноглобулина) позволил вскрыть основные факторы,которыми определяются прочность и высокая специфичность их образования.

Рис. 13.4. Расположение гипер-вариабельных участков в анти-генсвязывающей зоне иммуно-глобулина

Квадратами обозначены β-спираль-ные отрезки, рассматриваемые сторца, зигзагообразными линиями -гипервариабельные петли. Осталь-ные обозначения общепринятые; ср.рис. 13.5

Прежде всего это плотная подгонка поверхности активного центра антитела кструктуре антигена. Макромолекулы, в особенности белки, вступают в реакцию

Рис. 13.5. Модель антигенсвязывающего участка пространственной струк-туры одного из иммуноглобулинов

Контурные линии, подобно горизонталям топографической карты, проведены через 2А, гипервариабельные участки легких и тяжелых цепей обозначены соответственноLI, L2, L3, HI, H2 и НЗ. Замены аминокислотных остатков, происходящие на этихучастках, могут изменять как рельеф поверхности контакта с антигеном, так и еехарактер, например распределение заряженных, полярных и неполярных групп

с данным иммуноглобулином лишь частью своей поверхности — так называемымэпитопом. Для комплексов лизоцима с индивидуальными иммуноглобулинами(моноклональными антителами) показано, что их контактирующие поверхностиподогнаны настолько точно, что на площади примерно в 700 А 2 оказываются вы-тесненными все молекулы воды, которые гидратировали оба белка. Это удалениесвязанной, а значит, упорядоченной воды повышает неупорядоченность системыв целом, что приводит к росту энтропии и благоприятствует образованию прочно-го комплекса.

Вместе с тем сближение фукнциональных групп, принадлежащих антигенуи антителу, позволяет установить целый ряд ван-дер-ваальсовых контактов, водо-родных и ионных связей. Так, при образовании комплекса лизоцима и Fab ‘-фраг-мента иммуноглобулина возникает 126 межатомных контактов, в том числе 14водородных связей и одна ионная связь между аминогруппой лизина и карбокси-лат-ионом аспарагиновой кислоты.

Полное вытеснение воды из зоны связывания антигена стабилизирует во-дородные и ионные связи. Результатом является весьма высокая прочность ком-плекса, характеризующаяся константой связывания порядка 107-1010 М-1.

Заметим, что рельеф поверхности контакта антигена и антитела может бытьвесьма различным. Поверхность бывает почти плоской, со впадинами или выпук-лостями. Например, одно из антител к лизоциму частично заполняет своим вы-пуклым центром связывания впадину, в которой размещается субстрат этого фер-мента, и поэтому является его ингибитором. У лизоцима в этом комплексе пло-щадь контакта с иммуноглобулином составляет около 15% всей доступной рас-творителю поверхности белка.

В качестве эпитопа нередко выступает несколько сближенных в простран-ственной структуре белка-антигена участков последовательности. Определенаструктура трех комплексов лизоцима с моноклональными антителами. Суммар-ная площадь эпитопов в них — около 40% поверхности белка, а поскольку извест-но, что существуют и другие эпитопы, по-видимому, практически все или почти вседоступные участки молекулы белка могут обладать иммунологической активностью.

Еще один источник способности семейства иммуноглобулинов связыватьантигены самой различной структуры состоит в том, что поверхность зоны связы-вания, образованная V

L - и V

H -доменами составляет около 2000 А2 и намного

превышает обычную площадь эпитопа на поверхности белка-антигена (500—1000А2, у большинства небелковых антигенов она еще меньше). Вследствие этого дляобразования комплементарной эпитопу структуры может использоваться не всяповерхность зоны связывания доменов V

L - и V

H, а какая-то ее часть, в наиболь-

шей мере соответствующая строению антигена.

13.3. МНОГООБРАЗИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Своеобразна организация структурных генов иммуноглобулинов, котораяпризвана обеспечить возможность образования очень большого числа антител. Гены,кодирующие легкие и тяжелые цепи, собираются из меньших по размеру ге-нов, одни из которых, особенно многочисленные, кодируют вариабельные доме-ны V

L - и V

H (V-гены), а другие, которых гораздо меньше, — константные части

молекулы (С-гены).Так, константные домены легких, цепей кодируются несколькими генами,

что приводит к синтезу двух типов легких цепей: ае и А. В гаплоидном геномечеловека имеется один ген ае-цепи и несколько — А-цепи. Число генов, которы-ми кодируются вариабельные домены, гораздо больше. Так, существует около 100генов V

ае , на которых записаны аминокислотные последовательности вариабель-

ных доменов легких цепей типа ае.Заметим, что небольшой участок L-цепи, расположенный непосредственно

перед константным районом — J (от англ, joining — соединяющий), кодируется

особо и так же вариабелен. При созревании В-лим-фоцитов из этих отрезков со-бираются гены L-цепей, в которых путем рекомбинации объединяются гены V

—JL,—С

L , что приводит к возможности образования весьма многообразных

легких аe-цепей.Аналогично, из генов V

H (которых около 100) путем их рекомбинации с

генами DH

образуются гены тяжелых цепей — VH

—СH

.Общее число вариантов зон связывания при этом составит около 10 млн.Эта величина еще более возрастет, если учесть вклад соматических мутаций,которые приводят к дополнительным заменам аминокислотных остатков в ва-риабельных доменах иммуноглобулинов.

Своеобразный механизм формирования генов иммуноглобулинов обеспе-чивает возникновение очень большого числа аминокислотных последователь-ностей, а доменная организация этих белков и концентрирование замен в не-многих гипервариабельных отрезках цепи позволяет создавать в зоне связыванияантител чрезвычайно разнообразные по рельефу и распределению функциональ-ных групп поверхности, среди которых всегда можно найти такую, которая ком-плементарна поверхности того или иного антигена.

Помимо рассмотренных выше иммуноглобулинов G существуют иммуно-глобулины еще четырех классов: М, А, Е и D. Их молекулы также построены издоменов и организованы по такому же принципу. В иммуноглобулинах М и Е тя-желые цепи дополнены еще одним доменом— соответственно Сm 4 и С

Ђ4, в им-

муноглобулинах А и М С-концевые районы тяжелых цепей соединены между со-бой с участием специальной J-цепи. Есть и другие отличия в их структуре, в част-ности содержание и распределение углеводных цепей. Иммуноглобулин Н образу-ет пентамеры (L

5. Мембранно-связанные иммуноглобулины, которые принад-

лежат классам М и D, содержат на С-концах тяжелых цепей небольшие домены,образованные преимущественно гидрофобными аминокислотами, которые вы-полняют роль якоря, удерживающего молекулу иммуноглобулина на наружнойповерхности мембраны.

Таким образом, доменный принцип организации структуры и функции им-муноглобулинов чрезвычайно плодотворен и позволяет, используя один и тот жеструктурный мотив, создать богатую палитру антигенсвязывающих белков. Види-мо, по такому же плану построены и некоторые рецепторы клеточных мембран.

ГЛАВА 14ФИБРИЛЛЯРНЫЕ БЕЛКИ

Фибриллярные белки выполняют по преимуществу структурные функции,однако их роль ничуть не менее значительна, чем роль глобулярных белков, вели-

ко и число фибриллярных белков, особенно возросшее с открытием белков цито-скелета и межклеточного матрикса. Далее будут рассмотрены лишь некоторые,наиболее изученные фибриллярные белки.

14.1. КОЛЛАГЕН

Коллаген («образующий клей») является, видимо, наиболее распространен-ным белком многоклеточных. Так, у млекопитающих он составляет по массе око-ло 1/

4 суммарного белка. Коллаген — важнейший компонент соединительной

ткани, он входит в структуру кожи, костей, сухожилий, кровеносных сосудов,хрящей, зубов. Его главная функция — образование нерастворимых фибриллвысокой прочности.

Существует не менее десяти структурных генов, которые кодируют различ-ные молекулярные формы коллагена, отличающиеся первичной структурой, аиногда и пространственным строением. Кодируемые ими коллагены по-разномураспределены в органах и тканях. Коллаген типа I, наиболее распространенный ворганизме и содержащийся в коже, сухожилиях, костях, роговице глаза, построениз двух полипептидных цепей: α1 и отличающейся первичной структурой цепиα2; коллагены других типов образованы тремя одинаковыми и характерными дляданного типа полипептидными цепями. Каждая из полипептидных цепей колла-гена образована примерно 1000 аминокислотных остатков. Для коллагена харак-терна интенсивная посттрансляционная модификация, глубина которой зависитот органа или ткани и изменяется с возрастом животного.

В первичной структуре полипептидных цепей, образующих фибриллы кол-дагенов I—IV, четко выражен повторяющийся на протяжении всей цепи струк-турный мотив: Gly—Xaa—Yaa (где Хаа и Yaa — различные аминокислоты), причемчасто встречается структура Gly—Pro—Hyp. Этому соответствует высокое содер-жание глицина и пролина, а также оксипролина (Hyp).

Оксипролин, встречающийся только в коллагене и эластине, образуется как ре-зультат котрансляционной модификации пролина, которая происходит еще до завер-шения синтеза полипептидной цепи. Пролин, включенный в пептидную цепь, гидро-ксилируется содержащим двухвалентное железо ферментом пролилгидроксилазой.

Фермент катализирует реакцию кислорода с пролином, при которой проис-ходит гидроксилирование 4-го атома пролина, второй же атом молекулы кисло-рода реагирует с кетоглутаратом, превращая его в сукцинат и СO

2, Двухвалентное

состояние железа сохраняется в этих условиях благодаря восстановительному дей-ствию аскорбиновой кислоты:

Гидроксилированию по С-4 подвергаются только те остатки пролина, ко-торые предшествуют остаткам глицина в последовательности Pro—Gly—Xaa—Yaa.Аналогичным образом (котрансляционно) лиэин-гидроксилаза гидроксилируетпо β-углеродным атомам остатки лизина, предшествующие глицину. Гидроксиль-ные группы оксилизина служат точкой гликозилирования.

К ним последовательно присоединяются галактоза и глюкоза. Отмечен-ные модификации происходят в фибробластах и открывают собой целуюпоследовательность дальнейших превращений коллагена. Не претерпевший болееглубоких модификаций «незрелый» коллаген называется тропоколлагеном и мо-жет быть выделен из кожи молодых животных.

Тропоколлаген имеет форму стержня длиной 3000 А и диаметром 15 А ипредставляет собой три идущие в одном направлении полипептидные цепи, скру-ченные в спирали (рис. 14.1). Каждая из них аналогична спирали хорошо изучен-ного модельного полипептида— поли-L-пролина. Последняя отличается от α-спи-рали уже тем, что в ней невозможна стабилизация водородными связями вдольспирали, поскольку отсутствуют донорные группы NH. Вследствие этого кон фор-мация поли-L-пролина диктуется практически только пространственными ограни-чениями со стороны пирролидиновых колец остатков пролина. На один оборот

спирали приходится точно три аминокислотных остатка. Далее три параллельнонаправленные спирали типа поли-L-пролина в коллагене закручиваются в пучок,образуя суперспираль.

Три спирали связаны между собой поперечнымиводородными связями. Роль глицина обязательно за-нимающего каждое третье положение в пептиднойцепи, состоит в том, что он позволяет трем цепям кол-лагена сблизиться, так как не создает стерических по-мех в центре спирали, не имея боковой группы. Объе-мистые пирролидиновые кольца пролина и оксипро-лина направлены наружу (рис. 14.2).

Стабильность тройной спирали определяетсякооперативными взамодействиями, ее денатурация —переход в желатину — обычно происходит скачком внебольшом температурном интервале, середину кото-рого принято называть температурой плавленияколлагена. Интересно, что температура плавлениякоррелирует с содержанием суммы остатков пролина иоксипролина и как-то связана с температурой телаживотного, превышая ее на несколько градусов.

Рис. 14.1. Тройная спиральколлагена

Точками отмечены NH- груп-пы остатков глицина, занимаю-щих каждое третье положение

Рис. 14.2. Взаимодействие полипептидных цепей кол-лагена за счет образования водородных связей междуостатками глицина (обозначены литерой G)

Необходимое для этого сближение цепей обеспечивается ре-гулярно расположенными остатками глицина, не имеющимибоковых цепей

Такая «подогнанноств» температуры плавления к температуре тела, видимо,обусловлена необходимостью обеспечить эластичность коллаген овых волокон.Гидроксилирование пролина повышает стабильность и температуру плавления кол-лагена, поэтому нарушение гидроксилирования, например при цинге за счет недос-татка витамина С, приводит к поражению кожи, сосудов, выпадению зубов и т.п.

Образование тройной спирали коллагена может происходить спонтанно,однако это медленный процесс. In vivo такой скорости было бы недостаточно.Поэтому коллаген синтезируется в виде предшественника — проколлагена, кото-рый имеет молекулярную массу 140 кДа, в то время как молекулярная масса соб-ственно a-цепи равна 95 кДа. В предшественнике N- и С-концевые участки трехполипептидных цепей, первичная структура которых лишена характернрго «кол-лагенового» мотива, формируют глобулярные структуры, которые затем объединя-ются, взаимодействуя между собой, причём контакт между С-концевыми глобу-лами дополнительно стабилизируется межцепьевыми дисульфидными связями

В результате молекула проколлагена приобретает форму своеобразной ган-телей, в которой будущие коллагеновые пептидные цепи сближены и направленыпараллельно, что резко упрощает и ускоряет свертывание тройной спирали. Такимобразом, концевые глобулы выполняют функцию «монтажных устррйств», облег-чая правильную сборку молекулы проколлагена.

Проколлаген синтезируется и Декретируется в межклеточное пространствофибробластами. Затем специфические проколлагенпептидазы отщепляют выпол-нившие свбю роль глобулярные домены, оставляя тройную спираль, образован-ную полипептидными цепями, в каждой из которых структурный мотив Gly—Хаа—Уаа повторяется 338 раз (рис. 14.3).

Молекулы тропоколлагена упаковываются в коллагеновые волокна,располагаясь в них параллельно, однако со сдвигом по отношению друг к другупримерно на 1/

4, длины молекулы. Между концом одной молекулы и началом дру-

гой обязуется просвет в 400 А, который служит в костной ткани центром образо-вания гидроксилапатита.

Далее коллагеновое волокно стабилизируется целой системой поперечныхсшивок. Среди процессов посттрансляционной модификации, определяющих со-

зревание коллагена, (особенно важншобразование альлизина (альдегидо-производного лизина) под действием лизиноксидазы:

Аналогичное превращение в альдегид претерпевает и рксилизйн. Лизи-ноксидаза — медьсодержащий фермент, в котором в качестве кофактора высту-пает пиридоксаль. Далее спонтанно, без участия ферментов, образуется шиффовооснование с пространственно сближенной аминогруппой остатка лизина, находя-щегося в другой полипептидной цепи:

Рис. 14.3. Схема биосинтеза, сборки тройной спирали, формирования во-локна и посттрансляционной модификации коллагена (остальные пояснениясм. в тексте)

Связь —N=CH—, сама по себе малоустойчивая, восстанавливаясь до —NH—CH

2—, превращается в весьма прочную поперечную сшивку — так называемый

лизинонорлейцин:

Альдегидные группировки аль-лизина, будучи весьма реакционно-способными, легко вступают в реакции алъдольной, а затем и кротоновой конден-сации. Далее возможно присоединение к активированной двойной связи имида-зольной группы гистидина и еще более сложные превращения:

Количество и характер возникающих при этом поперечных связей позво-ляют регулировать эластичность волокна.

Таким образом, биосинтез коллагена включает целую цепь посттранс-ляцирнных модификаций. В фибробластах синтезируется и собирается проколла-ген, в котором уже проходит образование остатков оксипролина, оксилизина игликозилирование последних. После секреции проколлаген подвергается ограни-ченному протеолизу, который приводит к отщеплению концевых глобулярныхструктур и образованию тропоколлагена. Далее происходит созревание этого ещесохраняющего водорастворимость белка и возникает более или менее разветвленнаясистема поперечных межцепьевых «сшивок». Интенсивность последнего процес-са зависит от возраста животного и природы ткани, в которой локализован колла-ген, что позволяет регулировать физические свойства структур, в которые он вклю-чен.

Биологическая значимость этой последовательности превращений подчер-кивается тем, что нарушение хотя бы одного из ее звеньев приводит к серьезнымнарушениям в формировании соединительной ткани. Например, блокированиелизиноксидазы биогенным амином — латирином NH

2CN (β-амино-

пропионитрил), попадающим в организм животного при поедании им определен-ного вида горошка, делает невозможным образование аль-лизина и тем самымпрерывает дальнейшее формирование поперечных сшивок, стабилизирующихколлагеновые волокна, что приводит к глубоким поражениям кожи. Образованиепоперечных связей тормозится и при дефиците ионов меди; входящих в актив-ный Центр лизиноксидазы.

Интересно, что в стенках клеток растений содержатся оксипролин-богатыегликопротеины, играющие .роль структурообразующих белков. Другой структур-ный компонент стенок растительных клеток — глицин-богатый белок, найден-ный в бобовых. В его аминокислотной последовательности на долю глицина при-ходится 60%. Предполагают, что этот белок образует β-структуру.

14.2. ЭЛАСТИН

Эластин — нерастворимый фибриллярный белок, играющий важную рольв формировании эластичных тканей, прежде всего стенок артерий, легких и свя-зок. Полйпептидная цепь его предшественника — тропоэластина, — синтезируе-мая, как и коллаген, фибробластами, состоит примерно из 760 аминокислотныхостатков. Более половины из них приходится на глицин и аланин, четверть — натипично гидрофобные аминокислоты, среди которых особенно много валина, в товремя как число гидрофильных аминокислот очень невелико. Содержание проли-на в эластине (11%) значительно, меньше, чем в коллагене. Часть остатков проли-на гидроксилирована, однако оксипролин, по-видимому, не играет существенной

роли в эластине и, возможно, Образуется попутно, как следствие высокой актив-ности пролингидроксилазы в фибробластах, где синтезируется и коллаген.

Для первичной структуры эластина характерно обилие повторяющихся уча-стков последовательности, например последовательность Pro—Gly—Val—Gly—Valвстречается в эластине по меньшей мере 11 раз подряд. Эластин построен из боль-шого числа чередующихся гидрофобных и гидрофильных участков полипептиднойцепи, которые соответствуют множеству относительно коротких экзонов в струк-турном гене этого белка. Гидрофильные участки обогащены лизином.

По-видимому, гидрофобные участки ответственны за агрегацию, чрезвычай-но характерную для эластина. Гидрофильные же определяют образование межмо-лекулярных сшивок, которые делают агрегацию необратимой. Примерно в сере-дине каждого из гидрофильных участков содержатся остатки лизина, разделенныедвумя-тремя остатками других аминокислот, часто аланина, Например Lys—Ala—Ala—Lys, Lys—Ser—Ala—Ala—Lys—Val—Ala—Ala—Lys, Lys—Ala—Pro—Lys.

При созреваний тропоэластина почти все остатки лизина превращаются в аль-лизин под действием того же медьсодержащего фермента лизивоксидазы, которыймодифицирует коллаген. Образовавшиеся при этом альдегидные группы вступаютвреакции конденсации с другими остатками аль-лизина, а также с ε-аминогруппойеще не окисленного остатка лизина, в результате чего четыре сближенных в агрегатеостатка лизина дают десмозин — аминокислоту с пиридиниевым ядром, объединяю-щую в один узел четыре участка пептидной цепи эластина:

Сшивки такого типа делают эластин нерастворимым в воде, в то время какучастки между ними, имеющие конформацию неупорядоченного клубка, сохра-

няют способность к обратимому растяжению, чем и обусловлена растяжимостьсвязок и стенок артерий. Инактивация лизиноксидазы, которая может быть вы-звана дефицитом ионов меди или блокированием пиридоксаля в актирном цен-тре фермента (вследствие реакции с аминогруппой аминопропионитрила — лати-рина), тормозит созревание эластина и приводит к утрате эластичности связок иартерий, а иногда к разрыву аорты.

14.3. КЕРАТИНЫ

Кератин — структурообразующий фибриллярный белок, синтезируемыйэпителиальными клетками и образующий в них так называемые промежуточ-ные филаменты — тяжи, участвующие в построении цитоскелета. В цитоскелетклеток других типов входят белки, родственные кератину. Из кератина же построе-ны роговые образования — волосы, ногти, когти, клювы, перья, шипы, панцирь,сухой наружный слой кожи.

По мере перемещения эпителиальных клеток к поверхности синтезкератинов становится, все более интенсивным и в конечном счете волокна кера-тина заполняют всю клетку, поверхностные структуры которой оттесняются напериферию волокна, образуя его оболочку — кутикулу.

В эпителиальных клетках не менее, 20 структурных геновкодирует синтез кератинов, принадлежащих к одному издвух типов: I или II; кератины тина III синтезируются вкачестве белков цитоскелета в неэпителиальных клетках.Все кератины, являясь эволюционно родственными бел-ками, построены по одному плану. Так, эпидермальныйкератин II человека содержит в одной полипептиднойцепи 562 аминокислотнйх остатка, причем его N- иС-концевые фрагменты (своего рода домены), по-види-мому, не имеют какой-либо доминирующей регулярнойвторичной структуры, тогда как последовательность цент-ральной части полипептидной цепи, которая соответст-вует четырем экзонам, состоит из состыкованных четы-рех о-спиральных доменов. В каждом из них много-кратно повторяется одинаковый структурный мотив изсеми аминокислотных остатков, среди которых первый ичетвертый, как правило, гидрофобны. Например, с 386-го остатка начинается фрагмент (гидрофобные остаткивыделены полужирным шрифтом): Ile—Gln—Arg—Leu—Arg—Ser—Glu—Ile—Asp—His— Val—Lys—Lys—Gln—Cys—Ala,—Asn—Lea и т.д.

Рис. 14.4. Двойная спираль керотина

Регулярное появление гидрофобных боковых цепей через каждые три илидва аминокислотных остатка в α-спиральных участках кератина приводит к об-разованию своеобразных гидрофобных «гребней», взаимодействие между кото-рыми стабилизирует суперспираль, так называемую протофибриллу, образую-щуюся при закручивании двух (рис. 14.4) одинаково направленных цепей кера-тина друг относительно друга. По-видимому, концевые неспиральные участки вполипептидных цепях кератина, как и в коллагене, выполняют «монтажную» функ-цию, способствуя их правильной укладке и ускоряя образование суперспирали.Одиннадцать протофибрилл, соединяясь в пучок, образуют микрофибриллу, мик-рофибриллы собираются в фибриллы.

При образовании роговых структур — волос, шерсти, панциря и т.п. —большую роль играет белок матрикса, в который погружены фибриллы кератина.Этот неспиральный белок в отличие от собственно кератина очень богат остатка-ми цистеина, которые, окисляясь, образуют многочисленные дисулъфидные мос-тики, упрочняющие структуру фибрилл кератина и делающие их практическинерастворимыми. Тай, цистеин-богатые белки волос человека и шерсти овцы, оченьпохожие по первичной структуре, содержат в полипептидной цепи 168 амино-кислотных остатков, из которых 36% приходятся на Цистеин, превращающийсяпри окислении в цистин. Характерна N-концевая последовательность богатого серойбелка волос человека, в которой остатки цистеина занимают каждое третье иличетвертое место:

M et—Gly—Cys—Ser—Gly—Cys—Ser—Gly—Gly—Cys—Gly—Ser—Ser——Cys—Gly—Gly—Cys—Gly—Ser—Arg—Cys—Gly—Gly—Cys—Ser—Ser—

—Ser—Cys—Cys

Содержание остатков цистина в кератиновых роговых образованиях силь-но зависит от вида животного, пищевого рациона, природы эпидермальных тка-ней. Так, содержание цистйна в шерсти овцы значительно выше, чем в её рогах.Оно достигает 20% в Панцире черепахи.

Растягивание кератиновых волокон при одновременном их увлажнении приводит к глубокой реорганизации вторичной структуры: α-спиральные цепи,вытягиваясь, переходят в β-структуру с одновременным установлением системымежцепьевых водородных связей, чему способствует и увлажнение. Такой переходи обусловленное им растяжение кератиновых волокон, например волос, обрати-мы — при снятии нагрузки и понижении влажности происходит переход в α-спи-ральную структуру и сокращение длины. Это свойство используют при устройствепсихрометров — приборов, регистрирующих влажность воздуха.

Восстановление дисульфидных связей, проводимое обычно действием из-бытка меркаптосоединения (тиогликолевой кислоты или меркаптоэтанола), сни-мает поперечные сшивки в богатом цистином белке матрикса и делает волокна

кератина весьма гибкими, поддающимися формованию. Последующее окисле-ние вызывает образование уже иного набора дисульфидных связей и фиксируетновую форму волокна. Такую обработку применяют при «химической» завивкеволос, а также для придания шерстяным тканям, построенным из кератина,несминаемых складок.

14.4. ФИБРОИН ШЕЛКА

К структурным фибриллярным белкам относятся фиброин шелкаи белок паутины. В фиброине шелка полипептидные цепи богатыеглицином и аланином, содержат протяженные повторяющиеся последовательностиAla—Gly, например

— (Ala—Gly)4 —Tyr—Gly—(Ala—Gly)

5— Tyr— Gly— Ala— Ala— Ser—Gly—

— (Ala—Gly)2

и образуют антипараллельную β−cтруктуру. Боковые цепи остатков аланина, чере-дующихся в последовательности фиброина с глицином, располагаются по однусторону β−cкладчатого листа, так что гидрофобные контакты между ними дополни-тельно стабилизируют структуру. Близкие к полностью вытянутым полипептид-ные цепи фиброина придают волокну прочность, однако эластичность его неве-лика и определяется по преимуществу менее регулярными участками структуры.В природной шелковой нити типично фибриллярный белок фиброин погружен всвоего рода матрикс, образованный другим, но менее рядочбнным структурно бел-ком — серицином.

Завершая рассмотрение особенностей некоторых фибрилдярных белков,отметим, что их первичная структура, как правило, содержит характерные «моти-вы», т.е. повторяющиеся одинаковые или однотипные последрвательнрсти ами-нокислот, которые обеспечивают формирование весьма протяженной регулярнойвторичной структурад.

Граница между глобулярными и фибриллярными белками не столь резка,как это может показаться. Нередко компактные глобулярные и вытянутые фиб-риллярные элементы совмещаются в рамках одной и той же структуры. Это свой-ственно предшественникам фибриллярвых белков, например проколлагену, новстречается ив зрелых глобулярных белках, например в гемагглютинине вирусагриппа, ряде белков, регулирующих активность ДНК с участием «лейциновоймолнии», и т.п.

Вместе с тем немалый интерес представляют белки, образованные оченьдлинными полипептидными цепями, которые, однако, в отличие от рассмотрен-ных выше фибриллярных белков формируют пространственную структуру в видедлинной гирлянды обычно небольших, функционально специализированных гло-бул. В таких полидоменных белках соотношение длины и сечения молекулы ха-рактерно для фибриллы, что отражается на их физико-химических свойствах, од-нако присутствуют и черты, свойственные типично глобулярным образованиям.Форма их гигантских макромолекул нередко далека от линейной фибриллы и под-час весьма сложна.Такого рода белки играют важную роль в образовании внеклеточ-ного матрикса соединительной ткани — специфической среды, в которую погру-жены клетки. Они участвуют в процессах эмбрионального развития тканей, внут-ритканевой подвижности клеток, их закреплении, наконец, в расселении опухо-левых клеток — метастазировании.

14.5. ФИБРОНЕКТИН

Фибронеътиц — высокомолекулярный гликопротеин (молекулярная мас-са около 500 000 Да), образованный двумя почти, идентичными субльединицами,содержится в сыворотке крови

у а также присутствует в виде нерастворимых агре-

гатов в соединительной ткани. Его субъединицы содержат одну цолипептиднуюцепь и соединены в С-концевом районе дисульфидными связями. Полипептид-ная цепь каждой из них образует последовательно целый ряд доменов, которымсоответствуют сходные участки полипептидной цепи — своего рода повторы, ко-торые могут быть отнесены к трем различным типам. Интересно, что аналогич-ные повторы (и, следовательно, домены аналогичного строения) присутствуют вдругих белках иной функции. Так, повторы типа I структурно близки одному издоменов тканевого активатора плазминогена.

Отдельные участки последовательности фибрбнектина, видимо, домены илиих группы, функционально различны. Так, пять повторов типа I, охватывающихаминоконцевую последовательность фибронектина, направляют агрегацию егомолекул, участвуют в образовании межклеточного матрикса, связываясь с глико-зиЛаМиноглйканом — гепарином — огромной разветвленной молекулой, про-низывающей всю структуру межклеточного матрикса. Следующие шесть повто-ров (доменов), два из которых также принадлежат I типу, отвечают за взаимо-действие с еще одним белком межклеточного матрикса — коллагеном:

Один из повторов типа III, расположенный в центральном участке поли-пептидной цепи и свернутый примерно так же, как домены иммуноглобулинов,образован семью β−структурными отрезками. Он содержит чрезвычайно харак-терную последовательность аминокислот Arg—Gly—Asp (RGB в однобуквеннойзаписи). Эта последовательность, встречающаяся в несколько ином окружении и

в некоторых других белках, например в тромбине, специфически связывается срецептором на поверхности клеток, так называемым интегрином a

1. Это обес-

печивает адгезию клеток к фибронектину и играет важную роль в их ориентиро-ванном перемещении внутри соединительной ткани. Интересно, что сравнитель-но короткие пептиды, содержащие RGD-последовательность, имитируют способ-ность фибронектина взаимодействовать с рецепторами на поверхности клеток.

Домены типа III, структурно близкие иммуноглобулину, встречаются и вдругих гигантских белках, например в белке мышц тцтине (молекулярная масса3000000 Да), где они, как полагают, придают полипептидной цепи способность кобратимому растяжению за счет обратимого перехода компактной простран-ствен-ной структуры в развернутую и наоборот;

В фибронектине далее следуют домены, связывающие гепарин, и вблизикарбоксильного конца молекулы — связывающие фибрин. Расположенный на са-мом С-конце небольшой домен ответствен за антипараллельную ориентацию по-липептидных цепей субъединиц и образование между ними двух дисульфидныхсвязей.

Из сказанного видно, что фибронектин за счет соединения в весьма протя-жен-ной и гибкой структуре ряда функциональных доменов, настроенных наизбирательное связывание — адгезию макромолекул и целых клеток, обеспечива-ет достаточно динамичную пространственную организацию межклеточного мат-рикса. Очевидно, что эта функция чрезвычайно важна в развитии соединительнойткани и организма в целом. Присутствующий в крови растворимый фибронектиниграет ответственную структурообразующую роль в процессе заживления ран.

14.6. ЛАМИНИН

Ламинин — белок, участвующий в формировании внеклеточного матрик-са и закреплении клеток, — образован очень длинными полипептидными цепя-ми и по своей геометрии мог бы быть отнесен к фибриллярным белкам, однакодовольно протяженные его участки представляют собой цепочки глобул неболь-шого размера, структурно сходных с одним из факторов роста. Таким образом,ламинин нельзя безоговорочно считать традиционным фибриллярным белком,хотя по контурам молекулы и функциональным свойствам между ними немалообщего.

Этот гликопротеин с молекулярной массой около 900 000 Да является глав-ным компонентом базальной мембраны, на которой формируется соединитель-ная ткань. Известно несколько ламининов, отличающихся деталями структуры илокализацией в той или иной ткани, так что речь идет о целом семействе струк-турообразующих полидоменных белков.

Рис. 14.5. Структурная организация ла-минина:

А, В1 и В2 - полипептидные цепи, С-концыкоторых находятся в нижней части рисунка.Направленные параллельно спиральные рай-оны, по-видимому, образуют единую суперспи-раль. Один из ее участков ответствен за ростнейритов и адгезию нервных клеток. G - круп-ная глобула, образованная С-концевым рай-оном А-цепи.Римскими цифрами обозначены домены в по-липептидных цепях ламинина. Домен III цепиВ ответствен за связывание с рецептором наповерхности клетки и содержит после-довательность Туг Не Ser Gly Arg. N-Конце-вые глобулярные домены цепей В1 и В2 свя-зывают коллаген IV

Ламинин связывается с коллагеном типа IV, характерным для базальноймембраны, протеогликаном — гепарансульфатом — и другими макромолекулами,в частности главным белком базальной мембраны нидогеном, что приводит к фор-мированию многокомпонентной сетчатой структуры — матрикса. Помимо того,ламинин обеспечивает связывание клеток эпителия с базальной мембраной. Ла-минин (рис. 14.5) построен из трех полипептидных цепей: А-цепи (молекулярнаямасса 440 000 Да), В1-цепи (225 000 Да) и В2-цепи (205 000 Да). С-Концевыерайоны всех трех цепей могут образовывать весьма протяженные α-спирали, по-строенные из множества гептадных повторов, характерных для суперспирализо-ванных белков, например, кератинов.

По-видимому, С-концевые α-спиральные районы всех трех цепей сплетены вединую весьма жесткую палочкообразную структуру — суперспираль длиной около700—800 А, которая завершается глобулой, построенной за счет выступающего С-концевого участка А-цепи. N-Концевая часть А-цепи формирует, вероятно, несколькодоменов, включая так называемые цистеинбогатые участки, в которых примерно на50 аминокислот приходится 8 остатков цистеина. Эти домены структурно аналогич-ны фактору роста эпителия (EGF), имеют жесткую палочковидную структуру и, чтопримечательно, нередко обнаруживаются в структуре белков животных.

N-концевые участки цепей В1 и В2 как бы откинуты в стороны от анало-гичного участка цепи А, поэтому молекула ламинина приобретает форму креста,образованного тремя короткими отрезками и одним длинным, причем каждыйиз трех коротких лучей завершается двумя небольшими, а длинный — одной круп-ной глобулой. Центральная часть крестообразной структуры стабилизировананесколькими дисульфидными связями. N-Концевые участки легких цепей В1 иВ2 также образуют по Два глобулярных домена и жесткие палочковидные струк-туры, построенные аналогично фактору роста эпителия EGE.

В одном из таких EGF доменов цепи В1 находится участок узнавания ре-цептора ламинина, расположенного на поверхности клеток. Этот участок ответст-вен за адгезию клеток и их направленное перемещение. Характерно, что срав-нительно короткий пентапептид — фрагмент последовательности в этомдомене ламинина, имеющий строение Туr—Ile—Gly—Ser—Arg, — способенконкурировать с ламинином за взаимодействие с клеточным рецептором ипрепятствовать адгезии клеток, в том числе, например, клеток меланомы ба-зальной мембраной. Связывание коллагена IV, характерного компонента ба-зальной мембраны, обеспечивается глобулами на коротких лучах креста, участоксвязывания нидогена (150 кДа) расположен в EGF-подобном домене цепи В2.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Общие руководства и учебные пособия

Страйер-Л. Биохимия. - М.: Мир, 1984.Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. - М.: Мир, 1981, Т. 1-3.Ленинджер А. Основы биохимии. - М.: Мир, 1985.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987.

К главе 1

Якубке Х.Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. - М.: Мир, 1985.Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids/G.C. Barrett, ed. - London, N.Y.:Chapman, and Hall, 1985.

К главе 2

Якубке Х.Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. - М.: Мир, 1985. М.Bodansky. Peptide Chemistry. A. Practical Textbook. - N.Y: Springer-Verlag, 1988.

К главе 3

Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.:Мир1985.Остерман Л.А. Методы иссле-дования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и хроматография. - М.: Наука,1981.Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокуси-рованием, иммуноапектрофорезом и радиризотопным}! методами. - М.: Наука,1983.Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985.

К главе 4

Практическая химия белка/Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989.

К главе 5

Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной: организаций; белков. - М.: Мир,1982.Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая, химия, - М.: Мир, 1984. Т. 1, 2;1985. Т. 3.

К главе 6

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия.,- М.: Мир, 1984. Т. 1;Шульц Г., Ширмер Р. Принципы струдаурной организации белков: - М.: Мир,1982.Карплус М., Мак-Каммон Дж.Э. Динамика белковой структуры//В миренауки. 1986. № 6. С. 4-15.Chothia С. Principles that determine the structure of proteins//Ann. Rev. Bio-chem.1984. V. 53. P. 537-572.Ptitsym O.B. Protein Folding: Hypotheses and Experiments//J. Prot. Chem. 1987. V. 5.P. 273-293.Privalov P.L; Stability of Proteins//Adv. Protein Сhem. 1979. V. 33. P. 167-241; 1982.V. 35. P. 1-104.Methods in Enzytnology/C.H.W. Hire, S.N. Timashev, Eds. - Enzyme structure. Aca-demic Press, N.Y., London, 1986. V. 130. Part K; 1986. V. 131. Part L.Gething M.-J., Sambrook K. Protein folding in the cell//Nature. 1992. V. 355. P. 33-45.

К главе 8

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. - М.: Мир, 1981. Т. 3.

К главе 9

Glazer A.N. The Chemical Modification of Proteins by Group-Specific and Site-Spe-cific Reagents//The Proteins/Eds. H. Neurath, R.L. Hill. - N.Y., Academic Press, 1976.V. II. P. 1-103.

К главе 10

Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир, 1980.Дюга Э., Пенни К. Биоорганическая химия. - М.: Мир, 1983.Schuhz G. The Interplay Between Chemistry and Biology in the Design of Enzymatic

Catalyst//Science. 1988. V. 240. P. 426-433.Meihods in Enaymology, Posttranslatibnal Modifications/F.Wold, K- Moldave, Eds. -Academic Press, N.Y., London, 1983. V. 106. Part A; 1984. V. 107. Part B.PosifranslauorKtl Covalent Modifications of Proteins/B.C. Johnson, Ed. - AcademicPress, N.Y., London, 1983.

К главе 12

Kazirb Y., MOh. Л, Kozasa U et al. Structure and Function of Signal-transducing GTP-binding Proteins//Ann. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 349-400.

К главе 13

Иммунология/Шк ред. У. Пол. - М.: Мир, 1987; Т. 1.

Кгааве 14

Фрейзер Р. Кератины/Молекулы и клетки. - М.: Мир,,1970. Вып. 5, С. 118-133.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Абзимы 237Аденилатцикдаза 269, 290Аденозинмонофосфат циклический269, 290Адренокортикотропный гормон(АКТГ)38АДФ-Рибозилирование 271Азосочетание 188, 195, 196*Активный центр фермента 207, 225,226*Аланин 9*, 19Алкилборные кислоты 231Алкилирование карбоксильных групп190- тиоловых групп,192Алкогольдегидрогеназа 153, ,240Аллостерические эффекторы; 177Альбумин сывороточный 56Альдегид о-фталевый 15Альдегидопептиды 232Аль-лизин 306, 308, 309*Аминогруппа(ы) аминокислот 8, 12-18- защита при синтезе пептидов 25α-Аминогруппы 183ε-Аминогруппы лизина 183Аминокислотный анализ 62Аминокислоты 7-23- амиды 16- аминогруппы 12-15- анализаторы автоматические 64- ароматические 69- ацетилирование 283- ацилирование 12- белковые 7- гидразиды 73- гидрофильные 8, 108

- гидрофобные 7, 69,73, 108.- дабсил-производные 64 *- доступность боковых цепей гдля воды109*, 110*V- защищенные, симметричные ангид-риды 30- инвариантные 144 - карбоксильные группы: 15-18- кислотно-основные свойства 8- С-концевые, определение 73- N-концевые, определение 74- небелковые 7- реакции с металлами 16— химические 12-синтез 18-23- Эфиры 16Аминолиз α-галоидкарбоновых кислот19Аминопептидазы 283Аминотрансферазы 205ВОС-ангидрид 26, 30*; 32*,Ангидриды дикарбоновых кислот, мо-дификация аминогрупп лизина 156--157*Анемия серповидно-клеточная 180Аниониты 48Антибиотики пептидные 37Антиген(ы) 292, 295 *- зона связывания 297- центр связывания 295, 297, 298 *Антитела каталитические 249-251 *- моноклональные 57, 294, 298, 299*- поликлональные 57Антрахинонового ряда красители 55Апоферменты 204Аргинин 8, 9 *- модификация 196-Аргининянтарная кислота 7Арены 201, 202*Арилирование 13, 185 Аспарагин 8, 9 *, 63Аспарагиновая кислота 8, 9 *, 63

- - выщепление остатков 71- - полуальдегид 7- - синтез 22 Аспартат 35, 36 *Аспартаткарбамилгрансфераза 162 *Атерокальцин 259Аутокаталитическая реакция 280Аутофосфорилирование 285Аффинной хроматографии метод 52Аффинные реагенты 199N-Ацетилгалактозамин 262 *N-Ацетилглкюкозамин 260Ацетилимидазол 186Ацетилкоэнзим А 283Ацетилтрансфераза 283Ацилаза L-аминокислот 20, 21 *О-Ацилмочевина 28, 29 *Ацилфермент 229NO-Ацильная миграция 255Бактериородопсин, ренатурация 138Белковой молекулы динамика 114-116*- - уровни организации 60Белковые кристаллы 117Белок(ки), активностью управление 161- аминокислотного состава определе-ние 64- Бенс-Джонса 295- взаимодействие с водой 106, 107- внутримолекулярные перегруппи-ровки 254- выделение 39-58- гель-хроматография 43- гетеромерные 150- гидратация 8- гликозилирование 259- глобулярные, поверхность, структура, форма 113, 114- гомогенность 39, 61- гомомерные 151- денатурация 127- единицы свертывания 122- мембранные 124-126 *

- - интегральные 124—ренатурация 138- методы разделения 51- микрогетерогенность 62- множественные формы 152, 254- модификация котрансляционная 253- - посттрансляционная 253- определение 59- паутины 314- пентамерные 151- первичной и вторичной структур соотношение 99- полусинтез 34- полярные группы 106- пространственная структура 117- - - формирование 99- «растрепанные концы» 62- самосборка 60- GTP-связывающие 283- «со свиными хвостиками» 272- теплового шока 140- тепловые колебания 116-тетрамерные 151, 152*- тримерные 151- фибриллярные 302- физико-химические особенности 42- фосфорилирование 266- функциональных групп реакционная способность 181-183- «химерный» 57- с-H-ras 284, 285 * G-Еелки 283Бензилоксикарбонилхлорид 25, 26 *Бензилоксикарбонильная группа 25Биполярные ионы 8, 24Бифункциональные сшивающиереагенты 200СААХ-Бокс 276 Бора эффект 178Бромциан 52, 70Вазопрессин 38

Валин 10 *Ван-дер-ваальсовы связи 104Взаимодействия нековалентные 103Вода, влияние на белок 87Водородные связи 8, 86, 103, 105 *,106*, 153.Вторичная структура 79-102, 122- - водородные связи 86- - мерцающая 99- - нерегулярные элементы 80 ,- - оптические методы определения 101, 102- - регулярные элементы 80- - устойчивость 98β-Галактозидаза 58Гель-хроматография 43 Гем 162, 163 *Гепарин 315Геранил-геранил-пирофосфат 275 * Геранил-пирофосфат 275 *Гетеродимеры 161Гемоглобин(ы) 163, 167-180- А 179- F (фетальный) 177- R 174, 175-S180 324- Т 174, 175- аномальные 179-180- Бостон 179- Вена 179- гистидин дистальный 165, 166 *- - проксимальный 165, 166*, 171- релаксация молекулы 173- Саскатун 179- транспорт С0

2 и Н

- Хаммерсмит 179- четвертичная структура 168, 169 *, 172*- - - кооперативность 170- - - функциональная роль 173Гидантоин 19, 20 *Гидразинолиз пептидов 73Гидролазы 205, 233Гидрофобное ядро белка 108, 111 *,

ИЗ, 164Гидрофобность аминокислот, способыоценки 107Гидрофобные контакты 107, 154Гидрофобный гребень α-спирали 90Гипервариабельные петли иммуно-глобулинов 297 *, 298 *Гистидин 8, 9 *- алкилирование 195- модификация 195Гистидиндекарбоксилаза 255Гликогенсинтетаза 267, 269 *Гликогенфосфорилаза 269 *N-Гликозидная связь 260О-Гликозидная связь 262, 263 *Гликозилирование белков 259Гликолипиды 272, 273 *Гликопротеины 259-265- функциональная роль углеводныхкомпонентов 263, 264 *Глицеральдегидфосфат 246 *Глицеральдегидрофосфатдегидрогена-за 95*Глицин 8, 9 *- нестандартная конформация 84, 85 *Глобины 162-163- типы 163Глобула расплавленная 137Глутамин 8, 9 *, 63Глутаминовая кислота 8, 9 *, 63Глутаровый диальдегид 202Глутатионредуктаза 97 *Голоферменты 204Гомодимеры 161Гомосерин 7, 71, 78*Гомосериндегидрогеназа 22Грамицидин S 37, 54Fmoc-Группа 26, 27 *Гуанидин солянокислый 129, 132, 133*, 138, 156Гуанидогруппы аргинина модификация 196, 197*Дальние взаимодействия в белках 99Дансилирование 12

Дансилхлорид 12 *, 75Дансильный метод 75Двойных обратных величин метод 212,213*Дегидроаланин 40, 256Дегидрогеназа 205Дегидрофолатредуктаза 58 Дезамидирование 132Дезоксигемоглобин 170-172*, 175Денатурация 40, 65, 127- тепловая 104- факторы 128-132Десмозин 312Десорбция белков при хроматографии47, 50, 51 *Детергенты ионные 130Диазосоединения алифатические 190Дииодтирозин 187 *, 257 *Дикетопиперазин 24, 25 *Дикумарин 259Димер(ы) 151, 169Диметилаллил-пирофосфат 275 *Динитрофенилирование 13, 74Динитрофторбензол 13 *, 74, 185 *Диоксиацетонфосфат 246 *, 247Дипольный момент α-спирали 90Дисперсии оптического вращенияметод 101Дисульфидного обмена реакция 193Дисульфидные мостики (связи) 8, 111Дитиоэритрит 133 Дифосфоглицерат 175, 176 *Дифтамид 272Дифтерийный токсин 272Диэтиламиноэтил (ДЕАЕ)-целлюлоза48Додецилсульфат натрия 130, 157Домены 118-120*- иммуноглобулинов вариабельные 294, 295 *- - константные 294, 295 *- разделение 279

Зимогены 280β-Изгиб 96-98 *, 135, 263Изолейцин 9 *Изомеразы 206Изопентенилчтарофосфат 275 *Изопептидные связи 23Изоформы белков 152Изоэлектрическая точка 11 * Иммобилизация белков 202Иммуноглобулин(ы) 56, 292- антигенсвязывающий участок 299 *- классы 302- многообразие 301- сегментная гибкость 296-0293,294*Иммунодефицита человека вирусапротеиназа 34Иммуносорбция 56Ингибирование ферментов 215- - конкурентное 217- - неконкурентное 218- - необратимое 215- - обратимое 217Ингибиторы сериновых протеиназ 231, 232Инсулин 34, 36 *, 149, 277Интегрин 316Интерлейкин 34Интерфероны 34Иодирование 186Ионы биполярные 8, 24Калликреин 224Кальмодулин 269Кальцитонин 34Карбамилирование 131Карбаминовая кислота 178Карбангидраза 203Карбобензооксигруппа 25Карбодиимиды 28, 29 *, 189N-Карбоксиангидриды 177-Карбоксиглутаминовая кислота 258Карбоксильная(ые) группа(ы) 8

- - активация 28- - аспарагиновой и глутаминовой кислот 188- - защита 16S-Карбоксиметилцистеин 66 *Карбоксипептидазы 54, 73, 74, 182,220Карбониевый ион 236Катализ ферментативный 207Катализаторы биологические 203Катепсин D 265Катиониты 46, 48Кератин 311, 312*Киназы 205Коллаген 302, 305 *, 307 *, 315- температура плавления 305- тройная спираль 304 *, 307 *Коллагене вые волокна 306, 307 * 326Конденсация альдольная 310- кротоновая 308Конканавалин А 149Консервативные замены 164Константа диссоциации субстрата 209- ингибирования 216- Михаэлиса 209- - «кажущаяся» 217- - физический смысл 212- скорости бимолекулярная 211, 214Конформации стабильные 85*, 86С-Концевой (аминокислотный)остаток 24N-Концевой (аминокислотный)остаток 24Кооперативная система нековалентныхвзаимодействий 154Кринглы 119Лактатдегидрогеназа 152, 243- каталитический центр 244 *- субстрат 244Ламинин 316, 317*Латирин 309Легглобин 162

Лейцин 9 *Лейциновые молнии 156, 314Лиазы 206, 256Лигазы 206Лиганды 53, 293Лизин 8, 9 *, 21Лизина лактам 21-синтез 22, 23Лизинлактамаза 21Лизиноаланин 40, 41 *Лизиноксидаза 306, 309, 311Лизинонорлейцин 306, 308 *Лизоцим 233, 234*- механизм действия 237 *, 239Липопротеины 272β-Листы 136 -упаковка 121Льдоподобные структуры в воде 106Малатдегидрогеназа 243Межсубъединичные контакты 153Меланоцйтостимулирующий гормон 38Меркаптоуксусная кислота 132Меркаптоэтанол 65, 66 *, 132, 137Металлопротеиназа 54, 69Метионин 9*, 19, 63, 64 *- модификация 191Метионинсульфоксид 191Метионинсульфон 63, 64 * 191Миоглобин 163-165 *, 167 *Миристоилирование 273Михаэлиса комплекс 207, 208Моделирования молекулярно-дина-мического метод 116Модификации аминокислот реагенты183-198Модификация аффинная 183Модифицирование химическое 180Fv-Модуль в иммуноглобулине 295Моноиодтирозин 187Мочевина 132, 133*, 137,156Мутагенез сайт-специфический 134, 180,198,232,237Муцины 263

Нековалентные взаимодействия в, белке 90, 153- - во вторичной структуре 86Нидоген 317Нингидрин 14- цветная реакция с аминокислотами 64о-Нитротирозин 187 *Носители макропористые 46Оборотов число 214Овокальцин 259Оксиаминокислота 262Оксианионная впадина 228-230 *Оксигемоглобин 170-172*Оксидаза 205Оксидоредуктазы 205Оксипролин 303-305 *, 310Оксисукцйнимид 29 *Окситоцин 38Оксониевый ион 236Олигосахаридтрансфераза 262Омыления реакция 16Онкобелки 271, 284Онкоген 287Остеокальцин 259Паули реакция 188, 1Й6Пентафторфенол 29 *Пепсиноген 282Пептид(ы) 23- активационный 280- способы получения 34- определение первичной структуры 73, 74- предшественники регуляторных пептидов 38- природные 36- свойства 24- синтез ферментативный 36- - твердофазный метод 32- - химический 25Пептидилбромметилкетоны 200Пептидная связь 23, 80, 81—образование 28- - расщепление 70— - уме, транс 81 *, 83

- - - - изомераза 139Пептидные петли, роль в нековалент-ных взаимодействиях 155, 156Первичная(ые) структура(ы) 59-79, f41- - методы определения 65- - эволюционно отобранные 141- последовательности, задающиеповороты пептидной цепи 144Полиакриламид 43Полибелки 59, 158- разделение 278Полипептиды 23Полипептидная цепь неупорядоченная65- - пути свертывания 134-136 *RCD-Последовательность 315Посттрансляционной модификацииреакции 7Пренилирования реакция 274Пренилтрансфераза 276Проинсулин 35, 278Прокарбоксипептидаза 282-Проколлаген 306Проколлагенпептидаза 306Пролин 10*, 310Простетическая группа 162Пространственная структура белка,связь с первичной структурой 141

Протеиназа(ы) 205- аспартильные 258- сериновые 68, 69, 220- - активный центр 225, 226 *- - катализ 225- - механизм действия 227 *, 228; 231- системы свертывания крови, механизм действия 281-282Протеиндисульфидизомераза 138, 139*Протеинкиназы 150, 265- специфичность вторичная 67- - первичная 67Протеогликаны 259

Протеолиз глубокий 276- ограниченный 276, 277-Протоонкобелки 284Протоонкоген 287Проферментов активация 280- - биологический смысл 282Процессинг 60, 253, 260 328Районы иммуноглобулинов, определяющиекомплементарность 298Рамачандрана карта 84, 85 *, 91, 96, 97*«Растрепанные концы» 282Рацемазы21, 206Рацематы аминокислот 20- - способ разделения 20Рацемизация 31Резус-фактора белок 274Ренатурация белка 132-кинетика 133*-136Ретровирусы 279РНК-полимераза 151Росттрансформирующйй фактор ос 33Руеманна фиолетовый 14 *Связь ионная 16- координационная 16Секвенатор(ы) автоматический(е) 77- газофазный 79Серии 8, 9*, 103*Серицин 314Сефадекс 43Сефароза43, 50, 52Опаловая кислота 265Синтез белков de novo 148Синтетазы 206β-Складчатые листы 93, 153β-Складчатого слоя формирование 155β-Слой 93, 94 *Соединения включения 106α-Спираль(и) 80, 88, 97 *, 123, 136 *- амфифильная 91- гидрофобная 91- гребни 121

- левая 85 *, 88, 97 *- нековалентные взаимодействия 155-правая 85*, 88, 89*- упаковка 121, 122 Специфичность ферментов субстратная 205Сплайсинг альтернативный 290Стереоизбирательность реакции 22Стереохимическрго кода выраженность 147Стресс-белки 140β-Структура 80, 91, 96 *, 97*- антипараллельная 85 *, 86, 92-93 *, 314- нерегулярная 80- параллельная 85 *, 86; 91 *, 92- регулярная 80β-Структурных отрезков взаимодействие 155Субтилизины 220Субстрата связывание 220Субъединицы, зона контакта 161, 162Сульфгидрильных групп окисление 193Сульфопропилсефадекс 48Сульфоцистеин 66 *Супервторичная структура 94Таутомеразы 206Тела включения 137Термолизин 69Тиоредоксин 138, 139Тиреоглобулии 256, 257 *Тирозин 10 *, 187 *, 188 *- кодирование 256Тирозинкиназы 270Тироксин 257 *Титин 316 ,Тойоперл 43Токсинов белковых механизмдействия 279Трансаминазы 205Трансдуцин 288, 289 *Трансферазы 205Треонин 8, 9 *Трет-бутиловые эфиры 16, 26, 28 *Трет-бутоксикарбонильная группа 26

Третичная структура белка 88, 94, 101-148,155- - - дестабилизация 107- - - образование из элементов вторичной структуры 121- - - перенос эффекта на значительные расстояния 173- - - стабильность 103Трикетогидриндегидрат 14Триозофосфатизомераза 246- каталитический центр 246 *Трипсин 68, 224 * 280- ингибитор 34- электростатическое взаимодействие 68Трипсиноген 280Триптофан 10 *- модификация 197Тропокоялаген 304, 306Тропоэластин 311Туникамицин 262Уравнение Михаэлиса - Ментен 208-211Фактор роста эпителия 34Фарнезил-пирофосфат 275 *Фотоактивируемая фенилазидная группировка 201Фенилаланин 9 *, 15, 20, 22Фенилизотиоцианат 17, 75Фенилсефароза 50 *Фенилтиазолинон 76Фенилтиогидантоин 18Фенилгидантоиновый метод 75, 76 *Фенилтиокарбамил-аминокислота 17, 18 *Фенольные группы тирозина, модификация 186Фермент-субстратный комплекс 207, 208 *, 226- - переходный, модель 221Циклопептиды 37Циклоспорин 37, 140Циклофилин 140Цистеин, 9*, 63*, 192*- модификация 192Цистеиновая кислота 63 *Цистинв, 63*Цис, транс-изомеризация пептидной

связи 139Четвертичная структуру, 1^8-1.62- - анализ функциональной роли 158-162- - кооперативные эффекты 177- - способы мягкой диссоциации 156- - стехиометрии определение 150, 158Шаперонины 141Шапероны 140Шарнирный участок иммуно-глобулина 296Щиффа основание 13, 14 *, 185, 30)8 *Экзоны 310Экзопептидазы 73Эластин 310Электростатические контакты 104Эллмана реактив 193, 194 *Эндопротеиназы 69Энзимы 204Энкефалины 38, 39 *Энтеропептидаза 58, 280Эпитоп 298, 300Эстеразы 206Эфиры активированные 29Ядерного магнитного резонанса метод 118, 136*Ферменты 203-253- ингибирование 215- катализ 207- - кинетика 208- международная классификация 205- механизм действия 242- предшественников активация 280- протеолитические 41- систематика 204Ферримиоглобин 167Фиброин шелка 314Фибронектин 315Флуоренилмет илоксикарбонильнаягруппа 26Формилаза 282Фосген 17Фосфодиэстераза 269

Фосфопротеинфосфатазы 267-269 *Фосфопротеины 266Фосфорилазы 266-268- активация 267Фосфорилирование белков 266Фрагмент антигенсвязывающийиммуноглобулина 296Fab ‘-Фрагмент 295(Fab)2-Фрагменты 296Fc-Фрагмент 295Химотрипсин 69, 220Химотрипсиноген 281Хелатные структуры 17Хроматография аффинная 52- жидкостная 34- быстрая (FPLC), метод 50- высокоэффективная (ВЭЖХ) 72- гидрофобная 50- ионнообменная, метод 46, 49 *Хромофоры 101Цвиттер-ионы 8Циклоизомеразы, 206

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРЕДИСЛОВИЕ .............................................................................................................. 3ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................... 4

ГЛАВА 1. АМИНОКИСЛОТЫ ................................................................................. 6

1.1. КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ..................................... 71.2. ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ α-АМИНОКИСЛОТ ................................................. 11

1.2.1. Реакции аминогрупп ......................................................................................... 111.2.2. Реакции карбоксильных групп ......................................................................... 141.2.3. Реакции с совместным участием α-аминной и ................................................... 15α-карбоксильной групп ............................................................................................. 15

1.3. МЕТОДЫ СИНТЕЗА α-АМИНОКИСЛОТ .............................................................. 171.3.1. Химический синтез .......................................................................................... 171.3.2. Разделение рацемических аминокислот ............................................................ 191.3.3. Ферментативный синтез аминокислот ............................................................. 201.3.4. Микробиологический синтез аминокислот ....................................................... 21

ГЛАВА 2. ПЕПТИДЫ............................................................................................. 21

2.1. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ ............................................................. 222.2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ ................................................................. 23

2.2.1. Защита аминогруппы ........................................................................................ 242.2.2. Защита α-карбоксильной группы ..................................................................... 272.2.3. Образование иептидной связи ........................................................................... 272.2.4. Тактика пептидного синтеза .............................................................................. 30

2.3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ......................................................... 332.4. ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ....................................................................................... 35

ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ........................................................................... 38

3.1. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ .............................................................. 383.2. ХАРАКТЕРНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ, НА КОТОРЫХ

ОСНОВАНО ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ............................................................................... 403.3. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЕ.

ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ (ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ) ................................................ 41

3.4. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ ........................................... 443.5. ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ ..................................................... 473.6. АФФИННАЯ, ИЛИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ,....................................................... 49

ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ .................................................................................. 493.7. ИММУНОСОРБЦИЯ .............................................................................................. 543.8. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ ................... 55

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ .................................................................................. 55

ГЛАВА 4. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА .......................................................... 56........................................................................................................................................ 56

4.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА КАК УРОВЕНЬ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА .................. 564.2. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДИВИДУАЛЬНОСТИ БЕЛКА. МИКРОГЕТЕРОГЕН-

НОСТЬ БЕЛКОВ ...................................................................................................... 584.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА ............................... 594.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ...................................... 62

4.4.1. Подготовка белка к анализу .............................................................................. 624.4.2. Ферментативные методы фрагментации полипептидной цепи.......................... 644.4.3. Химические методы специфического расщепления .......................................... 66 пептидных связей ..................................................................................................... 664.4.4. Разделение пептидов, полученных фрагментацией ............................................ 68полипептидной цепи .................................................................................................. 68

4.5. Определение первичной структуры пептидов............................................................. 694.5.1. Определение С-концевых аминокислот ............................................................ 694.5.2. Определение N-концевых аминокислот и последовательностей ........................ 70

ГЛАВА 5. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА ..................................................................... 76

5.1. СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ ................................... 765.2. СТЕРИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ И ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА

ПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ............................................................................................... 785.3. РОЛЬ ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУ-

РЫ............................................................................................................................. 825.4. α -СПИРАЛЬ ............................................................................................................ 835.5. β-СТРУКТУРА ......................................................................................................... 865.6. β-ИЗГИБ .................................................................................................................. 915.7. ОБ УСТОЙЧИВОСТИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ .............................................. 935.8. О СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙ......................................................... 94

И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМИ ........................................................................... 945.9. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ .................. 96

ГЛАВА 6. ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА .......................................................... 97

6.1. СТАБИЛЬНОСТЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙСТРУКТУРЫ БЕЛКА .............................................................................................. 98

6.2. ГИДРОФОБНОЕ ЯДРО .......................................................................................... 103

6.3. РОЛЬ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ В СТАБИЛИЗАЦИИ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУ-РЫ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ ....................................................................................106

6.4. ФОРМА, КОМПАКТНОСТЬ И ДИНАМИКАМОЛЕКУЛЫ БЕЛКА ..............................................................................................108

6.5. ОСОБЕННОСТИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА .................................111КАК ГЛАВНОГО ИСТОЧНИКА ИНФОРМАЦИИ ................................................111О ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЕ БЕЛКА ...................................................111

6.6. ДОМЕНЫ В БЕЛКАХ..............................................................................................1126.7. ОБРАЗОВАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА ИЗ ЭЛЕМЕНТОВ ВТОРИЧ-

НОЙ СТРУКТУРЫ .................................................................................................1156.8. ТОПОЛОГИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ В БЕЛКАХ

И КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУР ..............................1166.9. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ..................................1186.10 ДЕНАТУРАЦИИ. БЕЛКА .......................................................................................1216.11. РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА .......................................................................................1256.12. О СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙ ......................................................134

И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРАМИ БЕЛКА ............................................134

ГЛАВА 7. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА................................................... 140

7.1. СТЕХИОМЕТРИЯ И ГЕОМЕТРИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ ...........................................................................................................142

7.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ СУБЪЕДИНИЦАМИ,СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ЧЕТВЕРТИЧНУЮ СТРУКТУРУ ..................................145

7.3. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТАКТОВ МЕЖДУСУБЪЕДИНИЦАМИ ..............................................................................................147

7.4. СПОСОБЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ ...........................................................................................................148

7.5. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ БЕЛКА .............................................................................................149

ГЛАВА 8. ГЛОБИНЫ ........................................................................................... 154

8. 1. МИОГЛОБИН .......................................................................................................1558.2. ГЕМОГЛОБИН .......................................................................................................159

8.2.1. Четвертичная структура гемоглобина ...............................................................1598.2.2. Присоединение кислорода к гемоглобину и сопровождающиеего изменения третичной структуры ..........................................................................1618.2.3. Функциональная роль четвертичной структуры гемоглобина ...........................1648.2.4. 2,3-Дифосфоглицерат — эффектор, регулирующийфункцию гемоглобина ..............................................................................................1668.2.5. Участие гемоглобина в транспорте СО2 и ионов водорода .................................1688.2.6. Аномальные гемоглобины ................................................................................169

ГЛАВА 9. ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ............................... 171

9.1. ОСОБЕННОСТИ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГОМОДИФИЦИРОВАНИЯ ........................................................................................ 171

9.2. ТИПОВЫЕ РЕАКЦИИ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬ-НЫХ ГРУПП БЕЛКА ............................................................................................... 1739.2.1. ε-Аминогруппы ............................................................................................... 1739.2.2. Фенольные группы тирозина ........................................................................... 1769.2.3. Реакции карбоксильных групп ........................................................................ 1789.2.4. Модификация остатков метиошша .................................................................. 1819.2.5. Модификация остатков цистеина .................................................................... 1829.2.6. Модификация имидазольной группы гистидива .............................................. 1859.2.7. Модификация гуанидогруппы аргинина .......................................................... 1869.2.8. Модификация индола в триптофане ................................................................. 187

9.3. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГО МОДИФИЦИРОВАНИЯ1889.3.1. Химическое модифицирование как способ выявления ролифункциональных групп белка ................................................................................... 1889.3.2. Аффинные реагенты ........................................................................................ 1899.3.4. Другие области применения химического ........................................................ 192модифицирования белков ......................................................................................... 192

ГЛАВА 10. ФЕРМЕНТЫ ....................................................................................... 193

10.1. СИСТЕМАТИКА ФЕРМЕНТОВ ........................................................................... 19410.2. ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА .................................... 19610.3. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА............................................................................................................... 19810.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ ..................................................................... 20410.5. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ.............................................................................. 209

10.5.1. Связывание субстрата .................................................................................... 20910.5.2. Каталитический механизм ............................................................................. 214

10.6. ЛИЗОЦИМ............................................................................................................ 22210.7. АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗА ............................................................................. 22810.8. ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА ................................................................................... 23210.9. ТРИОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗА ........................................................................... 23410.10. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА («АВЗИМЫ»)................................................ 237

ГЛАВА 11. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА ......................... 241

11.1. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПЕРЕГРУППИРОВКИ В БЕЛКАХ........................ 24211.2. ИОДИРОВАНИЕ ОСТАТКОВ ТИРОЗИНА ......................................................... 24411.3. ОБРАЗОВАНИЕ ОСТАТКОВ γ-КАРБОКСИГЛУТАМИНОВОЙКИСЛОТЫ .................................................................................................................... 24611.4. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ. ГЛИКОПРОТЕИНЫ................................... 247

11.4.1. N-Гликопротеины ..........................................................................................24711.4.2. O-Гликопротеины ...........................................................................................250

11.5. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ. ФОСФОПРОТЕИНЫ ................................25311.6. АВР-РИБОЗИЛИРОВАНИЕ.................................................................................25711.7. ЛИПОПРОТЕИНЫ ...............................................................................................259

11.7.1. Липопротеины с С-концевым гликолипидом .................................................25911.7-2. Липопротеины с N-концевой липидной группировкой .................................26011.7.3. Пренилированные белки ................................................................................261

11.8. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ.........................................................................26311.8.1. Формирование белка неканонической структуры. ..........................................264Биосинтез инсулина .................................................................................................26411.8.2. Разъединение белковых глобул в полибелках ..................................................26511.8.3. Разделение доменов ........................................................................................26511.8.4. Активация предшественников ферментов ......................................................266

11.9. ПРОЦЕССИНГ АМИНОКОНЦЕВОГО РАЙОНА БЕЛКА ...................................269

ГЛАВА 12. G-БЕЛКИ...........................................................................................269

12.1. БЕЛОК c-E-ras .......................................................................................................27012.2. ТРАНСДУЦИН ......................................................................................................27412.3. СТИМУЛИРУЮЩИЙ БЕЛОК Gs И ИНГИБИРУЮЩИЙ БЕЛОК Gi

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ .................................................................276

ГЛАВА 13. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ ..................................................................... 278

13.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА G........................27913.2. ЦЕНТР СВЯЗЫВАНИЯ АНТИГЕНОВ ..................................................................28213.3. МНОГООБРАЗИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ .....................................................286

ГЛАВА 14. ФИБРИЛЛЯРНЫЕ БЕЛКИ .................................................................. 287

14.1. КОЛЛАГЕН ...........................................................................................................28814.2. ЭЛАСТИН..............................................................................................................29514.3. КЕРАТИНЫ ...........................................................................................................29714.4. ФИБРОИН ШЕЛКА..............................................................................................29914.5. ФИБРОНЕКТИН ..................................................................................................30014.6. ЛАМИНИН ...........................................................................................................301

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА .............................................................................304ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ .......................................................................................307

Степанов Валентин Михайлович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ.СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВРедактор Л.С: Орлова. Художник Ю’.Т. Черепанов: Художественныйредактор Е.А. Вишнякова. Технические редакторы Е.И. Герасимова,Л\А. Овчинникова. Корректор Г.И. Кострикова. Оператор В.Н.ДумбарИВ № 9592ЛР № 010146 от. 25.12,91. Изд. № Х/Е-77. Сдано в набор 13.12.93.Подп. в печать 16.01.,96. Формат бОхвв 1/^. Бум. газетн.Гарнитура “Русская”. Печать офсетная. Объем 20,58 усл. печ. л.20,58 усл.кр.-отт. 21,35 уч.изд.л. Тираж 5000 экз. Зак. №56Издательство “Высшая школа”, 101430, Москва, ГСП-4,Неглинная ул, д. 29/14.

Набрано на персональном компьютере издательства.Отпечатано в АООТ “Оригинал”, 101898, Москва, Центр,Хохловский пер. 7.

stepanov

Documents

099534 8ffa2 grishin i emelyanov m stepanov a myslit i...

pÕhja-tallinna jk volta · arvo kraam 23.02.1971 armand...

ss 2013 alexander stepanov - heidelberg university · •...

a.i. l’vov, p.n. lebedev institute of physics, moscow,...

stepanov, prikaz knjige m. janicijevica

properties of minimizers of average-distance … ·...

sorgen wir gemeinsam fur unseren planeten erde von deutsch...

optimal location of dirichlet regions for elliptic pdes ·...

aleksei n. stepanov - port-arthur vol 1 (v.1.0).doc

smo afisha stepanov

art criticism -...

44078125 manual jurnalism situatii criza guzun stepanov

v.a. orlovich b.i. stepanov institute of physics, national...

projekt ustava republike srbije - clds.rs · projekt ustava...

veaceslav stepanov abstract

societ ĂŢ ile de lectur Ă sÂrb Ă din varia Ş...1...

powerpoint presentation...le père de la stl est alexandre...

stepanov b osnovnye principy prakticheskogo primeneniya smyc

liubomir stepanov sarbii din chizdia-cosariieste notat ă...

반응표면분석법을 이용한 결정화 공정의...