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H.P.L.C.
Cromatografia liquida ad alta pressione TECNICHE SPETTROSCOPICHE
Si basano sullo studio dell’interazione
radiazione-materia
chimclinica2012@gmail.com
Psw: clin2012
Natura della radiazione elettromagnetica
Ondulatoria: onda elettromagnetica
Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni
Lunghezza d’onda (l): distanza tra i massimi di due onde consecutive
Frequenza (n): n. di oscillazioni complete in un sec
C = l n
380 nm 780 nm
SPETTRO VISIBILE
SPETTRO delle radiazioni elettromagnetiche
Natura della radiazione elettromagnetica
Ondulatoria: onda elettromagnetica
Corpuscolare: treno di particelle dette quanti o fotoni
Energia dei fotoni E = h n
h è la costante di Plank
Ad una determinata n l’energia di ciascun fotone è sempre la stessa
L’assorbimento delle radiazioni nella materia è un processo
molto vario e complesso. I parametri importanti sono:
tipo e energia della radiazione incidente, natura del materiale.
Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare
Spettroscopia di assorbimento
Il protone si comporta come una calamita
Ciascun nucleo possiede una carica e alcuni nuclei (1H, 31P) hanno la
proprietà di ruotare su se stessi (spin).
La rotazione di una carica genera un campo magnetico.
Quando si applica una radiazione di opportuna n (risonante, 200 MHz), i nuclei
passando allo stato ad alta energia assorbono una frazione dell’energia applicata.
In assenza di campo magnetico In presenza di campo magnetico
Ai 2 orientamenti corrispondono
2 livelli energetici
Risonanza Magnetica in clinica
Analizza il comportamento dei protoni nelle molecole di acqua
(80% della massa del corpo umano) quando sottoposte a campi magnetici
ad elevata intensità.
Si applicano onde radio e i nuclei passano allo stato ad alta energia.
Il segnale radio è quindi interrotto e i protoni tornano nella posizione
precedente.
Ritornando al livello energetico più basso emettono radiazioni che
vengono trasmesse a un computer e trasformati in immagini 3D.
I tessuti ricchi di H2O, le cui molecole sono più mobili danno segnale
più forte, mentre quelli delle strutture rigide, come l’osso non ne
danno affatto.
380 nm 780 nm
SPETTRO VISIBILE
In chimica clinica si utilizzano principalmente tecniche
spettrofotometriche che utilizzano la luce UV-visibile (180-800nm)
La Spettrofotometria si basa su due principi:
• alcune molecole hanno la capacità di assorbire la luce
ad una determinata l;
• La quantità di luce assorbita è proporzionale alla
quantità di sostanza presente.
I/Io = Trasmittanza (T)
L’assorbanza è la grandezza di più immediata utilità essendo
direttamente proporzionale alla conc. molare della sostanza.
log 1/T = Assorbanza (A)
Legge di Lambert Beer
A = e c l
c = concentrazione
e = coefficiente di estinzione molare
l = cammino ottico
Elettrone allo stato
fondamentale
Elettrone allo
stato eccitato
fotone
E = hn
DE Solo se E fotone = DE = E2-E1
Perché alcune sostanze assorbono la luce
(solo a determinate l)?
Luce è policromatica (miscuglio di radiazioni a diversa l)
Luce monocromatica
(caratterizzata da una sola l)
Disperde le radiazioni grazie alla rifrazione
Come si seleziano determinate l?
Spettro a righe
Spettro a bande
Analisi quali-
quantitative
1s
2s
2p
3s
3p
3d
Livelli energetici e transizioni elettroniche nell’atomo di sodio
(N=11)
3s 3p 590 nm
4s
4s
3s 4p 330 nm
4p
Livelli energetici e transizioni elettroniche in una molecola
Sottolivelli vibrazionali
Sottolivelli rotazionali
Livelli elettronici
Perché si misura l’assorbanza al picco di assorbimento?
Fotometro o Spettrofotometro?
Un fotometro consiste di una sorgente, di un sistema di
fenditure, di filtri, di un rivelatore fotoelettrico.
Uno spettrofotometro differisce dal fotometro per il fatto che
esso contiene un più sofisticato sistema per selezionare una
ristretta e precisa gamma di radiazioni.
Applicazioni della spettrofotometria UV-VIS
in chimica clinica
1) Proteine
2) Emoglobina e metaboliti (bilirubina)
3) Zuccheri e metaboliti (glucosio)
4) Lipidi (colesterolo, trigliceridi)
5) Ormoni
6) Enzimi (AST, ALT, CK, LDH)
Analisi delle proteine plasmatiche totali
Metodo del Biureto (colorimetrico)
Lo ione Cu2+ reagisce con i legami peptidici in soluzione alcalina
con formazione di un complesso che assorbe a 540 nm (blu).
Il reagente contiene Na,K tartrato, che complessa lo ione Cu2+ e
ne previene la precipitazione.
Misura spettrofotometrica in bicromatismo (540 -700 nm)
Interferenze: emolisi
Misure in bicromatismo
Misura a due diverse l sullo stesso campione.
Permette di evitare l’allestimento del Bianco (miscela
contenente il campione e tutti i reagenti eccetto quello
che porta alla formazione del cromoforo)
Le Proteine Plasmatiche
Insieme di macromolecole estremamente eterogeneo per
caratteristiche chimiche e funzione.
Origine prevalentemente epatica, eccetto immunoglobuline
(plasmacellule), alcune lipoproteine (intestino)
Valori sierici di riferimento: 65-83 g/l
Si dividono in 2 gruppi:
1) Albumine
2) Globuline (4 tipi principali)
Mediante tecniche di laboratorio è possibile
fornire al clinico i valori di:
• proteine totali plasmatiche
• albumina
• rapporto albumina/globuline
L’aumento di proteine totali plasmatiche (meno frequente):
per disidratazione (vomito, diarrea, eccessiva sudorazione)
La diminuzione di proteine totali plasmatiche (piu’ frequente):
Diminuita sintesi per:
- insufficiente assunzione di amminoacidi (malnutrizione, malassorbimento)
- Malattie epatiche
Aumentata perdita per danni renali (escrezione eccessiva per
malfunzionamento glomerulo)
La presenza di proteine nelle urine (proteinuria) puo’
indicare un danno renale che provoca maggior
permeabilità del glomerulo renale alle proteine plasmatiche
Analisi delle proteine nelle urine
Nei soggetti normali: 40-150 mg/24h
Analisi delle proteine nelle urine
Metodo colorimetrico per dosaggio proteine totali
Il legame del colorante alle proteine determina uno spostamento del max di
assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide.
Il colorante Coomassie Brilliant Blue si lega specificatamente a residui di
arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Agisce primariamente
con i residui di arginina.
Misura spettrofotometrica in bicromatismo (595 -465 nm)
…Although the method is simple and fast, the unequal
dyebinding responses of individual proteins require
caution when applying this test to the complex mixture of
protein found in serum.
Enzimi come reagenti
Glucosio + O2 + H2O acido gluconico + H2O2
H2O2 + 4-aminoantipirina + fenolo chinoneimina + H2O
Glucosio
ossidasi
perossidasi
Cromoforo
Colorazione rossa
Determinazione del Glucosio con metodo
spettrofotometrico
Enzimi come indici di sofferenza tissutale
(ausilio diagnostico)
Piruvato + NADH + H+ Lattato + NAD+
LDH
Determinazione della Lattico Deidrogenasi (LDH) nel sangue
LDH H4 aumenta nell’infarto del miocardio, LDH M4
aumenta nelle lesioni di tessuto muscolare o epatico
Solo NADH assorbe a 340 nm
Il coenzima NAD è coinvolto nelle
reazioni catalizzate dalle deidrogenasi
E = hn
DE
b) hn
a) Rilassamento termico
ASSORBIMENTO
(ECCITAZIONE)
EMISSIONE
Fluorimetria
Spettrofotometria di fluorescenza
Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici
Maggiore specificità
Fluorimetro
Determinazione quantitativa
L’intensità di fluorescenza è proporzionale alla
concentrazione dell’analita (in soluzione diluite)
VANTAGGI
Sensibilità è 100-10000 volte superiore a metodi fotometrici
Maggiore specificità
SVANTAGGI
Sensibilità a variazione delle condizioni sperimentali (pH, temperatura) quenching
Studio e diagnosi di malattie congenite da alterazione del
metabolismo degli amminoacidi (fenilchetonuria)
La presenza di aspartame nel prodotto fa sì che esso
contenga una fonte di fenilanina. Pertanto, il prodotto
non è adatto a persone affette dalla malattia ereditaria
denominata fenilchetonuria.
Amminoacidopatie
Fenilchetonuria deficienza dell’enzima fenilalanina
idrossilasi (PAH)
X
Barriera
Emato-Encefalica
O=
Phenylpyruvate
Fenilalanina
transaminasi Inibitore competitivo
per piruvato
Inibitore di enzimi
della glicolisi
CICLO
DELL’UREA
Citrullinemia deficienza dell’enzima argininosuccinato sintetasi
AA vengono derivatizzati con sostanza
fluorescente per essere rivelabili
E = hn
DE
b) hn
a) Rilassamento termico
ASSORBIMENTO
(ECCITAZIONE)
EMISSIONE
Processi che danno luogo ad emissione di energia radiante
Eccitazione tipi di luminescenza
Radiazione EB fotoluminescenza (fluorescenza, fosforescenza)
Reazione chimica chemiluminescenza
Reazione in sistemi biologici bioluminescenza
Luminescenza
Emissione di luce da parte di una molecola che
passa dallo eccitato allo stato fondamentale
Quando lo stato eccitato viene prodotto da una
reazione chimica, si parla di chemiluminescenza
Perossidasi
luminolo
Condizione necessaria perchè si verifichi
chemiluminescenza è che la reazione sia esoergonica in
modo che i prodotti della reazione si vengano a trovare in
stati elettronici eccitati. L'emissione si verifica poi per
fluorescenza.
Limite di rivelabilità: 10-15 M
Intervallo di linearità: 10-12 – 10-6 M
Turbidimetria e Nefelometria
Tecniche analitiche impiegate per misurare la luce diffusa.
La diffusione della luce è un fenomeno fisico che dipende dalla
concentrazione e dalla dimensione di particelle in un campione .
Rivelatore: a 180° rispetto a radiazione incidente
a 90° rispetto a raggio incidente
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