tecnologia do dna recombinante i: análise de dna e rna bibliografia: recombinant dna – james...

Tecnologia do DNA recombinante I:

Análise de DNA e RNA

Bibliografia:Recombinant DNA – James Watson & Michael GilmanGuia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph RapleyBiologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da SilvaInstituto de Química- USP

Análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA)

Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR

Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos

Mutagênese in vitro

Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos

Endonucleases de restriçãoHaemophilus aegytius HaeIII 5’...G G C C...3’

3’...C C G G...5’

Haemophilus haemolyticus HhaI 5’...G C G C...3’ 3’...C G C G...5’

Escherichia coli EcoRV 5’..G A T A T C...3’ 3’..C T A T A G...5’

EcoRI 5’.G A A T T C...3’ 3’.C T T A A G...5’

Nocardia otitidis- NotI 5’..G C G G C C G C..3’caviarum 3’..C G C C G G C G..5’

DNA-Ligases

Clonagem de um segmento de DNA (gene) em vetores

Fragmento de DNA

Vetor ou veículo de clonagem:-plasmídeo-bacteriófago-cosmídeo-cromossomo artificial de bactéria (BAC)-cromossomo artificial de levedura (YAC)

Ligação enzimática: Ligase de DNA

insertofragmento de DNA ligado ao vetor

bactéria transformada

introduzir nas células: transformação e seleção

construção

Clonagem de DNA em bactérias

Detecção e análise de ácidos nucleicos

Eletroforese em gel de agarose

Brometo de Etídio

Fotografando um gel de agarose corado com Brometo de Etídio

Transiluminador com luz UV

Gel

Camera Polaroid

Dig

estã

o de

um

pl

asm

ídeo

com

en

zim

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e Re

stri

ção

Dig

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DN

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nôm

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Marcador de tamanho (pb)

Marcador de tamanho (pb)

Mapa de restrição

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Marcador de tamanho (pb)

Marcador de tamanho (pb)

Transferência de ácidos nucleicos do gel para membrana de náilon (Blot)

Gel

Membrana Papel toalhaPapel Filtro

Peso de 0,3-0,5 Kg

Reservatório com tampão de transferência

Ponte de papel

Hibridização de DNA (ou RNA) detecta se a solução contem sequencias complementares as fitas

imobilizadas no filtro

Southern Blot: DNA x DNA

Transferência para membrana

Eletroforese do DNA em gel de agarose

Hibridização da membrana com sonda radioativa

Exposição a filme de Raios-X

Marcar fragmento radioativamente para geração

de uma sonda para hidridização

Produção de sondas gênicas para hibridização

Marcação da sonda através da síntese in vitro com nucleotídeos radioativos (32P-

dATP)

Produção de sondas

gênicas para hibridização a

partir da sequência

conhecida de um peptídeo

Marcação da sonda com 32P na extremidade 5´(32P ATP)

Detecção de genes expressos Northern Blot RT-PCR (PCR precedido de

transcrição reversa) Análise do nível de expressão

de um único gene de cada vez Macroarrays de DNA Microarrays de DNA

Análise do nível de expressão de milhares de genes simultâneamente

Northern Blot: RNA x DNA

Transferência para membrana

Eletroforese de RNA em gel de agarose

Hibridização da membrana com sonda radioativa

Exposição a filme de Raios-X

28S

18S

Sonda Gene A

Northern BlotGel de Agarose

0h 24h

28S

18S

Sonda Gene B

Northern BlotGel de Agarose

0h 24h

Macro e microarrays de DNA

Arranjo ordenado de fragmentos de DNA imobilizados em uma superfície sólida porosa (membrana de náilon) ou não porosa (lâmina de vidro, plástico).

Os “pontos” neste arranjo correspondem a um gene específico. É possível fabricar microarranjos com MILHARES de “pontos” em alta densidade

Tipos de microarrays de DNA

GeneChip®: Oligonucleotídeos (20~25-mer) sintetizados in situ (on-chip). Estes são conhecidos como “DNA chips” e foram desenvolvidos pela Affymetrix em 1994.

DNA microarrays em vidro: Fragmentos de DNA obtidos por PCR (500~5.000 pb) ou oligonucleotídeos imobilizados em lâmina de vidro (lâmina de microscópio) com um “spotter” robotizado [~1995, grupo de Pat Brown, Stanford]

DNA purificado (plasmídeo/ produtos de PCR/ oligonucleotídeos) imobilizados em membrana de nylon ou plástico em alta densidade (ex: sequências de 8000 genes em membrana de 8 x 12cm, Clontech)

Principal aplicação da tecnologia de microarrays de DNA

Determinação do nível de expressão de milhares de genes

simultaneamente (abundância dos respectivos mRNAs)

Avaliação global da expressão gênica em células, tecidos e organismos em diferentes situações fisiológicas e patológicas

Classificação molecular de tumores – diagnóstico e prognóstico

Farmacogenômica/Toxicogenômica

GeneChip (oligoarray)

“Wafer”

12,7cm

250.000 probes (“features”) representando 5.000 genes humanos

Oligos (106- 107 cópias) / featureSíntese fotoquímica in situ

feature

Amostras de DNA (produtos de PCR purificados)

Deposição na lâmina de vidro com um robô (spotter)Imobilização covalente

Arranjo ordenado e preciso das amostras de DNA em alta densidade

“microarray de DNA em lâmina de vidro”

Microarrays de DNA

ID

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000000

DNA clones/PCR mRNA/cDNA Labelling Data Analysiscontrol sample

Cye 3 Cye 5

O genoma completo da levedura S.cerevisiae em um chip ~6.000 genes

http://cmgm.stanford.edu/pbrown/yeastchip.html

Bloco 11 inferior, sala 1100 – IQ/USPhttp://bioinfo.iq.usp.br/cagelab

Tecnologia do DNA recombinante II: Clonagem de genes

Bibliotecas de DNA

Bibliografia:Recombinant DNA – James Watson & Michael GilmanGuia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph RapleyBiologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da SilvaInstituto de Química- USP

Purificação e análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA)

Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR

Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos

Mutagênese in vitro

Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos

Construção de Bibliotecas de Genes

Bibliotecas Genômicas representam todo o genoma

Bibliotecas de cDNA representam os genes

expressos em um tecido ou situação fisiológica ou patológica

Clones genômicos Clones de cDNA

Biblioteca Genômica construída em bacteriófago

Biblioteca Genômica construída em bacteriófago

Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas

Varredura de Bibliotecas construídas em plasmídeo

Hibridização de colônias de bactérias

Estratégia de sequenciamento do genoma

Nature 15 Feb 2001 409(6822)

Who

le g

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otgu

n

Construção de Biblioteca de

cDNA

Clonar cDNAs em bacteriófagos ou plasmídeo

Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas

Vetor de expressão

Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos

Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos