tugas bioteknologi
Post on 28-Nov-2015
125 Views
Preview:
TRANSCRIPT
TUGAS BIOTEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN DALAM BIDANG KESEHATAN
“PEMBUATAN INSULIN”
OLEH :
NI NYOMAN ENGLANDARI MURTI 1008505011
NI MADE DWI DIANTHY MARYADHI 1008505044
ANGELIA PUTRI MOELIONO 1008505046
I DEWA AYU ADELIA VIVIANDARI 1008505047
A.A. FEBY DANUSWARI 1008505054
PUTU LITA ASTRIANI 1008505056
NI PUTU YULIA PURNAMI 1008505059
GUSTI AYU EKA PERTIWI 1008505060
PUTU IKA INDAH INDRASWARI 1008505061
NI MADE SENDI ROOSVALIN W. 1008505063
SAGUNG ARI MAHADEWI 1008505094
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2013
I. KONSEP DNA REKOMBINAN
Prinsip teknologi rekombinasi DNA yaitu menggabungkan molekul
fragmen DNA atau gen dari organisme yang berbeda sehingga menghasilkan
kombinasi baru yang sebenarnya tidak terdapat secara alami. DNA dari
manusia, hewan, tumbuhan dan mikroorganisme dapat direkombinasi. DNA
rekombinan buatan sangat berguna dalam penelitian genetika. Teknologi DNA
rekombinan terus mengembangkan metode untuk isolasi dan menyatukan gen
menjadi kombinasi baru. Tahap awal dari rekombinasi adalah isolasi gen
target. Isolasi gen dapat dilakukan dengan 2 cara yakni pemotongan secara
langsung dan isolasi mRNA untuk persiapan cDNA. Enzim endonuklease
restriksi digunakan untuk memotong untai DNA. Sedangkan DNA ligase
berguna untuk menggabungkan fragmen-fragmen DNA. Apabila menggunakan
metode isolasi mRNA, maka harus berdasarkan prinsip reverse transcription
dan memerlukan penyusunan DNA primer. Gen yang telah diperoleh kemudian
disisipkan pada vector pembawa yang akan membawa gen ke dalam sel inang
(host). Sel inang yang telah ditransformasi kemudian diseleksi dan digunakan
ataupun dikembangkan sebagai organisme penghasil DNA rekombinan
(Nelson, 2005).
DNA ini merupakan unit terkecil yang membawa sifat keturunan (gen).
Dalam penyisipan gen diperlukan mikroorganisme biasanya bakteri, beberapa
jenis ragi, atau virus. Bakteri yang biasanya digunakan adalah Escherichia coli,
yang berfungsi sebagai pembawa gen (vektor). Sifat bakteri atau ragi yang
mengandung gen titipan itu dikendalikan oleh gen asing tadi. Jadi gen asing ini
tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada dalam sel bakteri
(Sumastri, 2005).
Penelitian dalam bidang biologi molekuler dan biologi kedokteran
mengalami kemajuan yang pesat dengan adanya perkembangan manipulasi
gen. Manipulasi gen didefinisikan sebagai pembentukan baru materi genetik
yang dapat diturunkan dengan cara menyisipkan molekul-molekul asam
nukleat ke virus atau plasmid bakteri atau organism pembawa lainnya yang
memungkinkan terjadi penggabungan ke dalam organisme dan mampu
mengadakan penggandaan lagi. Pemanipulasian gen secara invitro dilakukan
pada awal tahun 1970 dengan adanya perkembangan teknik transformasi pada
bakteri Escherichia coli, pemotongan dan penggabungan molekul-molekul
DNA, dan pemantauan reaksi-reaksi pemotongan dan penggabungan. Jika
pragmen DNA tidak direplikasikan, cara yang paling baik adalah
melekatkanyya ke replikon yang cocok. Replikon ini dissebut juga vector atau
tempat pengklonan. Virus yang menyerang bakteri (bakteriofag) atau plasmid
merupakan vektor yang tepat karena merupakan replikon mereka sendiri, tidak
perlu pemeliharan khusus dan DNA nya dapat dipisahkan dalam bentuk utuh.
Pada mulanya plasmid dan fag yang tepat sebagai vektor hanya dijumpai pada
bakteri Escherichia coli (Sumastri, 2005). Kemajuan di
bidang bioteknologi yang lain diantaranya adalah sintesis insulin dengan
bantuan bakteri yang biasa terdapat di usus besar, namanya Escherichia coli.
Teknologi dasar proses ini disebut dengan teknologi plasmid (Anonim, 2012).
II. DIABETES MELITUS
Penyakit diabetes mellitus (DM)-yang dikenal masyarakat sebagai
penyakit gula atau kencing manis, terjadi pada seseorang yang mengalami
peningkatan kadar gula (glukosa) dalam darah akibat kekurangan insulin atau
reseptor insulin tidak berfungsi baik. Diabetes yang timbul akibat kekurangan
insulin disebut DM tipe 1 atau Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM).
Sedang diabetes karena insulin tidak berfungsi dengan baik disebut DM tipe 2
atau Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus (NIDDM). Insulin adalah
hormon yang diproduksi sel beta di pankreas, sebuah kelenjar yang terletak di
belakang lambung, yang berfungsi mengatur metabolisme glukosa menjadi
energi serta mengubah kelebihan glukosa menjadi glikogen yang disimpan di
dalam hati dan otot. Tidak keluarnya insulin dari kelenjar pankreas penderita
DM tipe 1 bisa disebabkan oleh reaksi autoimun berupa serangan antibodi
terhadap sel beta pankreas. Pada penderita DM tipe 2, insulin yang ada tidak
bekerja dengan baik karena reseptor insulin pada sel berkurang atau berubah
struktur sehingga hanya sedikit glukosa yang berhasil masuk sel. Akibatnya,
sel mengalami kekurangan glukosa, di sisi lain glukosa menumpuk dalam
darah. Kondisi ini dalam jangka panjang akan merusak pembuluh darah dan
menimbulkan berbagai komplikasi. Bagi penderita Diabetes Melitus yang
sudah bertahun-tahun minum obat modern seringkali mengalami efek yang
negatif untuk organ tubuh lain (Gustia,2012).
III. INSULIN
3.1 Sejarah Insulin
Insulin pertama kali di ekstraksi dari jaringan pankreas anjing pada
tahun 1921 oleh para ahli fisiologi asal kanada Sir Federick Glant Banting
dan Charles Hebert Best serta ahli fisiologi asal Inggris John James Richard
Macleod. Seorang ahli boikimia James Betram Collip kemudian
memproduksi dengan tingkat kemurnian yang cukup baik untuk digunakan
sebagai obat pada manusia. Pada tahun 1965 insulin manusia telah berhasil
disintesis secara kimia. Insulin merupakan protein manusia pertama yang
disintesis secara kimia. Secara tradisional, insulin untuk pengobatan pada
manusia diisolasi dari pakreas sapi atau babi. Walaupun insulin hewan secara
umum cukup memuaskan tetapi untuk penggunaan pada manusia dapat
menimbulkan dua masalah. Pertama, adanya perbedaan kecil dalam asam
amino penyusunnya yang dapat menimbulkan efek samping berupa alergi
pada beberapa penderita. Kedua, prosedur pemurnian sulit dan cemaran
berbahaya asal hewan tidak selalu dapat dihilangkan secara sempurna. Pada
tahun 1981 telah terjadi perbaikan secara berarti cara produksi insulin melalui
rekayasa genetika. Insulin yang diperoleh dengan cara ini mempunyai
struktur mirip dengan insulin manusia. Melalui teknologi DNA rekombinan,
insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. Karena
kedua hal tersebut di atas, insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek
samping yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang
diperoleh dari ekstrak pankreas hewan, tidak menimbulkan efek alergi serta
tidak mengandung kontaminan berbahaya (Gustia,2012).
Tabel 1. Perbedaan susunan asam amino pada insulin manusia, babi, dan sapi
Insulin manusia dan insulin babi hanya beda 1 asam amino yaitu pada
B30,sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda 3 asam amino yaitu
pada A8, A10, B30, sehingga pemakain insulin babi kurang imunogenik
dibandingkan insulin sapi. Tapi masalahnya, 1 babi yang diekstraksi
insulinnya hanya cukup untuk 1 orang selam 3 hari padahal saat ini ada ± 60
juta orang didunia yang menderita diabetes tergantung insulin dan meningkat
5-6 % pertahunnya. Maka dari itu sekarang banyak dikembangkan teknologi
recombinan untuk mendapatkan insulin. Faktor-faktor ini menyebabkan
peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan memasukkan
gen insulin ke dalam uanin yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk
memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami
diproduksi. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA
rekombinan (Gustia,2012).
3.2 Struktur Insulin dan Fungsi Insulin
Insulin merupakan hormon peptide yang disekresikan oleh sel β dari
Langerhans pancreas. Fungsi insulin adalah untuk mengatur kadar normal
glukosa darah. Insulin bekerja melalui memperantarai uptake glukosa seluler,
regulasi metabolism karbohidrat, lemak, dan protein, serta mendorong
pemisahan dan pertumbuhan sel melalui efek motigenik pada insulin
(Prabawati, 2012).
Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari
51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21
lainnya yang membentuk rantai kedua. Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan
uaninee. Kode uanine untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas
lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63
dalam rantai A dan 90 dalam rantai B). DNA yang membentuk kromosom,
terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-
masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada empat basa
nitrogen yang berbeda yaitu guanine, timin, sitosin dan guanine. Sintesis
protein tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang
diulang (Gustia,2012).
Gambar 2.
Struktur Insulin
Insulin adalah suatu hormon polipeptida yang diproduksi dalam sel-
sel β kelenjar Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi
kadar gula darah (kadar gula drah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Hormon insulin
yang diproduksi oleh tubuh kita dikenal sebagai sebutan insulin endogen.
Namun, ketika kelenjar pankreas mengalami gangguan sekresi guna
memproduksi hormon insulin, disaat inilah tubuh membutuhkan hormon
insulindari luar tubuh,dapat berupa obat buatan manusia yang dikenal sebagai
sebutan insulin eksogen.Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit
seperti diabetes militus tergantung insulin(diabetes tipe 1). Insulin terdiri dari
51 asam amino. Molekul insulin disusun oleh 2 rantai polipepttida A dan B
yang dihubungkan dengan ikatan disulfida. Rantai A terdiri dari 21 asam
amino dan rantai B terdiri dari 30 asam amino (Gustia,2012).
Insulin adalah hormon yang mengubah glukosa menjadi glikogen, dan
berfungsi mengatur kadar gula darah bersama hormon glukagon. Kekurangan
insulin karena cacat genetik pada pankreas, menyebabkan seseorang
menderita diabetes melitus (kencing manis) yang berdampak sangat luas
terhadap kesehatan, mulai kebutaan hingga impotensi. Sebelum ditemukan
teknik sintesis insulin, hormon ini hanya bisa diperoleh dari ekstraksi
pankreas babi atau sapi, dan sangat sedikit insulin bisa diperoleh. Setelah
ditemukan teknik sintesis insulin di bidang bioteknologi inilah, harga insulin
bisa ditekan dengan sangat drastis sehingga bisa membantu para penderita
diabetes melitus (Anonim, 2012).
III.3 Escherrichia coli
Gambar 1.
Bakteri Gram negatif, Escherrichia coli, penghuni alami saluran pencernaan
manusia
Escherrichia coli (E. coli) merupakan bakteri penghuni saluran
pencernaan manusia, merupakan ‘pabrik’ yang digunakan dalam rekayasa
genetika insulin. Ketika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama
dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat
mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan
cara menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini.
Pada E. coli, B-galaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen.
Untuk membuat bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada
enzim ini (Gustia,2012).
Gambar 2. Gambaran replikasi gen insulin pada E. coli
IV. TAHAP MANIPULASI DAN PENYISIPAN GEN PADA PEMBUATAN
INSULIN
Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama yaitu:
1. Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisikan, biasanya berupa
plasmid, yaitu lingkaran kecil DNA yang terdapat pada bakteri. Plasmid
diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing.
2. Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh
bakteri akan mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak
plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang dicopy
sehingga terjadi cloning gen.
3. Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim in
disebut enzim endonulease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu
enzim endonuklease yang dapat memotong DNA pada posisi dengan
urutan basa nitrogen tertentu.
(Gustia,2012).
Tahap-tahap manipulasi dan penyisipan gen pada pembuatan insulin adalah
sebagai berikut :
1. Pemilihan Inang
Para peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan
memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli,
untuk memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami
diproduksi. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA
rekombinan Gen insulin manusia dari pulau Langerhans diambil,kemudian
disambungkan ke dalam pasmid bakteri,membentuk kimera (DNA
recombinasi). Kimera itu dimasukkan ke dalam sel target E.coli. Bakteri E.coli
ini dikultur,untuk dikembangkan. Karakteristik bakteri E.coli yang menjadi
organisme pilihan untuk memproduksi insulin memiliki keunggulan-
keunggulan sebagai berikut:
Memiliki rentang umur pendek
Jumlah generasi yang banyak
Susunan genetik bakteri yang lebih mudah dimodifikasi
Lingkungan luar bekteri dapat dengan mudah dimodifikasi untuk
mempengaruhi ekspresi gen.
Menghasilkan produk,hampir mendekati yang kita inginkan (menyerupai
insulin yang dihasilkan sel β-pankreas)
Lebih ekonomis
Sudah banyak dipelajari dan digunakan oleh peneliti lainnya dalam DNA
rekombinan .
2. Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen pengkode
hormon insulin dari sel-sel pankreas manusia atau gen pengkode hormon
pertumbuhan dari kelenjar pituitary. Kromosom sel-sel pankreas dikeluarkan
dengan memecah membran plasma. Membran plasma ini dipecah dengan
diberi kejutan listrik atau dengan pemberian zat kimia yaitu polietilen glikol
atau kalsium klorida (CaCl2), sehingga kromosom dapat keluar dari sel
pankreas.
a. Mula-mula mRNA yang telah disalin dari gen penghasil insulin diekstrak
dari sel pankreas. Kemudian enzim transkriptase ditambahkan pada mRNA
bersamaan dengan nukleotida penyusun DNA.
b. Enzim ini menggunakan mRNA sebagai cetekan untuk membentuk DNA
berantai tunggal.
c. DNA ini kemudian dilepaskan dari mRNA.
d. Enzim DNA polymerase digunakan untuk melengkapi DNA rantai tunggal
menjadi ranati ganda, disebut DNA komplementer (c-DNA), yang
merupakan gen penghasil insulin.
3. Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi endonuklease untuk melepaskan bagian DNA yang mengkode insulin
(proinsulin) dari satu kromosom organism. Dengan adanya restriction enzymes
ini, dimungkinkan untuk memotong daerah DNA yang mengkode insulin dari
satu kromosom organisme sehingga dapat diproduksi insulin. Kemudian
memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk
persiapan memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan untuk
menganalisis.
4. Mengekstraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan
cara memecah dinding sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan
menggunakan deterjen atau dengan enzim lisozim, kemudian dilisis dengan
natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA kromosom akan
menggumpal dan dinetralisir dengan natrium asetat. DNA plasmid ini akan
menggumpal membentuk jaring-jaring dan dengan mudah mengendap. Untuk
memisahkan DNA ini dilakukan sentrifugasi. Cairan yang mengandung
plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan etanol. DNA plasmid yang
dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid ynag berbentuk lingkaran itu dipotong
dengan enzim restriksi endonuklease yaitu enzim yang sama digunakan untuk
memotong DNA pankreas. Enzim ini memecah ikatan fosfodiester pada
molekul DNA. Endonuklease memecah asam nukleat pada posisi internal,
sedangkan enzim eksonuklease memecah molekul DNA dari ujung
molekulnya. Sementara itu, di dalam serangkain tabung reaksi atau cawan
petri, gen penghasil insulin manusia (dalam bentuk c- DNA disiapkan untuk
dipasangkan pada plasmid yang terbuka tersebut). Plasmid adalah salah satu
bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil.
Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. Keunikan plasmid ini adalah:
ia bisa keluar-masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering dipertukarkan antar
bakteri.
5. Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam plasmid
dengan menggunakan enzim ligase yang fungsinya menggabungkan ikatan
fosfodiester antara fragmen ujung-ujung yang terpotong tadi. Proses
penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim yang digunakan untuk
memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama jenisnya, akan menghasilkan
ujung-ujung yang lengket yang sama strukturnya, sehingga penyambungannya
akan menyatu sempurna, sehingga dihasilkan molekul DNA
recombinan/plasmid recombinan yang bagus. Suhu optimum untuk ligasi
adalah 370C, tetapi ikatannya tidak stabil. Ligasi akan berhasil jika dilakukan
pada suhu 4-1500C.
6. Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan ke
dalam sel bakteri E.coli dengan cara transformasi. Transformasi dilakukan
dengan memasukkan bakteri E.coli ke dalam larutan CaCl2 sehingga terbentuk
lubang-lubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel bakteri.
Di dalam sel bakteri ini plasmid mengadakan replikasi. Diharapkan bakteri
yang telah disisipi gen tersebut mewarisi sifat gen baru, sehingga bakteri yang
telah disisipi dengan gen pengkode insulin dapat memproduksi insulin. Gen
insulin diekspresikan sewaktu bakteri bereplikasi dengan B-galaktosidase
dalam sel mengalami mitosis.
7. Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan atau mengkultur bakteri
hasil rekayasa dalam tabung fermentasi yang berisi medium untuk
pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi
human proinsulin dalam jumlah yang banyak.
(Sumastri,2005)
Gambar 3.
Proses pembuatan insulin DNA Rekombinan
V. SELEKSI KLON
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya
DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel
inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara
sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan
seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan.
Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah
transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau
berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti
ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa
fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara
kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel
inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat
dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk
membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan
sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah
satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa
kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa
fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut
menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara
in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reaction (PCR).
Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar
isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal
tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen
pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate).
Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang
membawa fragmen yang diinginkan. Atau cara lainnya yang hampir mirip
yaitu setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA
rekombinan diidentifikasi menggunakan probe. Probe adalah rantai RNA atau
rantai tunggal DNA yang diberi label bahan radioaktif atau bahan fluorescent
dan dapat berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan.
Pada langkah pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah ARNd dari
gen pengkode insulin pankreas manusia. Untuk memilih koloni bakteri mana
yang mengandung DNA rekombinan, caranya adalah menempatkan bakteri
pada kertas filter lalu disinari dengan ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA
rekombinan dan telah diberi probe akan tampak bersinar. Nah, bakteri yang
bersinar inilah yang kemudian diisolasi untuk membuat strain murni DNA
rekombinan. Dalam metabolismenya, bakteri ini akan memproduksi hormon
insulin (Anonim, 2012).
DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :
1. Produk PCR.
2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi
(Gaffar, 2007)
VI. PEMURNIAN INSULIN
Bakteri E.coli yang telah dikultur pada media dan telah
berkembangbiak dan mengandung proinsulin dalam jumlah besar kemudian
diinaktifkan untuk pengambilan proinsulin. Proses inaktifasi dilakukan
dengan cara heat sterilization. Setelah proinsulin diambil kemudian dilakukan
pemotongan secara enzimatik untuk memperoleh human insulin.
Setelah diperoleh human insulin, proses selanjutnya adalah pemurnian
untuk penghilangan sel-sel yang tidk diinginkan. Protein yang terbentuk,
sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A
atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-
galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai dicampur dan dihubungkan
kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulfida,
menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis) (Gustia,2012).
Pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi cair dan kristalisasi
(Muqshit, 2013). Pemurnian insulin melibatkan beberapa metode
kromatografi seperti kromatografi ion exchange, kromatografi reversed-
phase, kromatografi size exclusion serta teknik kristalisasi. Berikut skema
tahap pemurnian insulin :
Crude Insulin
Ion Exchange (menghilangkan pengotor pada proses fermentasi)
Reversed-phase (menghilangkan komponen yang menyerupai insulin)
Size exclusion (menghilangkan penggumpalan)
KristalisasiInsulin murni
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2012. Membuat Insulin dengan Bantuan E.coli. Available at: http://biologimediacentre.com/bioteknologi-5-membuat-insulin-dengan-bantuan-e-coli/.
Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Teknologi Molekul. Bandung: Jurusan Kimia Fakultas
MIPA Universitas Padjajaran.
Gustia, Riza., I Hardiyanti., Slamet. 2012. DNA Rekombinan Dalam Bidang
Kesehatan (Pembuatan Insulin). Jambi : Fakultas Keguruan dan Ilmu
Pendidikan Universitas Jambi.
Muqshit R. 2013. Rekombinasi DNA (Hormon Insulin). Jakarta: State Islamic
University
Nelson, David L, Cox, Michael M. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry 4 th Ed. New York : W.H Freeman.
Prabawati, Risma K. 2012. Mekanisme Seluler dan Molekuler Resistensi Insulin.
Malang : Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
Sumastri. 2005. Modul Rekayasa genetika. Bandung : Science Education Develompment Centre.
top related